Summary
Roman, immun farvning-kompatible vævs clearing teknikker som den ultimative 3D-billeddannelse af solvent-clearede organer tillader 3D visualisering af rabiesvirus hjerneinfektion og dens komplekse cellulære miljø. Tykke, antistof-mærkede hjernevæv skiver er lavet optisk gennemsigtige for at øge billeddannelse dybde og for at muliggøre 3D-analyse af konfokale Laserscanning mikroskopi.
Abstract
Visualisering af infektions processer i væv og organer ved immunolabeling er en nøgle metode i moderne infektionsbiologi. Evnen til at observere og studere fordelingen, tropisme, og overflod af patogener inde i orgel væv giver afgørende data om sygdomsudvikling og progression. Ved hjælp af konventionelle mikroskopi metoder, immunolabeling er for det meste begrænset til tynde sektioner opnået fra paraffin-indlejrede eller frosne prøver. Men det begrænsede 2D-billed plan af disse tynde sektioner kan føre til tab af vigtige oplysninger om den komplekse struktur af et inficeret organ og den cellulære sammenhæng af infektionen. Moderne multi farve, immun farvning-kompatible vævs clearing teknikker giver nu en relativt hurtig og billig måde at studere høj-volumen 3D-billede stakke af virus-inficerede orgel væv. Ved at udsætte vævet for organiske opløsningsmidler bliver det optisk gennemsigtigt. Dette svarer til prøvens brydningsindeks og fører i sidste ende til en signifikant reduktion af lysspredningen. Således, i kombination med lange fri arbejdsdistance mål, store vævs sektioner op til 1 mm i størrelse kan afbildet af konventionel confokal Laserscanning mikroskopi (clsm) ved høj opløsning. Her beskriver vi en protokol til at anvende dybvævs billeder efter vævs rydning for at visualisere rabiesvirus distribution i inficerede hjerner for at studere emner som virus patogenese, spredning, tropisme og Neuro invasion.
Introduction
Konventionelle histologi teknikker er mest afhængige af tynde sektioner af orgel væv, som i sagens natur kan give kun 2D indsigt i et komplekst 3D-miljø. Selv om det er muligt i princippet, kræver 3D-genopbygning fra serielle tynde sektioner krævende tekniske rørledninger til både udskæring og efterfølgende i silico-tilpasningen af de erhvervede billeder1. Desuden er problemfri rekonstruktion af z-volumener efter mikrotomen udskæring kritisk, da både mekaniske og beregningsmæssige artefakter kan forblive på grund af suboptimal billedregistrering forårsaget af ikke-overlappende billed planer, farvnings variationer og fysiske ødelæggelse af væv ved f. eks. Derimod muliggør ren optisk udskæring af intakte tykke vævsprøver erhvervelse af overlappende billed planer (oversampling) og letter dermed 3D-genopbygning. Dette er til gengæld yderst gavnlig for analysen af infektions processer i komplekse cellepopulationer (f. eks. neuronal netværk i forbindelse med de omgivende gliale og immunceller). Men iboende forhindringer af tykke vævs sektioner omfatter let spredning og begrænset antistof indtrængning i vævet. I de seneste år, en række teknikker er blevet udviklet og optimeret til at overvinde disse spørgsmål2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. målvævet er i det væsentlige blevet optisk gennemsigtigt ved behandling med enten vandig2,3,4,5,6,7 ,8,9 eller organiske opløsnings baserede10,11,12,13 opløsninger. Indførelsen af 3disco (3D-billeddannelse af solvent-clearede organer)11,12 og dets efterfølger udisco (Ultimate 3D-billeddannelse af solvent-clearede organer)13 leverede et relativt hurtigt, enkelt og billigt værktøj med fremragende clearing kapaciteter. De vigtigste bestanddele i clearing protokollen er de organiske opløsningsmidler tert-butanol (TBA), BENZYLALKOHOL (BA), benzylbenzoat (BB) og diphenyl ETHER (DPE). Udvikling og tilsætning af iDISCO (immunolabeling-aktiveret 3D-billeddannelse af solvent-clearede organer)14, en kompatibel immunofarvnings protokol, udgjorde en anden fordel i forhold til eksisterende metoder og aktiverede dybvævs mærkningen af antigener af interesse, samt langtidsopbevaring af immunofarvede prøver. Således, kombinationen af iDISCO14 og udisco13 giver mulighed for høj opløsning billeddannelse af antistof-mærkede proteiner i store vævs sektioner (op til 1 mm) ved hjælp af konventionelle clsm.
Bevarelsen af et organs komplekse struktur i alle tre dimensioner er særlig vigtig for hjernevæv. Neuroner udgør en meget heterogen cellulær delpopulation med meget forskelligartede 3D-morfologier baseret på deres neurite-projektioner (gennemgået af masland15). Desuden består hjernen af en række rum og delrum, der hver består af forskellige cellulære delpopulationer og forhold heraf, herunder gliale celler og neuroner (gennemgået af von Bartheld et al.16). Som en Neuro Tropic virus, den rabiesvirus (rabv, gennemgået af fooks et al.17) primært inficerer neuroner, ved hjælp af deres transport maskiner til at rejse i tilbage retning langs axoner fra det primære sted for infektion til centralnervesystemet (CNS). Den protokol, der er beskrevet her (figur 1A), giver mulighed for immun farvning-assisteret detektion og visualisering af RABV-og rabv-inficerede celler i store, sammenhængende billedstakke opnået fra inficeret hjernevæv. Dette muliggør en objektiv, 3D høj opløsning vurdering af infektionen miljø. Det gælder for hjernevæv fra en række forskellige arter, kan udføres umiddelbart efter fiksering eller efter langtidsopbevaring af prøver i PARAFORMALDEHYD (PFA), og tillader opbevaring og genindførsel af farvede og ryddede prøver i måneder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RABV-inficerede, PFA-Fixed arkiveret hjernemateriale blev brugt. De respektive dyreeksperimentelle undersøgelser blev evalueret af den ansvarlige dyrebeskyttelses-, brugs-og etiske komité under statens kontor for landbrug, fødevaresikkerhed og fiskeri i Mecklenburg-Vorpommern (LALFF M-V) og fik godkendelse med tilladelser 7221.3-2.1-002/11 (mus) og 7221.3-1-068/16 (fritter). Den almene omhu og de metoder, der blev anvendt i dyreforsøgene, blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer.
Forsigtig: denne protokol anvender forskellige giftige og/eller skadelige stoffer, herunder PFA, methanol (MeOH), hydrogenperoxid (H2O2), natriumazid (Nan3), TBA, BA, BB og DPE. MeOH og TBA er meget brandfarlige. Undgå udsættelse ved at bære passende personlige værnemidler (en laboratorie frakke, handsker og øjenværn) og gennemføre eksperimenter i en stinkhætte. Indsaml affaldet separat i passende beholdere, og smid det ud i henhold til lokale regler. Rabies virus klassificeres som et biosikkerhedsniveau (BSL)-2-patogen og kan derfor generelt håndteres under BSL-2-betingelser. Nogle aktiviteter, herunder procedurer, der kan generere aerosoler, arbejde med høje virus koncentrationer eller arbejde med nye Lyssavira, kan kræve BSL-3-klassifikation. Profylakse før eksponering anbefales til højrisiko personale, herunder dyrecaretakers og laboratoriearbejdere18,19. Se de lokale myndigheder.
1. fiksering af hjernevæv og skæring
- Fastgør hjerne prøverne i et passende volumen på 4% PFA i fosfat-bufferet saltvand (PBS [pH 7,4]) i mindst 48 h ved 4 °C (med et omtrentligt væv-til-fixativ forhold på 1:10 [v/v]).
- Vævsprøverne vaskes 3x i PBS i mindst 30 min. hver vask og opbevares i 0,02% NaN3/PBS ved 4 °c indtil brug.
- Afsnit vævet i 1 mm-tykke sektioner ved hjælp af en vibratome (klinge feed rate: 0,3 – 0,5 mm/s, amplitude: 1 mm, Skive tykkelse: 1.000 μm).
- Opbevar hver vævs sektion separat i en brønd af en multiwell Cell-kultur plade for at beholde den korrekte udsnitssekvens. Tilsæt 0,02% NaN3/PBS og opbevar vævs sektionerne ved 4 °c indtil brug.
2. prøve forbehandling med methanol
Bemærk: Udfør alle inkubations trin med blid svingning og, hvis det ikke er angivet på anden måde, ved stuetemperatur. Beskyt prøverne mod lys. Prøve forbehandlingen tjener det overordnede formål at forbedre antistof diffusion og reducere vævs autofluorescens ved udsættelse for MeOH og H2O2, henholdsvis14.
- Forbered 20% (v/v), 40%, 60% og 80% MeOH-opløsninger i destilleret vand. For eksempel, for 20% MeOH tilsættes 10 mL 100% MeOH til 40 mL destilleret vand i et passende forseglbart fartøj og blandes ved at invertere det.
- Prøverne overføres til fartøjer med rimelig størrelse (f. eks. 5 mL reaktions slanger). Vær forsigtig med at bruge materialer, der er kemisk resistente over for reagenserne i denne protokol. For eksempel, Bemærk, at mens polypropylen er egnet, polystyren er ikke.
Bemærk: volumen specifikationerne i denne protokol refererer til 5 mL reaktions slanger. Hvis der anvendes et andet fartøj, justeres lydstyrken i overensstemmelse hermed. - Prøverne inkubates i 4 mL af hver koncentration af den forberedte serie af MeOH-opløsninger i stigende rækkefølge for hver 1 time.
- Inkubere prøverne 2x for 1 h hver i ren (100%) MeOH.
- Prøverne afkøles til 4 °C (f. eks. i et laboratorium-sikkert køleskab).
- Forbered blegning opløsning (5% H2o2 i MeOH) af, for eksempel, fortynding en 30% H2O2 stamopløsning ved 1:6 i ren (100%) MeOH, og chill det ved 4 °C.
- Fjern 100% MeOH fra køle prøverne og tilsæt 4 mL forkølet blegning opløsning (5% H2O2 i MeOH). Inkuber natten over ved 4 °C.
- Den blege opløsning omveksle til 4 mL 80% MeOH og Inkuber i 1 time. Fortsæt med at bruge den forberedte serie af MeOH-opløsninger i faldende rækkefølge for 1 h hver, indtil prøverne er inkuberet i 1 time i 4 mL 20% MeOH.
- Prøverne 1x vaskes i 1 time med 4 mL PBS.
3. immun farvning
Bemærk: Udfør alle inkubations trin med blid svingning og, hvis det ikke er angivet på anden måde, ved stuetemperatur. Beskyt prøverne mod lys. For at forhindre mikrobiel vækst tilsættes NaN3 til en endelig koncentration på 0,02% til løsningerne i dette afsnit. Vævsprøver er yderligere permeabiliseret ved behandling med nonioniske rengøringsmidler Triton X-100 og Tween 20. Normalt serum anvendes til at blokere uspecifik antistof binding. Glycin og heparin tilsættes for at reducere den immunolabeling baggrund14.
- Prøverne vaskes 2x for 1 t hver i 4 mL 0,2% Triton X-100/PBS.
- Permeabilize prøverne i 2 dage ved 37 °C med 4 mL 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0,3 M Glycin/PBS.
- Bloker den uspecifikke binding af antistoffer ved at inkube prøverne i 2 dage ved 37 °C i 4 mL 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% normal serum/PBS.
Bemærk: Brug normalt serum fra samme art det sekundære antistof blev oprejst for at opnå ideelle blokerende resultater. - Prøverne inkubates i 2 mL primær antistof opløsning (3% normalt serum/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 med heparin] + primært antistof/antistoffer) i 5 dage ved 37 °C. Genopfrisk den primære antistof opløsning efter 2,5 dage.
- For PTwH rekonstruere heparin natriumsalt i destilleret vand for at lave en 10 mg/mL stamopløsning (Opbevar denne opløsning, angivet ved 4 °C). Stamopløsningen tilsættes 0,2% Tween 20/PBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL.
Bemærk: det kan kræve optimering at vælge den korrekte antistof fortynding. Generelt er standard immunhistokemisk koncentrationer et godt udgangspunkt.
- For PTwH rekonstruere heparin natriumsalt i destilleret vand for at lave en 10 mg/mL stamopløsning (Opbevar denne opløsning, angivet ved 4 °C). Stamopløsningen tilsættes 0,2% Tween 20/PBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL.
- Prøverne vaskes i 1 dag i 4 mL PTwH, og vaskebufferen ombytter mindst 4X – 5x i løbet af dagen, og den sidste vask overnatter.
- Prøverne inkubates i 2 mL sekundær antistof opløsning (3% normalt serum/PTwH + sekundært antistof/antistoffer) i 5 dage ved 37 °C. Genopfrisk den sekundære antistof opløsning efter 2,5 dage.
- Det sekundære antistof/antistoffer fortyndes ved 1:500 i sekundær antistof opløsning (dvs. 4 μL i 2 mL).
- Prøverne vaskes i 1 dag som beskrevet i trin 3,5, så den sidste vask overnatter.
4. nuklear farvning
Bemærk: Udfør alle inkubations trin med blid svingning og, hvis det ikke er angivet på anden måde, ved stuetemperatur. Beskyt prøverne mod lys. Hvis ingen nuklear farvning er påkrævet, eller excitation bølgelængde/emission spektrum af til-PRO-3 er nødvendig for excitation eller påvisning af en anden fluorophore, springe dette trin.
- Nukleinsyre-pletten fortyndes til-PRO-3 ved 1:1.000 i PTwH, og prøverne inkubates i 4 mL nuklear farvningsopløsning i 5 timer.
- Prøverne vaskes i 1 dag som beskrevet i trin 3,5, så den sidste vask overnatter.
Bemærk: efter skylningen kan prøverne opbevares i PBS ved 4 °C indtil optisk clearing.
5. vævs rydning
Bemærk: Udfør alle inkubations trin med blid svingning og, hvis det ikke er angivet på anden måde, ved stuetemperatur. Beskyt prøverne mod lys. Vævsprøverne er dehydrerede i en graderet serie af TBA-opløsninger. Da immun farvning kræver vandige opløsninger, skal alle farvnings procedurer være færdige før vævs rydning. Optisk clearance og refraktiv indeks matchning opnås ved behandling med en blanding af BA, BB og DPE. Clearing løsning er suppleret med DL-α-tocopherol som en antioxidant13.
- Forbered 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% og 96% TBA-opløsninger i destilleret vand. For eksempel, for 30% TBA tilsættes 15 mL 100% TBA til 35 mL destilleret vand i et passende forseglbart fartøj og blandes ved invertering.
Bemærk: TBA har et smeltepunkt på 25 – 26 °C; således, det har en tendens til at være solid ved stuetemperatur. For at tilberede TBA-opløsninger opvarmes den velforseglede flaske ved 37 °C i en inkubator eller et vandbad. - Prøverne dehydreres med 4 mL af hver koncentration af den forberedte serie af TBA-opløsninger i stigende rækkefølge for hver 2 h. Efterlad 96% TBA på natten.
- Dehydrat prøverne yderligere i ren (100%) TBA for 2 timer.
- Forbered clearing løsning BABB-D15.
Bemærk: BABB-D15 er en kombination af BA og BB (BABB), som blandes med DPE i et forhold på x: 1, hvor x er angivet i løsningens navn, i dette tilfælde 15.- For BABB blandes en-del BA med to dele BB.
- Bland BABB og DPE med et forhold på 15:1.
- Tilsæt 0,4 vol% DL-α-tocopherol (vitamin E).
Bemærk: for eksempel, for 20 mL BABB-D15, blandes 6,25 mL BA med 12,5 mL BB. Tilsæt 1,25 mL DPE og supplere det med 0,08 mL DL-α-tocopherol.
- Fjern prøverne i clea Rings opløsningen, indtil de er optisk gennemsigtige (2 – 6 timer).
- Prøverne kan opbevares ved 4 °C i BABB-D15, beskyttet mod lys, indtil montering og billeddannelse.
6. montering af prøve
- Brug en 3D-printer til at udskrive billed kammeret og låget (materiale: copolyester [CPE], dyse: 0,25 mm, laghøjde: 0,06 mm, vægtykkelse: 0,88 mm, vægtælling: 4, infill: 100%, ingen støttestruktur; den tilsvarende. STL-filen findes i de supplerende materialer i denne protokol).
- Saml billed kammeret (figur 2).
- Monter en rund dækseddel (diameter: 30 mm) på billed kammeret med RTV-1 (en-komponents rum-temperatur-vulkanisering) silikone gummi. Fjern den overskydende silikone gummi med en vand-furet vatpind og helbrede natten.
- Monter en rund dækseddel (diameter: 22 mm) på låget med RTV-1 silikone gummi. Fjern den overskydende silikone gummi med en vand-furet vatpind og helbrede natten.
- Placer prøven i et billed kammer, tilsæt en lille mængde BABB-D15, og Indsæt låget. Fyld kammeret op med BABB-D15 gennem indløbet, ved hjælp af en hypodermic nål (27 G x 3/4 tommer [0,40 mm x 20 mm]).
- Tilslut indløbet og forsegl billed kammeret med RTV-1 silikone gummi. Helbrede natten i mørket.
7. billeddannelse og billedbehandling
- Konfigurer billed anskaffelsen ved at vælge de respektive laserlinjer, så de passer til de anvendte fluorophorer. Juster detektionsintervallerne for hver detektor for at forhindre signal overlap mellem kanaler.
Bemærk: eksemplariske detektionsintervaller for Alexa fluor 488, Alexa fluor 568 og TO-PRO-3 er henholdsvis 500 – 550 nm, 590 – 620 nm og 645 – 700 nm. - Vælg anskaffelses parametrene, Definer den øvre og nedre grænse for z-stakken, og Hent billed stakken.
Bemærk: eksemplariske anskaffelses parametre er en sekventiel scanning med en pixelstørrelse på 60-90 nm, en z-trins størrelse på 0,5 μm, en linje gennemsnit på 1, en scanningshastighed på 400 Hz og en pinhole størrelse på 1 luftig enhed. - Behandl billed stakken ved hjælp af passende billedanalyse software (f. eks. Fiji) for at generere 3D-projektioner eller udføre dybtgående analyser.
Bemærk: på grund af den store størrelse af de erhvervede billedfiler, brug af en arbejdsstation er normalt nødvendigt.- Åbn anskaffelses-eller billedfilen (-erne) i Fiji (fil | Åben | Vælg filer).
- Hvis du f. eks. LIF-filer, skal du vælge eller fravælge de ønskede indstillinger i dialogvinduet bio-formats. Vis stak med hyperstack. Andre end at, ingen specifikke valg eller flåter er nødvendige. Tryk på OK.
- Hvis filen indeholder flere billedstakke, skal du vælge dem, der skal analyseres, og bekræfte ved at trykke på OK.
- Udfør blege korrektion ved at opdele det flettede billede i individuelle kanaler (billede | Farve | Kanal værktøj, og vælg derefter mere | Opdelte kanaler). For hver kanal skal du vælge blege korrektion (billede | Juster | Blege korrektion) og vælg simpelt forhold (baggrunds intensitet: 0,0).
Bemærk: i nogle tilfælde, for eksempel, når der ikke er lineær forfald af signalet eller signalet er for svagt samlet, kan simple forhold mislykkes. Alternativt kan du prøve eksponentiel pasform eller springe blege korrektionen over. - Juster lysstyrken og kontrasten for hver kanal ved hjælp af skyderne (billede | Juster | Lysstyrke | Kontrast).
- Flet kanalerne (billede | Farve | Flette kanaler), skal du oprette en sammensat (billede | Farve | Kanal værktøj, og vælg derefter mere | Gør sammensat), og konvertere det til RGB-format (billede | Farve | Kanal værktøj, og vælg derefter mere | Konverter til RGB).
- Hvis det er nødvendigt, skal du ændre størrelsen på billed stakken for at reducere beregningstiden og filstørrelsen (billede | Juster | Størrelse, begge muligheder afkrydset plus bilineær interpolation).
- Generer en 3D-projektion (billede | Stakke | 3D-projekt). Vælg lyseste punkt som projektionsmetode, og Indstil udsnitsafstanden, så den svarer til z-trinens størrelse på den erhvervede billedstak. Indstil rotationsvinklen til 1 for at opnå maksimal kvalitet, og Aktivér interpolation. Rediger den samlede rotation, gennemsigtigheds tærskler og opacitet efter behov.
- Hvis det er nødvendigt, skal du justere kontrasten og lysstyrken ved at konvertere 3D-projektion tilbage til 8-bit-format (billede | Type | 8-bit). Brug de respektive skydere (billede | Juster | Lysstyrke | Kontrast) og Omkonvertere billed stakken til RGB-format som beskrevet i trin 7.3.4.
- Gem 3D-projektion som. TIF-fil (billedfilformat) og. AVI-fil (video filformat).
- Åbn anskaffelses-eller billedfilen (-erne) i Fiji (fil | Åben | Vælg filer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kombinationen af iDISCO14 og udisco13 kombineret med høj opløsning clsm giver dyb indsigt i den spatiotemporale opløsning og PLASTICITET af rabv infektion af hjernevæv og den omgivende cellulære kontekst.
Ved hjælp af immun farvning af rabv glycosyleret (P) kan komplekse lag af inficerede neuronale celler visualiseres i tykke dele af musehjerner (figur 3). Efterfølgende kan sømløse 3D-projektioner af de erhvervede billedstakke rekonstrueres (figur 3A, B, højre panel; Animeret figur 1). Der skal udvises forsigtighed ved brug af primære antistoffer fra og sekundære antistoffer mod de arter, som organ materialet hidrører fra. Brugen af anti-mus IgG antistoffer på mus hjernevæv resulterede i en tydelig farvning af det vaskulære system (figur 3B, venstre panel). På grund af den høje opløsning er billedet stakke erhvervet med, infektion kan vurderes op til en enkelt celleniveau (figur 4), tillader påstande om, for eksempel, overflod og fordeling af antigen i cellen (figur 4C ).
Bortset fra mus hjernevæv, kan protokollen også anvendes til hjernevæv fra andre dyrearter (f. eks, fritter) (figur 5; Animeret figur 2). Sektioner taget fra forskellige rum af en inficeret ilder hjerne afslørede en varierende grad af RABV infektion (figur 5a-D).
Da hjernen omfatter mange forskellige cellulære delpopulationer, er differentiering mellem disse populationer afgørende. Ved hjælp af antistoffer rettet mod celle markører er det muligt at vurdere den cellulære identitet af inficerede og tilstødende celler. For eksempel kan astrocytter differentieres via udtryk af glialfibrillært syreholdigt protein (GFAP) (figur 6A, C; Animeret figur 3), mens neurites kan være specielt plettet til microtubule-associeret protein 2 (MAP2) (figur 6B, D; Animeret figur 4). Samtidig, virale proteiner, i dette tilfælde, RABV nucleoprotein (N), kan være costained at vurdere forholdet mellem inficerede celler og den fremhævede cellulære subpopulation.
Figur 1 : Grundlæggende princip og arbejdsgang i protokollen. (A) grafisk gengivelse af arbejdsgangen baseret på protokollerne fra renier et al.14 og pan et al.13. (B) to eksemplariske Ferret hjerne skiver, en før (venstre panel) og en efter behandling med organiske opløsningsmidler (højre panel). Clearing forvandler vævet optisk gennemsigtigt som Observer Bart af den så læsbare tekst. Den ryddede hjerne skive er indlejret i et 3D-printet billed kammer (højre panel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Teknisk illustration af 3D-printet billed kammer. (A) eksploderet visning tegning af billed kammeret. De prik-stiplede linjer fremhæver komponenter, der skal monteres på hinanden ved hjælp af RTV-1 silikone gummi. De stiplede linjer repræsenterer instruktioner for den efterfølgende samling af kammeret. (B) CAD (Computer-Aided Design) fil af billed kammeret. Den tilsvarende. STL-fil til udskrivning af billed kammeret findes i de supplerende materialer. C) fuldt samlet billed kammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Deep-vævs billeder af RABV-inficerede muse hjernevæv. (A og B) mus blev inficeret med en rekombinant Rævs Street virus. RABV P farvning (grøn) afslører inficerede neuronal lag med store, viklet neurite fremskrivninger inde i det ryddet hjernevæv. Kerner blev modfarvet med til-PRO-3 (blå). (B) brugen af fluorophore-mærkede anti-mus IgG sekundære antistoffer (rød) på mus væv resulterer i en tydelig mærkning af det vaskulære system. 3D-genopbygningen af de erhvervede billedstakke gør det muligt at observere fra forskellige betragtningsvinkler (A og B, højre paneler). Skala stænger = 60 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Billed anskaffelse i høj opløsning gør det muligt at foretage komplekse vurderinger op til et enkelt celleniveau. Hjernen blev dissekeret fra en TRIST L16-inficeret mus. (A) Rabv P farvning (grøn) fremhæver en individuelt inficeret neuron. (B og C) detalje billeder og fremskrivninger viser, at der kan foretages dybtgående analyser af antigen tæthed,-fordeling og-lokalisering. Kerner blev modfarvet med til-PRO-3 (blå). Skala stænger = 20 μm (A), 5 μm (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Deep-vævs billeder af RABV-inficerede Ferret hjernevæv. Fritter blev smittet med canine Street RABV. (A–D) Skiver fra specificerede områder af hjernen blev taget, immun plettet for RABV P (grøn), og optisk ryddet. Prognoser viser, at de inficerede celler i forskellige dele af hjernen varierer i mængde og morfologi. Endvidere fremhæver de, at protokollen finder anvendelse på andre væv end muse-afledte. Kerner blev modfarvet med til-PRO-3 (blå). Skala stænger = 60 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Flerfarvet immunofluorescens gør det muligt at cofarvning af celle markører. Hjernevæv skiver fra fritter inficeret med canine Street RABV blev brugt og coimmunoplettet for RABV N (rød) og enten (A og C) GFAP (grøn) eller (B og D) MAP2 (grøn). Der henviser til, at GFAP er en astrocyt markør, MAP2 specifikt fremhæver neurites. Kerner blev modfarvet med til-PRO-3 (blå). (C og D) nederst er der afbildet enkelt udsnit af de optalte detalje visninger fra de flettede fremskrivninger. Skala stænger = 15 μm (A og B) 10 μm (C og D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Animeret figur 1:3D rekonstruktioner og detalje projektioner af billedstakke fra RABV-inficerede musehjerner. Fremskrivningerne blev genereret fra de billedstakke, der er beskrevet i figur 3. (A og C) animationer af hele de respektive z-stakke. (B) en detaljeret projektion af en 3D-rekonstruktion af en del af z-stakken af de områder, der er fremhævet i begyndelsen af videoen. D) en detaljeret projektion af et tomogram af en del af z-stakken af de områder, der er fremhævet i begyndelsen af videoen. Grøn = RABV P; rød = mus IgG; blå = kerner. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Animeret figur 2:3D rekonstruktioner af billede stakke erhvervet fra en RABV-inficerede Ferret hjerne. Fremskrivningerne blev genereret fra de billedstakke, der er beskrevet i figur 5. (A–D) Anmærkningerne refererer til den samme figur og beskriver de respektive områder af hjernen, som skiverne blev taget fra. Grøn = RABV P; blå = kerner. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Animeret figur 3: gradvis projektion af de forskellige kanaler af en 3D-rekonstruktion af en RABV-inficeret ilder hjerne costained med astrocyt markør GFAP. Fremskrivninger blev genereret fra den billedstak, der er beskrevet i figur 6A. Den gradvise tilsætning af kanaler starter med RABV N (rød), hvorefter følge cellekerner (blå) og endelig GFAP (grøn), mens subtraktion først fjerner RABV N, derefter cellekerner, og i sidste ende GFAP. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Animeret figur 4: gradvis projektion af de forskellige kanaler for en 3D-rekonstruktion af en RABV-inficeret ilder hjerne costained med neuronal MARKØR MAP2. Fremskrivninger blev genereret fra den billedstak, der er beskrevet i figur 6B. Den gradvise tilsætning af kanaler starter med RABV N (rød), hvorefter følge cellen kerner (blå) og endelig, MAP2 (grøn), mens subtraktion først fjerner RABV N, så cellen kerner, og i sidste ende MAP2. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genopblussen og yderligere udvikling af vævs clearing teknikker i de seneste år2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 har åbnet mange nye muligheder for at opnå høj volumen billede stakke af orgel væv. Dette gav en uovertruffen og kraftfuldt værktøj til at studere, blandt mange andre emner, virus infektion. Den efterfølgende 3D rekonstruktion af disse billedstakke muliggør sofistikerede påstande om, for eksempel, virus tropisme, overflod, og tidsforløbet af infektion. Denne protokol beskriver den immunolabeling-assisteret visualisering af RABV-infektion i solvent-clearede hjernevæv.
Der er flere kritiske trin i forberedelsen og erhvervelse af billedet stakke af immunolabeled, opløsningsmiddel-ryddet væv. Langvarig udsættelse for PFA kan maskere epitoper og dermed resultere i nedsat antigenicitet20,21,22. Det er derfor vigtigt at begrænse fikserings tiderne til det nødvendige minimum og overføre prøverne til en passende løsning (f. eks. PBS suppleret med 0,02% NaN3 til langtidsopbevaring). Men alle repræsentative billeder og fremskrivninger, der er tilvejebragt her, er erhvervet fra arkiverede hjerne prøver, hvoraf nogle var blevet opbevaret i PFA i ugevis, og fremhævede anvendeligheden af teknikken til organmateriale, der har været udsat for PFA for længere tid. Lignende resultater er blevet vist for humane hjerne prøver13. En anden, hvis ikke den mest, kritiske skridt er antistof inkubation. Antistofkoncentrationer skal vælges omhyggeligt. Mens i de fleste tilfælde, standard IHC koncentrationer er et godt udgangspunkt for Deep-vævs antistof mærkning, nogle antigener kan kræve yderligere optimering af antistofkoncentrationen. Denne protokol viser, at både RABV N og P let påvises ved de anvendte antistoffer. Mens MeOH forbehandling normalt forbedrer immunolabeling, nogle antigener er uforenelige med denne behandling. For dem, Renier og kolleger14 leverede en alternativ MeOH-fri prøve forbehandling. Analyse af de erhvervede billede stakke kræver tilstrækkelig Computational Power. På grund af de store filstørrelser på op til flere Gigabyte pr. stak er der brug for kraftige computere til at behandle billederne. Efter behandling omfatter ofte subtraktion af baggrundsstøj og en blege korrektion for at kompensere for anskaffelses relaterede blegning effekter. Ved måling af afstande, skal det erindres, at som en bivirkning, er vævet skrumpende under clearing processen.
Sammenlignet med andre mikroskopi platforme, som lysplade Fluorescens mikroskopi (LSFM) eller to-foton Laserscanning mikroskopi (2PLSM), CLSM har den mest begrænsede arbejdsafstand. Derfor er det nødvendigt at preslus organer til 1 mm i tykkelse til billeddannelse. Derudover, CLSM har den langsomste erhvervelse hastighed på grund af sin høje billeddannelse opløsning. Brugen af et lysark mikroskop ville give mulighed for hurtigere billeddannelse af større mængder op til helhjernebilleddannelse, samtidig med at man ofrer billedopløsningen. En anden begrænsning er den iboende forøgelse af vævs autofluorescens med faldende bølgelængde. Dette gør brugen af fluorophorer og farvestoffer ophidset af laser linje på 405 nm, herunder Hoechst farvestoffer, upraktisk umuligt.
Med hensyn til andre vævs clearing teknikker, hybrid af iDISCO14 og udisco13 kombinerer de mest positive egenskaber: det er meget kompatibelt med immun farvning, meget alsidig, forholdsvis hurtig og billig, det har fremragende clearing kapaciteter, og det er muligt med en standard confokale mikroskop. Desuden er denne protokol ikke begrænset til immun farvning og clearing af hjernevæv, men kan også anvendes til en række andre bløde væv og patogener, både Neuroinvasive og ikke-Neuroinvasive. Afslutningsvis, den protokol, der er beskrevet her, repræsenterer en rørledning til høj opløsning 3D-billeddannelse af RABV-inficerede hjernevæv. 3D rekonstruktioner af inficeret hjernevæv kan bruges til at besvare en række spørgsmål vedrørende RABV sygdomsprogression, patogenese, og Neuro invasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Thomas C. Mettenleiter og Verena te kamp for en kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Federal Excellence Initiative fra Mecklenburg Vorpommern og den europæiske social fond (ESF) Grant koinfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) og et murene forskningstilskud på Lyssavira på Friedrich-Loeffler-instituttet (Ri-0372).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H.
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al.
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).
- CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
