Summary
قياسات للمخدرات هدف المشاركة أمران أساسيان لتطوير العقاقير الفعالة والتحقق من صحة التحقيق الكيميائية. هنا، نحن تفاصيل بروتوكول لقياس الاشتباك المخدرات المستهدفة باستخدام التصوير عالية المحتوى في تكييف الميكروسكوبية المتوافقة المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا).
Abstract
كوانتيتاتينج تفاعل الجزيئات الصغيرة مع الهدف المقصود من البروتين أمر بالغ الأهمية لتطوير العقاقير والتحقق من صحة الهدف والتحقق من صحة التحقيق الكيميائية. أساليب قياس هذه الظاهرة دون تعديل الهدف بروتين أو جزيء صغير قيمة خاصة ولو من الناحية التقنية الصعبة. المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا) أسلوب واحد لرصد المشاركة المستهدفة في الخلايا الحية. وهنا يصف لنا تعديلاً للبروتوكول سيتسا الأصلي، والذي يسمح لقياسات عالية الإنتاجية مع احتفاظها بالتعريب سوبسيلولار على مستوى الخلية الواحدة. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يوفر تقدما هاما لتطبيق سيتسا لتوصيف متعمقة للتفاعل المجمع المستهدف، لا سيما في السكان غير متجانسة من الخلايا.
Introduction
عند تطوير عقاقير جديدة أو المجسات الكيميائية من الضروري للزوجين التأثير الدوائي الملاحظ أو قراءات وظيفية للقياسات لشغل المستهدفة أو المشاركة في الخلايا الحية1،،من23. هذه البيانات ضرورية للتأكد من أن الجزيئات الصغيرة في الواقع تصل إلى هدفها المنشود، وكذلك للتحقق من صحة الفرضية البيولوجية وراء البروتين المستهدف التحديد4،5. وعلاوة على ذلك، وأثناء تطوير الأدوية، تستخدم نظم نموذجية للتعقيد المتزايد تحديد وتأكيد رائد مركبة قبل التجارب السريرية. لتأكيد الترجمة البيولوجيا عبر هذه النظم الإكلينيكية، أساليب لاقتفاء أثر المخدرات-هدف المشاركة والمصاحبة لعلم الأحياء في جميع مراحل عملية التنمية هذه الحاسمة.
مشاركة المخدرات المستهدفة تقليديا تحديا لرصد في الخلايا الحية مع جزيئات صغيرة أونفونكتيوناليزيد والبروتينات، وبخاصة على مستوى خلية واحدة مع القرار المكانية6،7. أسلوب واحد مؤخرا لمراقبة التفاعل بين معدلة العقاقير والبروتينات في الخلايا الحية هي المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا) الذي هو استقرار البروتين الأصلي في الاستجابة لتحدي حرارة المستحثة يجند كمياً8، 9،10. يتم ذلك عن طريق تحديد كمية البروتين للذوبان المتبقية بعد التعرض لحرارة تحد. في الكشف عن أولى سيتسا، استخدمت لطخة غربية للكشف. لتمكين حملات الفحص وضرب فرز مجموعات أكبر مجمع، الجهود المبذولة لزيادة إنتاجية تجارب سيتسا قد تؤدي إلى تطوير عدة فحوصات متجانسة، وعلى أساس ميكروسكوبية10،11. ومع ذلك، هو القيد واحد مع هذه الأساليب حاليا أفضل فإنها تكون مناسبة للعلاج المركب في تعليق خلية ويتطلب الكشف عن تحلل الخلية، مما يؤدي إلى فقدان المعلومات المكانية. سيتسا يمكن تطبيقها تجريبيا أما إلى تحول المستحثة يجند في التجميع الحراري درجة الحرارة (Tagg) في تركيز واحد من جزيء صغير أو تركيز يجند اللازمة لتحقيق الاستقرار في البروتين عند درجة حرارة واحدة. هذا الأخير هو ما يسمى الجرعة متحاور استجابة بصمات الأصابع (إيتدرف) للدلالة على الاعتماد على هذه القياسات في ظروف تجريبية محددة.
والهدف من هذا البروتوكول قياس الاشتباك المستهدفة باستخدام سيتسا في الخلايا ملتصقة بكشف الأجسام المضادة (إذا كان) إيممونوفلوريسسينت مع ارتفاع محتوى الفحص المجهري12. ويمتد هذا الإجراء منصة سيتسا الأصلي للسماح لخلية واحدة القياس الكمي لمشاركة الهدف مع الحفاظ على الترجمة سوبسيلولار. جدير بالذكر أن خلافا للعديد من التقارير السابقة، في هذا الإجراء العلاج المركب يتم في الخلايا ملتصقة العيش دون مفرزة السطحية أو الغسيل قبل التحدي الحرارة، وبالتالي الحفاظ على توازن المنشأة ملزمة ونحن نهدف إلى قياس13. حاليا، يتم التحقق من الأسلوب لهدف واحد بروتين p38α (MAPK14) في الخلية عدة خطوط، ويحدونا الأمل في أن تقاسم هذا الإجراء هذه التقنية يمكن تطبيقها على نطاق واسع عبر البروتين ذوبان. ونحن نتوقع أن هذا البروتوكول يمكن تكييفها في جميع أنحاء خط الأنابيب التنمية المخدرات من الفحص، وضرب التعقب عن طريق رصد الهدف المشاركة في فيفو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-زرع الخلايا
ملاحظة: للحصول على لمحة عامة عن سير العمل راجع الشكل 1. وتتوفر قائمة مفصلة بالمواد والمواد الكاشفة في الجدول للمواد.
- قبل البذر للخلايا، حفر ثقوب مع حفر قياسية في إطار أسود 384-جيدا التصوير لوحات الفحص لتجنب الوقوع تحت صفيحة لاحقاً أثناء الخطوة تدفئة فقاعات الهواء. لتجنب جزيئات البلاستيك تدخل الآبار خلال هذه الخطوة والحفاظ على ظروف معقمة، ختم اللوحات مع رقائق ألومنيوم لاصقة أو تغطية اللوحة قبل الحفر في غطاء زراعة الأنسجة. عادة، يكفي 3 ثقوب بقطر 3.5 ملم على كل جانب من اللوحة (الحافة القصيرة).
- إعداد مقعد الاندفاق الصفحي بالتنظيف باستخدام الإيثانول 70%. بعد تقنيات زراعة الأنسجة العقيم القياسية، وإزالة الوسائط من قارورة الخلية أو الطبق. تغسل الخلايا التي تحتوي على 5-10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) ثم قم بإضافة 2 مل التربسين لقارورة. احتضان قارورة على 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا A-431. عد الخلايا أما باستخدام عداد haemocytometer أو الخلية. إعداد تعليق خلية من خلايا/مل 50,000 في المتوسط الثقافة.
- الاستغناء عن 40 ميليلتر من تعليق خلية (إعطاء كثافة خلية الأخيرة من الخلايا 2,000 كل بئر) في كل من صفيحة الفحص باستخدام موزع كاشف الأكبر أو بيبيت الأقنية، تبعاً لحجم التجربة جيدا. باختصار نقل اللوحة من جنبا إلى جنب لتفريق الخلايا بالتساوي على الجزء السفلي من اللوحة.
- للتقليل من آثار حافة اللوحة، تسمح للخلايا لتسوية في الجزء السفلي من لوحة الفحص لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الجزء الخلفي من غطاء الاندفاق الصفحي. ثم، ضع اللوحة في وعاء من بلاستيك مع مناشف ورقية رطبة لضمان مناخ رطب. قبل الشروع في الاستخدام، مسح الحاويات البلاستيكية مع الإيثانول 70%.
- احتضان المربع مع لوحة الفحص عن 2-3 أيام في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة هوميديفيد تقليدية. رصد كونفلوينسي للخلايا حتى 50-75 ٪، حسب تقييم التفتيش البصري مع مجهر ضوء.
2-مجمع العلاج
- في يوم التجربة، نضح المتوسطة من كل كذلك استخدام غسالة لوحة. ضع اللوحة في لوحة الغسالة وحدد البرنامج الطموح. في حالة عدم توفر غسالة لوحة، ثم يمكن إزالة السائل بعكس اللوحة مع تطور يد سريع عبر علبة النفايات أو بالوعة. إزالة كاملة من السائل ضروري للأداء الجيد. ثم يتم إزالة أي سائل الزائدة التي دابينج مع مناشف ورقية.
- إضافة 30 ميليلتر من مركبات مخففة لتركيز المعتمد في مستنبت الخلية استخدام الاستغناء عن الآلي أو ماصة الأقنية تبعاً لمقياس التجربة. ضمان لإضافة سلبية ([دمس]) ومراقبة إيجابية (يجند معروفة) إلى عدة آبار في كل لوحة المقايسة. أن هذا مقايسة تحول حراري، فمن الضروري أن يتجاوز تركيز مركب ثابت التفكك لمراقبة الاستقرار البروتين. وهكذا، توجيهي الخام لتركيز مركب مرات 50-100 IC50، ولكن تم العثور على المزيد من التفاصيل أوصاف لتركيزات المركب في جزء المناقشة.
ملاحظة: ينبغي اختبار قابلية التحمل [دمس] خطوط الخلية قبل التجربة. - ختم ختم لوحة المقايسة المعالجة بالمجمع مع لوحة تنفس واحتضانها في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة هوميديفيد لمدة 30 دقيقة.
3-الحرارة التحدي
- أولاً، تعيين حمام المياه إلى درجة الحرارة المطلوبة. علما بأن درجة الحرارة النهائي هو التوصل إلى داخل الآبار التي بليت بالانزيم يمكن أن تكون مختلفة عن درجة الحرارة النهائية في حوض ماء. التحقيق الإزاحة مسبقاً مع مقياس حرارة الحرارية ولوحة الطباعة. عادة ما يستغرق 30 دقيقة للحمام يستقر عند درجة الحرارة المطلوبة.
- للتحقق من أن يتم التوصل إلى درجة الحرارة المطلوبة في آبار لوحة الفحص أثناء الخطوة تدفئة، إعداد صفيحة دمية الغلق التي تحتوي على نفس الحجم من المتوسطة كلوحة المقايسة.
- إزالة لوحات الفحص من الحاضنة. خلع خاتم تنفس وإعادة ختم لوحة الفحص التي تحتوي على الخلايا المعالجة بالمجمع مع إحباط ألومنيوم لاصقة ضيقة لضمان أنه لا توجد مياه سوف تسرب إلى الآبار أثناء التسخين اللاحق في حوض ماء. التأكد من وجود حفر ثقوب في إطار لوحة موجوداً.
- ضع لوحة المقايسة ولوحة الطباعة في حمام المياه في الجزء السفلي من لوحة الزاوية نحو سطح الماء لإجبار أي الهواء المتبقية خارج من تحت اللوحات.
- رصد درجة الحرارة داخل الآبار من لوحة الطباعة الجديدة باستخدام مقياس حرارة الحرارية.
- الحرارة لوحة الفحص في حمام الماء لمدة 3 دقائق. نقل فورا إلى المقايسة ولوحة الطباعة إلى آخر حمام المياه مع المياه خفف من الغرفة ليبرد لمدة 5 دقائق. لوحة المقايسة جاهز الآن لمزيد من المعالجة.
4-التثبيت
- الاستغناء عن 10 ميليلتر 16% (w/v) بارافورمالدهيد (PFA) مباشرة إلى لوحة الفحص باستخدام موزع كاشف الأكبر أو بيبيت الأقنية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: بعض المصفف تصنف على أنها مسببة للسرطان، وينبغي أن يتبع قواعد السلامة المؤسسية. - نضح الحل منهاج عمل بيجين وغسل الخلايا مع 300 ميليلتر PBS باستخدام غسالة لوحة. ضع اللوحة في لوحة الغسالة وحدد البرنامج الطموح.
ملاحظة: هذا الإجراء قد تم تحسين استخدام بروتوكول منطقة تجاوز سعة في لوحة الغسالة الذي هو السائل في الوقت ذاته الاستغناء عن وإزالة. إذا لم يتوفر لوحة الغسالة أو إجراء مشابه، يمكن بدلاً من ذلك أن يتم خطوة الغسيل يدوياً. - اليدوية الغسيل الداخلي: إزالة السائل من الآبار بعكس اللوحة مع تطور يد سريع عبر علبة النفايات أو بالوعة. إزالة كاملة من السائل ضروري للأداء الجيد. إضافة ميليلتر 80 من برنامج تلفزيوني مع ماصة متعددة القنوات وعكس اللوحة مرة أخرى كما هو موضح أعلاه، كرر الإجراء الغسيل مرتين. بعد الغسيل الأخير، لطخة اللوحة ضد مناشف ورقية نظيفة لإزالة أي سوائل زائدة.
5-بيرميبيليزيشن
- إضافة 20 ميليلتر من 0.1% (v/v) NP-40 إلى الآبار مع بيبيت الأقنية واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. غسل الخلايا باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4، 2).
- وبدلاً من ذلك، عند الاقتضاء، تطبيق مستضد استرجاع بروتوكولا، مثلاً:
- إضافة 20 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 1% إلى الآبار مع بيبيت الأقنية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وتغسل وفقا لنفس الإجراءات المذكورة أعلاه (الخطوة 4، 2).
- إضافة 80 ميكروليتر من 10 مم جليكاين في الرقم الهيدروجيني 7.2 واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح جليكاين الحل باستخدام غسالة لوحة بوضع على لوحة الغسالة وتحديد البروتوكول الطموح. انظر الملاحظات في 2.1 و 4.2 إذا لم يتوفر غسالة لوحة.
6-حظر
- إضافة 15 ميليلتر من 1% (w/v) ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني للآبار باستخدام موزع كاشف الأكبر أو بيبيت الأقنية. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع ختم لوحة رقائق ألومنيوم.
7-الابتدائي جسم
- نضح الحل حظر استخدام غسالة لوحة بوضع على لوحة الغسالة وتحديد البروتوكول الطموح. انظر الملاحظات في 2.1 و 4.2 إذا لم يتوفر غسالة لوحة.
- إضافة 10 ميليلتر من جسم الابتدائي تضعف تبعاً لذلك في 1% (w/v) جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني للآبار باستخدام بيبيت الأقنية. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع ختم لوحة رقائق ألومنيوم.
8-ثانوية جسم
- نضح الحل جسم الأولية وغسل الآبار وفقا لنفس الإجراء كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4، 2).
- إضافة 10 ميليلتر من جسم الثانوي 488 أليكسا تضعف تبعاً لذلك في 1% (w/v) جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ختم اللوحة مع ختم إحباط ألومنيوم لاصقة لحماية من الضوء.
ملاحظة: حماية لوحة من الضوء خلال هذا والخطوات اللاحقة.
9-النووية تلطيخ وقناع الخلية
- إضافة 10 ميليلتر من الصبغة النووية المخفف إلى 0.05 مغ/مل في برنامج تلفزيوني للآبار باستخدام بيبيت الأقنية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق إضافية.
- نضح بجسم الثانوي وحل هويشت وغسل الآبار باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4، 2).
- إضافة 10 ميليلتر من قناع خلية مخفف إلى 200 نانوغرام/مل في برنامج تلفزيوني للآبار باستخدام بيبيت الأقنية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- نضح الحل قناع الخلية وغسل الآبار باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح أعلاه (الخطوة 4، 2).
- الاستغناء عن 60 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لجميع الآبار باستخدام لوحة الغسالة أو موزع كاشف الأكبر بيبيت الأقنية، وختم اللوحات مع رقائق ألومنيوم لاصقة.
10-صورة اقتناء وتحليل
- التقاط الصور في تصوير محتوى عالية استخدام قنوات فلورسنت 3: DAPI (387/447)، والتجارة والنقل (472/520)، وتيكساسريد (562/624). الحصول على صور 4 الواحدة وكذلك استخدام 10 X الهدف. استخدام الليزر الآلي ضبط تلقائي للصورة، وتطبيق binning 2 خلال اقتناء. تخزين الصور كملفات tiff بمقياس 16 بت، الرمادي جنبا إلى جنب مع بيانات التعريف.
- تحليل الصور باستخدام البرمجيات المتاحة. تحديد حدود الخلية باستخدام خوارزمية "خلية التهديف" مع DAPI (نواة) وتيكساسريد (السيتوبلازم).
- استخراج متوسط كثافة لجميع الأطوال الموجية المكتسبة للمزيد من تحليل البيانات.
- حساب Z-عامل لضمان متانة المقايسة.
- حساب الاستقرار % باستخدام الصيغة التالية: 100 * (1-(كثافة جيدا – مراقبة سلبية متوسط كثافة جيدا)/(متوسط كثافة إيجابية تحكم-متوسط كثافة المراقبة السلبية)). هنا هو مراقبة سلبية [دمس] والتحكم الإيجابي هو مادة مرجعية. نظراً لتثبيت الحد الأقصى بين المركبات يمكن أن تختلف وفي الواقع أن تكون أكبر من عنصر التحكم الإيجابي للمنحنيات إيتدرف، كثافات تثبيت الحد الأقصى والحد الأدنى لكل مجمع تستخدم أحياناً بدلاً من قيم الكثافة لمراقبة الآبار .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويصف البروتوكول المبينة في الشكل 1 سير العمل الأساسي لتشغيل سيتسا فحوصات على خلايا ملتصقة بالكشف عن البروتين للذوبان المتبقية بتصوير المحتوى عالية. سير العمل هذا يمكن تكييفها بسهولة لجميع مراحل التطور الإنزيم عن طريق تعديل تخطيط لوحة من المركبات أو المواد الكاشفة14. ونحن بالتفصيل النتائج المتوقعة للعديد من المتوقع استخدام الحالات أدناه.
تحديد الأجسام المضادة والتنمية المقايسة. شرطا أساسيا لتحقيق نتائج ناجحة وهو تحديد جسم الأولية أو كاشف تقارب مناسبة أخرى يعترف بشكل انتقائي بالنموذج الأصلي من البروتين حضور البروتين وتجميعها، وسرع شكلت الحرارة خلال التحدي في الخطوة 3. إنشاء تحليل التصوير سيتسا الموصوفة هنا، نحن فحص فريق من 9 أجسام مضادة تستهدف p38α في 52 درجة مئوية لنافذة الإشارات بين عناصر إيجابية وأخرى سلبية. ثم أننا تيتراتيد أجسام أفضل، واستقر على الشروط المبينة في الشكل 2 أ ب مع الممثل الصور الفلورة ل p38α استقرت بها من يجند معروفة (مراقبة إيجابية) و [دمس] (مراقبة سلبية). كما ينبغي أن لم تنقطع الاعتراف بجسم بالتغييرات conformational من البروتين الهدف الذي قد يكون فعل يجند ملزمة (الشكل 2). على سبيل مثال، BIRB796 طويلة قبالة معدل، والتقدير الكمي لمشاركة الهدف لم يكن ممكناً إلا بتطبيق خطوة استرجاع مستضد (5.2؛ الشكل 2D). من المهم التحقق من صحة أداء جسم الأولية مع يغاندس المعروفة التي تغطي مواقع ربط مختلفة من البروتين المستهدف إذا كان متوفراً. ويتم التحقق من صحة جسم يفضل على حد سواء مع ودون خطوة استرجاع مستضد.
Tagg ومنحنيات إيتدرف. وكما ذكر أعلاه، يمكن تشغيل تجارب سيتسا في وضعين مختلفين، ومنحنياتagg تي والتجارب إيتدرف. كلا الخيارين استخدام نفس البروتوكول الأساسية المبينة في الشكل 1 ، وفي قسم البروتوكول. في الإعداد الأولى، يهدف إلى تحدي الخلايا بتدرج درجة الحرارة وقارن منحنياتagg تي في وجود وغياب تركيز واحد من يجند. لإجراء منحنىagg T، يتم تسخينها لوحات منفصلة لمدة 3 دقائق عبر مجموعة من درجات الحرارة. في إجراء هذه التجربة، من المهم أن الوقت طول العلاج المركب لكل لوحة مع الوقت المستغرق لحمام الماء لتحقيق الاستقرار في درجة حرارة جديدة. وفي هذا الصدد، تنفيذ خطوة التحدي الحرارة في حوض ماء تستغرق وقتاً طويلاً أكثر من التدفئة الأنابيب في جهاز PCR. المسار التجريبي إلى منحنيات استجابة تركيز التشغيل القادم يجند في درجة حرارة ثابتة لإنشاء منحنيات إيتدرف. بشكل عام، عند اختبار مركبات متعددة، تعد المقايسة لوحات جاهزة لإضافة مجمع باستخدام الآلي معالجة السائل لتحقيق البيانات الأكثر استنساخه. المركبات تضعف متسلسل في [دمس] وحل ثم في خلية ثقافة الإعلام مع التركيزات المطلوبة. لدينا عادة اختبار 11 نقطة تركيز سلسلة بدءاً من 50-100 ميكرومتر في 3 أو 4 إضعاف إضعاف، ولكن هذا يعتمد على فاعلية يغاندس المستخدمة. وينصح أولاً إنشاء منحنىagg تي في غياب وحضور يجند وتحديد درجة الحرارة لتجارب متحاور اللاحقة حيث يمكن ملاحظة تحول بين المنحنيات. ينبغي أن تكون درجة الحرارة المحددة حول أو فوق تيagg. كلا صيغ تسمح بتأكيد المشاركة المستهدفة ولكن لترتيب الانتماءات مجمع إيتدرف التجارب غالباً أكثر مناسبة. ويبين الشكل 3 ألف مثالاً على النتائج الكمية المتوقعة لمنحنىagg تي ويوضحها الشكل 3B نتائج تجربة إيتدرف نموذجية.
فحص الحملة. البروتوكول أيضا يمكن تكييفها لفحص حملات من أجل تحديد موثقات رواية من البروتين الهدف. وفي هذه الحالة، يتم تطبيق الحرارة متحاور التحديات لعدد كبير من المركبات بتركيز واحد متبوعاً بتجارب إيتدرف للمركبات الاستقرار التي تم تحديدها. إعداد لوحات الفحص جاهزة المقايسة، ونقل المركبات تضعف في ثقافة وسائل الإعلام إلى لوحات الفحص الآلي مناولة السائل باستخدام. كما هو الحال مع جميع فحوصات الثبات الحراري، من الضروري أن تتجاوز ثابت التفكك لمراقبة الاستقرار البروتين، وهكذا المطبقة لدينا مكتبات جزيء صغير في 50 ميكرومتر لتسهيل التعرف على ضرب. فرز من يضرب باستخدام إيتدرف سيسمح لاحقاً ترتيب وتحديد الأولويات لهذه المركبات. ويبين الشكل 4 نتيجة ممثل من لوحة فرز.
الشكل 1 . نظرة عامة التخطيطي البروتوكول الموصوفة في هذا المقال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . جسم تطوير الهوية والمقايسة. أ) بيانات المثال للكشف عن p38α البشرية في الخلايا A-431. الصور التمثيلية الإيجابية (1 ميكرومتر AMG548) وسلبية ([دمس]) عناصر التحكم. الأحمر-تلطيخ هويشت النووية، تلطيخ p38α الأخضر. الصور التي اتخذت مع 10 X التكبير؛ شريط مقياس اللون الأبيض يمثل 73 ميكرومتر. ب) مثال للبيانات الكمية معبراً عنها بمتوسط كثافة/خلية. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي لمتوسط replicates 16 6 لوحات منفصلة. كانت ساخنة كل لوحة إلى 52 درجة مئوية في حمام مائي متبوعاً بتثبيت الخلايا وبيرميبيليزيشن وإيمونوستينينج لاحقاً. قياس كثافة إشارة الفلورة ج) بعد علاج الخلايا A-431 مع 1 ميكرومتر BIRB796 أو [دمس] كما هو موضح أعلاه يتبع مباشرة من قبل التثبيت. نظراً لغياب خطوة تدفئة، إشارة BIRB796 أقل من الإشارة [دمس]، مما يوحي بأن يعطل BIRB796 الكشف عن p38α مع هذه الأجسام المضادة. د) منحنياتسيتسا إيتدرف للخلايا تعامل مع BIRB796 أما مع (المثلث الأزرق) أو بدون بروتوكول استرجاع مستضد (مثلث رمادي). لقد تم تعديل هذا الرقم من اكسيلسون et al. عام 201812. حقوق الطبع والنشر عام 2018 الجمعية الأمريكية الكيميائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . تجارب التراكم الحراري وإيتدرف- A) تجارب منحنى التجميع الحرارية للخلايا تعامل مع إيجابية (1 ميكرومتر AMG548، اللون البرتقالي) وسلبية ([دمس] في الرمادي) عناصر التحكم. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي لمتوسط replicates 32 أو 464. ب) إيتدرفسيتسا تجربة أجريت في 52 درجة مئوية للخلايا تعامل مع تخفيف المسلسل SB203580 باللون الأزرق، سكيبينوني-L باللون الأخضر و RWJ67657 باللون الأحمر. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي لمتوسط 6 replicates. معبراً عنه بمتوسط كثافة/خلية البيانات الكمية وتطبيع ضد أعلى تركيز لكل مجمع. لقد تم تعديل هذا الرقم من اكسيلسون et al. عام 201812. حقوق الطبع والنشر عام 2018 الجمعية الأمريكية الكيميائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . الممثل نظرة عامة على لوحة الفرز في التكبير X 10- عناصر إيجابية (1 ميكرومتر AMG548) هي في الأعمدة 2 و 24 وعناصر سلبية ([دمس]) في العمودين 1 و 23. جميع آبار أخرى تحتوي على 50 ميكرون من مكتبة المركبات المستخدمة للفرز مع عدة مرات إلى. في أرقام اقحم، يمثل خط أبيض في الزاوية اليمنى السفلي 200 ميكرومتر. لقد تم تعديل هذا الرقم من اكسيلسون et al. عام 201812. حقوق الطبع والنشر عام 2018 الجمعية الأمريكية الكيميائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما تمت مناقشته في المقطع النتائج، هناك العديد من الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء. أولاً، من المهم التعرف كاشف تقارب عالية الجودة. نوصي بفحص مكتبة صغيرة من الأجسام المضادة لكل من الهدف المنشود. بعد أن تم تحديد جسم الأولية، من المهم أيضا التحقق من صحة النظام لعدد من المواقع المختلفة ملزمة البروتين الهدف إذا كان ذلك مناسباً. ويعد الفحص مكافحة للمركبات التي تتداخل مع الإشارات المقايسة كما هو مبين في الشكل 2 بحذف التحدي الحرارة تشجيعا كبيرا. عندما يلاحظ إشارة انخفاض في وجود يجند، يمكن أن يكون اختبار بروتوكولا استرجاع مستضد كما هو موضح في الخطوة 5، 2. يمكن أن يسبب تدفئة متفاوتاً من الألواح تقلبات وتغيرات لوحة إلى لوحة في البيانات المرصودة. منذ اللوحات مغمورة جزئيا في حمام مائي خلال تحدي الحرارة عابرة (الخطوة 3، 4) الآبار الخارجي من اللوحات معرضة للماء الساخن في الجزء السفلي من الآبار ولكن أيضا عن طريق الجدار الخارجي فحسب. قد يتسبب هذا ارتفاع درجة الحرارة خلال نفس الوقت غمر في الآبار الخارجي للوحة وآثار حافة اللوحة اللاحقة. ولذلك، يوصي بتجنب الآبار الخارجي اللوحة. ويمكن رؤية آثار مماثلة أيضا إذا فقاعات الهواء محاصرون تحت صفيحة أثناء الخطوة تدفئة منع الاتصال كافية بين الجزء السفلي من الآبار والمياه الساخنة. ونظرا للتحديات مع تدفئة لوحات التصوير، أجهزة ولوحات على وجه التحديد للتعرض للحرارة يمكن أن يساعد النهوض بهذا الأسلوب. نحن استكشاف استخدام عدة خطوط الخلايا، وقد وجدت تقلب في مرفق السطحية بعد تحدي الحرارة لأنواع الخلايا ملتصقة. التجارب الأولية في المختبر لدينا تشير إلى أنه يمكن تقليل استخدام مصفوفة الطلاء أو خارج الخلية مثل سينثيماكس الثاني-اتفاقية استكهولم أو الخلية-تاك مفرزة الخلية، ولكن هذا يمكن أن يشكل تحديا تقنيا عند استخدام أنواع الخلايا شبه المرفقة. حيث يتم تنفيذ العلاج المركب في الخلايا الحية، يجب أن تكون جزيئات صغيرة نفاذية الخلية. إذا لم يكن المجمع نفاذية الغشاء، يوصي بأساليب سيتسا بديلة عالية الإنتاجية. بعض المركبات تحتاج إلى تنشيط أيضي لربط تلك البروتينات الهدف11. وفي مثل هذه الحالات، يوصي بالخلايا المعالجة أطول مع المجمع قبل التحدي الحرارة.
ويتطلب هذا البروتوكول صفيحة واحدة من خلية البذر للتصوير يجعلها قابلة لإنتاجية عالية فحص الحملات. عدد الخلايا لكل تجربة أقل بكثير مما يمكن أن يتحقق مع البقع الغربية أو فحوصات الفاسكرين السابق15. وعلاوة على ذلك، إزالة الغسيل أو الخلية المفرزة الخطوات، التي قد تغير من توافر المركب وملزم،، الحفاظ على توازن المنشأة ملزمة من خلال خطوة التحدي الحرارة. خلافا للإجراءات السابقة، يقال في نفس الوقت عدم وجود إشارة بسبب سيتوتوكسيسيتي على طريق تلطيخ النووية. وأخيراً، تصوير يحافظ القرار المكانية من الخلايا الفردية، مما يسمح للقياسات المشاركة المستهدفة في المختلطة السكان من الخلايا أو الخلايا الدول.
لتقييم إمكانية تطبيق النهج حقاً، هناك حاجة إلى جهود متضافرة لتطبيق هذه التقنية عبر البروتين ذوبان. وستوضح هذه التجارب السهولة من تحديد الكواشف تقارب مناسبة، أي تقرير بشكل انتقائي على البروتين الأصلي حضور المتبقية التشويه والتحريف وتجميع البروتينات. حاليا لا نعرف كيف سيؤثر مستويات البروتين التعبير القدرة على قياس موثوق بها نافذة إشارات. نتوقع أن تعكس تقارب والانتقائية للأجسام المضادة المتاحة، ونتوقع أن تطبق التكنولوجيات المستخدمة لتعزيز الإشارات في فحوصات إيمونوفلوريسسينت للبروتينات وفيرة منخفضة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام المعلمة البروتينات أو مركبات فونكتيوناليزيد للكشف عن في الإصدارات المعدلة من بروتوكول وصف. هذا البروتوكول محدودة إلى الأهداف التي تذوب والتفاعلات حيث يمكن ملاحظة استقرار القابلة للقياس الكمي. على سبيل المثال، يمكن تثبيت يغاندس الذاتية بروتين في فحوصات الخلايا الحية، التي قد تحول دون تحقيق المزيد من الاستقرار بها يجند خارجية. على الرغم من أن لم تستكشف هنا، نعتقد أنه سيكون من الممكن لقراءات متعددة للسماح لدراسة أهداف متعددة في وقت واحد، أو هدفا مع المستجيبة المتلقين للمعلومات. إجراء المزيد من الدراسات ضرورية للتحقيق في هذه الجوانب من في الموقع سيتسا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا الكشف للتقرير.
Acknowledgments
الكتاب تقر دعم البنية التحتية من علوم الحياة مختبر ومعهد كارولينسكا. كما تقر المؤلفين الإدخال ومناقشات مع شهادتي ميكايلا، ماغدالينا أوتروكا وتوماس Lundbäck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
References
- Morgan, P., et al. Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).
- Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. The Economics of Reproducibility in Preclinical Research. PLOS Biology. 13 (6), e1002165 (2015).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Morgan, P., et al. Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival. Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).
- Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).
- Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H.
- Robers, M. B., et al. Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET. Nature Communications. 6, 10091 (2015).
- Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Jafari, R., et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).
- Almqvist, H., et al. CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil. Nature Communications. 7, 11040 (2016).
- Axelsson, H., et al. In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells. ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).
- Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA). Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).
- Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. Assay Guidance Manual [Internet]. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).
- Mateus, A., et al. Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).
