Summary
혈액-뇌 장벽 무결성은 신경계 기능에 매우 중요합니다. Drosophila melanogaster에서는,혈액 두뇌 방벽은 늦은 배아 발생 도중 신경교 세포에 의해 형성됩니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 태아 및 제 3 instar 애벌레에 있는 혈액 두뇌 방벽 대형 및 유지보수를 위한 분석하는 방법을 기술합니다.
Abstract
적절한 신경계 발달에는 혈액-뇌 장벽의 형성, 신경계에 대한 접근을 엄격하게 조절하고 신경 조직을 독소와 병원체로부터 보호하는 확산 장벽이 포함됩니다. 이 장벽의 형성에 있는 결점은 신경병증과 상관되었습니다, 이 방벽의 고장은 많은 신경 퇴행성 질병에서 관찰되었습니다. 따라서, 잠재적인 치료 표적을 확인하기 위하여 혈액 두뇌 방벽의 대형 그리고 정비를 통제하는 유전자를 확인하는 것이 중요합니다. 이 유전자가 신경 발달에서 하는 정확한 역할을 이해하기 위하여는, 혈액 두뇌 방벽의 무결성에 변경된 유전자 발현의 효력을 분석할 필요가 있습니다. 혈액-뇌 장벽의 확립에서 기능하는 많은 분자는 과일 파리, 초파리 멜라노가스터를포함한 진핵 종에 걸쳐 보존되는 것으로 밝혀졌다. 과일 파리는 신경계 발달과 기능을 조절하는 분자 메커니즘을 검사하기위한 훌륭한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 이 프로토콜은 D. melanogaster 발달의 배아 및 애벌레 단계 도중 혈액 두뇌 방벽 무결성을 위한 분석하는 단계별 절차를 기술합니다.
Introduction
개발 하는 동안, 세포-세포 통신 및 상호 작용 조직 및 장기 구조 및 기능의 설립에 대 한 중요 한. 경우에 따라, 이러한 세포-세포 상호 작용 적절 한 장기 기능을 보장 하기 위해 주변 환경에서 장기를 밀봉. 이것은 혈액 뇌 장벽 (BBB)에 의해 절연된 신경계의 경우입니다. 인간에서 BBB의 기능 장애는 간질을 포함한 신경 질환에 연결되었으며, 장벽의 붕괴는 다발성 경화증 및 근위축성 측삭 경화증을 포함하는 신경 퇴행성 질환에서 관찰되었다1. 포유동물에서, BBB는 내피 세포2,3사이 단단한 접합에 의해 형성된다. 과일 플라이, 드로소필라 멜라노가스터를 포함한 다른 동물들은 신경교 세포로 구성된 BBB를 갖는다. 이러한 신경교 세포는 영양분, 노폐물, 독소 및 신경계 안팎으로 큰 분자의 움직임을 제어하기 위해 선택적으로 투과성 장벽을 형성한다4. 이를 통해 동작 전위를 발사하는 데 필요한 전기 화학 그라데이션의 유지 보수가 가능하여 이동성 및 조정4. D. 멜라노가스터에서,glia는 칼륨이 풍부하고 혈액과 같은 혈림프5에서신경계를 보호합니다.
D. melanogaster의중추 신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS), 2 개의 외부 신경교 층, subperineurial glia 및 perineurial glia, 외세포 질, 신경 라멜라의 외부 네트워크, 형성 hemolymph-뇌 및 hemolymph 신경 장벽6,이 문서 전반에 걸쳐 BBB라고. 개발 중 피각증 신경교는 polyploid되고 신경계를 둘러싸고 확대5,6,7,8,9,10,11 . 헤모 림프와 신경계 사이의 주요 확산 장벽을 제공하는 심층 신경 교향곡 형태5,6,12. 이러한 접합부는 척추동물에서 골수성 신경교의 파라노드에서 발견되는 격막과 유사한 접합부와 분자적으로 유사하며, 포유류13,14의BBB에서 단단한 접합부와 동일한 기능을 수행합니다. 15세 , 16세 , 17. 대사 산물과 큰 분자의 확산을 조절하기 위해 회음구 신경교를 나누고, 성장시키고, 감싸는6,10,18,19. BBB 형성은 25 °C5,8에서계란 누워 (AEL) 후 18.5 시간에 의해 완료된다. 이전 연구는 BBB형성20,21,22의중요한 조절자인 유전자를 확인했습니다. 이 유전자의 정확한 역할을 더 잘 이해하기 위하여는, BBB 무결성에 이 잠재적인 기계레이터의 돌연변이의 효력을 검토하는 것이 중요합니다. 이전 연구는 배아와 애벌레에 있는 BBB 무결성을 분석하기 위한 접근을 설명하는 동안, 이 분석법을 위한 포괄적인 프로토콜은 아직5,7을기술되지않았습니다. 이 단계별 프로토콜은 D. melanogaster 배아 및 제 3 instar 애벌레 단계 도중 BBB 무결성을 분석하는 방법을 기술합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 견본의 수집
- 배아 수집
- 각 배아 수집 케이지에서 최소 50명의 처녀 암컷을 20-25명의 수컷을 수집용으로 사용하십시오. 이 파리를 옥수수가루 한천식품(재료표)과함께 병에 담아 1~2일 간 배양하여 수집을 시작한다23.
참고: 더 많은 파리를 사용할 수 있지만, 여성 대 남성 비율은 2:1로 유지되어야 합니다. - 미리 따뜻한 사과 주스 한천 접시(표 1)25 °C에서 하룻밤.
참고: 이것은 배아의 적당한 발판을 위해 요구됩니다. 플레이트가 빨리 건조되는 경우, 챔버의 습도를 높이기 위해 인큐베이터에 물이 있는 그릇을 추가합니다. - 마취는 CO2를 사용하여 1.1.1 단계에서 파리를 옮기고 수집 케이지로 이동합니다. 미리 데운 사과 주스 한천 접시를 열린 끝에 효모 페이스트의 작은 얼룩이있는 것으로 놓고 빨간 슬리브(재료 표)로케이지에 고정하십시오. 오래된 배아를 치우기 위해, 파리가 25°C에서 1시간 동안 사과 주스 한천 접시에 배아/알을 낳도록 하십시오.
- 인큐베이터에서 수집 케이지를 제거합니다. 케이지 메시 측면을 아래로 반전하고 탭하여 케이지 의 맨 아래로 날아갑니다. 사과 주스 한천을 새로운 미리 데운 사과 주스 한천 접시로 작은 효모 페이스트 얼룩으로 교체하십시오. 첫 번째 접시를 버리십시오.
- 파리가 25°C에서 1시간 동안 새로운 사과 주스 한천 접시에 배아/계란을 놓을 수 있도록 하십시오. 1 시간 수집 다음이 판을 폐기하고 주사를 위한 배아를 수집하는 다음 단계로 진행한다.
- 늦은 단계 17 배아 (20-21 h AEL)를 수집하려면, 단계 1.1-1.1.5에서 원하는 유전자형의 파리가 25 °C에 대한 1 시간 동안 1시간 동안 15 °C에 효모 페이스트의 작은 얼룩으로 새로운 미리 온난 사과 주스 한천 접시에 누워 있도록 25 °C 인큐베이터에서 19 시간 동안 나이 플레이트 , 그래서 배아는 이미징 시 20-21 세가 될 것입니다.
참고: 이 단계는 샘플 수집, 주입 및 이미징의 여러 라운드에 대해 원하는대로 반복될 수 있습니다. - 0.1% 난온 계면활성제(PBTx)와 인산완충식염수(PBS)를 첨가하여 70 μm 나일론 메쉬를 가진 세포 스트레이너로 배아를 수집; 표 1) 페인트 브러시를 사용하여 접시의 표면을 덮고 표면에서 배아를 느슨하게합니다.
- 세포 스트레이너에서 수집된 배아를 50% 표백액(표1)에서100 mm 페트리 접시에 실온에서 가끔 교반하여 5분 동안. 페트리 접시에 PBTx에서 세포 스트레이너를 소용돌이치면서 배아를 3배 헹구고, 매번 PBTx의 신선한 접시를 사용한다.
- 모든 배아가 올바른 유전자형인 경우, 1.1.10 단계로 직접 진행하십시오. 올바른 유전자형의 배아생성이 헤테로지구스 플라이와 의한 십자가를 필요로 하는 경우, 형광성으로 표시된 밸런서 염색체의 존재 또는 부재를 사용하여 올바른 유전자형의 배아를 선택한다. 유전자형 선택을 위해 형광 기능이 있는 입체 현미경을 사용합니다.
참고: 변형-노란색 형광 단백질로 표시된 균형 염색체; 크루펠-Gal4, UAS-녹색 형광 단백질 (GFP); 및 트위스트-Gal4, UAS-GFP는 후기 배아 발생에서 유전자형 선택에 잘 작용한다(표 2)24,25,26. - 유리 피펫을 사용하여, PBTx에서 배아를 2% 아가로즈 겔 슬래브로 이송한다(표1). 여과지로 여분의 액체를 제거합니다. ~6~8개의 배아를 2% 아가로즈 젤 슬래브에 우측 후방과 등쪽 측면을 향하게합니다(그림 1B).
참고: 정자가 난자를 입력하는 작은 구멍인 마이크로필은 배아의 앞쪽 끝에 있습니다. 후방 끝이 더 둥글게 됩니다. 기관은 하얗게 나타나고 배아에 등쪽으로 위치하며, 배아의 등쪽과 복부 측의 구별을 허용합니다(그림 1B). - 양면 테이프로 슬라이드를 준비합니다. 배아 위에 있는 슬라이드를 단단히 눌러 양면 테이프로 옮김을 옮니다.
- 실온에서 배양하여 배아를 ~25 분 동안 배아를 건조합니다 (건조제는 사용되지 않습니다). 탈수 후, 할로카본 오일로 배아를 덮습니다.
참고: 탈수 기간은 실내의 온도, 습도 및 환기에 따라 다를 수 있습니다. 잠복기는 본 프로토콜의 섹션 2 및 3에 기재된 바와 같이, 주사및 화상진상을 위한 공초점 현미경을 위한 장치를 설치하기 위하여 이용되어야 한다.
- 각 배아 수집 케이지에서 최소 50명의 처녀 암컷을 20-25명의 수컷을 수집용으로 사용하십시오. 이 파리를 옥수수가루 한천식품(재료표)과함께 병에 담아 1~2일 간 배양하여 수집을 시작한다23.
- 애벌레 컬렉션
- 원하는 유전자형의 5-10 처녀 암컷 파리와 옥수수 가루 한천 음식과 유리병에 원하는 유전자형의 절반 많은 수컷과 십자가를 설정하고 25 °C23에서배양.
- 5-7 일 후, 유전자형에 따라, 집게로 부드럽게 유리병에서 방황 세 번째 instar 애벌레를 수집합니다. 1x PBS에서 애벌레를 헹구어 애벌레에 붙어있는 음식을 제거합니다. 필요한 경우 1.1.9단계에서 설명한 바와 같이 유충을 사과 주스 한천 플레이트에 옮기고, 지질질형에 대한 유충을 옮김을 한다.
- 페인트 브러시를 사용하여 티슈에 애벌레를 굴려 말립니다. 포셉을 사용하여 양면 테이프로 제조 된 슬라이드에 6−8 애벌레를 옮니다.
2. 바늘 및 견본 주입의 준비
- 이 프로토콜이 시작되기 전에 마이크로파이펫 풀러에 바늘을 당깁니다. 모세관을 바늘 풀러에 고정시키고 D. 멜라노가스터 주사에 대한 표준 바늘 모양 및 매개 변수에 따라 당기십시오(표 3)27. 주사를 위해 사용할 때까지 점토에 고정하여 페트리 접시에 바늘을 저장합니다.
- 10 kDa dextran 컨쥬게이션 101 산염화물(재료 표)에5 μL의 바늘을 적재하는 것은 배아에 대한 25 분 탈수 기간 동안 20 μL 겔 로딩 파이펫 팁을 사용하여 (단계 1.1.12), 또는 즉시 이송 후 슬라이드에 애벌레 (단계 1.2.3).
- 바늘을 바늘 홀더에 넣고 강철 베이스에 고정된 마이크로 매니퓰레이터에 넣습니다(재료표).
참고: 바늘은 배아 주입을 위한 현미경 단계에 거의 평행해야 하고 애벌레 주입을 위해 약간 아래쪽으로 각이 있어야 합니다. - 사출장치(재료 표)를50psi, 5-10 ms의 범위로 10으로 설정합니다.
참고: 사용 중인 특정 주입 장치에 대해 이러한 설정을 변경해야 할 수도 있습니다. - 슬라이드를 스테이지에 놓고 바늘 가장자리를 양면 테이프의 가장자리에 45° 각도로 놓아 각진 깨진 팁을 만듭니다.
참고: 배아의 경우 10 kDa dextran의 흐름을 허용하기에 충분한 팁을 깰 필요가 있습니다. 완벽한 바늘은 약간 각진 팁을 가지고 있으며 각 주사와 함께 염료의 작은 방울만 나올 것입니다. 애벌레의 경우, 팁을 더 깰 필요가 있지만, 애벌레 몸 벽을 관통하기 위해 각진 팁. 더 큰 염료 한 방울이 나올 것입니다. - 염료가 바늘 끝에 놓일 때까지 풋 페달을 펌프합니다.
- 바늘을 정렬하여 배아와 평행하거나 애벌레쪽으로 약간 아래쪽으로 기울어져 있습니다.
- 바늘을 움직여 시편의 후방 끝을 뚫고 발 페달을 펌핑하여 시편을 주입합니다. ~2 nL의 염료를 배아에 주입하고, ~220 nL의 염료를 애벌레에 주입합니다.
참고: 주사가 성공하면 배아 또는 유충이 염료로 범람해야합니다. - 배양 목적을 위해 주사 시간을 기록하십시오. 실온에서 10 분 동안 배아를 배양하십시오. 실온에서 30 분 동안 유충을 배양하십시오.
- 슬라이드를 계속 내려가 각 시편에 대한 주입 시간을 지적하면서 추가 시편을 주입합니다.
참고: 후속 해부 및 이미징 단계를 수행할 수 있는 속도에 따라 4−8 개의 시편을 한 번에 주입할 수 있습니다.
3. 화상 진찰을 위한 견본의 준비
-
배아의 화상 진찰
- 주입 다음, 화상 진찰을 위한 태아를 준비하십시오. 커버슬립을 배치할 때 배아의 손상을 방지하기 위해 슬라이드에 있는 샘플의 오른쪽과 왼쪽에 면팁 어플리케이터를 사용하여 석유 젤리를 스페이서로 바하십시오.
- 20배 의 객관적인 배아의 깊이 전반에 걸쳐 공초점 현미경을 사용하여 이미지 샘플. 다음 방정식을 사용하여 복부 신경 코드 (VNC)에서 관찰 된 염료를 가진 총 샘플의 비율을 계산합니다 : 손상된 BBB가있는 샘플의 % = 분석 된 VNC / 총 샘플 수에 염료 축적이있는 샘플 수.
-
유충의 해부 및 화상 진찰
- 애벌레 샘플에 대한 슬라이드를 미리 준비합니다. 두 개의 커버를 장착하면 약 0.5 cm 간격으로 미끄럼에 매니큐어를 장착 합니다.
참고: 커버립은 뇌의 스페이서 역할을 하므로 장착 과정에서 손상되지 않습니다. - 30 분 배양 후, 이미징에 사용되는 슬라이드에 직접 1 x PBS에 애벌레를 해부. 첫째, 한 쌍의 포셉을 사용하여 애벌레 몸의 중간쯤에 애벌레를 잡고 두 번째 쌍의 집게를 사용하여 애벌레의 전방 및 후방 절반을 분리합니다.
- 다음으로, 한 쌍의 포셉을 사용하여 입 후크의 전방 영역을 잡고 두 번째 포셉 쌍을 사용하여 입 후크를 잡는 집게의 끝 위로 몸벽을 반전시다. 뇌와 VNC가 노출됩니다.
- 신경을 분리하여 신체 벽에서 뇌와 VNC를 분리하고 슬라이드에서 신체 벽을 제거합니다(그림 1C,D). 원하는 경우 가상 디스크를 제거합니다.
- 80% 글리세롤의 10 μL로 견본을 덮고 화상 진찰을 위한 견본의 위에 덮개를 놓습니다.
- 20배 의 목적을 이용하여 신경계 조직의 깊이를 통한 영상. VNC에서 관찰된 염료를 사용하여 총 샘플의 백분율을 계산합니다.
- 애벌레 샘플에 대한 슬라이드를 미리 준비합니다. 두 개의 커버를 장착하면 약 0.5 cm 간격으로 미끄럼에 매니큐어를 장착 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기서 기재된 방법은 D. 멜라노가스터 배아 및 유충에서 CNS 전반에 걸쳐 BBB의 무결성의 가시화를 허용한다(도1). 늦은 배아 발생에서 BBB 형성이 완료되면, BBB는 뇌와 VNC5에서큰 분자를 배제하는 기능을 한다. 이 프로토콜은 BBB 형성을 분석하기 위해 이 기능을 활용합니다. 야생형(Oregon R) 후반기 17(20-21시간) 배아를 설포호다민 101산염료로 공액처리한 10 kDa dextran 컨쥬게이션을 주입했을 때, 대덱렌 분자는 예상대로 VNC에서 제외되었다(도2A). BBB 무결성에 대한 유전자 돌연변이의 효과를 입증하기 위해, 원시 유전자에 돌연변이가 있는 배아를 활용하였다. 이전에는, 원시 유전자는 배아 발생 동안 배아 밴드 후퇴를 조절하는 것으로 입증되었으며, 최근에는 발달28동안 VNC의 형태학적 변화를 조절하는 글리아에서 기능하는 것으로 나타났다. 헤테로지쿠스 원생 1돌연변이 배아는 야생형 대조군 배아에서 관찰된 결과와 유사한 손상되지 않은 BBB를 나타내었다(도2B). 대조적으로, 동형접합원 1 돌연변이 배아는 BBB의 무결성에 결함을 나타내고, 10 kDa dextran 염료가 VNC내로 범람하여, BBB가 형성되지 못했음을나타낸다(도 2C). 이러한 결과는 배아 단계 동안 BBB 형성을 분석하는 이 기술의 능력을 입증한다.
이전 연구는 subperineurial glia polyploidization에 있는 결점은 제 3 instar 애벌레 단계7,9에서관찰될 수 있는 BBB의 중단을 초래한다는 것을 설명했습니다. 따라서, BBB 형성 및/또는 유지 보수의 결함은 개발의 후반 단계에서 손상된 BBB를 초래할 수 있고, 제 3 의 instar 애벌레 단계에서 장벽의 무결성을 분석하는 것이 바람직하다. 따라서, 배아 단계에서 BBB 무결성을 분석하기 위해 활용된 프로토콜은 또한 애벌레에서 사용하기 위해 최적화되었다. 오리건 R 대조군 샘플에서, 10 kDa dextran은 BBB를 관통하지 못하고 뇌 및 VNC로부터 제외된다(그림2D,E). 염료는 BBB의 주변에 축적됩니다.
그림 1: 단계 17 배아및 제 3 instar 애벌레의 신경계. (A)17단계 배아 중추신경계(CNS)의 복부도의 개략체. CNS는 뇌 (Br)와 복부 신경 코드 (VNC)로 구성되며, 이는 dorsoventral 채널 (ch)을 가지고 있습니다. 전방 말단의 마이크로필(mp; 화살촉)은 배아의 방향을 지정하는데 사용될 수 있다. 오른쪽 후방. (B)17단계 배아는 1.1.10단계에서 권장되는 대로 등쪽을 위쪽과 후방을 오른쪽으로 향하도록 배아를 배반한다. 화살표가 기관을 가리키고 있습니다. 화살촉은 mp를 나타냅니다. 오른쪽 후방. (C)세 번째 인스타 애벌레에서 신경계의 도식. 두뇌 (Br) 및 VNC는 CNS를 구성, 신체 벽 근육에 VNC 시 냅 스에서 확장 하는 신경 동안 PNS의 일부. 오른쪽 후방. (D)세 번째 instar 애벌레 뇌와 VNC를 해부. 오른쪽 후방. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 혈액-뇌 장벽에 대 한 분석 (BBB) 형성. (A-C) 후기 17기 배아(20-21시간)를 10 kDa 설포호다민 101산 염화물 덱센으로 후경으로 주입하였다. 후방 아래로. 배율 막대 = 20 μm. 컨트롤에서 볼 수 있는 점은 복부 신경 코드(VNC)에 걸쳐 있는 dorsoventral 채널입니다. (A)오리건 R 제어. 샘플의 6.25 %, n = 16에서 염료 섭취. (B) 원시1/+ 형제 제어. 샘플의 6.67 %, n = 15에서 염료 섭취. (C)동형 접합 생1/1 돌연변이체. 샘플의 100 % 에서 염료 섭취, n = 22. (D)오레곤 R 제어 세 번째 instar 애벌레 뇌. 염료는 BBB에 축적되지만 CNS, n = 7에 침투하지 않습니다. 배율 막대 = 50 μm. (E)오레곤 R 제어 세 번째 instar 애벌레 VNC. 염료는 BBB에서 축적되지만 CNS, n = 11에 침투하지 않습니다. 파선은 VNC의 윤곽을 설명합니다. 배율 막대 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 늦은 배아 발달에서 의 Midgut 형태. 단계 13-17 배아의 전송된 빛 심상은 창자 형태학의 가시화를 허용합니다 (배아의 후방 반에 있는 진한 회색 지구). Midgut 형태는 배아 발달의 단계를 결정하는 데 사용될 수 있습니다, 이는 배아가 주입을 위해 적절하게 노화되고 있는지 여부를 결정할 때 도움이됩니다. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 솔루션 | 제조 법 |
| 2% 아가로즈 젤 | 에를렌마이어 플라스크에 40 mL의 이중 증류 H2O(ddH2O)에 아가로스 0.8 g을 넣고 한천을 녹입니다. 젤 주조 트레이에 붓고 젤이 실온에서 30 분 동안 고화되도록하십시오. |
| 사과 주스 한천 접시 | 한천 45 g과 ddH2O 1.5 L을 4 L 플라스크에 넣습니다. 121 °C에서 40-45 분 동안 오토 클레이브. 설탕 50g과 사과 주스 0.5 L을 1 L 비커에 넣고 약한 불(설정 3)을 저어 설탕을 녹여 서 태우지 않도록 주의하십시오. 오토클레이브에 이어, 예열된 설탕과 사과 주스를 한천과 물에 넣습니다. 열을 끄고 저어서 만질 수 있을 때까지 식힙니다. 70% 테고셉트의 15 mL를 넣고 저어서 분산시다. 0.5L 비커에 붓습니다. 에탄올로 스프레이하여 분젠 버너로 거품이나 불꽃을 제거합니다. 60mm 페트리 접시에 붓습니다. 적어도 24 시간 동안 설정하거나 페트리 접시뚜껑에 최소한의 응축이 있을 때까지 4 °C에서 보관하십시오. |
| 50% 표백제 | 15 mL의 ddH2O와 15 mL의 가정용 표백제를 원유관에 넣습니다. |
| 80% 글리세롤 | 10 mL의 경우, 15 mL 원엽 튜브에 오토 클레이브 ddH2O 와 글리세롤 2 mL 8 mL을 추가하십시오. 용액이 균일할 때까지 로커에 인큐베이션합니다. |
| 1x PBS | 1L의 경우, ddH2O의 900 mL에서 10x PBS의 100 mL을 희석하십시오. |
| 10x PBS | 2L의 경우, ddH2O의 1,600 mL에 다음을 용해: NaCl 160 g, KCl 4 g, Na2HPO4의28.8 g,KH2PO4의4.8 g. HCl을 사용하여 pH를 7.5로 조정합니다. |
| PBTx (PBS + 0.1% 요온 계면 활성제) | 1L의 경우 10x PBS 100 mL, 10% 요온 계면활성제 10 mL 및 ddH2O 890 mL을 결합합니다. |
| 70% 테고셉트 | 100% 에탄올의 매 10 mL마다 p-하이드록시벤조산, 메틸 에스테르 1 g을 섞는다. -20 °C에서 보관하십시오. |
| 10% 난오계면활성제 | 50 mL의 경우, 45 mL의 오토클레이브 ddH2O 및 5 mL의 난오계면활성제를 원뿔형 튜브에 추가합니다. 용액이 균일할 때까지 로커에서 회전합니다. |
| 효모 페이스트 | 건조 활성 효모를 ddH2O와 50 mL 플라스틱 비커에 섞어 부드러워질 때까지 섞으세요. |
표 1: 이 프로토콜 전체에서 사용되는 시약 및 버퍼입니다.
| 유전자 형 | 주식 |
| w[1118]; ln(2LR)글라, wg[Gla-1]/CyO, P{w[+mC]=GAL4-twi.G}2.2, P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH2.2 | 블루밍턴 #6662 |
| w{*]; sna[스코]/CyO, P{w[+mC]=Dfd-EYFP}2 | 블루밍턴 #8578 |
| w{*]; L[2] 핀[1]/CyO, P{w[+mC]=GAL4-Kr.C}DC3, P{w[+mC]=UAS=GFP. S65T}DC7 | 블루밍턴 #5194 |
| Df(1)JA27/FM7c, P{w[+mC]=GAL4-Kr.C}DC1, P{w[+mC]=UAS-GFP. S65T}DC5, sn[+] | 블루밍턴 #5193 |
| w[*]; ry[506] Dr[1]/TM6B, P{w[+mc]=Dfd-EYFP}3, Sb[1] Tb[1] ca[1] | 블루밍턴 #8704 |
| y[1] w[*]; D[*] gl[3]/TM3, P{w[+mC]=GAL4-Kr.C}DC2, P{w[+mC]=UAS-GFP. S65T}DC10, Sb[1] | 블루밍턴 #5195 |
| 오리건 R | 여러 균주 사용 가능 |
| 원시[1] cn[1] bw[1] sp[1]/CyO | 블루밍턴 #2749 |
| P{w[+mW.hs]=GawB}elav[C155] | 블루밍턴 #458 |
| w[1118]; P{w[+m*]=GAL4}리포지토리/TM3, Sb[1] | 블루밍턴 #7415 |
| P{UAS-GFP} | 여러 균주 사용 가능 |
표 2: 플라이 균주. 이 프로토콜을 통해 논의 비행 균주. 블루밍턴 드로소필라 스톡 센터 주식 번호는 해당되는 경우 제공됩니다.
| 주기 | 열 | 당겨 | 속도 | 시간 | 압력 | 램프 |
| 1 | 590 | 115 | 15 | 250 | 600 | Ⅹ |
| 2 | 575 | 130 | 60 | 250 | 600 | Ⅹ |
표 3: 마이크로파이펫 풀러 설정. 이 프로토콜에서 주사를 위한 바늘을 생성하는 데 사용되는 마이크로파이펫 풀러 설정.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 D. 멜라노가스터 발달의 후기 배아 및 제3 의 유충 단계 동안 BBB 무결성을 분석하는 데 필요한 단계에 대한 포괄적인 설명을 제공한다. 유사한 접근법은 성인5, 7,29,30뿐만아니라 개발 중에 BBB의 무결성을 분석하기 위해 다른 곳에서 기술되었다. 그러나 재료 및 방법 섹션의 절차에 대한 설명은 종종 본질적으로 광범위하며 쉽게 구현할 수 있는 충분한 세부 사항이 부족하여 연구원을 대신하여 중요한 문제 해결이 필요합니다. 이 프로토콜은 배아 및 애벌레 단계 동안 BBB 무결성을 분석하는 데 필요한 단계에 대한 포괄적 인 설명을 제공합니다. 각 단계에서 올바른 개발 단계가 검사되고 조직 아키텍처가 중단되지 않도록 하기 위해 따라야 할 중요한 단계가 있으며 BBB를 손상시킬 수 있습니다. 이러한 접근 방식에서 성공을 거두기 위해서는 정확한 결과를 도출하기 위해 프로토콜의 여러 단계 문제를 해결하는 것이 필요했습니다. 배아 및 애벌레 프로토콜의 중요한 단계는 아래에 기재되어 있다.
이전 연구는 18.5 h AEL5에의해 BBB의 설립을보고했다 . 정확한 개발 타이밍을 보장하기 위해서는 노화 시 일정한 온도로 시료를 유지하는 것이 중요합니다. 배아를 수집할 때, 사과 주스 한천 플레이트는 수집을 위해 사용하기 전에 25 °C로 가져와야합니다. 미리 따뜻해지지 않은 사과 주스 플레이트를 사용하면 개발 속도가 느려지고 아직 BBB를 확립하지 않은 샘플을 얻을 수 있으므로 신경계에서 10 kDa dextran의 축적을 나타낼 수 있습니다. 이와 같이, 하나는 18.5 h 보다 오래 된 샘플을 주입 하는 것이 중요 하다. 또한, 배아에서 이러한 실험을 수행 하는 경우, 개발 지연의 가능성을 고려할 필요가 있다, 이러한 지연은 단순히 발생할 수 있기 때문에 BBB의 나중에 설립. 잠재적인 발달 지연을 설명하기 위해, 샘플은 BBB 형성보고 후 약간 20-21 시간 AEL에서 분석되었다. 다른 조직의 형태, 특히 개발 중거트를 사용하여, 분석되는 배아의 올바른 발달 단계를 확립하는 데 도움이 될 수있다(도 3). 반대로, 부적절한 실험 타이밍은 이미 운동성이며 해칭 공정을 시작한 샘플을 초래할 수 있습니다. 이미 부화하기 시작한 애벌레의 수를 줄이려면 주사를 위해 배아를 수집하기 전에 암컷에게서 오래된 배아를 지우기 위해 최소 2 개의 1 시간 수집을 수행하는 것이 중요합니다. 첫 번째 인스타 유충에서 BBB의 분석이 바람직한 경우, 얼음에 9 웰 접시에 1x PBS에서 애벌레의 짧은 배양 주입 전에 운동성을 감소시키는 데 사용할 수 있습니다. 슬라이드는 또한 운동성을 줄이기 위해 주입 절차 동안 얼음 팩에 보관 할 수 있습니다.
배아에서 BBB의 확립에 관한 양질의 이미지와 정확한 결과를 보장하기 위해, 추가 단계는 절차 전반에 걸쳐 신중하게 따라야한다. 한천 슬래브에 배아를 일렬로 세워 질 때, 기관은 배아의 등쪽측이기 때문에 위로 향해야 한다(그림 1B). 배아가 양면 테이프로 슬라이드로 옮겨질 때, 태아의 복부 측이 위로 향하게 되어 나중에 프로토콜에서 공초점 이미징 중에 신경 코드의 최적 시각화를 허용합니다. 배아는 또한 주입 도중 운동을 억제하기 위하여 양면 테이프에 단단히 부착되어야 합니다. 평평한 2 % 아가로즈 패드를 사용하면 연구원은 배아손상의 위험없이 양면 테이프로 슬라이드를 배아에 단단히 밀어 넣을 수 있습니다. 슬라이드로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 제거하면 배아가 염료 주입 시 파열되는 것을 방지할 수 있습니다. 너무 많은 염료의 주입은 또한 파열하는 태아를 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 염료를 주입하기에 충분한 배아에 바늘을 삽입하는 것이 중요하지만 바늘이 잠재적으로 신경계를 뚫을 정도로 가양성 결과를 줄 수는 없습니다. 너무 큰 찔린 상처는 또한 헤모 림프와 염료가 배아에서 홍수를 일으켜 실패한 실험으로 이어질 수 있습니다. 이러한 잠재적 인 함정을 염두에두고 주사는 팁에 약간의 각도를 가진 바늘로 가장 성공적이며, 따라서 배아를 조심스럽게 뚫을 수있는 작은 지점이 있습니다.
BBB 무결성을 위한 애벌레를 아세이의 경우, 시료의 운동성으로 인해 문제가 발생할 수 있다. 고품질 양면 테이프의 사용은 주입을 위한 애벌레를 고정시키는 데 효과적이기 때문에 매우 중요합니다. 애벌레가 막히지 않으면 테이프에 다시 롤백하고 부드럽게 아래로 밀어 다시 고정할 수 있습니다. 주사를 위해 애벌레를 운반 할 때, 애벌레가 붙어있을 경우 페트리 접시에 슬라이드를 운반하는 것이 도움이됩니다. 주입 다음 단계는 BBB의 중단을 피하기 위해 가장 주의를 필요로합니다. 샘플의 잠재적 손상을 최소화하기 위해 이미징에 사용되는 슬라이드에서 직접 샘플을 해부하는 것이 가장 쉽습니다. 해부를 위해 샘플을 이송할 때 유충이 테이프에 강하게 부착되는 경우, 1x PBS 의 한 방울을 테이프에 첨가하여 접착력을 완화하고 해부를 위해 슬라이드로 옮길 수 있도록 할 수 있습니다. 해부 후, 가양성 결과를 피하기 위해 샘플을 충분히 평평하게 하는 것이 중요하지만 샘플 무결성이 손상되는 것은 아닙니다. 스페이서가 손상되는 뇌를 방지로 커버 슬립과 슬라이드 사이에 애벌레를 끼우는 것은, 아직 효과적인 이미징을 위해 샘플을 고정.
배아와 애벌레 에 대한 프로토콜로 성공을 거두기 위해서는 시료 처리가 시작되기 전에 주사 장치와 공초점 현미경이 설정되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이를 통해 샘플 비교에 필요한 샘플 이미징의 정확한 타이밍을 허용합니다. 그밖 접근은 배아 주입을 위한 반전한 현미경 설치를 요구하는 더 진보된 주입 설치를 이용했습니다. 이 프로토콜은 압력 조절기와 표준 해부 현미경 및 현미경 조작체를 활용합니다. 이 경우, 제브라피쉬 주사 설정은 단순히 플라이 배아 및 애벌레의 주입을 위해 조정되었다. 이 프로토콜뿐만 아니라 주입주사기와 마이크로 매니더를 활용하기 위해 더 단순화 될 수있다. 이러한 도구의 대부분은 생물학 부서에서 쉽게 사용할 수 있으며 심지어 교실 실험실 설정에서 사용할 수 있습니다, 프로토콜 구현의 최대 용이성을 허용.
화상 진찰 절차 도중, 화상 진찰을 위한 원하는 지구를 더 쉽게 확인하기 위하여 신경계의 세포를 표지하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 구체적으로, GAL4/UAS 시스템을 사용하여 뉴런 또는 글리아에서 GFP를 발현할 수 있으며, elav-Gal4또는 리포지토리-Gal4균주를 각각(표 2)31,32,33. 이러한 라벨링은 설포호다민 101산 염화물 덱스트렌과 대조를 제공하여 신경계의 무결성을 시각화할 것이다.
이 방법은 D. melanogaster의발달 도중 BBB의 무결성을 말하기에 집중하는 동안, 이 접근은 유기체 및 조직의 각종에 걸쳐 그밖 방벽의 무결성을 검토하기 위하여 적응될 수 있었습니다. 예를 들어, 마우스34에서BBB를 분석하기 위한 유사한 프로토콜이 출판되었다. 또한, D. 멜라노가스터에서 정자 발생 시 생식세포를 둘러싼 혈액-눈 장벽 및 체세포 장벽의 투과성은 유사한접근법(29,35)을이용한다. 프로토콜은 또한 창자를 포함하여 투과성을 시험하기 위하여 그밖 조직에서 사용을 위해 적응될 수 있었습니다. 다른 조직 또는 종에서 사용하기 위해이 프로토콜을 적응 할 때, 10 kDa dextran이 일부 장벽에 침투 할 만큼 작을 수 있으므로 장벽을 관통 할 수있는 분자의 크기를 고려해야합니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 다른 설정에서 사용하기 위해 쉽게 적응될 수 있는 D. melanogaster 개발 동안 BBB 무결성을 분석하는 단계별 절차를 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 주입을 위한 장비의 사용을 위한 박사 F. 브라이언 피켓 과 박사 로드니 데일 감사합니다. 이 작품은 로욜라 대학 시카고에서 M.D., D.T., J.J.에 연구 자금으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
References
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
- Hindle, S. J., Bainton, R. J.
- Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
- Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
- Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
- von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
- Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
- Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin--novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
- Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
- Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
- Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
- Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
- Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
- von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
- Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
- DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
- BDSC Cornmeal Food. , Bloomington Drosophila Stock Center. Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017).
- Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. Genetics. 174 (4), 2255-2257 (2006).
- Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
- Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
- Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
- Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
- Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
- Love, C. R., Dauwalder, B. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. Barichello, T. , Humana Press. New York, NY. 175-185 (2019).
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Developmental Biology. 238 (1), 47-63 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
- Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).
