Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Assay for blod-hjerne barriere integritet i Drosophila melanogaster

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60233
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Loyola University Chicago

Summary

Blod-hjerne barrieren integritet er afgørende for nervesystemet funktion. I Drosophila melanogasterdannes blod-hjerne barrieren af gliale celler under den sene embryogenesis. Denne protokol beskriver metoder til analyse af dannelse og vedligeholdelse af blod-hjerne barrieren i D. melanogaster embryoner og tredje INSTAR larver.

Abstract

Korrekt nervesystem udvikling omfatter dannelsen af blod-hjerne barrieren, diffusions barriere, der stramt regulerer adgangen til nervesystemet og beskytter neurale væv fra toksiner og patogener. Defekter i dannelsen af denne barriere er blevet korreleret med neuropatier, og nedbrydningen af denne barriere er blevet observeret i mange neurodegenerative sygdomme. Derfor er det afgørende at identificere de gener, der regulerer dannelsen og vedligeholdelsen af blod-hjerne barrieren for at identificere potentielle terapeutiske mål. For at forstå de nøjagtige roller disse gener spiller i neurale udvikling, er det nødvendigt at assay virkningerne af ændret Gen ekspression på integriteten af blod-hjerne barrieren. Mange af de molekyler, der fungerer i etableringen af blod-hjerne barrieren er blevet fundet at være bevaret på tværs af eukaryote arter, herunder frugtflue, Drosophila melanogaster. Frugt fluer har vist sig at være et glimrende model system til at undersøge de molekylære mekanismer, der regulerer nervesystemets udvikling og funktion. Denne protokol beskriver en trin-for-trin procedure til assay for blod-hjerne barriere integritet under embryonale og larvestadier af D. melanogaster udvikling.

Introduction

Under udvikling, celle-celle kommunikation og interaktioner er afgørende for etableringen af væv og organ struktur og funktion. I nogle tilfælde, disse celle-celle interaktioner forsegle organer fra det omgivende miljø for at sikre korrekt organfunktion. Dette er tilfældet for nervesystemet, som er isoleret af blod-hjerne barrieren (BBB). Dysfunktion af BBB i mennesker har været forbundet med neurologiske lidelser, herunder epilepsi, og nedbrydning af barrieren er blevet observeret i neurodegenerative sygdomme, herunder multipel sklerose og Amyotrofisk lateral sklerose1. I pattedyr dannes BBB af stramme kryds mellem endotelceller2,3. Andre dyr, herunder frugtflue, Drosophila melanogaster, har en BBB sammensat af gliale celler. Disse gliale celler danner en selektivt gennemtrængelig barriere for at kontrollere bevægelser af næringsstoffer, affaldsprodukter, toksiner og store molekyler ind og ud af nervesystemet4. Dette giver mulighed for vedligeholdelse af den elektrokemiske gradient er nødvendig for brand aktionspotentialer, giver mulighed for mobilitet og koordination4. I D. melanogaster, den glia beskytte nervesystemet fra den kalium-rige, blod-lignende hemolymph5.

I centralnervesystemet (CNS) og perifere nervesystem (PNS) af D. melanogaster, to udvendige gliale lag, subperineurial glia og perineurial glia, samt et ydre netværk af ekstracellulære matrix, neurale lamella, danner hemolymph-hjerne og hemolymph-nerve barriere6, benævnt BBB i hele denne artikel. Under udvikling subperineurial glia bliver polyploide og forstørre at omgive nervesystemet5,6,7,8,9,10,11 . Den subperineurial glia form septate knude, som giver den vigtigste diffusions barriere mellem hemolymph og nervesystemet5,6,12. Disse vejkryds ligner i molekylært de septat-lignende vejkryds, der findes ved paranoderne af myelinating glia hos hvirveldyr, og de udfører samme funktion som stramme kryds i BBB af pattedyr13,14, 15 , 16 , 17. perineurial glia dividerer, vokser og ombrydes omkring subperineurial glia for at regulere spredningen af metabolitter og store molekyler6,10,18,19. BBB formation er færdig med 18,5 h efter æglægning (AEL) ved 25 °c5,5. Tidligere undersøgelser har identificeret gener, der er kritiske regulatorer af BBB formation20,21,22. For bedre at forstå de nøjagtige roller af disse gener, er det vigtigt at undersøge effekten af mutation af disse potentielle lovgivere på BBB integritet. Mens tidligere undersøgelser har skitseret tilgange til bestemmelse BBB integritet i embryoner og larver, en omfattende protokol for denne analyse er endnu ikke beskrevet5,7. Denne trin-for-trin protokol beskriver metoder til at bestemmelse BBB integritet under D. melanogaster embryonale og tredje INSTAR larvestadier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. indsamling af prøver

  1. Embryo indsamling
    1. I hvert embryoopsamlings bur skal du bruge mindst 50 jomfru hunner med 20 − 25 hanner til samlinger. Inkuber disse fluer i en flaske med cornmeal-agar-mad (tabel over materialer) i 1 − 2 dage før påbegyndelse af samlinger23.
      Bemærk: Flere fluer kan bruges, men forholdet mellem kvinder og mænd skal holdes på 2:1.
    2. Varm æblesaft agar plader (tabel 1) ved 25 °c natten over.
      Bemærk: Dette er nødvendigt for korrekt iscenesættelse af embryoner. Hvis pladerne tørrer ud hurtigt, tilsættes en skål med vand til inkubator for at øge fugtigheden i kammeret.
    3. Anesthetize flyver fra trin 1.1.1 med CO2 og overføre fluer til en kollektion bur. Placer en pre-varmet æblesaft agar plade med en lille smøre af gær pasta på den åbne ende og Fastgør til buret med den røde ærme (tabel over materialer). For at rydde ældre embryoner, tillade fluer at lægge embryoner/æg på en æblesaft agar plade for 1 h ved 25 °C.
    4. Fjern opsamlings buret fra inkubator. Vend bur mesh side ned og Tap fluer ned til bunden af buret. Udskift æblesaft agar med en ny pre-varmet æblesaft agar plade med en lille smøre af gær pasta. Kassér den første plade.
    5. Lad fluer lægge embryoner/æg på den nye æblesaft agarplade i 1 time ved 25 °C. Kassér denne plade efter 1 h-samlingen og Fortsæt til næste trin for at indsamle embryoner til injektion.
    6. For at indsamle sene stadie 17 embryoner (20 − 21 timer AEL) tillades fluer af den ønskede genotype fra trin 1.1.1 − 1.1.5 til at lægge på en ny forvarmet æblesaft agar plader med en lille smøre af gær pasta ved 25 °c for 1 h. alder plade for 19 h i en 25 °c inkubator , så embryonerne bliver 20 − 21 timer gamle på tidspunktet for billeddannelse.
      Bemærk: Dette trin kan gentages som ønsket for flere runder af prøveindsamling, injektion, og Imaging.
    7. Saml embryoner fra plader i en cellefilter med 70 μm nylon mesh ved at tilføje fosfat-bufferet saltvand (PBS) med 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof (PBTx; Tabel 1) til at dække overfladen af pladen og løsne embryoner fra overfladen ved hjælp af en pensel.
    8. Dechorionat embryoner opsamles i celle sien i en 50% blegemiddel opløsning (tabel 1) i en 100 mm Petri skål i 5 min med lejlighedsvis agitation ved stuetemperatur. Skyl embryoer 3x ved at hvirvlende celle sien i PBTx i en Petri skål ved hjælp af en frisk skål PBTx hver gang.
    9. Hvis alle embryoner er af den korrekte genotype, skal du gå direkte til trin 1.1.10. Hvis generering af embryoner af den korrekte genotype kræver et kryds med heterozygot fluer, skal der vælges embryoner af den korrekte genotype ved hjælp af tilstedeværelsen eller fraværet af fluorescently-mærkede justerings kromosomer. Brug et stereomicroskop med fluorescerende egenskaber til valg af genotype.
      Bemærk: Balancer kromosomer markeret med deformeret-gult fluorescerende protein; Kruppel-GAL4, UAS-grønt fluorescerende protein (gfp); og twist-Gal4, UAS-gfp arbejde godt for genotype udvælgelse i sent embryo Genesis (tabel 2)24,25,26.
    10. Brug en glas pipette til at overføre embryoner i PBTx til en 2% agopstået gel-plade (tabel 1). Fjern overskydende væske med filtrerpapir. Justér ~ 6 − 8 embryoner på 2% agopstået gel-pladen med posterior til højre og Rygsiden opad (figur 1B).
      Bemærk: Micropyle, det lille hul, hvorigennem spermatozoer ind i ægget, er placeret i den forreste ende af embryonet. Den bageste ende er mere afrundet. Luftrør fremstår hvidt og er placeret dorsalt i embryonet, hvilket gør det muligt at skelne mellem de dorsale og ventrale sider af embryonet (figur 1B).
    11. Forbered et dias med et stykke dobbeltsidet tape. Tryk hårdt på sliden oven på embryonerne for at overføre dem til den dobbeltsidet tape.
    12. Udrusling af embryoner ved inkubation ved stuetemperatur i ~ 25 min (der anvendes ingen tørremiddel). Efter udtørring dækkes embryoner med halocarbonolie.
      Bemærk: Udtørring perioder kan variere afhængigt af temperatur, fugtighed og ventilation i rummet. Inkubationstiden bør anvendes til at oprette et injektions apparat og et Konfokal mikroskop til billeddannelse som beskrevet i punkt 2 og 3 i denne protokol.
  2. Larval Collection
    1. Sæt et kors op med 5 − 10 jomfruelige hunfluer af den ønskede genotype og halvt så mange hanner af den ønskede genotype i et hætteglas med cornmeal-agar-mad og Inkuber ved 25 °C23.
    2. Efter 5 − 7 dage, afhængigt af genotypen, opsamles omvandrende tredje INSTAR larver fra hætteglasset forsigtigt med pincet. Skyl larverne i 1x PBS for at fjerne mad, som sidder fast på larverne. Overfør Larverne til en æblesaft-agarplade til genotypebestemmelse som beskrevet i trin 1.1.9, hvis det er nødvendigt.
    3. Rul larver på et væv ved hjælp af en pensel til at tørre dem af. Overfør 6 − 8 larver til et dias, der er forberedt med dobbeltsidet tape ved hjælp af pincet.

2. klargøring af nåle og prøve injektion

  1. Træk nåle på en mikropipette aftrækker forud for indledningen af denne protokol. Fastgør kapillarrørene i kanyle pulleren og træk i henhold til standard nåle formen og parametrene for D. melanogaster injektioner (tabel 3)27. Opbevar nåle i en Petri skål ved at forankre dem i ler, indtil de anvendes til injektion.
  2. Ilæg en nål med 5 μL 10 kDa dextran konjugeret til sulforhodamin 101 syre klorid (tabel over materialer) ved hjælp af en pipettespids på 20 μl gel i løbet af 25 minutters udtørnings periode for embryoner (trin 1.1.12) eller umiddelbart efter overførsel af Larverne til sliden (trin 1.2.3).
  3. Ilægning af nålen i en kanyle holder og position i en micromanipulator fastgjort til en stål base (tabel over materialer).
    Bemærk: Nålen skal være næsten parallel med mikroskop stadiet for embryo injektion og vinklet lidt nedad for larve injektioner.
  4. Indstil Indsprøjtnings apparatet (tabel over materialer) til 50 PSI, 5 − 10 MS med en rækkevidde på 10.
    Bemærk: Det kan være nødvendigt at ændre disse indstillinger for det særlige Indsprøjtnings apparat, der anvendes.
  5. Placer diaset på scenen og pensel kanten af nålen mod kanten af den dobbeltsidet tape i en 45 ° vinkel for at skabe en vinklet, brudt spids.
    Bemærk: For embryoner er det kun nødvendigt at bryde spidsen nok til at give mulighed for strømmen af 10 kDa dextran. En perfekt nål har en let vinklet spids, og kun en lille dråbe af farvestof vil komme ud med hver injektion. For larver er det nødvendigt at bryde spidsen mere, men med en vinklet spids til at trænge ind i larve kropsvæg. En større dråbe af farvestof vil komme ud.
  6. Pumpens fodpedal, indtil farvestoffet er på spidsen af nålen.
  7. Juster nålen, så den er parallel med embryonet eller vinklet lidt nedad mod Larven.
  8. Bevæg kanylen for at punktere den bageste ende af prøven og injicere prøven ved at pumpe fodpedalen. Injicer ~ 2 nL af farvestof i embryoner, og ~ 220 nL af farvestof i larver.
    Bemærk: Embryoet eller Larven bør oversvømme med farvestof, hvis injektionen er vellykket.
  9. Bemærk tidspunktet for injektion til inkubations formål. Inkuber embryoner i 10 minutter ved stuetemperatur. Inkuber larverne i 30 minutter ved stuetemperatur.
  10. Fortsæt ned ad sliden for at injicere yderligere prøver og noterer Indsprøjtnings tidspunktet for hver prøve.
    Bemærk: Afhængigt af den hastighed, hvormed efterfølgende dissektion-og billedbehandlings trin kan udføres, kan der injiceres 4 − 8 prøver ad gangen.

3. klargøring af prøver til billeddannelse

  1. Billeddannelse af embryoner
    1. Efter injektion, Forbered embryoner til billeddannelse. Påfør vaseline med bomulds spids på højre og venstre side af prøverne på sliden som et afstandsstykke for at forhindre beskadigelse af embryonerne ved anbringelse af dæksedlen.
    2. Billed prøver ved hjælp af et Konfokal mikroskop i dybden af embryonet med en 20x mål. Beregn procentdelen af samlede prøver med farvestof observeret i ventrale nerveledning (VNC) ved hjælp af følgende ligning:% af prøver med kompromitteret BBB = antal prøver med farve ophobning i VNC/det samlede antal prøver, som er analyseret.
  2. Dissektion og billeddannelse af larver
    1. Forbered dias til larve prøver på forhånd. Monter to dæksedler med en afstand på ca. 0,5 cm fra hinanden til diaset med neglelak.
      Bemærk: Dæksedlerne fungerer som afstandsstykker til hjernen, så den ikke beskadiges under monteringsprocessen.
    2. Efter 30 min inkubation, dissekere larverne i 1x PBS direkte på diaset, der vil blive brugt i Imaging. Først skal du bruge et par pincet til at snuppe Larven halvvejs ned i larve legemet, og bruge et andet par tang til at adskille de forreste og bageste halvdele af Larven.
    3. Brug derefter et par pincet til at tage fat i den forreste region ved mund kroge, og brug et andet par tang til at invertere krops væggen over spidsen af pincet, der griber mund krogene. Hjernen og VNC vil blive eksponeret.
    4. Adskille hjernen og VNC fra kroppen væggen ved at afskære nerverne, og fjerne kroppen væggen fra diaset (figur 1C, D). Fjern imaginal discs, hvis det ønskes.
    5. Prøven dækkes med 10 μL 80% glycerol, og der placeres en dækseddel oven på prøven til billeddannelse.
    6. Billede gennem dybden af nervesystemet væv ved hjælp af en 20x mål. Beregn procentdelen af samlede prøver med farvestof observeret i VNC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoderne beskrevet her giver mulighed for visualisering af integriteten af BBB i hele CNS i D. melanogaster embryoner og larver (figur 1). Ved afslutningen af BBB dannelse i slutningen af embryogenese, BBB funktioner til at udelukke store molekyler fra hjernen og VNC5. Denne protokol udnytter denne funktion til at assay BBB formation. Når Wild-type (Oregon R) sent stadie 17 (20 − 21 h gamle) embryoner blev injiceret med 10 kDa dextran konjugeret til sulforhodamin 101 syre klorid fluorescerende farvestof, det store dextran molekyle blev udelukket fra VNC, som forventet (figur 2A). For at påvise virkningen af genetiske mutationer på BBB integritet, blev embryoner med mutationer i det rå gen udnyttet. Tidligere er det rå gen blevet påvist at regulere kimband retraktion under embryogenese, og for nylig har vist sig at fungere i glia at regulere morfologiske ændringer i VNC under udvikling28. Heterozygot rå1 -mutant embryoner udviste en intakt BBB, svarende til resultaterne observeret i vildtype kontrol embryoner (figur 2B). I modsætning hertil udviste homozygot rå1 -mutant embryoner defekter i BBB ' s integritet med 10 kDa dextran FARVESTOF oversvømmelser i VNC, hvilket indikerer, at BBB ikke kunne dannes (figur 2C). Disse resultater demonstrere evnen af denne teknik til at assay BBB dannelse under embryonale stadier.

Tidligere undersøgelser har vist, at en defekt i subperineurial glia polyploidization resulterer i en forstyrrelse af BBB, der kan observeres i tredje INSTAR larve faser7,9. Således kan defekter i BBB dannelse og/eller vedligeholdelse resultere i en kompromitteret BBB i de senere stadier af udviklingen, hvilket gør det ønskeligt at assay integriteten af barrieren i den tredje INSTAR larve fase. Derfor er den protokol, udnyttet til bestemmelse BBB integritet i embryonale stadier er også blevet optimeret til brug i larver. I Oregon R kontrolprøver, 10 kDa dextran undlader at trænge ind i BBB og er udelukket fra hjernen og VNC (figur 2D, E). Farvestoffet akkumuleres i periferien af BBB.

Figure 1
Figur 1: nervesystemet i stadie 17 embryoner og tredje INSTAR Larva. (A) skematisk af et ventrale syn på et stadie 17 embryo central nervesystem (CNS). CNS består af hjernen (br) og ventrale nerveledning (VNC), som har dorsoventral kanaler (CH). Micropyle (MP; Arrowhead) i den forreste ende kan anvendes til at orientere embryonet. Posterior til højre. (B) etape 17 embryo orienteret med Rygsiden opad og posterior til højre, som anbefalet i trin 1.1.10. Pilene peger på luftrøret. Arrowhead angiver MP. Posterior til højre. (C) skematisk af nervesystemet i den tredje INSTAR Larva. Hjernen (br) og VNC komponere CNS, mens nerverne strækker sig fra VNC synapse på kropsvæg muskler og er en del af PNS. Posterior til højre. D) dissekeret tredje INSTAR larve hjerne og VNC. Posterior til højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: assay for dannelse af blod-hjerne-barriere (BBB). (A-C) Sent stadie 17 embryoner (20 − 21 timer gamle) injiceret bagtil med 10 kDa sulforhodamin 101 syre klorid dextran. Posterior down. Skala bjælke = 20 μm. Prikker set i kontrol er dorsoventral kanaler, der spænder over ventrale nerveledning (VNC). (A) Oregon R-kontrol. Optagelse af farvestof i 6,25% af prøverne, n = 16. B) rå1/+ sidestillede kontrol. Optagelse af farvestof i 6,67% af prøverne, n = 15. C) homozygot rå1/1 -mutant. Optagelse af farvestof i 100% af prøverne, n = 22. (D) Oregon R Control tredje INSTAR larve hjernen. Dye ophobes ved BBB, men ikke trænge ind i CNS, n = 7. Scale bar = 50 μm. (E) Oregon R kontrol tredje INSTAR larve VNC. Dye ophobes ved BBB, men ikke trænge ind i CNS, n = 11. Stiplede linje skitserer VNC. Scale bar = 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: midgut morfologi i den sene embryonale udvikling. Transmitterede lysbilleder af stadie 13 − 17 embryoner giver mulighed for visualisering af tarm morfologi (mørkegrå regioner i den bageste halvdel af embryonet). Midgut morfologi kan bruges til at bestemme stadiet af embryonale udvikling, hvilket er nyttigt, når det bestemmes, om embryoner bliver alderen passende til injektion. Scale bar = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Løsning Opskrift
2% agopstået gel Tilsæt 0,8 g agopstået til 40 mL dobbeltdestilleret H2O (ddH2O) i en Erlenmeyerkolbe og mikroovn for at opløse agar. Hæld i en gel støbe bakke og lad gelen størkne i 30 minutter ved stuetemperatur.
Æblesaft agar plader Mål 45 g agar og 1,5 L ddH2O til en 4 L kolbe. Autoklave i 40 − 45 min ved 121 °C. Mål 50 g sukker og 0,5 L æblesaft i et 1 L bægerglas og rør ved lav varme (indstilling 3) for at opløse sukker, pas på ikke at brænde det. Efter autoklaveringen tilsættes det foropvarmede sukker og æblesaft til agar og vand. Rør på lav med varmen ud for at gøre det muligt at køle, indtil du kan røre den. Tilsæt 15 mL 70% tegosept og rør til Disperse. Hældes i et 0,5 L bægerglas. Spray med ethanol for at fjerne bobler eller flamme med en bunsenbrænder. Hæld i 60 mm petriskåle. Der kan indstilles i mindst 24 timer, eller indtil kondensvand er minimal på lågene i Petriskålene og opbevares ved 4 °C.
50% blegemiddel Der tilsættes 15 mL ddH2O og 15 ml husholdnings blegemiddel til et konisk rør.
80% glycerol For 10 ml tilsættes 8 ml autoklaveres DDH2O og 2 ml glycerol til et 15 ml konisk rør. Inkuber på en rocker, indtil opløsningen er homogen.
1x PBS For 1 L fortyndes 100 mL 10x PBS i 900 mL ddH2O.
10x PBS For 2 L, Opløs følgende i 1.600 mL ddH2O: 160 g NaCl, 4 g kcl, 28,8 g af na2hpo4og 4,8 g KH2po4. Justér pH til 7,5 med HCl.
PBTx (PBS + 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof) For 1 L kombineres 100 mL 10x PBS, 10 mL 10% nonionisk overfladeaktivt stof og 890 mL ddH2O.
70% tegosept Bland 1 g p-hydroxybenzoesyre, methylester for hver 10 mL 100% ethanol. Opbevares ved-20 °C.
10% nonionisk overfladeaktivt stof For 50 ml tilsættes 45 ml autoklaveres DDH2O og 5 ml nonionisk overfladeaktivt stof til et konisk rør. Drej på Vippeknappen, indtil opløsningen er homogen.
Gær pasta Bland tør aktiv gær med ddH2O i en 50 ml plastikbæger, indtil den er glat.

Tabel 1: reagenser og buffere, der anvendes i hele denne protokol.

Genotype Lager
w [1118]; ln (2LR) GLA, WG [GLA-1]/CyO, P {w [+ mC] = GAL4-TWI. G} 2.2, P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} AH 2.2 Bloomington #6662
w {*]; SNA [SCO]/CyO, P {w [+ mC] = DFD-EYFP} 2 Bloomington #8578
w {*]; L [2] PIN [1]/CyO, P {w [+ mC] = GAL4-kr. C} DC3, P {w [+ mC] = UAS = GFP. S65T} DC7 Bloomington #5194
DF (1) JA27/FM7c, P {w [+ mC] = GAL4-kr. C} DC1, P {w [+ mC] = UAS-GFP. S65T} DC5, SN [+] Bloomington #5193
w [*]; ry [506] Dr [1]/TM6B, P {w [+ MC] = DFD-EYFP} 3, SB [1] TB [1] ca [1] Bloomington #8704
y [1] w [*]; D [*] GL [3]/TM3, P {w [+ mC] = GAL4-kr. C} DC2, P {w [+ mC] = UAS-GFP. S65T} DC10, SB [1] Bloomington #5195
Oregon R Flere tilgængelige stammer
rå [1] cn [1] BW [1] SP [1]/CyO Bloomington #2749
P {w [+ mW. HS] = GawB} elav [C155] Bloomington #458
w [1118]; P {w [+ m *] = GAL4} repo/TM3, SB [1] Bloomington #7415
P {UAS-GFP} Flere tilgængelige stammer

Tabel 2: flyve stammer. Flyve stammer diskuteret i hele denne protokol. Bloomington Drosophila Stock Center-lager nummeret leveres, hvor det er relevant.

Cyklus Varme Trække Hastighed Tid Pres Rampe
1 590 115 15 250 600 X
2 575 130 60 250 600 X

Tabel 3: indstillinger for mikropipette aftrækker. Mikropipette aftrækker indstillinger, der anvendes til at generere nåle til injektion i denne protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol giver en omfattende beskrivelse af de nødvendige skridt til at assay for BBB integritet under de sene embryonale og tredje INSTAR larvestadier af D. melanogaster udvikling. Lignende tilgange er blevet beskrevet andetsteds for at assay integriteten af BBB under udvikling, samt i voksne etaper5,7,29,30. Men beskrivelser af procedurer i materialer og metoder sektioner er ofte af bred karakter og mangler tilstrækkelige detaljer for nem gennemførelse, nødvendiggør betydelig fejlfinding på vegne af forskeren. Denne protokol giver en omfattende beskrivelse af de skridt, der er nødvendige for at assay for BBB integritet under embryonale og larvestadier. I hver fase, er der kritiske skridt til at blive fulgt for at sikre, at den korrekte fase af udviklingen er ved at blive undersøgt og væv arkitektur er ikke forstyrret, hvilket kunne kompromittere BBB. For at opnå succes i disse tilgange var det nødvendigt at foretage fejlfinding af flere trin i protokollen for at give nøjagtige resultater. De kritiske trin i embryonale og larve protokoller er beskrevet nedenfor.

Tidligere undersøgelser har rapporteret etableringen af BBB af 18,5 h AEL5. For at sikre nøjagtig udviklingsmæssige timing, er det vigtigt at vedligeholde prøver ved en konstant temperatur under aldring. Ved opsamling af embryoner skal æblesaft agarplader bringes op på 25 °C, inden de anvendes til opsamling. Brug æblesaft plader, der ikke er blevet præ-varmet resulterer i langsommere udvikling og kan give prøver, der endnu ikke har etableret en BBB og vil derfor udvise ophobning af 10 kDa dextran i nervesystemet. Som sådan, det er vigtigt at sikre, at den ene er at injicere prøver, der er ældre end 18,5 h. Desuden er det nødvendigt at overveje muligheden for en forsinket udvikling, når disse eksperimenter udføres i embryoner, da en sådan forsinkelse blot kan resultere i den senere etablering af BBB. For at højde for eventuelle udviklingsmæssige forsinkelser blev prøverne analyseret ved 20 − 21 h AEL, lidt efter rapporterede BBB dannelse. Ved hjælp af morfologien af andre væv, især den udviklende midgut, kan hjælpe med at etablere den korrekte fase af udviklingen af embryonet, der er analyseret (figur 3). Omvendt kan forkert eksperimentel timing resultere i prøver, der allerede er motile sædceller og har påbegyndt ruge processen. For at reducere antallet af larver, der allerede har påbegyndt udklækning, er det vigtigt at udføre mindst to 1 h-samlinger for at rydde ældre embryoner fra kvinder, før de indsamler embryoner til injektion. Hvis analysen af BBB i første INSTAR larver ønskes, en kort inkubation af larver i 1x PBS i en 9-brønd skål på is kan bruges til at reducere motilitet før injektion. Slides kan også opbevares på en ispakning under Indsprøjtnings proceduren for at reducere motilitet.

For at sikre kvalitet billeder og nøjagtige resultater med hensyn til etableringen af BBB i embryonet, skal yderligere trin følges nøje under hele proceduren. Ved foring af embryoner på agar-pladen skal luftrør vende opad, da dette er den rygende side af embryonet (figur 1B). Når embryonerne overføres til diaset med dobbeltsidet tape, vil den ventrale side af fosteret vende opad, hvilket giver mulighed for optimal visualisering af nerveledningen under Konfokal billeddannelse senere i protokollen. Embryoner skal også være forsvarligt overholdt til dobbeltklæbende tape for at hæmme bevægelse under injektion. Brugen af en flad 2% aghas pad gør det muligt for forskeren at skubbe diaset med den dobbeltsidet tape fast på embryonerne under overførslen uden risiko for beskadigelse af embryonerne. Efter overførsel til diaset er udtørring nødvendig for at forhindre, at embryonet sprængt ved farve injektion. Injektion af for meget farvestof kan også få embryonet til at briste. Det er vigtigt kun at indsætte nålen i embryonet nok til at injicere farvestoffet, men ikke så meget, at nålen potentielt punktering nervesystemet, hvilket ville give et falsk positivt resultat. For stor af en punktering sår kan også resultere i hemolymph og farvestof oversvømmelser ud af embryonet, hvilket fører til en mislykket eksperiment. Med disse potentielle faldgruber i tankerne, injektion er mest vellykket med en nål, der har en lille vinkel til spidsen, således at der er et lille punkt, hvormed at omhyggeligt punktere embryonet.

I tilfælde af bestemmelse larver for BBB integritet, kan der opstå udfordringer på grund af motilitet af prøven. Brugen af høj kvalitet dobbeltsidet tape er kritisk, da det bør være effektiv i immobiliserende larver til injektion. Hvis Larven ikke bliver hængende, kan den rulles tilbage på båndet og skubbes forsigtigt ned for at resecure den. Ved transport af larver til injektion, er det nyttigt at bære diaset i en Petri skål, hvis larverne bliver usiddende. Trinene efter injektion kræver mest omhu for at undgå afbrydelse af BBB. For at minimere potentielle skader på prøven, er det nemmest at dissekere prøven direkte på de slides, der vil blive brugt til billeddannelse. Hvis Larven er stærkt overholdt på båndet, når du overfører prøven til dissektion, kan en dråbe 1x PBS føjes til båndet for at løsne vedhæftningen og give mulighed for overførsel til diaset for dissektion. Efter dissektion er det vigtigt at udglatte prøven tilstrækkeligt til at undgå falsk positive resultater, men ikke så meget, at prøvens integritet kompromitteres. Klemning af Larven mellem dæksedlen og diaset ved hjælp af ekstra dæksedler som afstandsstykker forhindrer hjernen i at blive beskadiget, men immobiliserer prøven for effektiv billeddannelse.

For at opnå succes med protokoller for både embryoner og larver er det afgørende at sikre, at Indsprøjtnings apparatet og konfokal mikroskop er sat op, før prøve behandlingen påbegyndes. Dette giver mulighed for præcis timing i billeddannelse af prøver, som er nødvendig for prøve sammenligning. Andre tilgange har udnyttet mere avancerede Indsprøjtnings opsætninger, der kræver et inverteret mikroskop, der er sat op til embryo injektion. Denne protokol anvender en standard dissekere mikroskop og micromanipulator med en trykregulator. I dette tilfælde, en zebra injektion oprettet var simpelthen tilpasset til injektion af flyve embryoner og larver. Denne protokol kan forenkles yderligere for at udnytte en micromanipulator med en sprøjte til injektion samt. Mange af disse værktøjer er let tilgængelige i biologi afdelinger og kan endda være tilgængelige i klasseværelset laboratorie indstillinger, giver mulighed for maksimal lethed af protokol implementering.

Under billedbehandlings proceduren kan det være nyttigt at mærke cellerne i nervesystemet for lettere at identificere den ønskede region til billeddannelse. Specifikt, man kunne bruge GAL4/UAS system til at udtrykke gfp i enten neuroner eller glia, ved hjælp af elav-GAL4 eller repo-GAL4 stammer, henholdsvis (tabel 2)31,32,33. En sådan mærkning ville give en kontrast med sulforhodamin 101 syre klorid dextran at visualisere integriteten af nervesystemet.

Mens denne metode er fokuseret på at analysere integriteten af BBB under udviklingen af D. melanogaster, denne tilgang kan tilpasses til at undersøge integriteten af andre barrierer på tværs af en række forskellige organismer og væv. For eksempel, lignende protokoller er blevet offentliggjort for bestemmelse BBB i mus34. Desuden, permeabilitet af blod-øje barrieren og den somatiske barriere omkring kimceller under spermatogenese i D. melanogaster anvende en lignende fremgangsmåde29,35. Protokollen kan også tilpasses til brug i andre væv for at teste permeabilitet, herunder i tarmen. Ved tilpasning af denne protokol til brug i andre væv eller arter, vil det være nødvendigt at overveje størrelsen af molekyler, der kan trænge ind i barrieren, da det er muligt, at 10 kDa dextran kan være lille nok til at gennemtrænge nogle barrierer. Samlet set denne protokol giver en trin-for-trin procedure til assay for BBB integritet under D. melanogaster udvikling, der let kan tilpasses til brug i andre indstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. F. Bryan Pickett og Dr. Rodney dale for brug af udstyr til injektion. Dette arbejde blev finansieret af forskningsmidler fra Loyola University Chicago til M.D., D.T. og J.J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran ThermoFisher Scientific D1863 Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips Eppendorf 22351656
100% Ethanol (200 proof) Pharmco-Aaper 11000200
Active Dry Yeast Red Star
Agar Fisher Scientific BP1423
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Air Compressor DeWalt D55140
Apple Juice Mott's Natural Apple Juice
Bleach Household Bleach 1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Bottle Plugs Fisher Scientific AS-277
Cell Strainers BD Falcon 352350
Confocal Microscope Olympus FV1000 Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator Puritan 19-062614
Double-Sided Tape 1/2" Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip Roboz RS-5015
Fly Food Bottles Fisher Scientific AS-355
Fly Food Vials Fisher Scientific AS-515
Foot Pedal Treadlite II T-91-S
Gel Caster Bio-Rad 1704422
Gel Tray Bio-Rad 1704436
Glass Pipette VWR 14673-010
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Granulated sugar Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil Lab Scientific, Inc. FLY-7000
Light Source Schott Ace I
Manipulator Stand World Precision Instruments M10
Micromanipulator World Precision Instruments KITE-R
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Needle Holder World Precision Instruments MPH310
Nightsea Filter Sets Electron Microscopy Science SFA-LFS-CY For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head Electron Microscopy Science SFA-RB For visualization of GFP
Paintbrush Simply Simmons Chisel Blender #6
Pipetter Fisher Scientific 13-683C
Pneumatic Pump World Precision Instruments PV830 This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Small Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-100
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Steel Base Plate World Precision Instruments 5052
Stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000 Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source Baytronix Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) Genesee Scientific 20-258
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 Nonionic surfactant
Vial Plugs Fisher Scientific AS-273

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  2. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  3. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
  4. Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
  5. Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
  6. Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
  7. Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
  8. Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
  9. Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
  10. von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
  11. Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
  12. Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
  13. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  14. Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
  15. Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
  16. Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
  17. Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
  18. von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
  19. Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
  20. Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
  21. Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
  22. DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
  23. BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017).
  24. Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
  25. Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
  26. Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
  27. Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
  28. Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
  29. Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
  30. Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).
  31. Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
  32. Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
  33. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  34. Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
  35. Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).

Tags

Udviklingsmæssige biologi Drosophila melanogaster blod-hjerne barrieren glia nervesystem ventrale nerve snor embryo larve
Assay for blod-hjerne barriere integritet i <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J.… More

Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233, doi:10.3791/60233 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter