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Neuroscience

विलायक-स्पष्ट मस्तिष्क ऊतक में रेबीज वायरस संक्रमण के उच्च संकल्प 3 डी इमेजिंग

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/59402
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health

Summary

उपन्यास, विलायक-स्पष्ट अंगों के अंतिम 3 डी इमेजिंग की तरह इम्यूनोस्टेनिंग-संगत ऊतक समाशोधन तकनीक रेबीज वायरस मस्तिष्क संक्रमण और इसके जटिल सेलुलर वातावरण के 3 डी दृश्य की अनुमति देते हैं। मोटी, एंटीबॉडी लेबल मस्तिष्क ऊतक स्लाइस इमेजिंग गहराई बढ़ाने के लिए और confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा 3 डी विश्लेषण सक्षम करने के लिए ऑप्टिकली पारदर्शी बना रहे हैं।

Abstract

प्रतिरक्षा लेबलिंग द्वारा ऊतकों और अंगों में संक्रमण प्रक्रियाओं का दृश्य आधुनिक संक्रमण जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण तरीका है। अंग ऊतकों के अंदर वितरण, ट्रोपिज्म, और रोगजनकों की बहुतायत का निरीक्षण और अध्ययन करने की क्षमता रोग के विकास और प्रगति पर निर्णायक डेटा प्रदान करती है। पारंपरिक माइक्रोस्कोपी तरीकों का उपयोग करना, इम्यूनोलेबलिंग ज्यादातर पैराफिन-एम्बेडेड या जमे हुए नमूनों से प्राप्त पतली वर्गों तक सीमित है। हालांकि, इन पतली वर्गों के सीमित 2 डी छवि विमान एक संक्रमित अंग की जटिल संरचना और संक्रमण के सेलुलर संदर्भ पर महत्वपूर्ण जानकारी के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. आधुनिक बहुरंगा, इम्यूनोस्टेनिंग-संगत ऊतक समाशोधन तकनीक अब वायरस संक्रमित अंग ऊतक के उच्च मात्रा 3 डी छवि ढेर का अध्ययन करने के लिए एक अपेक्षाकृत तेजी से और सस्ती तरीका प्रदान करते हैं। कार्बनिक सॉल्वैंट्स के लिए ऊतक को उजागर करके, यह ऑप्टिकली पारदर्शी हो जाता है। यह नमूने के अपवर्तक सूचकांकों से मेल खाता है और अंततः प्रकाश प्रकीर्णन में महत्वपूर्ण कमी की ओर जाता है। इस प्रकार, लंबे समय से मुक्त काम दूरी के उद्देश्यों के साथ संयोजन में, बड़े ऊतक वर्गों अप करने के लिए 1 मिमी आकार में उच्च संकल्प पर पारंपरिक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) द्वारा छवि बनाई जा सकती है। यहाँ, हम संक्रमित दिमाग में रेबीज वायरस वितरण की कल्पना करने के लिए ऊतक समाशोधन के बाद गहरी ऊतक इमेजिंग लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए वायरस रोगजनन, प्रसार, tropism, और neuroinvasion जैसे विषयों का अध्ययन करने के लिए।

Introduction

पारंपरिक ऊतक विज्ञान तकनीक ज्यादातर अंग ऊतकों की पतली वर्गों पर भरोसा करते हैं, जो स्वाभाविक रूप से एक जटिल 3 डी वातावरण में केवल 2 डी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. यद्यपि सिद्धांत रूप में व्यवहार्य है, धारावाहिक पतली वर्गों से 3 डी पुनर्निर्माण दोनों टुकड़ा करने और बाद में अधिग्रहीत छवियों1के silico संरेखण में तकनीकी पाइपलाइनों की मांग की आवश्यकता है. इसके अलावा, माइक्रोटोम टुकड़ा करने के बाद z-volumes का निर्बाध पुनर्निर्माण महत्वपूर्ण है क्योंकि यांत्रिक और संगणकीय कलाकृतियां, गैर-ओवरलेपिंग छवि विमानों, धुंधला विविधताओं, और भौतिक के कारण suboptimal छवि पंजीकरण के कारण बनी रह सकती हैं द्वारा ऊतक का विनाश, उदाहरण के लिए, microtome ब्लेड. इसके विपरीत, बरकरार मोटी ऊतक के नमूनों की शुद्ध ऑप्टिकल टुकड़ा करने की अनुमति देता है ओवरलैपिंग छवि विमानों के अधिग्रहण (ओवरसाम्पलिंग) और, जिससे, 3 डी पुनर्निर्माण की सुविधा. यह, बारी में, जटिल सेल आबादी में संक्रमण प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए बेहद फायदेमंद है (उदाहरण के लिए, आसपास के glial और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संदर्भ में न्यूरॉन नेटवर्क). हालांकि, मोटी ऊतक वर्गों के अंतर्निहित बाधाओं प्रकाश प्रकीर्णन और ऊतक में सीमित एंटीबॉडी प्रवेश शामिल हैं. हाल के वर्षों में, विभिन्न प्रकार की तकनीकों का विकास किया गया है और इन मुद्दों को दूर करने के लिए अनुकूलित किया गया है2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. मूलतः , लक्ष्य ऊतकों या तो जलीय2,3,4,5,6,7 के साथ उपचार द्वारा ऑप्टिकली पारदर्शी कर रहे हैं ,8,9 या कार्बनिक विलायक आधारित10,11,12,13 समाधान. 3DISCO की शुरूआत (3 डी विलायक-स्पष्ट अंगों की इमेजिंग)11,12 और उसके उत्तराधिकारी uDISCO (विलायक-स्पष्ट अंगों के अंतिम 3 डी इमेजिंग)13 के साथ एक अपेक्षाकृत तेजी से, सरल, और सस्ती उपकरण प्रदान की उत्कृष्ट समाशोधन क्षमताओं. समाशोधन प्रोटोकॉल के मुख्य घटक कार्बनिक सॉल्वैंट्स tert-butanol (TBA), बेंजिल शराब (बीए), बेंजिल बेंजोएट (बीबी), और डिफेनिल ईथर (डीपीई) हैं। IDISCO के विकास और इसके अलावा (प्रतिरक्षा-सक्षम 3 डी विलायक-स्पष्ट अंगों की इमेजिंग)14, एक संगत इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल, मौजूदा तरीकों पर एक और लाभ का गठन किया और एंटीजन के गहरे ऊतक लेबलिंग सक्षम ब्याज की, साथ ही प्रतिरक्षा नमूनों की लंबी अवधि के भंडारण। इस प्रकार, iDISCO14 और uDISCO13 के संयोजन के लिए अनुमति देता है उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए बड़े ऊतक वर्गों में एंटीबॉडी लेबल प्रोटीन (अप करने के लिए 1 मिमी) पारंपरिक CLSM का उपयोग कर.

सभी तीन आयामों में एक अंग की जटिल संरचना का संरक्षण मस्तिष्क के ऊतकों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। न्यूरॉन्स उनके neurite अनुमानों के आधार पर अत्यधिक विविध 3 डी morphologies के साथ एक बहुत विषम सेलुलर उपजनसंख्या शामिल (मसान द्वारा की समीक्षाकी 15). इसके अलावा, मस्तिष्क डिब्बों और subcompartments की एक संख्या के होते हैं, प्रत्येक विभिन्न सेलुलर subpopulations और उसके अनुपात से बना, glial कोशिकाओं और न्यूरॉन्स सहित (Von Bartheld एट अल द्वारा की समीक्षा की.16). एक neurotropic वायरस के रूप में, रेबीज वायरस (RABV, Fooks एट अल द्वारा समीक्षा की17)मुख्य रूप से न्यूरॉन्स को संक्रमित, उनके परिवहन मशीनरी का उपयोग करने के लिए संक्रमण के प्राथमिक स्थल से कुल्हाड़ी में प्रतिगामी दिशा में यात्रा करने के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस). यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल (चित्र 1ए) संक्रमित मस्तिष्क के ऊतकों से प्राप्त बड़े, सुसंगत छवि ढेर में RABV और RABV संक्रमित कोशिकाओं के इम्यूनोस्टेनिंग-सहायता प्राप्त पता लगाने और दृश्य के लिए अनुमति देता है। यह संक्रमण वातावरण के एक निष्पक्ष, 3 डी उच्च संकल्प मूल्यांकन सक्षम बनाता है। यह प्रजातियों की एक किस्म से मस्तिष्क के ऊतकों के लिए लागू है, निर्धारण के तुरंत बाद या paraformaldehyde (पीएफए) में नमूनों की लंबी अवधि के भंडारण के बाद किया जा सकता है, और भंडारण और महीनों के लिए दाग और मंजूरी दे दी नमूनों के reimaging की अनुमति देता है.

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Protocol

RABV संक्रमित, पीएफए तय संग्रहीत मस्तिष्क सामग्री का इस्तेमाल किया गया था. संबंधित पशु प्रयोगात्मक अध्ययन जिम्मेदार पशु देखभाल, उपयोग, और कृषि, खाद्य सुरक्षा के लिए राज्य कार्यालय की नैतिकता समिति द्वारा मूल्यांकन किया गया, और Mecklenburg-पश्चिमी Pomerania में फिशरी (LALFF एम-वी) और अनुमति के साथ अनुमोदन प्राप्त 7221.3-2.1-002/11 (mice) and 7221.3-1-068/16 (फेरेट्स). सामान्य देखभाल और पशु प्रयोगों में इस्तेमाल तरीकों को मंजूरी दे दी दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया.

चेतावनी: इस प्रोटोकॉल विभिन्न विषाक्त और / या हानिकारक पदार्थों का उपयोग करता है, पीएफए सहित, मेथनॉल (MeOH), हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2हे2),सोडियम azide (NaN3),TBA, बीए, बी बी, और डीपीई. MeOH और TBA अत्यधिक ज्वलनशील हैं. उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और आंख संरक्षण) पहनने और एक धूआं हुड में प्रयोगों का आयोजन करके जोखिम से बचें। उपयुक्त कंटेनरों में अलग से अपशिष्ट एकत्र करें और स्थानीय नियमों के अनुसार इसका निपटान करें। रेबीज वायरस को जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल)-2 रोगजनक के रूप में वर्गीकृत किया जाता है और इसलिए, आम तौर पर बीएसएल-2 शर्तों के तहत नियंत्रित किया जा सकता है। कुछ गतिविधियों, प्रक्रियाओं है कि एयरोसोल उत्पन्न कर सकते हैं सहित, उच्च वायरस सांद्रता के साथ काम करते हैं, या उपन्यास lyssaviruses के साथ काम, बीएसएल-3 वर्गीकरण की आवश्यकता हो सकती है. पशु देखभाल करने वालों और प्रयोगशाला कर्मचारियों सहित उच्च जोखिम वाले कर्मियों के लिए प्री-एक्सपोजर प्रोफिलैक्सिस की सिफारिश की जाती है18,19. स्थानीय प्राधिकरण विनियमों का संदर्भ लें।

1. मस्तिष्क के ऊतकों और अनुभागीकरण का निर्धारण

  1. फॉस्फेट-बफर्ड लवण में 4% पीएफए की एक उचित मात्रा में मस्तिष्क के नमूने को ठीक करें (पीबीएस [पीएच 7.4]) कम से कम 48 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर (एक अनुमानित ऊतक-से-स्थिर अनुपात के साथ 1:10 [v/v])।
  2. कम से कम 30 मिनट प्रत्येक धोने के लिए पीबीएस में ऊतक के नमूने 3x धो लें और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.02% NaN3/
  3. एक vibratome का उपयोग कर 1 मिमी मोटी वर्गों में ऊतक अनुभाग (ब्लेड फ़ीड दर: 0.3-0.5 मिमी, आयाम: 1 मिमी, टुकड़ा मोटाई: 1,000 $m).
  4. सही टुकड़ा अनुक्रम बनाए रखने के लिए, प्रत्येक ऊतक अनुभाग अलग से एक multiwell सेल संस्कृति प्लेट के एक कुएं में स्टोर. 0.02% NaN3/PBS जोड़ें और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक वर्गों की दुकान.

2. मेथनॉल के साथ नमूना pretreatment

नोट: कोमल दोलन के साथ सभी ऊष्मायन कदम प्रदर्शन और, अगर अन्यथा संकेत नहीं दिया, कमरे के तापमान पर. प्रकाश से नमूने की रक्षा करें. नमूना पूर्व उपचार क्रमशः1414 को एमओएच और एच2ओ2के संपर्क में आने से एंटीबॉडी विसरण में सुधार लाने और ऊतक ऑटोफ्लोरोसेंट को कम करने के समग्र उद्देश्य को पूरा करता है .

  1. आसुत जल में 20% (v/v), 40%, 60%, और 80% MeOH समाधान तैयार करें। उदाहरण के लिए, 20% MeOH के लिए, एक उपयुक्त सील करने योग्य पोत में आसुत पानी के 40 एमएल में 10 00% MeOH के 10 एमएल जोड़ें और इसे उलट कर मिश्रण करें।
  2. नमूनों को यथोचित आकार के जहाजों (उदा., 5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब) में स्थानांतरित करें। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त अभिकर्मकों के लिए रासायनिक प्रतिरोधी सामग्री का उपयोग करने के लिए ध्यान रखें। उदाहरण के लिए, ध्यान दें कि जबकि पॉलीप्रोपीलीन उपयुक्त है, polystyrene नहीं है.
    नोट: इस प्रोटोकॉल में मात्रा विनिर्देशों को देखें 5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों. यदि किसी भिन्न पोत का उपयोग किया जाता है, तो तदनुसार वॉल्यूम समायोजित करें.
  3. 1 एच प्रत्येक के लिए आरोही क्रम में MeOH समाधान की तैयार श्रृंखला के प्रत्येक एकाग्रता के 4 एमएल में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  4. शुद्ध में 1 एच प्रत्येक के लिए नमूने 2x इनक्यूबेट करें (100%) MeOH.
  5. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस (उदा., प्रयोगशाला-सुरक्षित रेफ्रिजरेटर में) को ठंडा करें।
  6. ब्लीचिंग समाधान तैयार (5% एच2O2 MeOH में) द्वारा, उदाहरण के लिए, शुद्ध में 1:6 पर एक 30% एच2हे2 शेयर समाधान को कम (100%) MeOH, और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा.
  7. फ्रिज में दिए गए नमूनों से 100% MeOH निकालें और prechilled विरंजन समाधान के 4 एमएल जोड़ें (5% एच2O2 MeOH में). रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. 80% MeOH के 4 एमएल के लिए विरंजन समाधान का आदान-प्रदान करें और 1 h के लिए इनक्यूबेट करें, 1 h प्रत्येक के लिए अवरोही क्रम में MeOH समाधान की तैयार श्रृंखला का उपयोग करते हुए जारी रखें जब तक कि नमूने 20% MeOH के 4 एमएल में 1 एच के लिए इनक्यूबेट किए गए हैं।
  9. पीबीएस के 4 एमएल के साथ 1 एच के लिए 1x नमूने धो लें।

3. इम्यूनोस्टेनिंग

नोट: कोमल दोलन के साथ सभी ऊष्मायन कदम प्रदर्शन और, अगर अन्यथा संकेत नहीं दिया, कमरे के तापमान पर. प्रकाश से नमूने की रक्षा करें. माइक्रोबियल विकास को रोकने के लिए, इस खंड में समाधान के लिए 0.02% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए NaN3 जोड़ें। ऊतक के नमूने आगे nonionic डिटर्जेंट Triton एक्स-100 और ट्वीन 20 के साथ उपचार द्वारा permebilized हैं. सामान्य सीरम का प्रयोग विशिष्ट एंटीबॉडी बंधन को अवरोधित करने के लिए किया जाता है। ग्लाइसिन और हेपरिन को इम्यूनोलेबलिंग पृष्ठभूमि14को कम करने के लिए जोड़ा जाता है .

  1. 0.2% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस के 4 एमएल में 1 एच प्रत्येक के लिए 2x नमूने धोएं।
  2. नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए 0.2% ट्राइटन एक्स-100/20% डीएमएसओ/0.3 एम ग्लिसिन/पीबीएस के 4 एमएल के साथ परमीश करें।
  3. 0.2% ट्राइटन एक्स-100/10% DMSO/6% सामान्य सीरम/पीबीएस के 4 एमएल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करके एंटीबॉडी के विशिष्ट बाइंडिंग को ब्लॉक करें।
    नोट: एक ही प्रजाति से सामान्य सीरम का प्रयोग माध्यमिक एंटीबॉडी आदर्श अवरुद्ध परिणाम प्राप्त करने में उठाया गया था.
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 2 एमएल में नमूनों को इनक्यूबेट करें (3% सामान्य सीरम/5% DMSO/PTwH [पीबीएस-ट्वेन 20 के साथ हेपरिन] + प्राथमिक एंटीबॉडी/एंटीबॉडी) 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए। 2.5 दिनों के बाद प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान ताज़ा करें।
    1. PTwH के लिए, आसुत पानी में हेपरिन सोडियम नमक का पुनर्गठन करने के लिए एक 10 mg/mL स्टॉक समाधान बनाने के लिए (इस समाधान की दुकान, aliuated, 4 डिग्री सेल्सियस पर). स्टॉक समाधान को 10 g/mL की अंतिम सांद्रता में 0.2% Tween 20/PBS में जोड़ें।
      नोट: सही एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का चयन अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. आम तौर पर, मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सांद्रता एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है।
  5. PTWH के 4 एमएल में 1 दिन के लिए नमूने धो लें, दिन के दौरान कम से कम 4x-5x धोने बफर का आदान प्रदान और रात भर पर अंतिम धोने छोड़ने.
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (3% सामान्य सीरम/पीटीएच + माध्यमिक एंटीबॉडी/एंटीबॉडी) के 2 एमएल में नमूनों को इनक्यूबेट करें। 2.5 दिनों के बाद द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान ताज़ा करें।
    1. द्वितीयक एंटीबॉडी विलयन में 1:500 पर द्वितीयक एंटीबॉडी/एंटीबॉडी को निरूपित करना (अर्थात् 2 एमएल में 4 डिग्री सेल्सियस)।
  7. चरण 3.5 में वर्णित के रूप में 1 दिन के लिए नमूने धो लें, रात भर पर अंतिम धोने छोड़ने.

4. परमाणु धुंधला

नोट: कोमल दोलन के साथ सभी ऊष्मायन कदम प्रदर्शन और, अगर अन्यथा संकेत नहीं दिया, कमरे के तापमान पर. प्रकाश से नमूने की रक्षा करें. यदि किसी अन्य फ्लोरोफोर की उत्तेजना या पता लगाने के लिए TO-PRO-3 की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य/उत्सर्जन स्पेक्ट्रम की आवश्यकता नहीं है, तो इस चरण को छोड़ दें।

  1. PTwH में 1:1,000 पर न्यूक्लिक एसिड दाग TO-PRO-3 को शांत और 5 एच के लिए परमाणु धुंधला समाधान के 4 एमएल में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  2. चरण 3.5 में वर्णित के रूप में 1 दिन के लिए नमूने धो लें, रात भर पर अंतिम धोने छोड़ने.
    नोट: washes के बाद, नमूने ऑप्टिकल समाशोधन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है।

5. ऊतक समाशोधन

नोट: कोमल दोलन के साथ सभी ऊष्मायन कदम प्रदर्शन और, अगर अन्यथा संकेत नहीं दिया, कमरे के तापमान पर. प्रकाश से नमूने की रक्षा करें. ऊतक के नमूने TBA समाधान की एक वर्गीकृत श्रृंखला में निर्जलित कर रहे हैं. के रूप में इम्यूनोस्टेनिंग जलीय समाधान की आवश्यकता है, सभी धुंधला प्रक्रियाओं ऊतक समाशोधन से पहले समाप्त किया जाना है. ऑप्टिकल क्लीयरेंस और अपवर्तक सूचकांक मिलान बीए, बी बी और डीपीई के मिश्रण के साथ उपचार द्वारा प्राप्त किए जाते हैं। समाशोधन समाधान एक एंटीऑक्सीडेंट13के रूप में डीएल-जेड-टोकोफरॉल के साथ पूरक है।

  1. आसुत जल में 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% और 96% TBA समाधान तैयार करें। उदाहरण के लिए, 30% TBA के लिए, एक उपयुक्त सील करने योग्य पोत में आसुत पानी के 35 एमएल में 100% TBA के 15 एमएल जोड़ें और उलटा करके मिश्रण करें।
    नोट: TBA 25-26 डिग्री सेल्सियस के एक पिघलने बिंदु है; इस प्रकार, यह कमरे के तापमान पर ठोस हो जाता है. TBA समाधान तैयार करने के लिए, एक इन्क्यूबेटर या पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से सील की गई बोतल को गर्म करें।
  2. 2 एच प्रत्येक के लिए आरोही क्रम में TBA समाधान की तैयार श्रृंखला के प्रत्येक एकाग्रता के 4 एमएल के साथ नमूने निर्जलीकरण. रात भर 96% TBA छोड़ दें.
  3. नमूनों को शुद्ध में आगे निर्जलित करें (100%) 2 ज के लिए TBA.
  4. समाशोधन समाधान BABB-D15 तैयार करें।
    नोट: BABB-D15 बीए और बी बी (BABB) जो Xके अनुपात में DPE के साथ मिलाया जाता है का एक संयोजन है:1, जहां एक्स समाधान के नाम में निर्दिष्ट किया गया है, इस मामले में 15.
    1. BABB के लिए, दो भागों बी बी के साथ एक भाग बीए मिश्रण.
    2. 15:1 के अनुपात में BABB और DPE मिलाएं.
    3. जोड़ें 0.4 vol% डीएल-जेड-टोकोफेरोल (विटामिन ई).
      नोट: उदाहरण के लिए, BABB-D15 के 20 एमएल के लिए, बी बी के 12.5 एमएल के साथ बीए के 6.25 एमएल मिश्रण. डीपीई के 1.25 एमएल जोड़ें और इसे 0ण्08 एमएल डीएल-जेड-टोकोफेरोल के साथ पूरक करें।
  5. समाधान समाशोधन में नमूनों को साफ़ करें जब तक कि वे ऑप्टिकली पारदर्शी (2-6 ज) न हों।
  6. नमूने BABB-D15 में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, प्रकाश से संरक्षित, जब तक बढ़ते और इमेजिंग.

6. नमूना बढ़ते

  1. एक 3 डी प्रिंटर का उपयोग करना, इमेजिंग चैम्बर और ढक्कन प्रिंट (सामग्री: copoliester [CPE], नोजल: 0.25 मिमी, परत ऊंचाई: 0.06 मिमी, दीवार मोटाई: 0.88 मिमी, दीवार गिनती: 4, infill: 100%, कोई समर्थन संरचना; इसी . STL फ़ाइल इस प्रोटोकॉल की अनुपूरक सामग्री में पाया जा सकता है).
  2. इमेजिंग कक्ष को इकट्ठा करना (चित्र 2)।
    1. RTV-1 (एक घटक कमरे तापमान-vulcanizing) सिलिकॉन रबर के साथ इमेजिंग कक्ष पर एक दौर कवरस्लिप (व्यास: 30 मिमी) माउंट। एक पानी गीला कपास झाड़ू के साथ अतिरिक्त सिलिकॉन रबर निकालें और रात भर इलाज.
    2. RTV-1 सिलिकॉन रबर के साथ ढक्कन पर एक दौर कवरस्लिप (व्यास: 22 मिमी) माउंट। एक पानी गीला कपास झाड़ू के साथ अतिरिक्त सिलिकॉन रबर निकालें और रात भर इलाज.
  3. एक इमेजिंग कक्ष में नमूना प्लेस, BABB-D15 की एक छोटी मात्रा में जोड़ें, और ढक्कन डालें. इनलेट के माध्यम से BABB-D15 के साथ कक्ष भरें, एक hypodermic सुई का उपयोग कर (27 जी x 3/4 इंच [0.40 मिमी x 20 मिमी]).
  4. इनलेट प्लग और RTV-1 सिलिकॉन रबर के साथ इमेजिंग कक्ष सील. अंधेरे में रात भर इलाज.

7. इमेजिंग और छवि प्रसंस्करण

  1. इस्तेमाल किया फ्लोरोफोर्स मैच के लिए संबंधित लेजर लाइनों का चयन करके छवि अधिग्रहण की स्थापना की। चैनलों के बीच संकेत ओवरलैप को रोकने के लिए प्रत्येक डिटेक्टर का पता लगाने पर्वतमाला समायोजित करें।
    नोट: एलेक्सा फ्लोर 488, एलेक्सा फ्लोर 568, और टू-प्रो-3 के लिए अनुकरणीय पता लगाने पर्वतमाला 500-550 एनएम, 590-620 एनएम, और 645-700 एनएम, क्रमशः कर रहे हैं।
  2. प्राप्ति पैरामीटर चुनें, z-स्टैक के ऊपरी और निचले बॉर्डर को परिभाषित करें, और छवि स्टैक प्राप्त करें.
    नोट: अनुकरणीय अधिग्रहण पैरामीटर 60-90 एनएम के पिक्सेल आकार के साथ एक अनुक्रमिक स्कैन, 0.5 डिग्री मीटर का एक z-चरण आकार, 1 की एक पंक्ति औसत, 400 हर्ट्ज की स्कैन गति, और 1 एयरी यूनिट का पिनहोल आकार है।
  3. 3D अनुमानों को जनरेट करने या गहन विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (उदा., फिजी) का उपयोग करके छवि स्टैक संसाधित करें.
    नोट:: अधिग्रहीत छवि फ़ाइलों के बड़े आकार के कारण, एक कार्यस्थान का उपयोग आमतौर पर आवश्यक है।
    1. प्राप्ति या छवि फ़ाइल (फ़ाइलों) को फिजी में खोलें (फाइल ] ओपन ] फ़ाइलों का चयन करें).
      1. यदि उपयोग कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, . LIF फ़ाइलें, का चयन करें या जैव-स्वरूप संवाद विंडो में इच्छित विकल्प ों को अचयनित करें। हाइपरस्टैकके साथ स्टैक देखें | उसके अलावा, कोई विशिष्ट चयन या ticks आवश्यक हैं. प्रेस ठीकहै |
      2. यदि फ़ाइल में एकाधिक छवि स्टैक हैं, तो विश्लेषण करने और ठीकदबाकर पुष्टि करने के लिए लोगों का चयन करें.
    2. मर्ज की गई छवि को अलग-अलग चैनलों में विभाजित करके ब्लीच सुधार करें (छवि | रंग ] चैनलउपकरण, तो और अधिक का चयन करें | विभाजित चैनल) प्रत्येक चैनल के लिए, ब्लीच सुधार का चयन करें (छवि ] समायोजित करें ] ब्लीच सुधार) और सरल अनुपात (पृष्ठभूमि तीव्रता: 0.0) का चयन करें।
      नोट: कुछ मामलों में, उदाहरण के लिए, जब संकेत का कोई रेखीय क्षय है या संकेत भी समग्र कमजोर है, सरल अनुपात विफल हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक्सपोनेंशियल फिट का प्रयास करें या ब्लीच सुधार को छोड़ दें।
    3. स्लाइडर्स का उपयोग कर प्रत्येक चैनल के लिए चमक और इसके विपरीत समायोजित करें (छवि ] समायोजित करें ] चमक ] इसके विपरीत).
    4. चैनल मर्ज करें (छवि ] रंग ] मर्ज चैनल), एक समग्र बनाने (छवि ] रंग ] चैनलउपकरण, तो और अधिक का चयन करें | कम्पोजिटबनाओ), और यह RGB प्रारूप में परिवर्तित (छवि ] रंग ] चैनलउपकरण, तो और अधिक का चयन करें | आरजीबी में कनवर्ट करें)
    5. यदि आवश्यक हो, तो परिकलन समय और फ़ाइल का आकार कम करने के लिएछवि स्टैक का आकार बदलें (छवि ] समायोजित करें ] आकार,दोनों विकल्पों पर टिकी प्लस bilinear प्रक्षेप).
    6. एक 3 डी प्रक्षेपण उत्पन्न (छवि ] ढेर ] 3 डी परियोजना)। प्रक्षेपण विधि के रूप में सबसे तेज बिंदु चुनें और अधिग्रहीत छवि स्टैक के z-चरण आकार से मेल करने के लिए स्लाइस रिक्ति सेट करें। अधिकतम गुणवत्ता के लिए, 1 करने के लिए रोटेशन कोण वेतन वृद्धि सेट और प्रक्षेप सक्षम करें। आवश्यकतानुसार पूर्ण रोटेशन, पारदर्शिता थ्रेशोल्ड और अस्पष्टता को संशोधित करें.
    7. यदि आवश्यक हो, तो 3D प्रक्षेप को वापस 8-बिट स्वरूप में कनवर्ट करके इसके विपरीत और चमक को फिर से समायोजित करें (छवि | टाइप करें ] 8-बिट)। संबंधित स्लाइडर्स का उपयोग करें (छवि ] समायोजित करें ] चमक ] इसके विपरीत) और छवि स्टैक RGB स्वरूप में reconvert के रूप में चरण 7.3.4 में वर्णित है.
    8. के रूप में 3 डी प्रक्षेपण सहेजें. TIF फ़ाइल (छवि फ़ाइल स्वरूप) और | AVI फ़ाइल (वीडियो फ़ाइल स्वरूप).

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Representative Results

iDISCO14 और uDISCO13 के संयोजन उच्च संकल्प सीएलएसएम के साथ मिलकर मस्तिष्क के ऊतकों और आसपास के सेलुलर संदर्भ के RABV संक्रमण के spatiotemporal संकल्प और plasticity में गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.

RABV फॉस्फोप्रोटीन (पी) के इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करते हुए, संक्रमित न्यूरोनल कोशिकाओं की जटिल परतों को माउस ब्रेन के मोटे वर्गों में देखा जा सकता है (चित्र 3)। बाद में, अधिग्रहीत छवि स्टैक के निर्बाध 3D अनुमानों का पुनर्निर्माण किया जा सकता है (चित्र 3ए, बी ,दाएँ फलक; एनिमेटेड चित्र 1). अंग सामग्री से उत्पन्न होने वाली प्रजातियों के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी और माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय देखभाल की जानी चाहिए। माउस मस्तिष्क के ऊतकों पर एंटी-माउस आईजीजी एंटीबॉडी के उपयोग के परिणामस्वरूप संवहनी प्रणाली का एक विशिष्ट धुंधला हो गया (चित्र 3बी, बाएं पैनल)। उच्च रिज़ॉल्यूशन के कारण छवि स्टैक प्राप्त हो जाते हैं, संक्रमण का मूल्यांकन एकल-कक्ष स्तर तक किया जा सकता है (चित्र 4), पर दावे की अनुमति देना, उदाहरण के लिए, कक्ष के भीतर प्रतिजन की बहुतायत और वितरण (चित्र4ब्) ).

माउस मस्तिष्क के ऊतकों के अलावा, प्रोटोकॉल भी अन्य पशु प्रजातियों से मस्तिष्क के ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है (जैसे, फेरेट्स) (चित्र 5; एनिमेटेड चित्र 2). संक्रमित फेरेट मस्तिष्क के विभिन्न डिब्बों से ली गई धाराओं से RABV संक्रमण की एक अलग डिग्री का पता चला (चित्र 5ए -डी)।

के रूप में मस्तिष्क कई अलग अलग सेलुलर subpopulations शामिल हैं, इन आबादी के बीच भेदभाव महत्वपूर्ण है. सेल मार्करों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करना, संक्रमित और पड़ोसी कोशिकाओं की सेलुलर पहचान का आकलन संभव है. उदाहरण के लिए, एस्ट्रोसाइट्स को ग्लिल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से विभेदित किया जा सकता है (GFAP) (चित्र 6A,C; एनिमेटेड चित्रा 3), जबकि न्यूराइट विशेष रूप से microtubule-संबद्ध प्रोटीन 2 (MAP2) के लिए दाग जा सकता है (चित्र 6बी, डी; एनिमेटेड चित्र 4). इसके साथ ही, वायरल प्रोटीन, इस मामले में, RABV न्यूक्लिओप्रोटीन (एन), संक्रमित कोशिकाओं और प्रकाश डाला सेलुलर subpopulation के बीच संबंध का आकलन करने के लिए costained किया जा सकता है.

Figure 1
चित्र 1 : मूल सिद्धांत और प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह. (ए) रेनियर एट अल 14 और पैन एट अल13से प्रोटोकॉल के आधार पर कार्यप्रवाह का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व . (बी) दो अनुकरणीय फेरेट मस्तिष्क स्लाइस, एक से पहले (बाएं पैनल) और कार्बनिक सॉल्वैंट्स (दाएं पैनल) के साथ उपचार के बाद एक . समाशोधन ऊतक ऑप्टिकली पारदर्शी तो पठनीय पाठ द्वारा प्रेक्षणीय के रूप में बदल जाता है. मंजूरी दे दी मस्तिष्क टुकड़ा एक 3 डी मुद्रित इमेजिंग कक्ष (दाएं पैनल) में एम्बेडेड है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : 3 डी मुद्रित इमेजिंग कक्ष के तकनीकी चित्रण. (ए) इमेजिंग चैम्बर का विस्फोट दृश्य ड्राइंग। डॉट-डैश्ड लाइनें उन घटकों को हाइलाइट करती हैं जिन्हें आरटीवी-1 सिलिकॉन रबर का उपयोग करके एक दूसरे पर माउंट किया जाना है। डैश्ड रेखाएँ कक्ष के बाद की असेंबली के लिए निर्देशों का प्रतिनिधित्व करती हैं. (बी) इमेजिंग चैम्बर की सीएडी (कंप्यूटर-सहायता प्राप्त डिजाइन) फाइल। इसी | इमेजिंग चैम्बर मुद्रित करने के लिए STL फ़ाइल अनुपूरक सामग्रीमें पाया जा सकता है. (सी) पूरी तरह से इकट्ठे इमेजिंग चैम्बर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : RABV संक्रमित माउस मस्तिष्क के ऊतकों के दीप ऊतक इमेजिंग. (ए और बी) चूहे एक पुनः संयोजक vulpine सड़क वायरस से संक्रमित थे. RABV पी धुंधला (हरा) मंजूरी दे दी मस्तिष्क के ऊतकों के अंदर बड़े, उलझा हुआ न्युराइट अनुमानों के साथ संक्रमित न्यूरोनल परतों का पता चलता है। न्यूक्ली को TO-PRO-3 (नीला) से मुकाबला किया गया। (बी) माउस ऊतक पर फ्लोरोफोर-लेबलेड एंटी-माउस आईजी माध्यमिक एंटीबॉडी (लाल) का उपयोग संवहनी प्रणाली की एक विशिष्ट लेबलिंग में परिणाम है। अधिग्रहीत छवि ढेर के 3 डी पुनर्निर्माण विभिन्न देखने के कोण से अवलोकन सक्षम बनाता है (ए और बी, सही पैनल). स्केल बार्स ] 60 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : उच्च संकल्प छवि अधिग्रहण एक एकल सेल स्तर तक जटिल आकलन सक्षम बनाता है. मस्तिष्क एक अकाली L16 संक्रमित माउस से अलग किया गया था. (ए) RABV P धुंधला (हरा) एक व्यक्तिगत रूप से संक्रमित न्यूरॉन पर प्रकाश डाला गया. (ठ और ब्) विस्तार से चित्र और अनुमान यह प्रदर्शित करते हैं कि प्रतिजन बहुतायत, वितरण और स्थानीयकरण का गहन विश्लेषण किया जा सकता है। न्यूक्ली को TO-PRO-3 (नीला) से मुकाबला किया गया। स्केल बार्स ] 20 डिग्री मी (ए), 5 डिग्री मी (सी) कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : RABV संक्रमित फेरेट मस्तिष्क के ऊतकों के दीप ऊतक इमेजिंग. फेरेट्स कुत्ते सड़क RABV से संक्रमित थे. (ए-डी) मस्तिष्क के निर्दिष्ट क्षेत्रों से स्लाइस लिया गया, RABV पी (हरी) के लिए इम्यूनोसम्पसित, और ऑप्टिकली मंजूरी दे दी. अनुमानों से पता चलता है कि मस्तिष्क के विभिन्न भागों में संक्रमित कोशिकाओं राशि और आकारिकी में अलग. इसके अलावा, वे माउस व्युत्पन्न के अलावा अन्य ऊतकों के लिए प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता पर प्रकाश डाला. न्यूक्ली को TO-PRO-3 (नीला) से मुकाबला किया गया। स्केल बार्स ] 60 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : मल्टीकलर इम्यूनोफ्लोरेसेंस सेलुलर मार्करों के costaining की अनुमति देता है. कुत्ते सड़क RABV से संक्रमित फेरेट से मस्तिष्क ऊतक स्लाइस का इस्तेमाल किया गया और RABV एन (लाल) और या तो (ए और सी) GFAP (हरा) या (बी और डी) MAP2 (हरा) के लिए coimmunostained. जबकि GFAP एक एस्ट्रोसाइट मार्कर है, MAP2 विशेष रूप से neurites पर प्रकाश डाला गया. न्यूक्ली को TO-PRO-3 (नीला) से मुकाबला किया गया। (सी और डी) तल पर विलय किए गए अनुमानों से परिगणित विवरण दृश्यों के एकल स्लाइस निष्कर्षणों को दर्शाया गया है। स्केल बार ] 15 डिग्री मी (ए और बी) 10 डिग्री मी (सी और डी) कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Animated Figure 1
एनिमेटेड चित्रा 1: 3 डी पुनर्निर्माण और RABV संक्रमित माउस दिमाग से छवि ढेर के विस्तार अनुमानों. अनुमान चित्र 3में वर्णित छवि स्टैक से उत्पन्न किए गए थे. (ए और सी) पूरे संबंधित z-स्टैक के एनिमेशन. (ख) वीडियो के आरंभ में हाइलाइट किए गए क्षेत्रों के z-स्टैक के एक भाग के 3D पुनर्निर्माण का विस्तृत अनुमान। (घ) वीडियो के आरंभ में हाइलाइट किए गए क्षेत्रों के z-स्टैक के एक भाग के एक टोमोग्राम का विस्तृत प्रक्षेपण। ग्रीन ] RABV P; लाल जेड माउस आईजीजी; नीला ] नाभिक. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Animated Figure 2
एनिमेटेड चित्रा 2: एक RABV संक्रमित फेरेट मस्तिष्क से प्राप्त छवि ढेर के 3 डी पुनर्निर्माण. अनुमान चित्र 5में वर्णित छवि स्टैक से उत्पन्न किए गए थे. (ए-डी) एनोटेशन एक ही आंकड़ा को देखें और मस्तिष्क स्लाइस से लिया गया था मस्तिष्क के संबंधित क्षेत्रों का वर्णन. ग्रीन ] RABV P; नीला ] नाभिक. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Animated Figure 3
एनिमेटेड चित्रा 3: एस्ट्रोसाइट मार्कर GFAP के साथ costained एक RABV संक्रमित फेरेट मस्तिष्क के एक 3 डी पुनर्निर्माण के विभिन्न चैनलों के क्रमिक प्रक्षेपण. चित्र 6कमें वर्णित छवि स्टैक से अनुमान उत्पन्न किए गए थे। चैनलों के क्रमिक जोड़ RABV एन (लाल) के साथ शुरू होता है, जिसके बाद सेल नाभिक का पालन करें (नीला) और, अंत में, GFAP (हरा), जबकि घटाव पहले RABV N को हटा, तो सेल नाभिक, और अंत में GFAP. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Animated Figure 4
एनिमेटेड चित्रा 4: एक RABV संक्रमित फेरेट मस्तिष्क के एक 3 डी पुनर्निर्माण के विभिन्न चैनलों के क्रमिक प्रक्षेपण न्यूरॉन मार्कर MAP2 के साथ costained. चित्र 6खमें वर्णित छवि स्टैक से अनुमान उत्पन्न किए गए थे। चैनलों के क्रमिक जोड़ RABV N (लाल) के साथ शुरू होता है, जिसके बाद सेल नाभिक (नीला) का पालन करें और, अंत में, MAP2 (हरा), जबकि घटाव पहले RABV N को हटा, तो सेल नाभिक, और अंततः MAP2. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

हाल के वर्षों में ऊतक समाशोधन तकनीकों का पुनरुत्थान और आगे विकास2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 अंग ऊतक के उच्च मात्रा छवि ढेर प्राप्त करने के लिए कई नई संभावनाओं को खोल दिया है. यह कई अन्य विषयों, वायरस संक्रमण के बीच, अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय और शक्तिशाली उपकरण प्रदान की. इन छवि ढेर के बाद 3 डी पुनर्निर्माण पर परिष्कृत दावों सक्षम बनाता है, उदाहरण के लिए, वायरस tropism, बहुतायत, और संक्रमण के समय पाठ्यक्रम. यह प्रोटोकॉल विलायक-स्पष्ट मस्तिष्क ऊतक में RABV संक्रमण के इम्यूनोलेबलिंग-सहायता दृश्य का वर्णन करता है।

इम्यूनोलेबल, विलायक-स्पष्ट ऊतक की छवि ढेर की तैयारी और अधिग्रहण में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। पीएफए के लंबे समय तक संपर्क से एपिटोपोंका हो सकता है और इस प्रकार इसके परिणामस्वरूप प्रतिजनन में कमी आई 20 ,21,22. इसलिए, यह आवश्यक न्यूनतम करने के लिए निर्धारण समय को सीमित करने और एक उपयुक्त समाधान के लिए नमूने हस्तांतरण करने के लिए महत्वपूर्ण है (उदाहरण के लिए, पीबीएस लंबी अवधि के भंडारण के लिए 0.02% NaN3 के साथ पूरक). हालांकि, सभी प्रतिनिधि छवियों और अनुमानों यहाँ प्रदान संग्रहीत मस्तिष्क के नमूने से प्राप्त किया गया है, जिनमें से कुछ सप्ताह के लिए पीएफए में संग्रहीत किया गया था, अंग सामग्री है कि पीएफए के लिए उजागर किया गया है के लिए तकनीक की प्रयोज्यता पर प्रकाश डाला समय की विस्तारित अवधि. मानव मस्तिष्क के नमूनों के लिए इसी प्रकार के परिणाम 13 दिखाए गएहैं. एक और, नहीं तो सबसे अधिक, महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी ऊष्मायन है. एंटीबॉडी सांद्रता सावधानी से चुना जाना है. जबकि ज्यादातर मामलों में, मानक IHC सांद्रता गहरी ऊतक एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु हैं, कुछ प्रतिजनों एंटीबॉडी एकाग्रता के अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि दोनों RABV एन और पी इस्तेमाल एंटीबॉडी द्वारा आसानी से पता लगाने योग्य हैं. जबकि MeOH pretreatment आमतौर पर इम्यूनोलेबलिंग में सुधार करता है, कुछ एंटीजन इस उपचार के साथ असंगत हैं। उन लोगों के लिए, Renier और उनके सहयोगियों14 एक विकल्प MeOH मुक्त नमूना pretreatment प्रदान की. अधिग्रहीत छवि स्टैक के विश्लेषण के लिए पर्याप्त अभिकलन शक्ति की आवश्यकता होती है. स्टैक प्रति कई गीगाबाइट्स तक की बड़ी फ़ाइल आकार के कारण, शक्तिशाली कंप्यूटर छवियों को संसाधित करने के लिए आवश्यक हैं। पोस्टप्रोसेसिंग में अक्सर पृष्ठभूमि शोर का घटाव और अधिग्रहण-संबद्ध विरंजन प्रभावों की क्षतिपूर्ति करने के लिए एक ब्लीच सुधार शामिल होता है। दूरी को मापने के दौरान, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि, एक पक्ष प्रभाव के रूप में, ऊतक समाशोधन प्रक्रिया के दौरान सिकुड़ रहा है.

अन्य माइक्रोस्कोपी प्लेटफार्मों की तुलना में, जैसे प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) या दो-फोटोन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (2पीएलएसएम), सीएलएसएम की सबसे सीमित कार्य दूरी है। इसलिए, इमेजिंग के लिए मोटाई में 1 मिमी करने के लिए अंगों preslice करने के लिए आवश्यक है। साथ ही, CLSM अपने उच्च इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन के कारण सबसे धीमी प्राप्ति की गति है। एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप का उपयोग पूरे दिमाग इमेजिंग के लिए बड़ी मात्रा में तेजी से इमेजिंग के लिए अनुमति देगा, जबकि एक साथ छवि संकल्प त्याग. एक अन्य सीमा कम तरंगदैर्ध्य के साथ ऊतक autofluorscence के अंतर्निहित वृद्धि है. यह फ्लोरोफोर और 405 एनएम पर लेजर लाइन द्वारा उत्साहित रंगों का उपयोग renders, Hoechst रंगों सहित, असंभव के लिए अव्यावहारिक.

अन्य ऊतक समाशोधन तकनीक के संबंध में, iDISCO14 और uDISCO13 के संकर सबसे सकारात्मक विशेषताओं को जोड़ती है: यह अत्यधिक इम्यूनोस्टेनिंग के साथ संगत है, अत्यधिक बहुमुखी, अपेक्षाकृत तेजी से और सस्ती, यह है उत्कृष्ट समाशोधन क्षमताओं, और यह एक मानक confocal माइक्रोस्कोप के साथ संभव है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल इम्यूनोस्टेनिंग और मस्तिष्क के ऊतकों के समाशोधन के लिए प्रतिबंधित नहीं है, लेकिन यह भी अन्य नरम ऊतकों और रोगजनकों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है, दोनों neuroinvasive और गैर neuroinvasive. अंत में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल RABV संक्रमित मस्तिष्क ऊतक के उच्च संकल्प 3 डी इमेजिंग के लिए एक पाइप लाइन का प्रतिनिधित्व करता है. संक्रमित मस्तिष्क के ऊतकों के 3 डी पुनर्निर्माण RABV रोग प्रगति, रोगजनन, और neuroinvasion से संबंधित सवालों की एक किस्म के जवाब देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों ने थॉमस सी Mettenleiter और Verena te Kamp को समीक्षकों द्वारा पांडुलिपि पढ़ने के लिए धन्यवाद दिया। इस काम Mecklenburg पश्चिमी Pomerania और यूरोपीय सामाजिक कोष (ESF) अनुदान KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) और Lyssaviruses पर एक intramural सहयोगी अनुसंधान अनुदान के संघीय उत्कृष्टता पहल द्वारा समर्थित किया गया था पर Lyssaviruses पर फ्रेडरिक-लॉफलर-इंस्टीट्यूट (री-0372)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Benzyl alcohol Alfa Aesar 41218 Clearing reagent
Benzyl benzoate Sigma-Aldrich BB6630-500ML Clearing reagent
Dimethyl sulfoxide Carl Roth 4720.2 Various buffers
Diphenyl ether Sigma-Aldrich 240834-100G Clearing reagent
DL-α-Tocopherol Alfa Aesar A17039 Antioxidant
Donkey serum Bio-Rad C06SBZ Blocking reagent
Glycine Carl Roth 3908.2 Background reduction
Goat serum Merck S26-100ML Blocking reagent
Heparin sodium salt Carl Roth 7692.1 Background reduction
Hydrogen peroxide solution (30 %) Carl Roth 8070.2 Sample bleaching
Methanol Carl Roth 4627.4 Sample pretreatment
Paraformaldehyde Carl Roth 0335.3 Crystalline powder to make fixative solution
Sodium azide Carl Roth K305.1 Prevention of microbial growth in stock solutions
tert-Butanol Alfa Aesar 33278 Sample dehydration for tissue clearing
TO-PRO-3 Thermo Fisher T3605 Nucleic acid stain
Triton X-100 Carl Roth 3051.2 Detergent
Tween 20 AppliChem A4974,0500 Detergent
Miscellaneous
5 mL reaction tubes Eppendorf 0030119401 Sample tubes
Coverslip, circular (diameter: 22 mm) Marienfeld 0111620 Part of imaging chamber
Coverslip, circular (diameter: 30 mm) Marienfeld 0111700 Part of imaging chamber
Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) B. Braun 4657705 Filling of the imaging chamber with clearing solution
RTV-1 silicone rubber Wacker Elastosil E43 Adhesive for the assembly of the imaging chamber
Ultimaker CPE 2.85 mm transparent Ultimaker 8718836374869 Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber
Technical equipment and software
3D printer Ultimaker Ultimaker 2+ Printing of imaging chamber
Automated water immersion system Leica 15640019 Software-controlled water pump
Benchtop orbital shaker Elmi DOS-20M Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)
Benchtop orbital shaker, heated New Brunswick Scientific G24 Environmental Shaker Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm)
Confocal laser scanning microscope Leica DMI 6000 TCS SP5 Inverted confocal microscope for sample imaging
Fiji NIH (ImageJ) open source software (v1.52h) Image processing package based on ImageJ
Long working distance water immersion objective Leica 15506360 HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
Vibratome Leica VT1200S Sample slicing
Workstation Dell Precision 7920 CPU: Intel Xeon Gold 5118
GPU: Nvidia Quadro P5000
RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4
SSD: 2 TB
Primary antibodies
Goat anti-RABV N Friedrich-Loeffler-Institut Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N
Dilution: 1:400
Rabbit anti-GFAP Dako Z0334 Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382)
Dilution: 1:100
Rabbit anti-MAP2 Abcam ab32454 Polyclonal antibody (RRID:AB_776174)
Dilution: 1:250
Rabbit anti-RABV P 160-5 Friedrich-Loeffler-Institut Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010)
Dilution: 1:1,000
Secondary antibodies
Donkey anti-goat IgG Thermo Fisher Scientific depending on conjugated fluorophore Highly cross-absorbed
Dilution: 1:500
Donkey anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific depending on conjugated fluorophore Highly cross-absorbed
Dilution: 1:500
Donkey anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific depending on conjugated fluorophore Highly cross-absorbed
Dilution: 1:500
Goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific depending on conjugated fluorophore Highly cross-absorbed
Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific depending on conjugated fluorophore Highly cross-absorbed
Dilution: 1:500

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 146 Confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी uDISCO iDISCO इम्यूनोफ्लोरेसेंस ऊतक समाशोधन ऑप्टिकल समाशोधन गहरी ऊतक एंटीबॉडी लेबलिंग 3 डी इमेजिंग रेबीज वायरस मस्तिष्क तंत्रिका आक्रमण रोगजनन
विलायक-स्पष्ट मस्तिष्क ऊतक में रेबीज वायरस संक्रमण के उच्च संकल्प 3 डी इमेजिंग
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Zaeck, L., Potratz, M., Freuling, C. M., Müller, T., Finke, S. High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue. J. Vis. Exp. (146), e59402, doi:10.3791/59402 (2019).

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