Summary
Roman, immunokleuring-compatibele weefsel clearing technieken zoals de ultieme 3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen toestaan de 3D-visualisatie van rabiësvirus herseninfectie en zijn complexe cellulaire omgeving. Dikke, antilichaam gelabelde hersenweefsel segmenten zijn optisch transparant gemaakt om de beeld diepte te vergroten en 3D-analyse mogelijk te maken door confocale laser scanning microscopie.
Abstract
De visualisatie van infectie processen in weefsels en organen door immunolabeling is een belangrijke methode in de moderne infectie biologie. De mogelijkheid om de verdeling, het tropisme en de overvloed van pathogenen in orgaan weefsels te observeren en bestuderen, verschaft cruciale gegevens over ziekte ontwikkeling en progressie. Met conventionele microscopie methoden is immunolabeling meestal beperkt tot dunne secties die zijn verkregen uit met paraffine ingesloten of bevroren monsters. Het beperkte 2D-beeldvlak van deze dunne secties kan echter leiden tot het verlies van cruciale informatie over de complexe structuur van een geïnfecteerd orgaan en de cellulaire context van de infectie. Moderne Multicolor, immunokleuring-compatibele weefsel clearing technieken bieden nu een relatief snelle en goedkope manier om high-volume 3D-beeld stapels van virus-geïnfecteerde orgaanweefsel te bestuderen. Door het weefsel bloot te stellen aan organische oplosmiddelen, wordt het optisch transparant. Dit komt overeen met de brekingsindices van het monster en leidt uiteindelijk tot een significante reductie van lichtverstrooiing. Dus, in combinatie met lange vrije-afstands doelstellingen, kunnen grote weefsel delen tot 1 mm in grootte worden afgebeeld door conventionele confocale laser scanning microscopie (CLSM) bij hoge resolutie. Hier beschrijven we een protocol om Deep-tissue-beeldvorming toe te passen na weefsel clearing om rabiësvirus distributie in geïnfecteerde hersenen te visualiseren om onderwerpen als virus pathogenese, verspreiding, tropisme en neuro invasies te bestuderen.
Introduction
Conventionele histologie technieken vertrouwen meestal op dunne delen van orgaan weefsels, die inherent alleen 2D-inzichten kunnen bieden in een complexe 3D-omgeving. Hoewel het in principe haalbaar is, vereist 3D-reconstructie van seriële dunne secties veeleisende technische pijpleidingen voor zowel snijden als daaropvolgende in silico-uitlijning van de verkregen beelden1. Bovendien is een naadloze reconstructie van z-volumes na microtoom-snijden cruciaal omdat zowel mechanische als computationele artefacten kunnen blijven vanwege suboptimale beeldregistratie veroorzaakt door niet-overlappende afbeeldings vlakken, kleurings variaties en fysieke vernietiging van weefsel door bijvoorbeeld het mes van de microtoom. Zuiver optisch snijden van intacte dikke weefselmonsters zorgt daarentegen voor de verwerving van overlappende beeld vlakken (oversampling) en vergemakkelijkt daarmee de 3D-reconstructie. Dit, op zijn beurt, is zeer gunstig voor de analyse van infectie processen in complexe celpopulaties (bijvoorbeeld neuronale netwerken in de context van de omringende gliacellen en immune cellen). Echter, inherente obstakels van dikke weefsel secties omvatten lichtverstrooiing en beperkte antilichaam penetratie in het weefsel. In de afgelopen jaren is een verscheidenheid aan technieken ontwikkeld en geoptimaliseerd om deze problemen te overwinnen2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. in wezen worden doelweefsels optisch transparant gedraaid door middel van een behandeling met ofwel waterige2,3,4,5,6,7 ,8,9 of op organische oplosmiddelgebaseerde 10,11,12,13 oplossingen. De introductie van 3disco (3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen)11,12 en zijn opvolger udisco (Ultimate 3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen)13 voorzag in een relatief snelle, eenvoudige en goedkope tool met uitstekende clearing mogelijkheden. De belangrijkste bestanddelen van het clearing protocol zijn de organische oplosmiddelen tert-butanol (TBA), benzylalcohol (BA), Benzylbenzoaat (BB) en difenyl ether (DPE). De ontwikkeling en toevoeging van iDISCO (immunolabeling-enabled 3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen)14, een compatibel immunokleurings protocol, vormde een ander voordeel ten opzichte van bestaande methoden en stelde de diepe weefsel etikettering van antigenen van belang, evenals de lange termijn opslag van immuunbevlekte monsters. Zo zorgt de combinatie van iDISCO14 en udisco13 voor de beeldvorming met hoge resolutie van antilichaam-gelabelde eiwitten in grote weefsel secties (tot 1 mm) met conventionele CLSM.
Het behoud van de complexe structuur van een orgel in alle drie de dimensies is vooral belangrijk voor hersenweefsel. Neuronen bestaan uit een zeer heterogene cellulaire subpopulatie met zeer uiteenlopende 3D-morfologieën op basis van hun neuriet projecties (beoordeeld door Masland15). Bovendien bestaat de hersenen uit een aantal compartimenten en subcompartimenten, elk samengesteld uit verschillende cellulaire subpopulaties en ratio's daarvan, met inbegrip van gliacellen en neuronen (beoordeeld door von Bartheld et al.16). Als een trope virus, het rabiësvirus (rabv, beoordeeld door Fooks et al.17) infecteert voornamelijk neuronen, met behulp van hun transportmachines te reizen in retrograde richting langs axonen van de primaire site van infectie naar het centrale zenuwstelsel (CNS). Het hier beschreven Protocol (Figuur 1A) maakt de detectie en visualisatie van rabv en rabv geïnfecteerde cellen mogelijk in grote, samenhangende beeld stapels verkregen uit geïnfecteerd hersenweefsel. Dit maakt een onbevooroordeelde, 3D hoge-resolutie beoordeling van de infectie omgeving. Het is van toepassing op hersenweefsel van een verscheidenheid van soorten, kan onmiddellijk worden uitgevoerd na fixatie of na de lange termijn opslag van monsters in Paraformaldehyde (PFA), en laat de opslag en reimaging van bevlekte en gewiste monsters voor maanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RABV-geïnfecteerde, PFA-vaste gearchiveerde hersen materiaal werd gebruikt. De respectieve dierexperimentele studies werden geëvalueerd door de verantwoordelijke dierenzorg, het gebruik en de ethische commissie van het staatsbureau voor landbouw, voedselveiligheid en visserij in Mecklenburg-Voor-Pommeren (LALFF M-V) en hebben goedkeuring gekregen met machtigingen 7221.3-2.1-002/11 (muizen) en 7221.3-1-068/16 (fretten). De algemene zorg en methoden die bij de dierproeven worden gebruikt, zijn volgens de goedgekeurde richtsnoeren uitgevoerd.
Let op: dit protocol maakt gebruik van verschillende toxische en/of schadelijke stoffen, waaronder PFA, methanol (MeOH), waterstofperoxide (H2O2), natrium natriumazide (Nan3), TBA, BA, BB en DPE. MeOH en TBA zijn zeer licht ontvlambaar. Vermijd blootstelling door het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (een Labcoat, handschoenen en oogbescherming) en het uitvoeren van experimenten in een rook afzuigkap. Verzamel afval afzonderlijk in geschikte containers en gooi het weg volgens de lokale voorschriften. Rabiësvirus is geclassificeerd als een bioveiligheidsniveau (BSL)-2 pathogeen en kan, daarom, over het algemeen worden behandeld onder BSL-2 voorwaarden. Sommige activiteiten, waaronder procedures die aërosolen kunnen genereren, werken met hoge virus concentraties of werken met roman lyssavirussen, kunnen BSL-3-classificatie vereisen. Pre-exposure profylaxe wordt aanbevolen voor risicovolle personeel, met inbegrip van dierenverzorgers en laboratoriummedewerkers18,19. Raadpleeg de voorschriften van de lokale overheid.
1. fixatie van hersenweefsel en snijden
- Repareer hersen monsters in een geschikt volume van 4% PFA in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS [pH 7,4]) voor ten minste 48 uur bij 4 °C (met een geschatte weefsel-tot-fixerende verhouding van 1:10 [v/v]).
- Was de weefselmonsters 3x in PBS gedurende ten minste 30 min elke was en bewaar ze in 0,02% NaN3/PBS bij 4 °c tot het gebruik.
- Sectie het weefsel in 1 mm dikke delen met behulp van een vibratome (Blade feed rate: 0.3 – 0.5 mm/s, amplitude: 1 mm, segment dikte: 1.000 μm).
- Om de juiste segment volgorde te behouden, moet u elke weefsel sectie afzonderlijk opslaan in een put van een multi well-celkweek plaat. Voeg 0,02% NaN3/PBS toe en bewaar de weefsel secties bij 4 °c tot het gebruik.
2. monstervoorbehandeling met methanol
Opmerking: Voer alle incubatie stappen uit met zachte oscillatie en, indien niet anders aangegeven, bij kamertemperatuur. Bescherm de monsters tegen licht. De voor behandeling van het monster dient het algemene doel van het verbeteren van de antilichaam diffusie en het verminderen van weefsel autofluorescentie door blootstelling aan MeOH en H2O2, respectievelijk14.
- Bereid 20% (v/v), 40%, 60% en 80% MeOH-oplossingen in gedistilleerd water. Bijvoorbeeld, voor 20% MeOH, voeg 10 mL 100% MeOH toe aan 40 mL gedistilleerd water in een geschikt afsluitbare vat en meng door het te inverteren.
- Breng de monsters over naar redelijk grote vaten (bijv. 5 mL reactie buizen). Zorg voor het gebruik van materialen die chemisch resistent zijn voor de reagentia die in dit protocol worden gebruikt. Bijvoorbeeld, merk op dat terwijl polypropyleen geschikt is, polystyreen is niet.
Opmerking: de volume specificaties in dit protocol verwijzen naar 5 mL reactie buizen. Als een ander vat wordt gebruikt, past u de volumes dienovereenkomstig aan. - Inbroed de monsters in 4 mL van elke concentratie van de bereide reeks MeOH-oplossingen in oplopende volgorde van elk 1 uur.
- Inincuberen de monsters 2x voor 1 h elk in puur (100%) MeOH.
- Koel de monsters af tot 4 °C (bijv. in een laboratorium veilige koelkast).
- Bereiding bleek oplossing (5% H2o2 in meoh) door bijvoorbeeld een 30% h2o2 stockoplossing te verdunen bij 1:6 in pure (100%) MeOH, en chill het op 4 °C.
- Verwijder de 100% MeOH uit de gekoelde monsters en voeg 4 mL voorgekoelde bleek oplossing (5% H2O2 in meoh) toe. Inincuberen op 4 °C.
- Ruil de bleek oplossing in voor 4 mL 80% MeOH en inincuberen gedurende 1 uur. Gebruik de bereide reeks MeOH-oplossingen in aflopende volgorde voor 1 uur per stuk totdat de monsters gedurende 1 uur in 4 mL van 20% MeOH zijn geïnbroed.
- Was de monsters 1x voor 1 uur met 4 mL PBS.
3. immunokleuring
Opmerking: Voer alle incubatie stappen uit met zachte oscillatie en, indien niet anders aangegeven, bij kamertemperatuur. Bescherm de monsters tegen licht. Om microbiële groei te voorkomen, voegt u NaN3 toe aan een eindconcentratie van 0,02% aan de oplossingen in deze sectie. Weefselmonsters worden verder doordrongen door behandeling met nietionogene detergenten Triton X-100 en tween 20. Normaal serum wordt gebruikt om onspecifieke antilichaam binding te blokkeren. Glycine en heparine worden toegevoegd om de immunolabeling-achtergrond te verminderen14.
- Was de monsters 2x voor 1 h per stuk in 4 mL 0,2% Triton X-100/PBS.
- Permeabiliseer de monsters gedurende 2 dagen bij 37 °C met 4 mL 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0,3 M glycine/PBS.
- Blokkeer de niet-specifieke binding van antilichamen door de monsters gedurende 2 dagen te bebroed bij 37 °C in 4 mL 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% normaal serum/PBS.
Opmerking: gebruik het normale serum van dezelfde soort als het secundaire antilichaam werd verhoogd om ideale blokkerende resultaten te bereiken. - Inincuberen de monsters in 2 mL primaire antilichaam oplossing (3% normaal serum/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 met heparine] + primair antilichaam/antilichamen) gedurende 5 dagen bij 37 °C. Vernieuw de primaire antilichaam oplossing na 2,5 dagen.
- Voor PTwH, reconstitueer het heparine natriumzout in gedistilleerd water om een 10 mg/mL stockoplossing te maken (Bewaar deze oplossing, alicgeciteerd, bij 4 °C). Voeg de stockoplossing toe aan 0,2% tween 20/PBS tot een eindconcentratie van 10 μg/mL.
Opmerking: het kiezen van de juiste antilichaam verdunning kan optimalisatie vereisen. Over het algemeen zijn standaard immunohistochemie concentraties een goed uitgangspunt.
- Voor PTwH, reconstitueer het heparine natriumzout in gedistilleerd water om een 10 mg/mL stockoplossing te maken (Bewaar deze oplossing, alicgeciteerd, bij 4 °C). Voeg de stockoplossing toe aan 0,2% tween 20/PBS tot een eindconcentratie van 10 μg/mL.
- Was de monsters 1 dag in 4 mL PTwH, ruil de reinigings buffer ten minste 4x – 5x in de loop van de dag en laat de laatste wasbeurt 's nachts rusten.
- Inincuberen de monsters in 2 mL secundaire antilichaam oplossing (3% normaal serum/PTwH + secundair antilichaam/antilichamen) gedurende 5 dagen bij 37 °C. Vernieuw de secundaire antilichaam oplossing na 2,5 dagen.
- Verdun het secundaire antilichaam/antilichamen tegen 1:500 in secundaire antilichaam oplossing (d.w.z. 4 μL in 2 mL).
- Was de monsters 1 dag zoals beschreven in stap 3,5, waardoor de laatste wasbeurt 's nachts wordt verlaten.
4. nucleaire kleuring
Opmerking: Voer alle incubatie stappen uit met zachte oscillatie en, indien niet anders aangegeven, bij kamertemperatuur. Bescherm de monsters tegen licht. Als er geen nucleaire kleuring vereist is of als de excitatie golflengte/emissiespectrum van TO-PRO-3 vereist is voor de excitatie of detectie van een andere fluorophore, sla deze stap dan over.
- Verdun de nucleïnezuur vlek tot-PRO-3 bij 1:1000 in PTwH en inbroed de monsters in 4 mL kern kleurings oplossing gedurende 5 uur.
- Was de monsters 1 dag zoals beschreven in stap 3,5, waardoor de laatste wasbeurt 's nachts wordt verlaten.
Opmerking: na de wassen kunnen de monsters worden opgeslagen in PBS bij 4 °C tot de optische clearing.
5. weefsel clearing
Opmerking: Voer alle incubatie stappen uit met zachte oscillatie en, indien niet anders aangegeven, bij kamertemperatuur. Bescherm de monsters tegen licht. De weefselmonsters zijn gedehydrateerd in een gesorteerde reeks van TBA-oplossingen. Aangezien bij de immunokleuring waterige oplossingen nodig zijn, moeten alle kleurings procedures vóór de weefsel clearing worden voltooid. Optische klaring en brekingsindex matching worden bereikt door behandeling met een mengsel van BA, BB en DPE. De clearing oplossing wordt aangevuld met DL-α-tocoferol als een antioxidant13.
- Bereid 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% en 96% TBA-oplossingen in gedistilleerd water. Voeg bijvoorbeeld voor 30% TBA 15 mL 100% TBA toe aan 35 mL gedistilleerd water in een geschikt afsluitbaar vat en meng door inverting.
Opmerking: TBA heeft een smeltpunt van 25 – 26 °C; Dus, het neigt te zijn solide bij kamertemperatuur. Verwarm de goed afgedichte fles op 37 °C in een incubator of waterbad om TBA-oplossingen voor te bereiden. - Dehydraat de monsters met 4 mL van elke concentratie van de bereide reeks TBA-oplossingen in oplopende volgorde voor elk 2 uur. Laat de 96% TBA 's nachts.
- Dehydraat de monsters verder in zuivere (100%) TBA voor 2 uur.
- Maak clearing Solution BABB-D15.
Opmerking: BABB-D15 is een combinatie van BA en BB (BABB) die wordt gemengd met DPE in een verhouding van x: 1, waarbij x is opgegeven in de naam van de oplossing, in dit geval 15.- Meng voor BABB een deel BA met twee delen BB.
- Meng BABB en DPE in een verhouding van 15:1.
- Voeg 0,4 vol% DL-α-tocoferol (vitamine E) toe.
Opmerking: Meng bijvoorbeeld voor 20 mL BABB-D15 6,25 mL BA met 12,5 mL BB. Voeg 1,25 mL DPE toe en vul het aan met 0,08 mL DL-α-tocoferol.
- Wis de monsters in de klaringoplossing totdat ze optisch transparant zijn (2 – 6 h).
- De monsters kunnen worden bewaard bij 4 °C in BABB-D15, beschermd tegen licht, tot montage en beeldvorming.
6. monster montage
- Druk met behulp van een 3D-printer de beeldvormings kamer en het deksel (materiaal: copolyester [CPE], nozzle: 0,25 mm, laag hoogte: 0,06 mm, wanddikte: 0,88 mm, wand graaf: 4, infill: 100%, geen ondersteuningsstructuur; de corresponderende. STL-bestand kan worden gevonden in de aanvullende materialen van dit Protocol).
- Monteer de Imaging kamer (Figuur 2).
- Monteer een ronde Afdeklijst (diameter: 30 mm) op de Imaging kamer met RTV-1 (één-component kamer-temperatuur-vulcanizing) Silicone rubber. Verwijder het overtollige Silicone rubber met een waterbevoafd wattenstaafje en genezen 's nachts.
- Monteer een ronde afdek (diameter: 22 mm) op het deksel met RTV-1 Silicone rubber. Verwijder het overtollige Silicone rubber met een waterbevoafd wattenstaafje en genezen 's nachts.
- Plaats het monster in een beeldvormings kamer, voeg een klein volume BABB-D15 toe en plaats het deksel. Vul de kamer met BABB-D15 door de inlaat, met behulp van een hypodermische naald (27 G x 3/4 inch [0,40 mm x 20 mm]).
- Sluit de inlaat aan en verzegel de Imaging kamer met RTV-1 Silicone rubber. 'S nachts genezen in het donker.
7. Imaging en beeldverwerking
- Stel de beeld verwerving in door de respectieve laserlijnen te selecteren die overeenkomen met de gebruikte fluor. Pas het detectiebereik van elke detector aan om te voorkomen dat het signaal overlapping tussen kanalen.
Opmerking: voorbeeldige detectie marges voor Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 en TO-PRO-3 zijn respectievelijk 500 – 550 nm, 590 – 620 nm en 645 – 700 nm. - Kies de acquisitie parameters, definieer de boven-en onderrand van de z-stack en verkrijg de afbeeldings stack.
Opmerking: voorbeeldige acquisitie parameters zijn een sequentiële scan met een pixelgrootte van 60-90 nm, een z-Step grootte van 0,5 μm, een lijn gemiddelde van 1, een scansnelheid van 400 Hz en een pinhole grootte van 1 luchtige eenheid. - Verwerk de afbeeldings stack met behulp van de juiste beeldanalyse software (bijvoorbeeld Fiji) om 3D-projecties te genereren of diepgaande analyses uit te voeren.
Opmerking: vanwege de grote omvang van de verkregen afbeeldingsbestanden is het gebruik van een werkstation meestal noodzakelijk.- Open de acquisitie of het afbeeldingsbestand (en) in Fiji (bestand | Open | Selecteer bestanden).
- Als u bijvoorbeeld gebruikt. LIF-bestanden, selecteert u de gewenste opties in het dialoogvenster bio-indelingen en schakelt u deze uit. Bekijk de stack met Hyper stack. Anders dan dat, zijn geen specifieke selecties of teken nodig. Druk op OK.
- Als het bestand meerdere afbeeldingsstapels bevat, selecteert u de bestanden die u wilt analyseren en bevestigt u door op OKte drukken.
- Voer de Bleach-correctie uit door de samengevoegde afbeelding in afzonderlijke kanalen te splitsen (afbeelding | Kleur | Kanalen toolen selecteer meer | Gesplitste kanalen). Selecteer voor elk kanaal Bleach Correction (afbeelding | Aanpassen | Bleekmiddel correctie) en kies eenvoudige verhouding (achtergrond intensiteit: 0,0).
Opmerking: in sommige gevallen, bijvoorbeeld, wanneer er geen lineair verval van het signaal of het signaal is te zwak over het algemeen, eenvoudige verhouding kan mislukken. U ook exponentiële pasvorm uitproberen of de Bleach-correctie overslaan. - Pas de helderheid en het contrast voor elk kanaal aan met behulp van de schuifregelaars (afbeelding | Aanpassen | Helderheid | Contrast).
- De kanalen samenvoegen (afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen), maak een composiet (afbeelding | Kleur | Kanalen toolen selecteer meer | Maak composiet) en converteer het naar de RGB-indeling (afbeelding | Kleur | Kanalen toolen selecteer meer | Converteren naar RGB).
- Wijzig zo nodig de grootte van de afbeeldingsstapel om de berekeningstijd en bestandsgrootte te verkleinen (afbeelding | Aanpassen | Grootte, beide opties aangevinkt plus bilineaire interpolatie).
- Een 3D-projectie genereren (afbeelding | Stapels | 3D-project). Kies helderste punt als projectie methode en stel de segment afstand in op de grootte van de z-stap van de verworven afbeeldingsstapel. Voor maximale kwaliteit stelt u de stap voor rotatiehoek in op 1 en schakelt u interpolatie in. Wijzig indien nodig de totale rotatie, transparantie drempels en dekking.
- Pas zo nodig het contrast en de helderheid aan door de 3D-projectie terug te zetten naar 8-bits indeling (afbeelding | Type | 8-bits). Gebruik de respectieve schuifregelaars (afbeelding | Aanpassen | Helderheid | Contrast) en converteer de afbeeldingsstapel opnieuw naar de RGB-indeling zoals beschreven in stap 7.3.4.
- Sla de 3D-projectie op als. TIF-bestand (Image File Format) en. AVI-bestand (videobestandsformaat).
- Open de acquisitie of het afbeeldingsbestand (en) in Fiji (bestand | Open | Selecteer bestanden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De combinatie van iDISCO14 en udisco13 in combinatie met CLSM met hoge resolutie biedt diepgaande inzichten in de spatiotemporele resolutie en plasticiteit van rabv infectie van hersenweefsel en de omringende cellulaire context.
Met behulp van immunokleuring van RABV fosfoproteïne (P) kunnen complexe lagen van geïnfecteerde neuronale cellen worden gevisualiseerd in dikke delen van muizenhersenen (Figuur 3). Vervolgens kunnen naadloze 3D-projecties van de verworven beeld stapels worden gereconstrueerd (Figuur 3A, B, rechter paneel; Animatie figuur 1). Er moet voorzichtig worden opgetreden bij het gebruik van primaire antilichamen en secundaire antilichamen tegen de soort waarvan het orgaan materiaal afkomstig is. Het gebruik van anti-muis IgG-antilichamen op muizen hersenweefsel resulteerde in een duidelijke kleuring van het vasculaire systeem (Figuur 3B, linker paneel). Vanwege de hoge resolutie waarin de beeld stapels worden verkregen, kan de infectie tot een eencellige niveau worden beoordeeld (Figuur 4), waardoor asserties kunnen worden vastgesteld op bijvoorbeeld de overvloed en de verdeling van het antigeen in de cel (Figuur 4C ).
Afgezien van muizen hersenweefsel, kan het protocol ook worden toegepast op hersenweefsel van andere diersoorten (bijv. fretten) (Figuur 5; Animatie figuur 2). Secties uit verschillende compartimenten van een geïnfecteerde Ferret hersenen onthulde een variërende mate van RABV infectie (Figuur 5a-D).
Omdat de hersenen veel verschillende cellulaire subpopulaties omvat, is differentiatie tussen deze populaties van vitaal belang. Bij het gebruik van antilichamen tegen celmarkeringen is het mogelijk om de cellulaire identiteit van besmette en naburige cellen te beoordelen. Zo kunnen astrocyten worden gedifferentieerd via de uitdrukking van gliacellen fibrillair zuur eiwit (GFAP) (Figuur 6A, C; Geanimeerde figuur 3), terwijl neurites specifiek kunnen worden gekleurd voor microtubulus-geassocieerde proteïne 2 (map2) (Figuur 6B, D; Animatie figuur 4). Tegelijkertijd kunnen virale eiwitten, in dit geval RABV nucleoproteïne (N), worden cobevlekt om de relatie tussen geïnfecteerde cellen en de gemarkeerde cellulaire subpopulatie te beoordelen.
Figuur 1 : Basisprincipe en workflow van het protocol. A) grafische weergave van de workflow op basis van de protocollen van Renier et al.14 en pan et al.13. B) twee voorbeeldige Ferret-hersen schijfjes, één voor (linker paneel) en één na behandeling met organische oplosmiddelen (rechter paneel). Clearing verandert het weefsel optisch transparant als waarneembaar door de dan leesbare tekst. De gewiste hersen Slice is ingebed in een 3D-gedrukte Imaging kamer (rechter paneel). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Technische illustratie van de 3D-gedrukte Imaging kamer. A) uitgelichte tekening van de beeldvormings kamer. De gestippelde lijnen accentueren componenten die op elkaar moeten worden gemonteerd met behulp van RTV-1 Silicone rubber. De onderbroken lijnen geven instructies voor de volgende assemblage van de kamer. B) CAD-bestand (computer-aided design) van de beeldvormings kamer. De corresponderende. STL-bestand voor het afdrukken van de Imaging kamer kan worden gevonden in de aanvullende materialen. C) volledig geassembleerde beeldvormings kamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Diep weefsel beeldvorming van RABV geïnfecteerde muizen hersenweefsel. (A en B) muizen werden geïnfecteerd met een recombinant zacht Street virus. RABV P kleuring (groen) onthult geïnfecteerde neuronale lagen met grote, verstrikt neuriet projecties in het geklaard hersenweefsel. Nuclei waren tegen-PRO-3 (blauw). B) het gebruik van fluorophore-gelabelde anti-muis IgG secundaire antilichamen (rood) op het muis weefsel resulteert in een duidelijke labeling van het vasculaire systeem. De 3D-reconstructie van de verworven beeld stapels maakt observatie vanuit verschillende kijkhoeken mogelijk (a en B, rechter panelen). Schaal staven = 60 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Beeld verwerving met een hoge resolutie maakt complexe evaluaties tot één celniveau mogelijk. De hersenen werd ontleed van een trieste L16-geïnfecteerde muis. A) Rabv P-kleuring (groen) wijst op een individueel geïnfecteerd neuron. (B en C) detail afbeeldingen en projecties tonen aan dat diepgaande analyses van de overvloed aan antigeen, distributie en lokalisatie kunnen worden uitgevoerd. Nuclei waren tegen-PRO-3 (blauw). Schaal staven = 20 μm (A), 5 μm (C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Diep weefsel beeldvorming van RABV geïnfecteerde Ferret hersenweefsel. Fretten werden geïnfecteerd met Canine Street RABV. (A–D) Segmenten uit bepaalde gebieden van de hersenen werden genomen, immunogekleurd voor RABV P (groen), en optisch gewist. Projecties tonen aan dat de geïnfecteerde cellen in verschillende delen van de hersenen verschillen in hoeveelheid en morfologie. Bovendien wijzen zij op de toepasselijkheid van het protocol op andere weefsels dan muizen. Nuclei waren tegen-PRO-3 (blauw). Schaal staven = 60 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Multicolor immunofluorescentie maakt de cokleuring van cellulaire markers mogelijk. Hersenweefsel plakjes van fretten geïnfecteerd met Canine Street RABV werden gebruikt en coimmunogekleurd voor RABV N (rood) en ofwel (a en C) GFAP (groen) of (B en D) map2 (groen). Terwijl GFAP een astrocyten marker is, wijst MAP2 specifiek op neurites. Nuclei waren tegen-PRO-3 (blauw). (C en D) aan de onderkant worden enkele schijfjes extracties van de geïnventariseerd detailweergaven uit de samengevoegde projecties afgebeeld. Schaal staven = 15 μm (a en B) 10 μm (C en D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Geanimeerde figuur 1:3D-reconstructies en detail projecties van beeld stapels van RABV-geïnfecteerde muizenhersenen. De projecties werden gegenereerd op basis van de in Figuur 3beschreven beeld stapels. (A en C) animaties van de gehele z-stacks. B) een gedetailleerde projectie van een 3D-reconstructie van een deel van de z-stack van de gebieden die aan het begin van de video zijn gemarkeerd. D) een gedetailleerde projectie van een Tomogram van een deel van de z-stack van de gebieden die aan het begin van de video zijn gemarkeerd. Groen = RABV P; rood = muis IgG; blauw = kernen. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Geanimeerde figuur 2:3D reconstructies van beeld stapels verworven van een RABV geïnfecteerde Ferret hersenen. De projecties werden gegenereerd op basis van de beeld stapels zoals beschreven in Figuur 5. (A–D) De aantekeningen verwijzen naar dezelfde figuur en beschrijven de respectieve gebieden van de hersenen waar de segmenten vandaan zijn gehaald. Groen = RABV P; blauw = kernen. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Geanimeerde figuur 3: geleidelijke projectie van de verschillende kanalen van een 3D reconstructie van een RABV geïnfecteerde Ferret hersenen costained met astrocyten marker GFAP. Projecties werden gegenereerd uit de beeld stapel zoals beschreven in Figuur 6A. De geleidelijke toevoeging van kanalen begint met RABV N (rood), waarna volgt de celkernen (blauw) en, ten slotte, GFAP (groen), terwijl de aftrekken eerst RABV N verwijdert, dan de celkernen, en uiteindelijk GFAP. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Geanimeerde figuur 4: geleidelijke projectie van de verschillende kanalen van een 3D reconstructie van een RABV geïnfecteerde Ferret hersenen costained met neuronale marker map2. Projecties werden gegenereerd uit de beeld stapel zoals beschreven in Figuur 6B. De geleidelijke toevoeging van kanalen begint met RABV N (rood), waarna volgt de celkernen (blauw) en, ten slotte, MAP2 (groen), terwijl de aftrekken eerst RABV N verwijdert, dan de celkernen, en uiteindelijk MAP2. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De heropleving en verdere ontwikkeling van weefsel clearing technieken in de afgelopen jaren2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 hebben vele nieuwe mogelijkheden voor het verkrijgen van een hoog volume beeld stapels van orgaanweefsel geopend. Dit voorzag in een ongeëvenaarde en krachtige tool om te studeren, onder vele andere onderwerpen, virus infectie. De daaropvolgende 3D-reconstructie van deze beeld stapels maakt geavanceerde asserties mogelijk, bijvoorbeeld virus tropisme, overvloed en het tijdsverloop van de infectie. Dit protocol beschrijft de immunolabeling-geassisteerde visualisatie van RABV-infectie in solvent-geklaard hersenweefsel.
Er zijn verschillende kritische stappen in de voorbereiding en overname van de beeld stapels van immunolabeled, solvent-geklaard weefsel. Langdurige blootstelling aan PFA kan epitopen maskeren en dus resulteren in een verminderde antigeniciteit20,21,22. Het is daarom belangrijk om de fixatie tijden tot het noodzakelijke minimum te beperken en de monsters over te dragen naar een passende oplossing (bijvoorbeeld PBS aangevuld met 0,02% NaN3 voor langdurige opslag). Alle representatieve afbeeldingen en projecties die hier worden verstrekt, zijn echter verkregen uit gearchiveerde hersen monsters, waarvan sommige al weken in PFA zijn opgeslagen, waarbij de toepasbaarheid van de techniek op orgaan materiaal wordt benadrukt dat is blootgesteld aan PFA voor langere tijd. Vergelijkbare resultaten zijn aangetoond voor menselijke hersenen monsters13. Een andere, zo niet de meest kritische stap is de antilichaam incubatie. De antilichaamconcentraties moeten zorgvuldig worden gekozen. Hoewel in de meeste gevallen standaard IHC-concentraties een goed uitgangspunt zijn voor de etikettering van diep weefsel antilichamen, kunnen sommige antigenen extra optimalisatie van de antilichaam concentratie vereisen. Dit protocol toont aan dat zowel RABV N als P gemakkelijk detecteerbaar zijn door de gebruikte antilichamen. Terwijl MeOH voor behandeling meestal immunolabeling verbetert, sommige antigenen zijn onverenigbaar met deze behandeling. Voor hen voorzag Renier en collega's14 in een alternatieve, meoh-vrije monstervoorbehandeling. Analyse van de verworven beeld stapels vereist voldoende rekenkracht. Vanwege de grote bestandsgrootten van maximaal enkele gigabytes per stack, zijn krachtige computers nodig om de afbeeldingen te verwerken. Nabewerking omvat vaak het aftrekken van achtergrondruis en een bleekmiddel correctie om te compenseren voor aanschaffing-geassocieerde bleken effecten. Bij het meten van afstanden moet in gedachten worden gehouden dat, als neveneffect, het weefsel tijdens het clearing proces krimpt.
In vergelijking met andere microscopie platforms, zoals licht blad fluorescentiemicroscopie (LSFM) of Two-photon laser scanning microscopie (2PLSM), heeft CLSM de meest beperkte werkafstand. Daarom is het noodzakelijk om organen te preslice tot 1 mm in dikte voorbeeld vorming. Bovendien heeft CLSM de langzaamste acquisitie snelheid vanwege de hoge beeldvormings resolutie. Het gebruik van een licht blad Microscoop zou zorgen voor snellere beeldvorming van grotere volumes tot hele hersen beeldvorming, terwijl tegelijkertijd de beeldresolutie wordt opgeofferd. Een andere beperking is de inherente toename van weefsel autofluorescentie met afnemende golflengte. Dit maakt het gebruik van fluoroforen en kleurstoffen opgewonden door de laser lijn op 405 nm, inclusief Hoechst kleurstoffen, onpraktisch tot onmogelijk.
Met betrekking tot andere weefsel clearing technieken, de hybride van iDISCO14 en udisco13 combineert de meest positieve attributen: het is zeer compatibel met immunokleuring, zeer veelzijdig, relatief snel en goedkoop, het heeft uitstekende clearing capaciteiten, en het is haalbaar met een standaard confocale Microscoop. Bovendien is dit protocol niet beperkt tot de immunokleuring en clearing van hersenweefsel, maar kan het ook worden toegepast op een verscheidenheid van andere zachte weefsels en pathogenen, zowel neuroinvasief als niet-neuroinvasief. Concluderend, het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een pijpleiding voor hoge-resolutie 3D-beeldvorming van RABV-geïnfecteerde hersenweefsel. De 3D reconstructies van geïnfecteerde hersenweefsel kan worden gebruikt om een verscheidenheid van vragen met betrekking tot ziekteprogressie RABV, pathogenese, en neuro invasie te beantwoorden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Thomas C. Mettenleiter en Verena te kamp voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd gesteund door het Federal Excellence Initiative van Mecklenburg-Voor-Pommeren en het Europees Sociaal Fonds (ESF) Grant KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) en een studiebeurs voor intramurale samenwerking op lyssavirussen in de Friedrich-Loeffler-Instituut (RI-0372).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
- Pichat, J., Iglesias, J. E., Yousry, T., Ourselin, S., Modat, M. A Survey of Methods for 3D Histology Reconstruction. Medical Image Analysis. 46, 73-105 (2018).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-171 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Masland, R. H.
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Fooks, A. R., et al.
- WHO. WHO Expert Consultation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. , No. 1012 (2018).
- CDC. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th Edition. US Department of Health and Human Services. , (2009).
- Arnold, M. M., et al. Effects of fixation and tissue processing on immunohistochemical demonstration of specific antigens. Biotechnic & Histochemistry. 71 (5), 224-230 (1996).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. The American Journal of Surgical Pathology. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Orbanz, J., Finke, S. Generation of recombinant European bat lyssavirus type 1 and inter-genotypic compatibility of lyssavirus genotype 1 and 5 antigenome promoters. Archives of Virology. 155 (10), 1631-1641 (2010).
