Summary
Nuove tecniche di sgombero dei tessuti immunostaining come l'ultima imaging 3D di organi autorizzati dai solventi consentono la visualizzazione 3D dell'infezione cerebrale da virus del virus della rabbia e del suo complesso ambiente cellulare. Le fette spesse di tessuto cerebrale etichettate con anticorpi sono rese otticamente trasparenti per aumentare la profondità di imaging e consentire l'analisi 3D mediante microscopia a scansione laser confocale.
Abstract
La visualizzazione dei processi di infezione nei tessuti e negli organi mediante immunoetichettatura è un metodo chiave nella moderna biologia delle infezioni. La capacità di osservare e studiare la distribuzione, il tropismo e l'abbondanza di agenti patogeni all'interno dei tessuti degli organi fornisce dati cardine sullo sviluppo e la progressione della malattia. Utilizzando metodi di microscopia convenzionali, l'immunoetichettatura è per lo più limitata a sezioni sottili ottenute da campioni conbloccati o congelati con paraffina. Tuttavia, il piano di immagine 2D limitato di queste sezioni sottili può portare alla perdita di informazioni cruciali sulla struttura complessa di un organo infetto e sul contesto cellulare dell'infezione. Le moderne tecniche di compensazione dei tessuti multicolore e immunostaining ora forniscono un modo relativamente veloce ed economico per studiare pile di immagini 3D ad alto volume di tessuto di organi infettati da virus. Esponendo il tessuto a solventi organici, diventa otticamente trasparente. Corrisponde agli indici di rifrazione del campione e alla fine porta a una significativa riduzione della diffusione della luce. Pertanto, in combinazione con obiettivi di lunga distanza di lavoro liberi, grandi sezioni di tessuto fino a 1 mm di dimensioni possono essere immagini dalla microscopia a scansione laser confocale convenzionale (CLSM) ad alta risoluzione. Qui, descriviamo un protocollo per applicare l'imaging dei tessuti profondi dopo la compensazione dei tessuti per visualizzare la distribuzione del virus della rabbia nei cervelli infetti al fine di studiare argomenti come la patogenesi del virus, la diffusione, il tropismo e la neuroinvasione.
Introduction
Le tecniche istologiche convenzionali si basano principalmente su sezioni sottili di tessuti di organi, che possono fornire intrinsecamente solo approfondimenti 2D in un ambiente 3D complesso. Anche se fattibile in linea di principio, la ricostruzione 3D da sezioni sottili seriali richiede tubazioni tecniche impegnative sia per il taglio che per il successivo allineamento in silico delle immagini acquisite1. Inoltre, la ricostruzione senza soluzione di continuità dei volumi z dopo il taglio dei microtomi è fondamentale in quanto gli artefatti meccanici e computazionali possono rimanere a causa della registrazione dell'immagine non ottimale causata da piani di immagine non sovrapposti, variazioni di colorazione e distruzione del tessuto, ad esempio, dalla lama del microtoma. Al contrario, la suddivisione ottica pura di campioni di tessuto spesso intatti consente l'acquisizione di piani di immagine sovrapposti (sovracampionamento) e, quindi, facilita la ricostruzione 3D. Questo, a sua volta, è altamente vantaggioso per l'analisi dei processi di infezione in popolazioni cellulari complesse (ad esempio, reti neuronali nel contesto delle cellule leali e immunitarie circostanti). Tuttavia, gli ostacoli intrinseci delle sezioni dei tessuti spessi includono la dispersione della luce e la limitata penetrazione degli anticorpi nel tessuto. Negli ultimi anni, una varietà di tecniche è stata sviluppata e ottimizzata per superare questi problemi2,3,4,5,6,7,8 , 9 (in vie , 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12 mila , 13. In sostanza, i tessuti bersaglio vengono trasformatiotticamente trasparenti mediante trattamento con ,8,9 o organicsolvente-based10,11,12,13 soluzioni. L'introduzione di 3DISCO (3D imaging di organi con cancellazione del solvente)11,12 e il suo successore uDISCO (ultima imaging 3D di organi autorizzati solventi)13 ha fornito uno strumento relativamente veloce, semplice e poco costoso con eccellenti capacità di compensazione. I principali costituenti del protocollo di compensazione sono i solventi organici tert-butanol (TBA), l'alcol benzyl (BA), il benzyl benzoato (BB) e l'etere difenile (DPE). Lo sviluppo e l'aggiunta di iDISCO (immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs)14, un protocollo di immunostaining compatibile, ha costituito un altro vantaggio rispetto ai metodi esistenti e ha permesso l'etichettatura dei tessuti profondi degli antigeni di interesse, nonché l'immagazzinamento a lungo termine di campioni immunostainsi. Pertanto, la combinazione di iDISCO14 e uDISCO13 consente l'imaging ad alta risoluzione di proteine con etichetta tura anticorpo in grandi sezioni di tessuto (fino a 1 mm) utilizzando CLSM convenzionale.
La conservazione della struttura complessa di un organo in tutte e tre le dimensioni è particolarmente importante per il tessuto cerebrale. I neuroni costituiscono una sottopopolazione cellulare molto eterogenea con morfologie 3D altamente diverse in base alle loro proiezioni neurite (riviste da Masland15). Inoltre, il cervello è costituito da un certo numero di compartimenti e sottocomparti, ciascuno composto da diverse sottopopolazioni cellulari e rapporti di essi, tra cui cellule gliali e neuroni (rivisto da von Bartheld et al.16). Come virus neurotropico, il virus della rabbia (RABV, recensito da Fooks et al.17) infetta principalmente i neuroni, utilizzando i loro macchinari di trasporto per viaggiare in retrogrado lungo gli assoni dal sito primario di infezione al sistema nervoso centrale (CNS). Il protocollo qui descritto (Figura 1A) consente il rilevamento e la visualizzazione assistita dall'immunostaining delle cellule infettate da RABV e RABV in grandi stack di immagini coerenti ottenuti da tessuto cerebrale infetto. Ciò consente una valutazione imparziale e 3D ad alta risoluzione dell'ambiente di infezione. È applicabile al tessuto cerebrale di una varietà di specie, può essere eseguito immediatamente dopo la fissazione o dopo lo stoccaggio a lungo termine di campioni in paraformaldeide (PFA), e consente lo stoccaggio e il reimaging di campioni macchiati e cancellati per mesi.
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Protocol
È stato utilizzato materiale cerebrale archiviato fissato in RABV, fissato pIS. I rispettivi studi sugli studi sugli animali sono stati valutati dal responsabile della cura degli animali, dell'uso e del comitato etico dell'Ufficio statale per l'agricoltura, la sicurezza alimentare e la pesca in Meclemburgo-Pomerania occidentale (LALFF M-V) e hanno ottenuto l'approvazione con autorizzazioni 7221.3-2.1-002/11 (topi) e 7221.3-1-068/16 (furetti). Le cure generali e i metodi utilizzati negli esperimenti sugli animali sono stati effettuati secondo le linee guida approvate.
AVVISO: Questo protocollo utilizza varie sostanze tossiche e/o nocive, tra cui PFA, metanolo (MeOH), perossido di idrogeno (H2O2),azide di sodio (NaN3), TBA, BA, BB e DPE. MeOH e TBA sono altamente infiammabili. Evita l'esposizione indossando adeguati dispositivi di protezione personale (un camice da laboratorio, guanti e protezione degli occhi) e conducendo esperimenti in un cofano di fumi. Raccogliere i rifiuti separatamente in contenitori appropriati e smaltirlo secondo le normative locali. Il virus della rabbia è classificato come patogeno a livello di biosicurezza (BSL)-2 e può, pertanto, essere generalmente gestito in condizioni di BSL-2. Alcune attività, tra cui procedure che possono generare aerosol, lavorare con alte concentrazioni di virus, o lavorare con nuovi lyssavirus, possono richiedere classificazione BSL-3. La profilassi pre-esposizione è consigliata per il personale ad alto rischio, compresi i custodi di animali e i lavoratori di laboratorio18,19. Fare riferimento alle normative degli enti locali.
1. Fissazione del tessuto cerebrale e sezionamento
- Fissare i campioni cerebrali in un volume appropriato del 4% di PFA nella salina con buffer fosfato (PBS [pH 7.4]) per almeno 48 h a 4 gradi centigradi (con un rapporto tissutale/fissatore approssimativo di 1:10 [v/v]).
- Lavare i campioni di tessuto 3x in PBS per almeno 30 min ogni lavaggio e conservarli in 0,02% NaN3/PBS a 4 gradi centigradi fino all'uso.
- Sezionare il tessuto in sezioni spesse 1 mm utilizzando un vibratome (velocità di alimentazione della lama: 0,3–0,5 mm/s, ampiezza: 1 mm, spessore della fetta: 1.000 m).
- Per mantenere la corretta sequenza di fette, conservare ogni sezione di tessuto separatamente in un pozzo di una piastra di coltura cellulare multi-bene. Aggiungere lo 0,02% NaN3/PBS e conservare le sezioni di tessuto a 4 gradi centigradi fino all'uso.
2. Sample pretrattamento con metanolo
NOTA: Eseguire tutti i passaggi di incubazione con oscillazione delicata e, se non indicato altrimenti, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. Il pretrattamento del campione serve allo scopo generale di migliorare la diffusione degli anticorpi e ridurre l'autofluorescenza dei tessuti mediante esposizione a MeOH e H2O2, rispettivamente14.
- Preparare le soluzioni 20% (v/v), 40%, 60% e 80% MeOH in acqua distillata. Ad esempio, per il 20% Di MeOH, aggiungere 10 mL di 100% MeOH a 40 mL di acqua distillata in un recipiente sigillabile appropriato e mescolare invertendolo.
- Trasferire i campioni su recipienti di dimensioni ragionevoli (ad esempio, tubi di reazione da 5 mL). Fare attenzione a utilizzare materiali chimicamente resistenti ai reagenti utilizzati in questo protocollo. Per esempio, si noti che mentre il polipropilene è adatto, il polistirolo non lo è.
NOTA: le specifiche di volume in questo protocollo si riferiscono a tubi di reazione 5 mL. Se si utilizza un recipiente diverso, regolare i volumi di conseguenza. - Incubare i campioni in 4 mL di ogni concentrazione della serie preparata di soluzioni MeOH in ordine crescente per 1 h ciascuno.
- Incubare i campioni 2x per 1 h ciascuno in puro (100%) Meoh.
- Raffreddare i campioni a 4 gradi centigradi (ad esempio, in un frigorifero sicuro per laboratorio).
- Preparare la soluzione di sbiancamento (5% H2O2 in MeOH), ad esempio, diluendo una soluzione stock 30% H2O2 a 1:6 in puro (100%) MeOH, e raffreddare a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere il 100% MeOH dai campioni refrigerati e aggiungere 4 mL di soluzione di sbiancamento preschilled (5% H2O2 in MeOH). Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
- Scambiare la soluzione di sbiancamento per 4 mL di 80% MeOH e incubare per 1 h. Continuare utilizzando la serie preparata di soluzioni MeOH in ordine decrescente per 1 h ciascuno fino a quando i campioni sono stati incubati per 1 h in 4 mL di 20% MeOH.
- Lavare i campioni 1x per 1 h con 4 mL di PBS.
3. Immunostaining
NOTA: Eseguire tutti i passaggi di incubazione con oscillazione delicata e, se non indicato altrimenti, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. Per prevenire la crescita microbica, aggiungere NaN3 a una concentrazione finale dello 0,02% alle soluzioni di questa sezione. I campioni di tessuto sono ulteriormente permeabilizzati dal trattamento con detergenti non ionici Triton X-100 e Tween 20. Il siero normale viene utilizzato per bloccare il legame dell'anticorpo non specifico. Glicina e eparina vengono aggiunte per ridurre lo sfondo di immunoetichettatura14.
- Lavare i campioni 2x per 1 h ciascuno in 4 mL di 0,2% Triton X-100/PBS.
- Permialita i campioni per 2 giorni a 37 mL con 4 mL di 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M glicina/PBS.
- Bloccare il legame non specifico degli anticorpi incubando i campioni per 2 giorni a 37 mL in 4 mL dello 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% siero normale/PBS.
NOTA: Utilizzare il siero normale della stessa specie in cui è stato allevato l'anticorpo secondario per ottenere risultati di blocco ideali. - Incubare i campioni in 2 mL di soluzione anticorpale primaria (3% siero normale/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 con eparina] - anticorpi primari/ anticorpi) per 5 giorni a 37 . Aggiornare la soluzione anticorpale primaria dopo 2,5 giorni.
- Per PTwH, ricostituire il sale di sodio di eparina in acqua distillata per realizzare una soluzione di riserva da 10 mg/mL (memorizzare questa soluzione, aliquotata, a 4 gradi centigradi). Aggiungete la soluzione di stock allo 0,2% Tween 20/PBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL.
NOTA: la scelta della corretta diluizione dell'anticorpo può richiedere l'ottimizzazione. In generale, le concentrazioni standard di immunoistochimica sono un buon punto di partenza.
- Per PTwH, ricostituire il sale di sodio di eparina in acqua distillata per realizzare una soluzione di riserva da 10 mg/mL (memorizzare questa soluzione, aliquotata, a 4 gradi centigradi). Aggiungete la soluzione di stock allo 0,2% Tween 20/PBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL.
- Lavare i campioni per 1 giorno in 4 mL di PTwH, scambiando il tampone di lavaggio almeno 4x-5x durante il corso della giornata e lasciando il lavaggio finale durante la notte.
- Incubare i campioni in 2 mL di soluzione anticorpale secondaria (3% siero normale/PTwH - anticorpi secondari/anticorpi) per 5 giorni a 37 . Aggiornare la soluzione anticorpale secondaria dopo 2,5 giorni.
- Diluire gli anticorpi secondari/anticorpi a 1:500 nella soluzione anticorpale secondaria (cioè 4 ll in 2 mL).
- Lavare i campioni per 1 giorno come descritto al punto 3.5, lasciando il lavaggio finale acceso durante la notte.
4. Colorazione nucleare
NOTA: Eseguire tutti i passaggi di incubazione con oscillazione delicata e, se non indicato altrimenti, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. Se non è necessaria alcuna colorazione nucleare o se per l'eccitazione o la rilevazione di un altro fluoroforo è necessaria alcuna colorazione nucleare o lo spettro di lunghezza d'onda/emissione di eccitazione di TO-PRO-3, saltare questo passaggio.
- Diluire la macchia acida nucleica TO-PRO-3 a 1:1,000 in PTwH e incubare i campioni in 4 mL di soluzione di colorazione nucleare per 5 h.
- Lavare i campioni per 1 giorno come descritto al punto 3.5, lasciando il lavaggio finale acceso durante la notte.
NOTA: Dopo aver lavato i suoi oligogliani, i campioni possono essere conservati in PBS a 4 gradi centigradi fino alla compensazione ottica.
5. Sgombera dei tessuti
NOTA: Eseguire tutti i passaggi di incubazione con oscillazione delicata e, se non indicato altrimenti, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. I campioni di tessuto sono disidratati in una serie graduata di soluzioni TBA. Poiché l'immunostaining richiede soluzioni acquose, tutte le procedure di colorazione devono essere completate prima della compensazione dei tessuti. La distanza ottica e l'abbinamento dell'indice refrattivo si ottengono mediante trattamento con una miscela di BA, BB e DPE. La soluzione di compensazione è integrata con DL-z-tocopherol come antiossidante13.
- Preparare le soluzioni TBA 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% e 96% e 96% in acqua distillata. Ad esempio, per il 30% di TBA, aggiungere 15 mL di 100% TBA a 35 mL di acqua distillata in un recipiente sigillabile appropriato e mescolare invertendo.
NOTA: TBA ha un punto di fusione di 25-26 gradi centigradi; quindi, tende ad essere solido a temperatura ambiente. Al fine di preparare le soluzioni TBA, scaldare la bottiglia ben sigillata a 37 gradi centigradi in un'incubatrice o in un bagno d'acqua. - Disidratare i campioni con 4 mL di ogni concentrazione della serie preparata di soluzioni TBA in ordine crescente per 2 h ciascuno. Lasciare il 96% TBA acceso durante la notte.
- Disidratare ulteriormente i campioni in puro (100%) TBA per 2 h.
- Preparare la soluzione di compensazione BABB-D15.
NOTA: BABB-D15 è una combinazione di BA e BB (BABB) che viene mescolata con DPE ad un rapporto di x:1, dove x è specificato nel nome della soluzione, in questo caso 15.- Per BABB, mescolare una parte BA con due parti BB.
- Mescolare BABB e DPE ad un rapporto di 15:1.
- Aggiungere 0,4 vol% DL-tocopherol (vitamina E).
NOTA: Ad esempio, per 20 mL di BABB-D15, mescolare 6,25 mL di BA con 12,5 mL di BB. Aggiungere 1,25 mL di DPE e integrarlo con 0,08 mL di DL-z-tocopherol.
- Cancellare i campioni nella soluzione di compensazione fino a quando non sono otticamente trasparenti (2-6 h).
- I campioni possono essere conservati a 4 gradi centigradi in BABB-D15, protetti dalla luce, fino al montaggio e all'imaging.
6. Montaggio del campione
- Utilizzando una stampante 3D, stampare la camera di imaging e il coperchio (materiale: copolyester [CPE], ugello: 0,25 mm, altezza strato: 0,06 mm, spessore della parete: 0,88 mm, conteggio parete: 4, riempimento: 100%, nessuna struttura di supporto; la corrispondente . STL si trova nei Materiali supplementari di questo protocollo).
- Assemblare la camera di imaging (Figura 2).
- Montare una vetritta rotonda (diametro: 30 mm) sulla camera di imaging con RTV-1 (un componente della temperatura-temperatura) gomma in silicone. Rimuovere la gomma in silicone in eccesso con un tampone di cotone bagnato dall'acqua e curare durante la notte.
- Montare una vestra rotonda (diametro: 22 mm) sul coperchio con gomma siliconica RTV-1. Rimuovere la gomma in silicone in eccesso con un tampone di cotone bagnato dall'acqua e curare durante la notte.
- Mettere il campione in una camera di imaging, aggiungere un piccolo volume di BABB-D15 e inserire il coperchio. Riempire la camera con BABB-D15 attraverso l'inseridio, utilizzando un ago ipodermico (27 G x 3/4 di pollice [0,40 mm x 20 mm]).
- Collegare l'inseridie e sigillare la camera di imaging con gomma in silicone RTV-1. Cura durante la notte al buio.
7. Imaging ed elaborazione delle immagini
- Impostare l'acquisizione dell'immagine selezionando le rispettive linee laser in modo che corrispondano ai fluorofori utilizzati. Regolare gli intervalli di rilevamento di ciascun rivelatore per evitare la sovrapposizione del segnale tra i canali.
NOTA: gli intervalli di rilevamento esemplari per Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 e TO-PRO-3 sono rispettivamente 500-550 nm, 590-620 nm e 645-700 nm. - Scegliere i parametri di acquisizione, definire il bordo superiore e inferiore dello z-stack e acquisire la pila di immagini.
NOTA: I parametri di acquisizione esemplari sono una scansione sequenziale con una dimensione in pixel di 60-90 nm, una dimensione z-step di 0,5 m, una media di linea di 1, una velocità di scansione di 400 Hz e una dimensione di foro stenopeico di 1 unità Airy. - Elaborare la pila di immagini utilizzando un software di analisi delle immagini appropriato (ad esempio, Fiji) per generare proiezioni 3D o eseguire analisi approfondite.
NOTA: a causa delle grandi dimensioni dei file di immagine acquisiti, l'uso di una workstation è di solito necessario.- Aprire i file di acquisizione o di immagine in Fiji (File Proprietà Open . Selezionare i file).
- Se si utilizza, ad esempio, . LIF, selezionare o deselezionare le opzioni desiderate nella finestra di dialogo Bioformati. Visualizza stack con Hyperstack. A parte questo, non sono necessarie selezioni o zecche specifiche. Premere OK.
- Se il file contiene più pile di immagini, selezionare quelle da analizzare e confermare premendo OK.
- Eseguire la correzione della candeggina suddividendo l'immagine unita in singoli canali (Immagine Proprietà Color (Colore) Strumento Canali, quindi selezionare Altro Dividi canali). Per ogni canale, selezionare la correzione della candeggina (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Correzione sbiancamento) e scegliere Rapporto semplice (intensità di sfondo: 0.0).
NOTA: In alcuni casi, ad esempio, quando non c'è decadimento lineare del segnale o il segnale è troppo debole nel complesso, Simple Ratio potrebbe fallire. In alternativa, prova Exponential Fit o salta la correzione della candeggina. - Regolare la luminosità e il contrasto per ciascun canale utilizzando i cursori (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Proprietà Brightness . Contrasto).
- Unire i canali (Immagine Proprietà Color (Colore) Unisci canali), crea un composito (Immagine Proprietà Color (Colore) Strumento Canali, quindi selezionare Altro Crea composito) e convertirlo in formato RGB (Immagine Proprietà Color (Colore) Strumento Canali, quindi selezionare Altro Converti in RGB).
- Se necessario, ridimensionare la pila di immagini per ridurre il tempo di calcolo e le dimensioni del file (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Dimensione, entrambe le opzioni selezionate più interpolazione bilineare).
- Generazione di una proiezione 3D (Immagine Proprietà Stacks . Progetto 3D). Scegliete Punto più luminoso come metodo di proiezione e impostate la spaziatura della sezione in modo che corrisponda alla dimensione del passo z della pila di immagini acquisita. Per la massima qualità, impostate l'incremento dell'angolo di rotazione su 1 e attivate l'interpolazione. Modificare la rotazione totale, le soglie di trasparenza e l'opacità in base alle esigenze.
- Se necessario, regolare il contrasto e la luminosità convertendo di nuovo la proiezione 3D in formato a 8 bit (Immagine Proprietà Type (Tipo) 8 bit). Utilizzare i rispettivi cursori (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Proprietà Brightness . Contrasto) e riconvertire la pila di immagini in formato RGB come descritto nel passaggio 7.3.4.
- Salvare la proiezione 3D come . TIF (formato file immagine) e . File AVI (formato file video).
- Aprire i file di acquisizione o di immagine in Fiji (File Proprietà Open . Selezionare i file).
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Representative Results
La combinazione di iDISCO14 e uDISCO13 accoppiato con CLSM ad alta risoluzione fornisce una profonda conoscenza della risoluzione spatiotemporale e della plasticità dell'infezione rabV del tessuto cerebrale e del contesto cellulare circostante.
Utilizzando l'immunostainizzazione della fosfora RABV (P), gli strati complessi di cellule neuronali infette possono essere visualizzati in spesse sezioni di cervelli murini (Figura 3). Successivamente, le proiezioni 3D senza soluzione di continuità degli stack di immagini acquisite possono essere ricostruite (Figura 3A, B, pannello destro; Figura animata 1). È necessario prestare attenzione quando si utilizzano anticorpi primari e anticorpi secondari contro la specie da cui proviene il materiale dell'organo. L'uso di anticorpi IgG anti-topo sul tessuto cerebrale del topo ha provocato una distinta colorazione del sistema vascolare (Figura 3B, pannello sinistro). A causa dell'elevata risoluzione con cui vengono acquisite le pile di immagini, l'infezione può essere valutata fino a un livello a singola cellula (Figura 4), consentendo alle asserzioni, ad esempio, l'abbondanza e la distribuzione dell'antigene all'interno della cella (Figura 4C ).
Oltre al tessuto cerebrale del topo, il protocollo può essere applicato anche al tessuto cerebrale di altre specie animali (ad esempio, furetti) (Figura 5; Figura animata 2). Le sezioni prese da diversi compartimenti di un cervello di furetto infetto hanno rivelato un diverso grado di infezione da RABV (Figura5A-D).
Poiché il cervello comprende molte sottopopolazioni cellulari diverse, la differenziazione tra queste popolazioni è vitale. Utilizzando anticorpi diretti contro i marcatori cellulari, è possibile valutare l'identità cellulare delle cellule infette e vicine. Ad esempio, gli astrociti possono essere differenziati attraverso l'espressione di proteine acide fibrillari gliali (GFAP) (Figura6A,C; Figura animata 3), mentre i neuriti possono essere macchiati in modo specifico per la proteina associata amicrobuli 2 (MAP2) (Figura6B,D; Figura animata 4). Allo stesso tempo, le proteine virali, in questo caso la nucleoproteina RABV (N), possono essere colate per valutare la relazione tra le cellule infette e la sottopopolazione cellulare evidenziata.
Figura 1 : principio di base e flusso di lavoro del protocollo. (A) Rappresentazione grafica del flusso di lavoro basata sui protocolli di Renier et al.14 e Pan et al.13. (B) Due fette di cervo di furetto esemplare, una prima (pannello sinistro) e una dopo il trattamento con solventi organici (pannello destro). La compensazione diventa il tessuto otticamente trasparente come osservabile dal testo allora leggibile. La fetta cerebrale cancellata è incorporata in una camera di imaging stampata in 3D (pannello destro). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : illustrazione tecnica della camera di imaging stampata in 3D. (A) Disegno della vista esplosa della camera di imaging. Le linee tratteggiate a punti evidenziano i componenti che devono essere montati l'uno sull'altro utilizzando la gomma in silicone RTV-1. Le linee tratteggiate rappresentano le istruzioni per la successiva assemblea della camera. (B) CAD (progettazione assistita da computer) della camera di imaging. Il file . STL per stampare la camera di imaging è reperibile nei Materiali supplementari. (C) Camera di imaging completamente assemblata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Immagini di tessuti profondi di tessuto cerebrale infetto da RABV. (A e B) I topi sono stati infettati da un virus di strada vulpinante ricombinante. RabV P colorazione (verde) rivela strati neuronali infetti con grandi, proiezioni neurite impigliato all'interno del tessuto cerebrale eliminato. I nuclei sono stati controcontaminati con TO-PRO-3 (blu). (B) L'uso di anticorpi secondari anti-topo etichettati con fluoroforo (rosso) sul tessuto del topo si traduce in un'etichettatura distinta del sistema vascolare. La ricostruzione 3D delle pile di immagini acquisite consente l'osservazione da diversi angoli di visione (A e B, pannelli di destra). Barre di scala - 60 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione consente valutazioni complesse fino a un livello a cella singola. Il cervello è stato sezionato da un topo infettato da SAD L16. (A) La colorazione RABV P (verde) evidenzia un neurone infetto singolarmente. (B e C) Le immagini e le proiezioni di dettaglio dimostrano che è possibile eseguire analisi approfondite dell'abbondanza, della distribuzione e della localizzazione dell'antigene. I nuclei sono stati controcontaminati con TO-PRO-3 (blu). Barre della scala ( 20 m (A), 5 m (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Acquisizione di tessuti profondi di tessuto cerebrale infetto da rabV. I traghetti erano infettati da RABV di canine Street. (A–D) Sono state prese fette da aree specifiche del cervello, immunostainse per RABV P (verde) e cancellate otticamente. Le proiezioni dimostrano che le cellule infette in diverse parti del cervello differiscono per quantità e morfologia. Inoltre, evidenziano l'applicabilità del protocollo a tessuti diversi da quelli derivati dal topo. I nuclei sono stati controcontaminati con TO-PRO-3 (blu). Barre di scala - 60 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : l'immunofluorescenza multicolore consente la costamento dei marcatori cellulari. Sono state utilizzate fette di tessuto cerebrale da furetti infettati da strade canine RABV e coimmunostainizzati per RABV N (rosso) e per GFAP (A e C)(verde) o (B e D) MAP2 (verde). Mentre GFAP è un marcatore di astrociti, MAP2 evidenzia specificamente i neuriti. I nuclei sono stati controcontaminati con TO-PRO-3 (blu). (C e D) Nella parte inferiore sono rappresentate le estrazioni a sezione singola delle viste di dettaglio enumerate dalle proiezioni unite. Barre di scala : 15 m (A e B) 10 m (C e D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura animata 1: ricostruzioni 3D e proiezioni di dettaglio di pile di immagini da cervelli di topi infettati da RABV. Le proiezioni sono state generate dagli stack di immagini descritti nella Figura 3. (A e C) Animazioni dell'intero rispettivo stack z. (B) Proiezione dettagliata di una ricostruzione 3D di una parte della z-stack delle aree evidenziate all'inizio del video. (D) Proiezione dettagliata di un tomogramma di una parte della z-stack delle aree evidenziate all'inizio del video. Verde - RABV P; rosso : mouse IgG; blu e nuclei. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Figura animata 2: ricostruzioni 3D di pile di immagini acquisite da un cervello di furetto infettato da RABV. Le proiezioni sono state generate dagli stack di immagini descritti nella Figura 5. (A–D) Le annotazioni si riferiscono alla stessa figura e descrivono le rispettive aree del cervello da cui sono state prelevate le sezioni. Verde - RABV P; blu e nuclei. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Figura animata 3: Proiezione graduale dei diversi canali di una ricostruzione 3D di un cervello di furetto infettato da RABV costante con marcatore astrocito GFAP. Le proiezioni sono state generate dallo stack di immagini descritto nella Figura 6A. L'aggiunta graduale di canali inizia con RABV N (rosso), dopo di che seguono i nuclei cellulari (blu) e, infine, GFAP (verde), mentre la sottrazione rimuove prima RABV N, poi i nuclei cellulari, e infine GFAP. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Figura animata 4: Proiezione graduale dei diversi canali di una ricostruzione 3D di un cervello di furetto infettato da RABV costante con marcatore neuronale MAP2. Le proiezioni sono state generate dallo stack di immagini descritto nella Figura 6B. L'aggiunta graduale di canali inizia con RABV N (rosso), dopo di che seguono i nuclei cellulari (blu) e, infine, MAP2 (verde), mentre la sottrazione rimuove prima RABV N, poi i nuclei cellulari, ed eventualmente MAP2. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
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Discussion
La rinascita e l'ulteriore sviluppo delle tecniche di sgombero dei tessuti negli ultimi anni2,3,4,5,6,7,8, 9 (in vie , 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12 mila , 13 del sistema , 14 hanno aperto molte nuove possibilità per ottenere pile di immagini ad alto volume di tessuto dell'organo. Questo ha fornito uno strumento ineguagliabile e potente per studiare, tra molti altri argomenti, l'infezione da virus. La successiva ricostruzione 3D di questi stack di immagini consente asserzioni sofisticate, ad esempio, sul tropismo dei virus, l'abbondanza e il decorso temporale dell'infezione. Questo protocollo descrive la visualizzazione assistita dall'immunolabeling dell'infezione da RABV nel tessuto cerebrale autorizzato dal solvente.
Ci sono diversi passaggi critici nella preparazione e nell'acquisizione delle pile di immagini di tessuto immunoetichettato e sottoposto a solvente. L'esposizione prolungata al PFA può mascherare gli epitopi e, di conseguenza, provocare una diminuzione dell'antigenicità20,21,22. È quindi importante limitare i tempi di fissaggio al minimo necessario e trasferire i campioni a una soluzione appropriata (ad esempio, PBS integrato con 0,02% NaN3 per lo stoccaggio a lungo termine). Tuttavia, tutte le immagini e le proiezioni rappresentative qui fornite sono state acquisite da campioni cerebrali archiviati, alcuni dei quali erano stati conservati in PFA per settimane, evidenziando l'applicabilità della tecnica al materiale per organi che è stato esposto al PFA per periodi di tempo prolungati. Risultati simili sono stati mostrati per i campioni di cervello umano13. Un altro, se non il più importante, passo critico è l'incubazione anticorpale. Le concentrazioni di anticorpi devono essere scelte con attenzione. Mentre nella maggior parte dei casi, concentrazioni standard di IHC sono un buon punto di partenza per l'etichettatura dell'anticorpo dei tessuti profondi, alcuni antigeni possono richiedere un'ulteriore ottimizzazione della concentrazione di anticorpi. Questo protocollo dimostra che sia RABV N che P sono facilmente rilevabili dagli anticorpi usati. Mentre il pretrattamento MeOH di solito migliora l'immunoetichettatura, alcuni antigeni sono incompatibili con questo trattamento. Per questi, Renier e colleghi14 hanno fornito un campione alternativo senza MeOH pretrattamento. L'analisi degli stack di immagini acquisite richiede un'adeguata potenza di calcolo. A causa delle grandi dimensioni dei file fino a diversi gigabyte per stack, sono necessari computer potenti per elaborare le immagini. La post-elaborazione spesso include la sottrazione del rumore di fondo e una correzione della candeggina per compensare gli effetti di sbiancamento associati all'acquisizione. Quando si misurano le distanze, va tenuto presente che, come effetto collaterale, il tessuto si sta restringendo durante il processo di compensazione.
Rispetto ad altre piattaforme di microscopia, come la microscopia a fluorescenza di foglio di luce (LSFM) o la microscopia a scansione laser a due fotoni (2PLSM), cLSM ha la distanza di lavoro più limitata. Pertanto, è necessario prefettare gli organi a 1 mm di spessore per l'imaging. Inoltre, CLSM ha la velocità di acquisizione più lenta a causa della sua elevata risoluzione di imaging. L'uso di un microscopio a foglio chiaro consentirebbe un'imaging più veloce di volumi più grandi fino all'imaging a tutto il cervello, sacrificando contemporaneamente la risoluzione dell'immagine. Un'altra limitazione è l'aumento intrinseco dell'autofluorescenza dei tessuti con lunghezza d'onda decrescente. Questo rende impossibile l'uso di fluorofori e coloranti eccitati dalla linea laser a 405 nm, tra cui i coloranti Hoechst.
Per quanto riguarda le altre tecniche di sminamento dei tessuti, l'ibrido di iDISCO14 e uDISCO13 combina gli attributi più positivi: è altamente compatibile con l'immunostaining, altamente versatile, relativamente veloce e poco costoso, ha eccellenti capacità di compensazione, ed è fattibile con un microscopio confocale standard. Inoltre, questo protocollo non è limitato all'immunostaining e alla cancellazione del tessuto cerebrale, ma può anche essere applicato a una varietà di altri tessuti molli e patogeni, sia neuroinvasivi che non neuroinvasivi. In conclusione, il protocollo qui descritto rappresenta una pipeline per l'imaging 3D ad alta risoluzione del tessuto cerebrale infetto da RABV. Le ricostruzioni 3D del tessuto cerebrale infetto possono essere utilizzate per rispondere a una varietà di domande riguardanti la progressione della malattia di RABV, la patogenesi e l'invasione della neurodipendenza.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Thomas C. Mettenleiter e Verena te Kamp per aver letto criticamente il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Federal Excellence Initiative del Meclemburgo Western Pomerania e dal Fondo sociale europeo (FSE) Grant KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) e da una sovvenzione di ricerca collaborativa inmurale sui Friedrich-Loeffler-Institute (Ri-0372).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
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