Summary
Målinger af drug target engagement er centrale for udvikling af effektive lægemidler og kemiske sonde validering. Vi detalje her, en protokol til måling af stof-mål engagement ved hjælp af høje indhold billeddannelse på en mikrotiterplade-kompatible tilpasning af cellulære termisk Skift assay (CETSA).
Abstract
Quantitating samspillet mellem små molekyler med deres tilsigtede protein mål er kritisk for udvikling af lægemidler, target validering og kemiske sonde validering. Metoder, der måler dette fænomen uden ændring af protein mål eller lille molekyle er særlig værdifuld, selvom teknisk udfordrende. Cellulære termisk Skift assay (CETSA) er en teknik til at overvåge mål engagement i levende celler. Her beskriver vi en tilpasning af den oprindelige CETSA protokol, som giver høj overførselshastighed målinger samtidig bevare subcellulært lokalisering på enkelt celle-niveau. Vi mener, at denne protokol tilbyder vigtige fremskridt til anvendelsen af CETSA for dybdegående karakterisering af sammensatte-target interaktion, især i heterogene befolkninger af celler.
Introduction
Ved udvikling af nye stoffer eller kemiske sonder er det vigtigt at koble konstaterede farmakologiske virkning eller funktionelle udlæsning til målinger af target belægning eller engagement i levende celler1,2,3. Disse data er nødvendige for at sikre at den lille molekyle i virkeligheden når sin ønskede mål og validere biologiske hypotesen bag protein target udvalg4,5. Desuden, under udvikling af lægemidler, modelsystemer af stigende kompleksitet der bruges til at vælge og bekræfte en bly sammensatte forud for kliniske forsøg. For at bekræfte oversættelse af biologi på tværs af disse prækliniske systemer, er metoder til opsporing stof-mål engagement og ledsager biologi i hele denne udviklingsproces kritisk.
Drug-mål engagement har traditionelt været udfordrende at overvåger i levende celler med unfunctionalized små molekyler og proteiner, især på det enkelt celle niveau med rumlige opløsning6,7. En nyere metode til at observere samspillet mellem uændrede stoffer og proteiner i levende celler er cellulære termisk Skift assay (CETSA) hvor ligand-induceret stabilisering af et nativt protein som svar på en varme udfordring er kvantificeret8, 9,10. Dette opnås ved at kvantificere resterende opløseligt protein efter udsættelse for en varme udfordring. I den første offentliggørelse af CETSA, blev vestlige skamplet brugt til registrering. For at aktivere screening kampagner og ramte triaging af større sammensatte samlinger, har bestræbelser på at øge gennemløbet af CETSA eksperimenter ført til udviklingen af flere homogen, mikrotiterplade-baseret assays10,11. Dog er en begrænsning med disse metoder at de er i øjeblikket bedst egnet til sammensatte behandling i celle suspensioner og påvisning kræver celle lysis, fører til tab af geografisk information. CETSA kan anvendes eksperimentelt enten som en ligand-induceret forskydning i termisk sammenlægning temperatur (Tagg) på en enkelt koncentration af den lille molekyle eller den ligand koncentration nødvendigt at stabilisere proteinet på en enkelt temperatur. Sidstnævnte kaldes isotermisk dosis svar fingeraftryk (ITDRF) til at betyde afhængighed af disse målinger på de specifikke forsøgsbetingelser.
Målet med denne protokol er at måle mål engagement ved hjælp af CETSA i vedhængende celler af immunfluorescent påvisning af antistof (IF) med high-indhold mikroskopi12. Denne procedure udvider den oprindelige CETSA platform til at give mulighed for enkelt-celle kvantificering af mål engagement med bevarelse af subcellulært lokalisering. Navnlig, i modsætning til mange tidligere rapporter, er i denne procedure sammensatte behandling udført i live vedhængende celler uden overflade udstationering eller vask før den varme udfordring, således at beskytte det etablerede bindende ligevægt vi sigter mod at måle13. I øjeblikket, metoden er valideret for ét mål protein p38α (MAPK14) i flere cellelinjer, og vi håber, at ved at dele denne procedure teknikken kan anvendes bredt på tværs af smeltende proteomet. Vi forventer, at denne protokol kan tilpasses hele stof udvikling rørledning fra screening, ramte triaging gennem overvågning af target engagement i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. såning af celler
Bemærk: Se figur 1for en generel oversigt over arbejdsprocessen. En detaljeret liste over materialer og reagenser, der er tilgængelige i Tabel af materialer.
- Inden såning af cellerne, bore huller med en standard bor i ramme af sort 384-godt imaging assay plader til at undgå luftbobler blive fanget under pladen senere under trinnet varme. Undgå plastik partiklerne ind brøndene under dette trin og opretholde sterile forhold, forsegle plader med en klæbende aluminiumsfolie eller dække plade før boringer i vævskultur hætte. Typisk, 3 huller med en diameter på 3,5 mm på hver side af pladen (kort kant) tilstrækkeligt.
- Forbered en laminar flow bænk ved rengøring med 70% ethanol. Efter standard aseptisk vævskultur teknikker, fjerne medier fra celle kolbe eller parabol. Vaske cellerne med 5-10 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og derefter tilsættes 2 mL trypsin til kolben. Inkuber i kolben ved 37 ° C, indtil A-431 cellerne frigøre. Tælle cellerne, enten ved hjælp af en hæmocytometer eller cellen counter. Forberede en cellesuspension af 50.000 celler/mL i dyrkningsmediet.
- Dispensere 40 µL af cellesuspension (at give en afsluttende celle tæthed af 2.000 celler pr. brønd) i hver brønd med en assay plade ved hjælp af en bulk reagens dispenser eller en multikanals pipette, afhængigt af omfanget af eksperimentet. Kort flytte pladen fra side til side til at sprede celler jævnt på bunden af pladen.
- For at minimere plade-kant effekter, Tillad cellerne til at bosætte sig i bunden af assay plade i 20 minutter ved stuetemperatur i laminar flow hætte. Pladen anbringes derefter i en plast beholder med fugtige papirservietter til at sikre et fugtigt atmosfære. Før brug, tørre plastikbeholder med 70% ethanol.
- Inkuber boksen med assay plade i 2-3 dage ved 37 ° C og 5% CO2 i en konventionel befugtet inkubator. Overvåge confluency af celler indtil 50-75%, vurderet ved visuel inspektion med et lysmikroskop.
2. sammensatte behandling
- Opsug medium fra hver brønd med en plade skive på dagen af forsøget. Pladen anbringes på pladen vaskemaskinen og vælg programmet aspiration. Hvis der ikke findes en plade skive, kan så væsken fjernes ved invertere pladen med en hurtig hånd twist over en spildbakken eller vask. Fuldstændig fjernelse af væske er afgørende for gode resultater. Eventuelle overskydende væske fjernes derefter ved at duppe med papirservietter.
- Tilføj 30 µL af forbindelser fortyndet til den bevilgede koncentration i cellekulturmedium ved hjælp af automatiserede udlevering eller en multikanalpipette afhængigt af omfanget af eksperimentet. Sørge for at tilføje en negativ (DMSO) og positivt (kendte ligand) kontrol flere brønde på hvert assay plade. Da dette er en termisk Skift assay, er det nødvendigt, at den sammensatte koncentration overstiger dissociationskonstant observere protein stabilisering. Således, en grov rettesnor for sammensatte koncentration er 50 - 100 gange IC50, men mere detaljerede beskrivelser af sammensatte koncentrationer findes i afsnittet diskussion.
Bemærk: DMSO tolerabiliteten af cellelinjer bør testes før eksperimentet. - Seal stof-behandlede assay pladen med en åndbar plade forsegle og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i en fugtig inkubator i 30 minutter.
3. varme udfordring
- Først, sæt vandbadet til den ønskede temperatur. Bemærk at den endelige temperatur, der nås inde wells af assay plade kan være forskellig fra den endelige temperatur i vandbad. Undersøge offset på forhånd med en dummy plade og termoelement termometer. Det tager typisk 30 minutter til at stabilisere sig på den ønskede temperatur.
- For at kontrollere, at den ønskede temperatur er nået i wells af assay plade under trinnet varme, forberede en ulukkede dummy plade der indeholder den samme mængde af medium som assay plade.
- Fjerne assay plader fra rugemaskinen. Tage den åndbare segl og re forsegle assay pladen som indeholder de stof-behandlede celler med en stram klæbende aluminiumsfolie til at sikre, at ingen vand vil lække ind i brøndene under den efterfølgende opvarmning i vandbad. Sikre, at de borede huller i plade ramme er tilgængelige.
- Placer den analyse og de dummy plader i vandbad med bunden af pladen vinklet mod vandoverfladen at tvinge enhver resterende luft ud fra under pladerne.
- Overvåge temperaturen inde wells af en ny dummy plade ved hjælp af et termoelement termometer.
- Varme assay plade i vandbad i 3 minutter. Straks overføre analysen og dummy plade til et andet vandbad med værelse-hærdet vand til at køle ned i 5 minutter. Assay pladen er nu klar til yderligere behandling.
4. fiksation
- Undvære 10 µL 16% (w/v) PARAFORMALDEHYD (PFA) direkte til assay pladen ved hjælp af en bulk reagens dispenser eller en multikanals pipette. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter.
Bemærk: Nogle fikseringsmidler er klassificeret som kræftfremkaldende og institutionelle sikkerhedsbestemmelser bør følges. - Opsug PFA løsning og cellerne vaskes med 300 µL PBS ved hjælp af en plade skive. Pladen anbringes på pladen vaskemaskinen og vælg programmet aspiration.
Bemærk: Denne procedure er blevet optimeret ved hjælp af et overløb protokol på plade vaskemaskinen som væske er samtidig udleveres og fjernet. Hvis der ikke findes en plade skive eller lignende procedure, kan vaske trin alternativt gøres manuelt. - Manuel vask procedure: Fjern væsken fra brøndene ved invertere pladen med en hurtig hånd twist over en spildbakken eller vask. Fuldstændig fjernelse af væske er afgørende for gode resultater. Tilsættes 80 µL af PBS med en multikanalpipette og Vend pladen igen som beskrevet ovenfor, Gentag vask proceduren to gange. Efter den sidste vask, duppes plade mod rene papirservietter til at fjerne overskydende væske.
5. permeabilization
- Tilføj 20 µL af 0,1% (v/v) NP-40 for brønde med en multikanal pipette og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter. Vaske cellerne ved hjælp af den samme procedure som beskrevet ovenfor (trin 4.2).
- Alternativt, når det er hensigtsmæssigt, anvende en antigen hentning protokol, f.eks.:
- Tilføj 20 µL af 1% SDS brønde med en multikanal pipette. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter og vask efter samme procedure beskrevet ovenfor (trin 4.2).
- Tilsættes 80 μl af 10 mM glycin til pH 7,2 og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Opsug den glycin løsning ved hjælp af en plade skive ved anbringelse på plade vaskemaskinen og vælge aspiration protokol. Se noter i 2.1 og 4.2, hvis en plade skive ikke er tilgængelig.
6. blokering
- Tilføj 15 µL af 1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i PBS brønde ved hjælp af en bulk reagens dispenser eller en multikanals pipette. Inkuber plade ved stuetemperatur i 1 time eller natten over ved 4 ° C med en aluminium folie plade segl.
7. primære antistof
- Opsug den blokerende løsning ved hjælp af en plade skive ved anbringelse på plade vaskemaskinen og vælge aspiration protokol. Se noter i 2.1 og 4.2, hvis en plade skive ikke er tilgængelig.
- Tilsæt 10 µL af primære antistof fortyndes tilsvarende i 1% (w/v) BSA i PBS brønde med en multikanal pipette. Inkuber plade ved stuetemperatur i 1 time eller natten over ved 4 ° C med en aluminium folie plade segl.
8. sekundær antistof
- Opsug den primære antistof løsning og vaske brønde efter samme procedure som beskrevet ovenfor (trin 4.2).
- Tilsæt 10 µL af Alexa 488 sekundær antistof fortyndes tilsvarende i 1% (w/v) BSA i PBS. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time. Forsegle pladen med en klæbende aluminium folie forsegling til at beskytte mod lys.
Bemærk: Beskytte plade fra lys i løbet af denne og efterfølgende trin.
9. nukleare farvning og celle maske
- Tilsæt 10 µL af nukleare farvestof fortyndet til 0,05 mg/mL i PBS brønde med en multikanal pipette. Inkuber ved stuetemperatur i yderligere 10 minutter.
- Opsug sekundær antistof og Hoechst løsning og vaske brønde ved hjælp af den samme procedure som beskrevet ovenfor (trin 4.2).
- Tilsæt 10 µL af celle maske fortyndet til 200 ng/mL i PBS brønde med en multikanal pipette. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Opsug den celle maske løsning og vaske brønde ved hjælp af den samme procedure som beskrevet ovenfor (trin 4.2).
- Dispensere 60 µL af PBS til alle brønde ved hjælp af plade spændeskive, en bulk reagens dispenser eller en multikanals pipette, og forsegle plader med en klæbende aluminiumsfolie.
10. billede erhvervelse og analyse
- Capture billeder på en høj indhold imager bruger 3 fluorescerende kanaler: DAPI (387/447), normal god landbrugspraksis (472/520) og TexasRed (562/624). Erhverve 4 billeder pr. brønd ved hjælp af 10 X mål. Bruge automatiserede laser autofokus og anvende binning 2 under erhvervelse. Gemme billeder som 16 bit, grå skala tiff filer sammen med metadata.
- Analysere billeder ved hjælp af tilgængelige software. Identificere celle grænser ved hjælp af en celle Scoring algoritme med DAPI (kernen) og TexasRed (cytoplasma).
- Uddrag gennemsnitlige intensitet for alle erhvervede bølgelængder for yderligere dataanalyse.
- Beregne Z-faktor for at sikre robustheden af analysen.
- Beregne % stabilisering ved hjælp af følgende formel: 100 * (1-(godt intensitet – gennemsnitlig godt intensitet negativ kontrol) / (gennemsnitlig intensitet positiv kontrol-gennemsnitlig intensitet negativ kontrol)). Negativ kontrol er her DMSO og positive kontrollen er henvises stoffet. Da den maksimale stabilisering mellem forbindelser kan variere og faktisk være større end den positive kontrol for ITDRF kurver, er de maksimale og minimale stabilisering intensiteter for hvert stof undertiden anvendes i stedet for kontrolhullerne intensitetsværdierne .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den protokol, der er skitseret i figur 1 beskriver den grundlæggende arbejdsgang for at køre CETSA assays på vedhængende celler med påvisning af resterende opløseligt protein af høj indhold billeddannelse. Denne arbejdsproces kan være let tilpasses til alle faser af analysen udvikling ved at ændre layoutet plade af forbindelser eller reagenser14. Vi detalje forventede resultater for flere forventede brug tilfælde nedenfor.
Antistof identifikation og analyse udvikling. En forudsætning for vellykkede resultater er identifikation af en primær antistof eller andre egnede affinitet reagens, der selektivt genkender den indfødte form for protein i nærværelse af den aggregerede og udfældet protein dannes under varmen udfordre i trin 3. For at etablere CETSA imaging analysen beskrives her, screenet vi et panel af 9 antistoffer rettet mod p38α ved 52° C for signal vindue mellem de positive og negative kontroller. Vi derefter titreres de bedste antistoffer og afgjort på de betingelser, der er vist i figur 2 A, B med repræsentant immunofluorescens billeder for p38α stabiliseret af en kendt ligand (positiv kontrol) og DMSO (negativ kontrol). Antistof anerkendelse bør også ikke forstyrres af konformationelle ændringerne af target proteinet, der kan være fremkaldt af ligand bindende (figur 2 c). Som et eksempel, BIRB796 har en lang off sats og kvantificering af mål engagement var kun muligt ved at anvende et antigen hentning skridt (5.2; Figur 2D). Det er vigtigt at validere udførelsen af det primære antistof med kendte ligander dækker forskellige bindingssteder target protein, hvis den er tilgængelig. Antistof validering er fortrinsvis udført både med og uden antigen hentning trin.
Tagg og ITDRF kurver. Som nævnt ovenfor, kan du køre CETSA eksperimenter i to forskellige modes, Tagg kurver og ITDRF eksperimenter. Begge varianter benytter samme basis protokol skitseret i figur 1 og i afsnittet protokol. I den første opsætning er formålet at udfordre celler med en temperaturgradient og sammenligne Tagg kurver i tilstedeværelse og fravær af en enkelt koncentration af ligand. Hvis du vil udføre en Tagg kurve, opvarmes separate plader i 3 minutter på tværs af forskellige temperaturer. I at udføre dette eksperiment, er det vigtigt at sammensatte behandling tidslængde for hver plade med den tid, det tager for vandbad til at stabilisere den nye temperatur. I denne sammenhæng er udføre varme udfordring trin i vandbadet mere tidskrævende end varme rør i en PCR-maskine. Den eksperimentelle vej er at næste køre koncentration/respons-kurver af en ligand på en fast temperatur til at generere ITDRF kurver. Generelt, når du tester flere forbindelser, er assay klar plader til den sammensatte tilføjelse udarbejdet ved hjælp af automatiseret flydende håndtering for at opnå de mest reproducerbare data. Forbindelser er seriefremstillede fortyndet i DMSO og derefter opløst i celle dyrkningsmedier til den ønskede koncentration. Vi har typisk testet 11 punkt koncentration serien starter ved 50-100 µM i 3 eller 4 fold fortynding, men dette afhænger af styrken af ligander anvendes. Det tilrådes at først opstilles en Tagg kurve både i fravær og tilstedeværelsen af en ligand og vælg temperatur for efterfølgende isotermisk eksperimenter hvor et skift mellem kurverne kan observeres. Den valgte temperatur skal være omkring eller lige over Tagg. Begge formater mulighed for bekræftelse af mål engagement men for placering af sammensatte tilhørsforhold ITDRF eksperimenter er ofte mere velegnede. Figur 3A viser en illustration af forventede kvantificerede resultater for en Tagg kurve og figur 3B kvantificerer resultaterne af et typisk ITDRF eksperiment.
Screening kampagne. Protokollen kan også tilpasses screening kampagner for at identificere nye bindemidler af target proteinet. I dette tilfælde anvendes isotermisk varme udfordringer for et stort antal forbindelser på en enkelt koncentration efterfulgt af ITDRF eksperimenter for identificerede stabiliserende forbindelser. Vi udarbejder assay klar screening plader og overføre de forbindelser, der er fortyndet i dyrkningsmedier til assay plader ved hjælp af automatiserede flydende håndtering. Som med alle termisk stabilitet assays, er det nødvendigt at overstige dissociationskonstant observere protein stabilisering, og dermed har vi anvendt lille molekyle biblioteker på 50 µM at lette hit identifikation. Triaging af de hits, ved hjælp af ITDRF vil senere tillade ranking og prioritering af disse forbindelser. Figur 4 viser et repræsentativt resultat fra en screening plade.
Figur 1 . Skematisk oversigt over den protokol, der er beskrevet i denne artikel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Antistof identifikation og udvikling. A) eksempeldata til påvisning af menneskelige p38α i A-431 celler. Repræsentative billeder af positive (1 µM AMG548) og negative (DMSO) kontrol. Rød - nukleare Hoechst farvning, grøn-p38α farvning. Billeder taget med 10 X forstørrelse; den hvide skalalinjen repræsenterer 73 µm. B) eksempel på kvantificerede data udtrykt som gennemsnitlig intensitet/celle. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien af 16 flergangsbestemmelser for 6 separate plader. Hver plade blev opvarmet til 52 ° C i et vandbad, efterfulgt af fiksation af celler, permeabilization og efterfølgende immunfarvning. C) immunofluorescens signal intensitet måles efter behandling af A-431 celler med 1 µM BIRB796 eller DMSO som beskrevet ovenfor fulgt direkte af fiksering. I mangel af en varme trin er BIRB796 signal lavere end DMSO signal, hvilket tyder på at BIRB796 forstyrrer påvisning af p38α med denne antistof. D) ITDRFCETSA kurver for celler behandles med BIRB796 enten med (blå trekant) eller uden (grå trekant) antigen hentning protokol. Dette tal er blevet ændret fra Axelsson et al. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Termisk sammenlægning og ITDRF eksperimenter. A) termisk sammenlægning kurve eksperimenter for celler behandles med positive (1 µM AMG548 i orange) og negative (DMSO i grå) kontrol. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien af 32 eller 464 replikater. B) ITDRFCETSA eksperiment udføres ved 52 ° C for celler behandles med serielle fortyndinger af SB203580 i blå, Skepinone-L i grønt og RWJ67657 med rødt. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien af 6 replikater. Kvantificerede data er udtrykt som gennemsnitlig intensitet/celle og normaliseret mod den højeste koncentration af respektive sammensatte. Dette tal er blevet ændret fra Axelsson et al. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Repræsentative oversigt over en screening plade på 10 X forstørrelse. Positive kontroller (1 µM AMG548) er i kolonne 2 og 24 og negative kontroller (DMSO) i kolonne 1 og 23. Alle andre brønde indeholder 50 µM bibliotek forbindelser anvendes til screening med flere hits angivet. I inset tal repræsenterer den hvide linje i nederste højre hjørne 200 µm. Dette tal er blevet ændret fra Axelsson et al. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som omtalt i afsnittet resultater, er der flere vigtige skridt til proceduren. For det første er det vigtigt at identificere en høj kvalitet affinitet reagens. Vi anbefaler screening et lille bibliotek med antistoffer for hver ønsket mål. Efter en primær antistof er blevet valgt, er det også vigtigt at validere system for en række forskellige bindingssteder protein-målet, hvis det er relevant. Counter screening for forbindelser, der forstyrrer analysen signal, som vist i figur 2 c ved at udelade den varme udfordring er stærkt tilskyndes. Når en reduceret signal i tilstedeværelse af en ligand er observeret, kan en antigen hentning protokol som beskrevet i trin 5.2 testes. Ujævn opvarmning af pladerne kan medføre udsving og plade til plade variationer i de observerede data. Da pladerne er delvist nedsænket i vandbad under forbigående varme challenge (trin 3,4) er de ydre wells af pladerne udsat for det varme vand ikke kun på bunden af brøndene, men også gennem den ydre væg. Dette kan medføre højere temperatur under neddykning samtidigt i de yderste brønde plade og efterfølgende pladen kanteffekter. Det anbefales derfor, at undgå de ydre pladens huller. Lignende effekter kan også ses, hvis luftbobler fanget under pladen under varme trin forhindrer tilstrækkelig kontakt mellem det varme vand og bunden af brøndene. I betragtning af udfordringerne med varme imaging plader, kunne enheder og plader lavet specielt til udsættelse for varme medvirke til at fremme denne metode. Vi har undersøgt brugen af flere cellelinjer, og har fundet variation i overfladen udlæg efter varme udfordring for vedhængende celletyper. Foreløbige forsøg i vores lab tyder på at brugen af en belægning eller ekstracellulære matrix som Synthemax II-SC eller celle-Tak kan minimere celle detachment, men dette kan udgøre en teknisk udfordring, når du bruger semi-vedlagte celletyper. Da sammensatte behandling udføres i levende celler, skal de små molekyler celle gennemtrængelige. Hvis stoffet ikke er membran gennemtrængelige, anbefales alternative høj overførselshastighed CETSA metoder. Nogle forbindelser skal aktiveres metabolisk binder til deres mål proteiner11. I sådanne tilfælde anbefales længere behandling celler med sammensatte inden den varme udfordring.
Denne protokol kræver en enkelt plade fra celle Seedning til imaging gør det indstillet til high throughput screening kampagner. Antallet af celler til hvert eksperiment er meget lavere end der kan opnås med western blotting eller tidligere AlphaScreen-undersøgelser,15. Desuden er vask eller celle detachement trin, som kan ændre sammensatte tilgængelighed og bindende, fjernet, bevare den etablerede bindende ligevægt gennem varme udfordring trin. I modsætning til tidligere procedurer forlyder manglende signal på grund af cytotoksicitet samtidig på af nukleare farvning. Endelig, imaging bevarer den rumlige opløsning af de enkelte celler, giver mulighed for target engagement målinger i blandede bestande af celler eller celle stater.
For at virkelig vurdere anvendeligheden af tilgangen, er samordnet indsats for at anvende teknikken på tværs af smeltende proteomet nødvendige. Sådanne eksperimenter vil afklare let at identificere egnede affinitet reagenser, som betænkningen selektivt på de indfødte protein i overværelse af de resterende denatureret og aggregerede proteiner. Vi ved i øjeblikket ikke, hvordan protein udtryk niveauer vil påvirke evnen til pålideligt måle et signal vindue. Vi forventer at afspejle affinitet og selektivitet af de tilgængelige antistoffer, og forventer, at teknologier, der anvendes til at forbedre signal i immunfluorescent assays vil være gældende for lav rigelige proteiner. Alternativt, tagged proteiner eller functionalized stoffer kunne bruges til påvisning i modificerede versioner af de beskrevne protokol. Denne protokol er begrænset til mål, smelte og interaktioner hvor en kvantificerbar stabilisering kan observeres. For eksempel, kan endogene ligander stabilisere et protein i levende celle assays, som kan forhindre yderligere stabilisering af en udefrakommende ligand. Selv om ikke undersøgt her, mener vi, at det bliver muligt at multiplex udlæsninger at give mulighed for undersøgelse af flere mål samtidig, eller et mål med downstream effektorer. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at efterforske disse aspekter af i situ CETSA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger til rapport.
Acknowledgments
Forfatterne anerkende infrastruktur støtte fra videnskab for Life laboratorium og Karolinska Institutet. Forfatterne også anerkende input og drøftelser med Michaela Vallin, Magdalena Otrocka og Thomas Lundbäck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
- Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
- Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
- Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H.
- Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
- Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
- Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
- Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
- Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).
