Name: Imaging 3D ad alta risoluzione dellinfezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Scopri tecniche di immunocolorazione con rimozione del solvente per l'imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale di topo. Questo metodo consente l'analisi dettagliata delle cellule neuronali infette.

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Gli autori ringraziano Thomas C. Mettenleiter e Verena te Kamp per aver letto criticamente il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Federal Excellence Initiative del Meclemburgo Western Pomerania e dal Fondo sociale europeo (FSE) Grant KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) e da una sovvenzione di ricerca collaborativa inmurale sui Friedrich-Loeffler-Institute (Ri-0372).

È stato utilizzato materiale cerebrale archiviato fissato in RABV, fissato pIS. I rispettivi studi sugli studi sugli animali sono stati valutati dal responsabile della cura degli animali, dell'uso e del comitato etico dell'Ufficio statale per l'agricoltura, la sicurezza alimentare e la pesca in Meclemburgo-Pomerania occidentale (LALFF M-V) e hanno ottenuto l'approvazione con autorizzazioni 7221.3-2.1-002/11 (topi) e 7221.3-1-068/16 (furetti). Le cure generali e i metodi utilizzati negli esperimenti sugli animali sono stati effettuati secondo le linee guida approvate.
AVVISO: Questo protocollo utilizza varie sostanze tossiche e/o nocive, tra cui PFA, metanolo (MeOH), perossido di idrogeno (H2O2),azide di sodio (NaN3), TBA, BA, BB e DPE. MeOH e TBA sono altamente infiammabili. Evita l'esposizione indossando adeguati dispositivi di protezione personale (un camice da laboratorio, guanti e protezione degli occhi) e conducendo esperimenti in un cofano di fumi. Raccogliere i rifiuti separatamente in contenitori appropriati e smaltirlo secondo le normative locali. Il virus della rabbia è classificato come patogeno a livello di biosicurezza (BSL)-2 e può, pertanto, essere generalmente gestito in condizioni di BSL-2. Alcune attività, tra cui procedure che possono generare aerosol, lavorare con alte concentrazioni di virus, o lavorare con nuovi lyssavirus, possono richiedere classificazione BSL-3. La profilassi pre-esposizione è consigliata per il personale ad alto rischio, compresi i custodi di animali e i lavoratori di laboratorio18,19. Fare riferimento alle normative degli enti locali.
1. Fissazione del tessuto cerebrale e sezionamento
<ol><li>Fissare i campioni cerebrali in un volume appropriato del 4% di PFA nella salina con buffer fosfato (PBS [pH 7.4]) per almeno 48 h a 4 gradi centigradi (con un rapporto tissutale/fissatore approssimativo di 1:10 [v/v]).</li>
	<li>Lavare i campioni di tessuto 3x in PBS per almeno 30 min ogni lavaggio e conservarli in 0,02% NaN3/PBS a 4 gradi centigradi fino all'uso.</li>
	<li>Sezionare il tessuto in sezioni spesse 1 mm utilizzando un vibratome (velocità di alimentazione della lama: 0,3–0,5 mm/s, ampiezza: 1 mm, spessore della fetta: 1.000 m).</li>
	<li>Per mantenere la corretta sequenza di fette, conservare ogni sezione di tessuto separatamente in un pozzo di una piastra di coltura cellulare multi-bene. Aggiungere lo 0,02% NaN3/PBS e conservare le sezioni di tessuto a 4 gradi centigradi fino all'uso.</li>
</ol>2. Sample pretrattamento con metanolo
NOTA: Eseguire tutti i passaggi di incubazione con oscillazione delicata e, se non indicato altrimenti, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. Il pretrattamento del campione serve allo scopo generale di migliorare la diffusione degli anticorpi e ridurre l'autofluorescenza dei tessuti mediante esposizione a MeOH e H2O2, rispettivamente14.
<ol><li>Preparare le soluzioni 20% (v/v), 40%, 60% e 80% MeOH in acqua distillata. Ad esempio, per il 20% Di MeOH, aggiungere 10 mL di 100% MeOH a 40 mL di acqua distillata in un recipiente sigillabile appropriato e mescolare invertendolo.</li>
	<li>Trasferire i campioni su recipienti di dimensioni ragionevoli (ad esempio, tubi di reazione da 5 mL). Fare attenzione a utilizzare materiali chimicamente resistenti ai reagenti utilizzati in questo protocollo. Per esempio, si noti che mentre il polipropilene è adatto, il polistirolo non lo è. NOTA: le specifiche di volume in questo protocollo si riferiscono a tubi di reazione 5 mL. Se si utilizza un recipiente diverso, regolare i volumi di conseguenza.</li>
	<li>Incubare i campioni in 4 mL di ogni concentrazione della serie preparata di soluzioni MeOH in ordine crescente per 1 h ciascuno.</li>
	<li>Incubare i campioni 2x per 1 h ciascuno in puro (100%) Meoh.</li>
	<li>Raffreddare i campioni a 4 gradi centigradi (ad esempio, in un frigorifero sicuro per laboratorio).</li>
	<li>Preparare la soluzione di sbiancamento (5% H2O2 in MeOH), ad esempio, diluendo una soluzione stock 30% H2O2 a 1:6 in puro (100%) MeOH, e raffreddare a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Rimuovere il 100% MeOH dai campioni refrigerati e aggiungere 4 mL di soluzione di sbiancamento preschilled (5% H2O2 in MeOH). Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Scambiare la soluzione di sbiancamento per 4 mL di 80% MeOH e incubare per 1 h. Continuare utilizzando la serie preparata di soluzioni MeOH in ordine decrescente per 1 h ciascuno fino a quando i campioni sono stati incubati per 1 h in 4 mL di 20% MeOH.</li>
	<li>Lavare i campioni 1x per 1 h con 4 mL di PBS.</li>
</ol>3. Immunostaining
NOTA: Eseguire tutti i passaggi di incubazione con oscillazione delicata e, se non indicato altrimenti, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. Per prevenire la crescita microbica, aggiungere NaN3 a una concentrazione finale dello 0,02% alle soluzioni di questa sezione. I campioni di tessuto sono ulteriormente permeabilizzati dal trattamento con detergenti non ionici Triton X-100 e Tween 20. Il siero normale viene utilizzato per bloccare il legame dell'anticorpo non specifico. Glicina e eparina vengono aggiunte per ridurre lo sfondo di immunoetichettatura14.
<ol><li>Lavare i campioni 2x per 1 h ciascuno in 4 mL di 0,2% Triton X-100/PBS.</li>
	<li>Permialita i campioni per 2 giorni a 37 mL con 4 mL di 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M glicina/PBS.</li>
	<li>Bloccare il legame non specifico degli anticorpi incubando i campioni per 2 giorni a 37 mL in 4 mL dello 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% siero normale/PBS. NOTA: Utilizzare il siero normale della stessa specie in cui è stato allevato l'anticorpo secondario per ottenere risultati di blocco ideali.</li>
	<li>Incubare i campioni in 2 mL di soluzione anticorpale primaria (3% siero normale/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 con eparina] - anticorpi primari/ anticorpi) per 5 giorni a 37 . Aggiornare la soluzione anticorpale primaria dopo 2,5 giorni.<ol>
<li>Per PTwH, ricostituire il sale di sodio di eparina in acqua distillata per realizzare una soluzione di riserva da 10 mg/mL (memorizzare questa soluzione, aliquotata, a 4 gradi centigradi). Aggiungete la soluzione di stock allo 0,2% Tween 20/PBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. NOTA: la scelta della corretta diluizione dell'anticorpo può richiedere l'ottimizzazione. In generale, le concentrazioni standard di immunoistochimica sono un buon punto di partenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare i campioni per 1 giorno in 4 mL di PTwH, scambiando il tampone di lavaggio almeno 4x-5x durante il corso della giornata e lasciando il lavaggio finale durante la notte.</li>
	<li>Incubare i campioni in 2 mL di soluzione anticorpale secondaria (3% siero normale/PTwH - anticorpi secondari/anticorpi) per 5 giorni a 37 . Aggiornare la soluzione anticorpale secondaria dopo 2,5 giorni.<ol>
<li>Diluire gli anticorpi secondari/anticorpi a 1:500 nella soluzione anticorpale secondaria (cioè 4 ll in 2 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare i campioni per 1 giorno come descritto al punto 3.5, lasciando il lavaggio finale acceso durante la notte.</li>
</ol>4. Colorazione nucleare
NOTA: Eseguire tutti i passaggi di incubazione con oscillazione delicata e, se non indicato altrimenti, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. Se non è necessaria alcuna colorazione nucleare o se per l'eccitazione o la rilevazione di un altro fluoroforo è necessaria alcuna colorazione nucleare o lo spettro di lunghezza d'onda/emissione di eccitazione di TO-PRO-3, saltare questo passaggio.
<ol><li>Diluire la macchia acida nucleica TO-PRO-3 a 1:1,000 in PTwH e incubare i campioni in 4 mL di soluzione di colorazione nucleare per 5 h.</li>
	<li>Lavare i campioni per 1 giorno come descritto al punto 3.5, lasciando il lavaggio finale acceso durante la notte. NOTA: Dopo aver lavato i suoi oligogliani, i campioni possono essere conservati in PBS a 4 gradi centigradi fino alla compensazione ottica.</li>
</ol>5. Sgombera dei tessuti
NOTA: Eseguire tutti i passaggi di incubazione con oscillazione delicata e, se non indicato altrimenti, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. I campioni di tessuto sono disidratati in una serie graduata di soluzioni TBA. Poiché l'immunostaining richiede soluzioni acquose, tutte le procedure di colorazione devono essere completate prima della compensazione dei tessuti. La distanza ottica e l'abbinamento dell'indice refrattivo si ottengono mediante trattamento con una miscela di BA, BB e DPE. La soluzione di compensazione è integrata con DL-z-tocopherol come antiossidante13.
<ol><li>Preparare le soluzioni TBA 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% e 96% e 96% in acqua distillata. Ad esempio, per il 30% di TBA, aggiungere 15 mL di 100% TBA a 35 mL di acqua distillata in un recipiente sigillabile appropriato e mescolare invertendo. NOTA: TBA ha un punto di fusione di 25-26 gradi centigradi; quindi, tende ad essere solido a temperatura ambiente. Al fine di preparare le soluzioni TBA, scaldare la bottiglia ben sigillata a 37 gradi centigradi in un'incubatrice o in un bagno d'acqua.</li>
	<li>Disidratare i campioni con 4 mL di ogni concentrazione della serie preparata di soluzioni TBA in ordine crescente per 2 h ciascuno. Lasciare il 96% TBA acceso durante la notte.</li>
	<li>Disidratare ulteriormente i campioni in puro (100%) TBA per 2 h.</li>
	<li>Preparare la soluzione di compensazione BABB-D15. NOTA: BABB-D15 è una combinazione di BA e BB (BABB) che viene mescolata con DPE ad un rapporto di x:1, dove x è specificato nel nome della soluzione, in questo caso 15.<ol>
<li>Per BABB, mescolare una parte BA con due parti BB.</li>
		<li>Mescolare BABB e DPE ad un rapporto di 15:1.</li>
		<li>Aggiungere 0,4 vol% DL-tocopherol (vitamina E). NOTA: Ad esempio, per 20 mL di BABB-D15, mescolare 6,25 mL di BA con 12,5 mL di BB. Aggiungere 1,25 mL di DPE e integrarlo con 0,08 mL di DL-z-tocopherol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cancellare i campioni nella soluzione di compensazione fino a quando non sono otticamente trasparenti (2-6 h).</li>
	<li>I campioni possono essere conservati a 4 gradi centigradi in BABB-D15, protetti dalla luce, fino al montaggio e all'imaging.</li>
</ol>6. Montaggio del campione
<ol><li>Utilizzando una stampante 3D, stampare la camera di imaging e il coperchio (materiale: copolyester [CPE], ugello: 0,25 mm, altezza strato: 0,06 mm, spessore della parete: 0,88 mm, conteggio parete: 4, riempimento: 100%, nessuna struttura di supporto; la corrispondente . STL si trova nei <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59402/3D_ImagingChamber.stl" target="_blank">Materiali supplementari</a> di questo protocollo).</li>
	<li>Assemblare la camera di imaging (Figura 2).<ol>
<li>Montare una vetritta rotonda (diametro: 30 mm) sulla camera di imaging con RTV-1 (un componente della temperatura-temperatura) gomma in silicone. Rimuovere la gomma in silicone in eccesso con un tampone di cotone bagnato dall'acqua e curare durante la notte.</li>
		<li>Montare una vestra rotonda (diametro: 22 mm) sul coperchio con gomma siliconica RTV-1. Rimuovere la gomma in silicone in eccesso con un tampone di cotone bagnato dall'acqua e curare durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mettere il campione in una camera di imaging, aggiungere un piccolo volume di BABB-D15 e inserire il coperchio. Riempire la camera con BABB-D15 attraverso l'inseridio, utilizzando un ago ipodermico (27 G x 3/4 di pollice [0,40 mm x 20 mm]).</li>
	<li>Collegare l'inseridie e sigillare la camera di imaging con gomma in silicone RTV-1. Cura durante la notte al buio.</li>
</ol>7. Imaging ed elaborazione delle immagini
<ol><li>Impostare l'acquisizione dell'immagine selezionando le rispettive linee laser in modo che corrispondano ai fluorofori utilizzati. Regolare gli intervalli di rilevamento di ciascun rivelatore per evitare la sovrapposizione del segnale tra i canali. NOTA: gli intervalli di rilevamento esemplari per Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 e TO-PRO-3 sono rispettivamente 500-550 nm, 590-620 nm e 645-700 nm.</li>
	<li>Scegliere i parametri di acquisizione, definire il bordo superiore e inferiore dello z-stack e acquisire la pila di immagini. NOTA: I parametri di acquisizione esemplari sono una scansione sequenziale con una dimensione in pixel di 60-90 nm, una dimensione z-step di 0,5 m, una media di linea di 1, una velocità di scansione di 400 Hz e una dimensione di foro stenopeico di 1 unità Airy.</li>
	<li>Elaborare la pila di immagini utilizzando un software di analisi delle immagini appropriato (ad esempio, Fiji) per generare proiezioni 3D o eseguire analisi approfondite. NOTA: a causa delle grandi dimensioni dei file di immagine acquisiti, l'uso di una workstation è di solito necessario.<ol>
<li>Aprire i file di acquisizione o di immagine in Fiji (File Proprietà Open . Selezionare i file).<ol>
<li>Se si utilizza, ad esempio, . LIF, selezionare o deselezionare le opzioni desiderate nella finestra di dialogo Bioformati. Visualizza stack con Hyperstack. A parte questo, non sono necessarie selezioni o zecche specifiche. Premere OK.</li>
			<li>Se il file contiene più pile di immagini, selezionare quelle da analizzare e confermare premendo OK.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire la correzione della candeggina suddividendo l'immagine unita in singoli canali (Immagine Proprietà Color (Colore) Strumento Canali, quindi selezionare Altro Dividi canali). Per ogni canale, selezionare la correzione della candeggina (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Correzione sbiancamento) e scegliere Rapporto semplice (intensità di sfondo: 0.0). NOTA: In alcuni casi, ad esempio, quando non c'è decadimento lineare del segnale o il segnale è troppo debole nel complesso, Simple Ratio potrebbe fallire. In alternativa, prova Exponential Fit o salta la correzione della candeggina.</li>
		<li>Regolare la luminosità e il contrasto per ciascun canale utilizzando i cursori (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Proprietà Brightness . Contrasto).</li>
		<li>Unire i canali (Immagine Proprietà Color (Colore) Unisci canali), crea un composito (Immagine Proprietà Color (Colore) Strumento Canali, quindi selezionare Altro Crea composito) e convertirlo in formato RGB (Immagine Proprietà Color (Colore) Strumento Canali, quindi selezionare Altro Converti in RGB).</li>
		<li>Se necessario, ridimensionare la pila di immagini per ridurre il tempo di calcolo e le dimensioni del file (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Dimensione, entrambe le opzioni selezionate più interpolazione bilineare).</li>
		<li>Generazione di una proiezione 3D (Immagine Proprietà Stacks . Progetto 3D). Scegliete Punto più luminoso come metodo di proiezione e impostate la spaziatura della sezione in modo che corrisponda alla dimensione del passo z della pila di immagini acquisita. Per la massima qualità, impostate l'incremento dell'angolo di rotazione su 1 e attivate l'interpolazione. Modificare la rotazione totale, le soglie di trasparenza e l'opacità in base alle esigenze.</li>
		<li>Se necessario, regolare il contrasto e la luminosità convertendo di nuovo la proiezione 3D in formato a 8 bit (Immagine Proprietà Type (Tipo) 8 bit). Utilizzare i rispettivi cursori (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Proprietà Brightness . Contrasto) e riconvertire la pila di immagini in formato RGB come descritto nel passaggio 7.3.4.</li>
		<li>Salvare la proiezione 3D come . TIF (formato file immagine) e . File AVI (formato file video).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Survey+of+Methods+for+3D+Histology+Reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction.</a> Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell types.</a> Current Biology. 14 (13), 497-500 (2004).</li>
<li>von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+search+for+true+numbers+of+neurons+and+glial+cells+in+the+human+brain%3A+A+review+of+150+years+of+cell+counting%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting.</a> The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Rabies.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091(2017).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Expert+Consultation+on+Rabies%2C+Third+Report%5BTitle%5D)+AND+%22WHO+Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).</li>
<li>CDC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories%2C+5th+Edition.+US+Department+of+Health+and+Human+Services%22">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services</a>. , (2009).</li>
<li>Arnold, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+and+tissue+processing+on+immunohistochemical+demonstration+of+specific+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens.</a> Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li>
<li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li>
<li>Orbanz, J., Finke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+European+bat+lyssavirus+type+1+and+inter-genotypic+compatibility+of+lyssavirus+genotype+1+and+5+antigenome+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters.</a> Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La rinascita e l'ulteriore sviluppo delle tecniche di sgombero dei tessuti negli ultimi anni2,3,4,5,6,7,8, 9 (in vie , 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12...

Le tecniche istologiche convenzionali si basano principalmente su sezioni sottili di tessuti di organi, che possono fornire intrinsecamente solo approfondimenti 2D in un ambiente 3D complesso. Anche se fattibile in linea di principio, la ricostruzione 3D da sezioni sottili seriali richiede tubazioni tecniche impegnative sia per il taglio che per il successivo allineamento in silico delle immagini acquisite1. Inoltre, la ricostruzione senza soluzione di continuità dei volumi z dopo il taglio dei microtomi è fondamentale in quanto gli artefatti meccanici e computazionali possono rimanere a causa della registrazione dell'immagine non ottimale causata da piani di immagine non sovrapposti, variazioni di colorazione e distruzione del tessuto, ad esempio, dalla lama del microtoma. Al contrario, la suddivisione ottica pura di campioni di tessuto spesso intatti consente l'acquisizione di piani di immagine sovrapposti (sovracampionamento) e, quindi, facilita la ricostruzione 3D. Questo, a sua volta, è altamente vantaggioso per l'analisi dei processi di infezione in popolazioni cellulari complesse (ad esempio, reti neuronali nel contesto delle cellule leali e immunitarie circostanti). Tuttavia, gli ostacoli intrinseci delle sezioni dei tessuti spessi includono la dispersione della luce e la limitata penetrazione degli anticorpi nel tessuto. Negli ultimi anni, una varietà di tecniche è stata sviluppata e ottimizzata per superare questi problemi2,3,4,5,6,7,8 , 9 (in vie , 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12 mila , 13. In sostanza, i tessuti bersaglio vengono trasformatiotticamente trasparenti mediante trattamento con ,8,9 o organicsolvente-based10,11,12,13 soluzioni. L'introduzione di 3DISCO (3D imaging di organi con cancellazione del solvente)11,12 e il suo successore uDISCO (ultima imaging 3D di organi autorizzati solventi)13 ha fornito uno strumento relativamente veloce, semplice e poco costoso con eccellenti capacità di compensazione. I principali costituenti del protocollo di compensazione sono i solventi organici tert-butanol (TBA), l'alcol benzyl (BA), il benzyl benzoato (BB) e l'etere difenile (DPE). Lo sviluppo e l'aggiunta di iDISCO (immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs)14, un protocollo di immunostaining compatibile, ha costituito un altro vantaggio rispetto ai metodi esistenti e ha permesso l'etichettatura dei tessuti profondi degli antigeni di interesse, nonché l'immagazzinamento a lungo termine di campioni immunostainsi. Pertanto, la combinazione di iDISCO14 e uDISCO13 consente l'imaging ad alta risoluzione di proteine con etichetta tura anticorpo in grandi sezioni di tessuto (fino a 1 mm) utilizzando CLSM convenzionale.
La conservazione della struttura complessa di un organo in tutte e tre le dimensioni è particolarmente importante per il tessuto cerebrale. I neuroni costituiscono una sottopopolazione cellulare molto eterogenea con morfologie 3D altamente diverse in base alle loro proiezioni neurite (riviste da Masland15). Inoltre, il cervello è costituito da un certo numero di compartimenti e sottocomparti, ciascuno composto da diverse sottopopolazioni cellulari e rapporti di essi, tra cui cellule gliali e neuroni (rivisto da von Bartheld et al.16). Come virus neurotropico, il virus della rabbia (RABV, recensito da Fooks et al.17) infetta principalmente i neuroni, utilizzando i loro macchinari di trasporto per viaggiare in retrogrado lungo gli assoni dal sito primario di infezione al sistema nervoso centrale (CNS). Il protocollo qui descritto (Figura 1A) consente il rilevamento e la visualizzazione assistita dall'immunostaining delle cellule infettate da RABV e RABV in grandi stack di immagini coerenti ottenuti da tessuto cerebrale infetto. Ciò consente una valutazione imparziale e 3D ad alta risoluzione dell'ambiente di infezione. È applicabile al tessuto cerebrale di una varietà di specie, può essere eseguito immediatamente dopo la fissazione o dopo lo stoccaggio a lungo termine di campioni in paraformaldeide (PFA), e consente lo stoccaggio e il reimaging di campioni macchiati e cancellati per mesi.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Alfa Aesar</td><td>41218</td><td>Reagente di chiarificazione</td></tr><tr><td>Benzyl benzoato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BB6630-500ML</td><td>Reagente di chiarificazione</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Carl Roth</td><td>4720.2</td><td>Vari tamponi</td></tr><tr><td>Etere di difenile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240834-100G</td><td>Reagente schiarente</td></tr><tr><td>DL-&alfa;-Tocoferolo</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17039</td><td>Antiossidante</td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SBZ</td><td>Reagente bloccante</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Carl Roth</td><td>3908.2</td><td>Riduzione dello sfondo</td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Merck</td><td>S26-100ML</td><td>Reagente bloccante</td></tr><tr><td>Eparina sale sodico</td><td>Carl Roth</td><td>7692.1</td><td>Sfondo riduzione</td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno (30 %)</td><td>Carl Roth</td><td>8070.2</td><td>Sbiancamento dei campioni</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Carl Roth</td><td>4627.4</td><td>Pretrattamento dei campioni</td></tr><tr><td>Paraformaldeide Carl</td><td>Roth</td><td>0335.3</td><td>Polvere cristallina per la produzione di soluzione fissativa</td></tr><tr><td>Azoturo di sodio</td><td>Carl Roth</td><td>K305.1</td><td>Prevenzione della crescita microbica nelle soluzioni madre</td></tr><tr><td>terz-butanolo</td><td>Alfa Aesar</td><td>33278</td><td>Disidratazione del campione per la pulizia dei tessuti</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Thermo Fisher</td><td>T3605</td><td>Colorazione dell'acido nucleico</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td>Detersivo</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Reazione detergente</td></tr><tr><td><forte>Varie</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr>5 <tr><td>ml tubi</td><td>Eppendorf</td><td>0030119401</td><td>Provette per campioni</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti, circolare (diametro: 22 mm)</td><td>Marienfeld</td><td>0111620</td><td>Parte della camera di imaging</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti, circolare (diametro: 30 mm)</td><td>Marienfeld</td><td>0111700</td><td>Parte della camera di imaging</td></tr><tr><td>Ago ipodermico (27 G x &frac34; &rdquo; [0,40 mm x 20 mm])</td><td>B. Braun</td><td>4657705</td><td>Riempimento della camera di imaging con soluzione di pulizia</td></tr><tr><td>RTV-1 gomma siliconica</td><td>Wacker</td><td>Elastosil E43</td><td>Adesivo per l'assemblaggio della camera di imaging</td></tr><tr><td>Ultimaker CPE 2,85 mm trasparente</td><td>Ultimaker</td><td>8718836374869</td><td>Filamento di copoliestere per stampante 3D per stampare parti della camera di imaging</td></tr><tr><td>Attrezzature tecniche e software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stampante 3D</td><td>Ultimaker</td><td>Ultimaker 2+</td><td>Stampa della camera di imaging</td></tr><tr><td>Sistema automatizzato di immersione in acqua</td><td>Leica</td><td>15640019</td><td>Pompa dell'acqua controllata da software Agitatore</td></tr><tr><td>orbitale da banco</td><td>Elmi</td><td>DOS-20M</td><td>Incubazione del campione a temperatura ambiente (~ 150 giri/min)</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale da banco, riscaldato</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>G24 Agitatore ambientale</td><td>Incubazione del campione a 37 gradi C (~ 150 giri/min)</td></tr><tr><td>Microscopio a scansione laser confocale</td><td>Leica</td><td>DMI 6000 TCS SP5</td><td>Microscopio confocale invertito per l'imaging di campioni</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH (ImageJ)</td><td>Software open source (v1.52h)</td><td>Pacchetto di elaborazione delle immagini basato su ImageJ</td></tr><tr><td>Obiettivo ad immersione in acqua a lunga distanza di lavoro</td><td>Leica</td><td>15506360</td><td>HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Workstation</td><td>Dell</td><td>Precision 7920</td> di slicing <td>di esempio: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB</td></tr><tr><td>Anticorpi primari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-RABV N</td><td>Friedrich-Loeffler-Institut</td><td></td><td>Siero policlonale monospecifico di capra anti-RABV N, generato mediante immunizzazione di capra con nucleoproteina RABV N espressa da baculovirus e purificata con His-tag Diluizione: 1:400</td></tr><tr>Anticorpo policlonale<td>di coniglio</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>(RRID:AB_10013382) Diluizione: 1:100</td></tr><tr>Anticorpo policlonale di<td>coniglio anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab32454</td><td>(RRID:AB_776174) Diluizione: 1:250</td></tr><tr><td>Anti-RABV di coniglio P 160-5</td><td>Friedrich-Loeffler-Institut</td><td></td><td>Siero policlonale policlonale monospecifico di coniglio anti-RABV P, generato mediante immunizzazione di coniglio con fosfoproteina RABV espressa da baculovirus e His-tag-purificata P (vedi riferimento 23: Orbanz et al., 2010) Diluizione: 1:1.000</td></tr><tr><td><forte>Anticorpi secondari</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-capra IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>a seconda del coniugato fluoroforo</td><td>Altamente assorbito Diluizione: 1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-topo d'asino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>a seconda del fluoroforo coniugato</td><td>Altamente assorbito Diluizione: 1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio d'asino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>a seconda del fluoroforo coniugato</td><td>Altamente assorbito Diluizione: 1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-topo di capra</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>a seconda del fluoroforo coniugato</td><td>Altamente assorbito Diluizione: 1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio di capra</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>a seconda del fluoroforo coniugato</td><td>Altamente assorbito Diluizione: 1:500</td></tr></tbody></table>

imaging 3d ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

La visualizzazione dei processi di infezione nei tessuti e negli organi mediante immunoetichettatura è un metodo chiave nella moderna biologia delle infezioni. La capacità di osservare e studiare la distribuzione, il tropismo e l'abbondanza di agenti patogeni all'interno dei tessuti degli organi fornisce dati cardine sullo sviluppo e la progressione della malattia. Utilizzando metodi di microscopia convenzionali, l'immunoetichettatura è per lo più limitata a sezioni sottili ottenute da campioni conbloccati o congelati con paraffina. Tuttavia, il piano di immagine 2D limitato di queste sezioni sottili può portare alla perdita di informazioni cruciali sulla struttura complessa di un organo infetto e sul contesto cellulare dell'infezione. Le moderne tecniche di compensazione dei tessuti multicolore e immunostaining ora forniscono un modo relativamente veloce ed economico per studiare pile di immagini 3D ad alto volume di tessuto di organi infettati da virus. Esponendo il tessuto a solventi organici, diventa otticamente trasparente. Corrisponde agli indici di rifrazione del campione e alla fine porta a una significativa riduzione della diffusione della luce. Pertanto, in combinazione con obiettivi di lunga distanza di lavoro liberi, grandi sezioni di tessuto fino a 1 mm di dimensioni possono essere immagini dalla microscopia a scansione laser confocale convenzionale (CLSM) ad alta risoluzione. Qui, descriviamo un protocollo per applicare l'imaging dei tessuti profondi dopo la compensazione dei tessuti per visualizzare la distribuzione del virus della rabbia nei cervelli infetti al fine di studiare argomenti come la patogenesi del virus, la diffusione, il tropismo e la neuroinvasione.

La combinazione di iDISCO14 e uDISCO13 accoppiato con CLSM ad alta risoluzione fornisce una profonda conoscenza della risoluzione spatiotemporale e della plasticità dell'infezione rabV del tessuto cerebrale e del contesto cellulare circostante.
Utilizzando l'immunostainizzazione della fosfora RABV (P), gli strati complessi di cellule neuronali infette possono essere visualizzati in spesse sezioni di cervelli murini (Figura 3<...

Nuove tecniche di sgombero dei tessuti immunostaining come l'ultima imaging 3D di organi autorizzati dai solventi consentono la visualizzazione 3D dell'infezione cerebrale da virus del virus della rabbia e del suo complesso ambiente cellulare. Le fette spesse di tessuto cerebrale etichettate con anticorpi sono rese otticamente trasparenti per aumentare la profondità di imaging e consentire l'analisi 3D mediante microscopia a scansione laser confocale.

Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Questo protocollo consente la visualizzazione dell'infezione da virus e fornisce approfondimenti approfonditi sulla risoluzione spaziotemporale dell'ambiente di infezione e sul contesto cellulare circostante. L'applicabilità dell'immunosocienza relativa all'imaging dei tessuti profondi non solo consente il rilevamento di virus, ma di fatto consente anche la differenziazione di varie sottopopolazioni cellulari utilizzando i rispettivi marcatori cellulari. Per fissare il tessuto per l'immunostaining posizionare i campioni cerebrali in un rapporto uno-10 del 4% di paraformaldeide in PBS per campionare il volume del tessuto per almeno 48 ore a quattro gradi Celsius.Al termine del periodo di fissazione lavare i campioni di tessuto tre volte in PBS per almeno 30 minuti per lavaggio prima di trasferire i campioni in azide di sodio al 02% in PBS a quattro gradi Celsius. Quindi utilizzare un vibratomo impostato su una velocità di avanzamento della lama da 0,3 a 0,5 millimetri al secondo per sessare i tessuti in sezioni spesse da un millimetro. Conservare le sezioni in azide fresco allo 02% di sodio in PBS a quattro gradi Celsius.Per il pretrattamento del metanolo immergere i campioni in una

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Qui si descrive un metodo rapido e semplice per celle di immagine fluorescente in semi-densi fettine di cervello. Fissando, affettare, e otticamente compensazione tessuto cerebrale si descrivono le modalità standard di imaging epifluorescente o confocale può essere utilizzato per visualizzare le singole cellule e reti neuronali all'interno intatto tessuto nervoso.

Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

Il virus infetta i neuroni piramidali nella corteccia cerebrale e le proteine virali espresse si localizzano all'interno di strutture granulari intracitoplasmatiche note come corpi di inclusione.

Rilevamento di proteine virali nel tessuto cerebrale di topo infetto da virus della rabbia

Questo video dimostra la colorazione immunoistochimica per il rilevamento dell'antigene del virus della rabbia nel tessuto cerebrale di topo infetto. Il processo include la deparaffinazione e il trattamento con alcol, seguiti da un trattamento proteolitico per migliorare l'accessibilità dell'antigene. La colorazione immunoistochimica rivela precipitati rossi, confermando la presenza di antigeni della rabbia nella sezione tissutale.

Una colorazione immunoistochimica per la rilevazione degli antigeni del virus della rabbia

Fonte: Zaeck, L., et al. Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia in tessuto cerebrale eliminato con solvente. J. Vis. Exp. (2019).  Questo video mostra il processo di preparazione e imaging del tessuto cerebrale di topo infettato dal virus della rabbia (RABV) per valutare la progressione dell'infezione. Descrive i passaggi chiave, tra cui la colorazione dei tessuti con marcatori fluorescenti, la disidratazione, la pulizia e il montaggio per la microscopia a scansione...

Visualizzazione tridimensionale di un'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale del topo

Il test immunohistochimico rapido diretto (DRIT) offre un'Organizzazione Mondiale per la Salute Animale e l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OIE/OMS) riconosciuta alternativa al test di anticorpo fluorescente diretto (DFA) per la diagnosi della rabbia. Questo test consente di applicazioni sul campo che possono essere eseguite in circa 1 h su impronte cerebrali utilizzando la microscopia leggera.

Sorveglianza della rabbia migliorata utilizzando un test immunoistochimico rapido diretto

Presentiamo un protocollo completo per la diagnosi post-mortem della rabbia animale in condizioni di campo utilizzando un rapido test diagnostico immunocromatico (RIDT), dal campionamento della biopsia cerebrale all'interpretazione finale. Descriviamo anche ulteriori applicazioni utilizzando il dispositivo per l'analisi molecolare e la genotipizzazione virale.

Test diagnostico immunocromatico rapido sulla rabbia sul campo per impostazioni limitate alle risorse con ulteriori applicazioni molecolari

Qui, presentiamo un protocollo di test immunoistochimico per la rilevazione dell'antigene del virus della rabbia come test diagnostico alternativo per i tessuti fissati alla formalina.

Test immunoistochimico per il rilevamento dell'antigene del lyssavirus da tessuti fissati con formalina

Questo protocollo presenta un approccio basato su qRT-PCR per determinare il numero di copia genica della nucleoproteina del virus della rabbia (N) all'interno di varie strutture anatomiche cerebrali bovine utilizzando la trascrizione in vitro.

Quantificazione del virus della rabbia in varie strutture cerebrali bovine

Qui, presentiamo un flusso di lavoro rapido ed economico per la caratterizzazione dei genomi del virus della rabbia (RABV) utilizzando la tecnologia dei nanopori. Il flusso di lavoro ha lo scopo di supportare la sorveglianza basata sulla genomica a livello locale, fornendo informazioni sui lignaggi RABV circolanti e sul loro posizionamento all'interno delle filogenesi regionali per guidare le misure di controllo della rabbia.

Sequenziamento dell'intero genoma per una rapida caratterizzazione del virus della rabbia utilizzando la tecnologia Nanopore

Questo protocollo dimostra il test della reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) in tempo reale della trascrizione inversa del pan-lyssavirus LN34 dalla raccolta dei tessuti all'interpretazione dei risultati, compresi gli aggiornamenti alle sequenze e alle formulazioni dei primer per migliorare le prestazioni del test per alcuni lissavirus e lagomorfi non antirabbici. Dimostriamo anche la configurazione del saggio per un formato multiplex LN34 a pozzetto singolo (LN34M).

Diagnosi post-mortem della rabbia negli animali mediante il test di reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale LN34 aggiornato e multiplexato

Scopri tecniche di immunocolorazione con rimozione del solvente per l'imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale di topo. Questo metodo consente l'analisi dettagliata delle cellule neuronali infette.

Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente

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