Summary
La integridad de la barrera hematoencefálica es fundamental para la función del sistema nervioso. En Drosophila melanogaster, la barrera hematoencefálica se forma por células gliales durante la embriogénesis tardía. Este protocolo describe los métodos para el ensayo para la formación y el mantenimiento de barreras hematoencefálicas en embriones D. melanogaster y larvas de tercera estrella.
Abstract
El desarrollo adecuado del sistema nervioso incluye la formación de la barrera hematoencefálica, la barrera de difusión que regula estrechamente el acceso al sistema nervioso y protege el tejido neural de toxinas y patógenos. Los defectos en la formación de esta barrera se han correlacionado con las neuropatías, y la descomposición de esta barrera se ha observado en muchas enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es fundamental identificar los genes que regulan la formación y el mantenimiento de la barrera hematoencefálica para identificar posibles dianas terapéuticas. Con el fin de entender las funciones exactas que estos genes juegan en el desarrollo neuronal, es necesario determinar los efectos de la expresión génica alterada en la integridad de la barrera hematoencefálica. Muchas de las moléculas que funcionan en el establecimiento de la barrera hematoencefálica se han encontrado para ser conservadas a través de especies eucariotas, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Las moscas de la fruta han demostrado ser un excelente sistema modelo para examinar los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo y la función del sistema nervioso. Este protocolo describe un procedimiento paso a paso para el ensayo de la integridad de la barrera hematoencefálica durante las etapas embrionarias y larvales del desarrollo de D. melanogaster.
Introduction
Durante el desarrollo, la comunicación celular y las interacciones son fundamentales para el establecimiento de la estructura y función de tejidos y órganos. En algunos casos, estas interacciones células-células sellan los órganos del entorno circundante para asegurar el funcionamiento adecuado del órgano. Este es el caso del sistema nervioso, que está aislado por la barrera hematoencefálica (BBB). Disfunción del BBB en seres humanos se ha relacionado con trastornos neurológicos incluyendo epilepsia, y la descomposición de la barrera se ha observado en enfermedades neurodegenerativas incluyendo esclerosis múltiple y esclerosis lateral amiotrófica1. En los mamíferos, el BBB está formado por uniones estrechas entre las células endoteliales2,3. Otros animales, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, tienen un BBB compuesto de células gliales. Estas células gliales forman una barrera selectivamente permeable para controlar el movimiento de nutrientes, productos de desecho, toxinas y moléculas grandes dentro y fuera del sistema nervioso4. Esto permite el mantenimiento del gradiente electroquímico necesario para disparar potenciales de acción, permitiendo la movilidad y coordinación4. En D. melanogaster, la glia protege el sistema nervioso de la hemolinfa5rica en potasio.
En el sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (PNS) de D. melanogaster, dos capas glias externas, la glia subperineurial y la glia perineurial, así como una red externa de matriz extracelular, la lamela neural, forman la hemolinfa-cerebro y la barrera del nervio hemafifáfico6, conocido como el BBB a lo largo de este artículo. Durante el desarrollo la glia subperineurial se convierte nofoides y se agranda para rodear el sistema nervioso5,6,7,8,9,10,11 . La glia subperineurial forma uniones septato, que proporcionan la principal barrera de difusión entre la hemolinfa y el sistema nervioso5,6,12. Estas uniones son molecularmente similares a las uniones similares a septatos que se encuentran en los paranodos de la glia mielinante en vertebrados, y realizan la misma función que las uniones estrechas en el BBB de los mamíferos13,14, 15 , 16 , 17. La glia perineurial divide, crece y envuelve alrededor de la glia subperineurial para regular la difusión de metabolitos y moléculas grandes6,10,18,19. La formación de BBB se completa en 18,5 h después de la puesta de huevos (AEL) a 25 oC5,8. Estudios anteriores han identificado genes que son reguladores críticos de la formación BBB20,21,22. Para comprender mejor las funciones exactas de estos genes, es importante examinar el efecto de la mutación de estos reguladores potenciales en la integridad de bBB. Si bien estudios anteriores han esbozado enfoques para decir la integridad de BBB en embriones y larvas, aún no se ha descrito un protocolo integral para este ensayo5,7. Este protocolo paso a paso describe los métodos para decir la integridad de BBB durante las etapas embrionarias de D. melanogaster y la tercera etapa larval instar.
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Protocol
1. Recogida de muestras
- Colección embryo
- En cada jaula de recolección de embriones, utilice un mínimo de 50 hembras vírgenes con 20 a 25 machos para las colecciones. Incubar estas moscas en una botella con alimentos de agar harina de maíz(Tabla de Materiales)durante 1 a 2 días antes de comenzar las colecciones23.
NOTA: Se pueden utilizar más moscas, pero la proporción de mujeres a hombres debe mantenerse en 2:1. - Platos de agar jugo de manzana pre-caliente(Tabla 1) a 25oC durante la noche.
NOTA: Esto es necesario para la puesta en escena adecuada de embriones. Si las placas se están secando rápidamente, agregue un recipiente con agua a la incubadora para aumentar la humedad de la cámara. - Anestetiza las moscas del paso 1.1.1 con CO2 y transfiere las moscas a una jaula de recolección. Coloque un plato de agar jugo de manzana precalentado con un pequeño frotis de pasta de levadura en el extremo abierto y asegúrelo a la jaula con la manga roja(Tabla de materiales). Con el fin de limpiar embriones más viejos, permita que las moscas pongan embriones/huevos en una placa de agar jugo de manzana durante 1 h a 25 oC.
- Retire la jaula de recogida de la incubadora. Invierta el lado de la malla de la jaula hacia abajo y toque las moscas hacia abajo hasta la parte inferior de la jaula. Sustituya el agar jugo de manzana por un nuevo plato de agar de jugo de manzana precalentado con un pequeño frotis de pasta de levadura. Deseche el primer plato.
- Dejar que las moscas pongan embriones/huevos en la nueva placa de agar jugo de manzana durante 1 h a 25 oC. Deseche esta placa después de la recolección de 1 h y continúe con el siguiente paso para recoger embriones inyectables.
- Para recoger embriones de etapa tardía 17 (20-21 h AEL), permita que las moscas del genotipo deseado de los pasos 1.1.1-1.1.5 se acosten sobre una nueva placa de agar de jugo de manzana precalentada con un pequeño frotis de pasta de levadura a 25 oC durante 1 h. Placa de edad para 19 h en una incubadora de 25 oC , por lo que los embriones serán de 20 a 21 h de edad en el momento de la toma de imágenes.
NOTA: Este paso se puede repetir según se desee para múltiples rondas de recolección de muestras, inyección e imágenes. - Recoger embriones de placas en un colador de células con malla de nylon de 70 m mediante la adición de solución salina tamponada de fosfato (PBS) con 0.1% tensioactivo no iónico (PBTx; Tabla 1) para cubrir la superficie de la placa y aflojar embriones de la superficie usando un pincel.
- Embriones dechorionatos recogidos en el colador celular en una solución de lejía al 50%(Tabla 1) en una placa Petri de 100 mm durante 5 min con agitación ocasional a temperatura ambiente. Enjuague los embriones 3 veces girando el colador celular en PBTx en una placa Petri, usando un plato fresco de PBTx cada vez.
- Si todos los embriones son del genotipo correcto, proceda directamente al paso 1.1.10. Si la generación de embriones del genotipo correcto requiere una cruz con moscas heterocigotas, seleccione embriones del genotipo correcto utilizando la presencia o ausencia de cromosomas equilibradores marcados fluorescentesmente. Utilice un estereomicroscopio con capacidades fluorescentes para la selección de genotipos.
NOTA: Cromosomas equilibradores marcados con proteína fluorescente amarilla deformada; Kruppel-Gal4, proteína fluorescente verde UAS (GFP); y twist-Gal4, UAS-GFP funcionan bien para la selección del genotipo en la embriogénesis tardía(Tabla 2)24,25,26. - Utilizando una pipeta de vidrio, transfiera embriones en PBTx a una losa de gel de agarosa del 2% (Tabla 1). Retire el exceso de líquido con papel de filtro. Alinee los embriones de 6 a 8 en la losa de gel de agarosa del 2% con el lado posterior a la derecha y dorsal hacia arriba(Figura 1B).
NOTA: El micropyle, el pequeño orificio a través del cual los espermatozoides entran en el óvulo, se encuentra en el extremo anterior del embrión. El extremo posterior es más redondeado. La tráquea aparece blanca y se encuentra dorsalmente en el embrión, permitiendo la distinción de los lados dorsal y ventral del embrión(Figura 1B). - Prepare una diapositiva con una pieza de cinta adhesiva de doble cara. Presione firmemente la diapositiva en la parte superior de los embriones para transferirlos a la cinta de doble cara.
- Desecar embriones por incubación a temperatura ambiente por 25 min (no se utiliza desecante). Después de la desecación, cubrir los embriones con aceite de halocarbon.
NOTA: Los períodos de desecación pueden variar dependiendo de la temperatura, la humedad y la ventilación en la habitación. El período de incubación debe utilizarse para configurar el aparato para inyección y el microscopio confocal para la toma de imágenes, tal como se describe en las secciones 2 y 3 de este protocolo.
- En cada jaula de recolección de embriones, utilice un mínimo de 50 hembras vírgenes con 20 a 25 machos para las colecciones. Incubar estas moscas en una botella con alimentos de agar harina de maíz(Tabla de Materiales)durante 1 a 2 días antes de comenzar las colecciones23.
- Colección larval
- Establecer una cruz con 5 x 10 moscas hembra vírgenes del genotipo deseado y la mitad de machos del genotipo deseado en un vial con alimentos de harina de maíz-agar e incubar a 25 oC23.
- Después de 5 a 7 días, dependiendo del genotipo, recoger las larvas de tercera estrella errantes del vial suavemente con fórceps. Enjuague las larvas en 1x PBS para eliminar los alimentos pegados a las larvas. Transfiera las larvas a una placa de agar jugo de manzana para el genotipado como se describe en el paso 1.1.9 si es necesario.
- Enrolle las larvas sobre un pañuelo usando un pincel para secarlas. Transfiera 6 a 8 larvas a un portaobjetos preparado con cinta adhesiva de doble cara con fórceps.
2. Preparación de agujas e inyección de especímenes
- Tire de las agujas de un tirador de micropipeta antes del inicio de este protocolo. Asegure los tubos capilares en el tirador de la aguja y tire de acuerdo con la forma estándar de la aguja y los parámetros para las inyecciones de D. melanogaster (Tabla 3)27. Almacene las agujas en un plato de Petri anclando en arcilla hasta su uso para inyección.
- Cargue una aguja con 5 l de 10 kDa de dextran conjugado con cloruro ácido sulforhodamine 101(Tabla de materiales) utilizando una punta de pipeta de carga en gel de 20 l durante el período de desecación de 25 minutos para embriones (paso 1.1.12), o inmediatamente después de la transferencia de larvas al portaobjetos (paso 1.2.3).
- Cargue la aguja en un soporte de aguja y colóquela en un micromanipulador fijado a una base de acero(Tabla de materiales).
NOTA: La aguja debe ser casi paralela a la etapa del microscopio para la inyección de embriones y en ángulo ligeramente hacia abajo para las inyecciones de larvas. - Ajuste el aparato de inyección(Tabla de materiales)a 50 psi, 5 x 10 ms con un rango de 10.
NOTA: Puede ser necesario modificar estos ajustes para el aparato de inyección en particular que se está utilizando. - Coloque la corredera en el escenario y el borde del cepillo de la aguja contra el borde de la cinta de doble cara en un ángulo de 45o para crear una punta en ángulo rota.
NOTA: Para los embriones sólo es necesario romper la punta lo suficiente como para permitir el flujo del dextran de 10 kDa. Una aguja perfecta tiene una punta ligeramente inclinada y sólo una pequeña gota de tinte saldrá con cada inyección. Para las larvas, es necesario romper más la punta, pero con una punta en ángulo para penetrar en la pared del cuerpo larvario. Una gota más grande de tinte saldrá. - Bombee el pedal hasta que el tinte esté en la punta de la aguja.
- Alinee la aguja de modo que sea paralela con el embrión o en ángulo ligeramente hacia abajo hacia la larva.
- Mueva la aguja para perforar el extremo posterior de la muestra e inyecte la muestra bombeando el pedal. Inyectar 2 nL de tinte en embriones, y 220 nL de tinte en larvas.
NOTA: El embrión o larva debe inundarse con tinte si la inyección es exitosa. - Tenga en cuenta el tiempo de inyección para fines de incubación. Incubar embriones durante 10 min a temperatura ambiente. Incubar larvas durante 30 min a temperatura ambiente.
- Continúe por el portaobjetos para inyectar muestras adicionales, observando el tiempo de inyección de cada espécimen.
NOTA: Dependiendo de la velocidad con la que se pueden realizar los pasos posteriores de disección e imágenes, se pueden inyectar 4 a 8 muestras a la vez.
3. Preparación de muestras para imágenes
-
Imágenes de embriones
- Después de la inyección, prepare embriones para la toma de imágenes. Aplique vaselina con un aplicador con punta de algodón en los lados derecho e izquierdo de las muestras en el portaobjetos como espaciador para evitar daños a los embriones al colocar la cubierta.
- Muestras de imagen utilizando un microscopio confocal a lo largo de la profundidad del embrión con un objetivo de 20x. Calcular el porcentaje de muestras totales con tinte observado en el cordón del nervio ventral (VNC) utilizando la siguiente ecuación: % de muestras con BBB comprometida - Número de muestras con acumulación de tinte en el VNC/número total de muestras ensayadas.
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Disección e imágenes de larvas
- Prepare diapositivas para muestras larvales con anticipación. Monte dos cubiertas espaciadas aproximadamente 0,5 cm de distancia a la diapositiva con esmalte de uñas.
NOTA: Los cubreobjetos funcionan como espaciadores para el cerebro, por lo que no se daña durante el proceso de montaje. - Después de la incubación de 30 minutos, diseccionar las larvas en 1x PBS directamente en el portaobjetos que se utilizará en la toma de imágenes. Primero, usa un par de fórceps para agarrar la larva hasta la mitad del cuerpo larvario, y usa un segundo par de fórceps para separar las mitades anterior y posterior de la larva.
- A continuación, usa un par de fórceps para agarrar la región anterior en los ganchos de la boca, y usa un segundo par de fórceps para invertir la pared del cuerpo sobre la punta de los fórceps agarrando los ganchos de la boca. El cerebro y el VNC estarán expuestos.
- Separe el cerebro y el VNC de la pared del cuerpo separando los nervios y retire la pared del cuerpo de la diapositiva(Figura 1C,D). Retire los discos imaginables si lo desea.
- Cubra la muestra con 10 ml de glicerol al 80% y coloque un cubreobjetos encima de la muestra para obtener imágenes.
- Imagen a través de la profundidad del tejido del sistema nervioso utilizando un objetivo 20x. Calcular el porcentaje de muestras totales con tinte observado en el VNC.
- Prepare diapositivas para muestras larvales con anticipación. Monte dos cubiertas espaciadas aproximadamente 0,5 cm de distancia a la diapositiva con esmalte de uñas.
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Representative Results
Los métodos descritos aquí permiten la visualización de la integridad del BBB en todo el SNC en embriones y larvas de D. melanogaster (Figura 1). Una vez completada la formación de BBB en la embriogénesis tardía, el BBB funciona para excluir moléculas grandes del cerebro y VNC5. Este protocolo aprovecha esta función para probar la formación BBB. Cuando se inyectaron embriones de tipo salvaje (Oregon R) en etapa tardía 17 (20-21 h de edad) con 10 kDa de dextran conjugado según el tinte fluorescente de cloruro ácido de sulforhodamine 101, la molécula de dextran grande fue excluida del VNC, como se esperaba(Figura 2A). Con el fin de demostrar el efecto de las mutaciones genéticas en la integridad bBB, se utilizaron embriones con mutaciones en el gen crudo. Anteriormente, se ha demostrado que el gen crudo regula la retracción de la banda germinal durante la embriogénesis, y más recientemente se ha demostrado que funciona en la glia para regular los cambios morfológicos en el VNC durante el desarrollo28. Los embriones mutantes heterocigotos crudos1 exhibieron un BBB intacto, similar a los resultados observados en embriones de control de tipo salvaje(Figura 2B). Por el contrario, los embriones mutantes homocigotos crudos1 mostraron defectos en la integridad del BBB, con un tinte dextrano de 10 kDa inundando el VNC, lo que indica que el BBB no se formó(Figura 2C). Estos resultados demuestran la capacidad de esta técnica para analizar la formación de BBB durante las etapas embrionarias.
Estudios anteriores han demostrado que un defecto en la poliploidización de la glia subperineurial da lugar a una interrupción del BBB que se puede observar en las terceras etapas larvales de la estrella7,9. Por lo tanto, los defectos en la formación y/o mantenimiento de BBB podrían dar lugar a un BBB comprometido durante etapas posteriores de desarrollo, por lo que es deseable la integridad del ensayo de la barrera en la tercera etapa larval instar. Por lo tanto, el protocolo utilizado para decir la integridad de BBB en etapas embrionarias también se ha optimizado para su uso en larvas. En las muestras de control de Oregón R, 10 kDa dextran no puede penetrar el BBB y se excluye del cerebro y VNC(Figura 2D,E). El tinte se acumula en la periferia del BBB.
Figura 1: El sistema nervioso de los embriones en etapa 17 y la tercera larva instar. (A) Esquema de una vista ventral de un sistema nervioso central embrionario (SNC) en etapa 17. El SNC consiste en el cerebro (Br) y el cordón del nervio ventral (VNC), que tiene canales dorsoventrales (ch). El micropyle (mp; punta de flecha) en el extremo anterior se puede utilizar para orientar el embrión. Detrás a la derecha. (B) Embria de etapa 17 orientada con el lado dorsal hacia arriba y hacia la derecha, como se recomienda en el paso 1.1.10. Las flechas apuntan a la tráquea. Arrowhead indica el mp. Detrás a la derecha. (C) Esquema del sistema nervioso en la tercera larva instar. El cerebro (Br) y vNC componen el SNC, mientras que los nervios que se extienden desde la sinapsis VNC sobre los músculos de la pared del cuerpo y son parte del SNS. Detrás a la derecha. (D) Diseccionó el tercer cerebro larvario instar y vNC. Detrás a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ensayo para la formación de barrera hematoencefálica (BBB). (A-C) En etapa tardía 17 embriones (20-21 h de edad) se inyectaron posteriormente con 10 kDa de sulforhodamine 101 ácido cloruro dextran. Posteriormente hacia abajo. Barra de escala a 20 m. Los puntos que se ven en los controles son canales dorsoventrales que abarcan el cordón nervioso ventral (VNC). (A) Control Oregon R. Setiñe la ingesta en el 6,25% de las muestras, n a 16. (B) control hermano1/+ sin procesar. Setiñó la ingesta en el 6,67% de las muestras, n a 15. (C) Homocigoto crudo1/1 mutante. Tindeir la ingesta en el 100% de las muestras, n a 22. (D) Oregon R controlar el tercer cerebro larvario instar. El tinte se acumula en el BBB, pero no penetra en el SNC, n a 7. Barra de escala a 50 m. (E) Control Oregon R tercera instar larval VNC. El tinte se acumula en el BBB, pero no penetra en el SNC, n a 11. Línea discontinua delinea el VNC. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Morfología del intestino medio en el desarrollo embrionario tardío. Las imágenes de luz transmitidaden los embriones de la etapa 13 a 17 permiten la visualización de la morfología intestinal (regiones grises oscuras en la mitad posterior del embrión). La morfología de la parte media se puede utilizar para determinar la etapa del desarrollo embrionario, que es útil a la hora de determinar si los embriones están envejeciendo adecuadamente para la inyección. Barra de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Receta |
| 2% Gel de Agarosa | Añadir 0,8 g de agarosa a 40 ml de H2O de doble destilado (ddH2O) en un matraz Erlenmeyer y microondas para disolver el agar. Vierta en una bandeja de fundición de gel y deje que el gel se solidifique durante 30 minutos a temperatura ambiente. |
| Platos de agar jugo de manzana | Mida 45 g de agar y 1,5 L de ddH2O en un matraz de 4 L. Autoclave para 40 x 45 min a 121 oC. Mida 50 g de azúcar y 0,5 L de jugo de manzana en un vaso de precipitados de 1 L y revuelva a fuego lento (ajuste 3) para disolver el azúcar, teniendo cuidado de no quemarlo. Después del autoclave, agregue el azúcar precalentado y el jugo de manzana al agar y al agua. Revuelve a fuego lento con el calor apagado para dejar que se enfríe hasta que puedas tocarlo. Añadir 15 ml de 70% tegosept y remover para dispersar. Vierta en un vaso de precipitados de 0,5 L. Rocíe con etanol para eliminar burbujas o llamas con un quemador Bunsen. Vierta en platos petri de 60 mm. Dejar fijar durante al menos 24 h, o hasta que haya una condensación mínima en las tapas de los platos de petri y almacenar a 4 oC. |
| 50% Bleach | Añadir 15 ml de ddH2O y 15 ml de lejía doméstica en un tubo cónico. |
| 80% Glicerol | Para 10 ml, añadir 8 ml de ddH2O autoclavedo y 2 ml de glicerol a un tubo cónico de 15 ml. Incubar sobre un balancín hasta que la solución sea homogénea. |
| 1x PBS | Para 1 L, diluir 100 mL de 10pbs en 900 mL de ddH2O. |
| 10x PBS | Para 2 L, disolver lo siguiente en 1.600 ml de ddH2O: 160 g de NaCl, 4 g de KCl, 28,8 g de Na2HPO4y 4,8 g de KH2PO4. Ajuste el pH a 7,5 con HCl. |
| PBTx (PBS + 0,1% tensioactivo no iónico) | Para 1 L, combine 100 mL de 10pbS, 10 ml de surfactante no iónico 10% y 890 mL de ddH2O. |
| 70% Tegosept | Mezclar 1 g de ácido p-hidroxibenzoico, éster metílico por cada 10 ml de etanol 100%. Conservar a -20oC. |
| 10% Tensioactivo no iónico | Para 50 ml, añadir 45 ml de ddH2O autoclavey y 5 ml de tensioactivo no iónico a un tubo cónico. Gire sobre el balancín hasta que la solución sea homogénea. |
| Pasta de levadura | Mezclar la levadura activa seca con ddH2O en un vaso de precipitado de plástico de 50 ml hasta que quede suave. |
Tabla 1: Reactivos y búferes utilizados en este protocolo.
| Genotipo | Acción |
| w[1118]; ln(2LR)Gla, wg[Gla-1]/CyO, P-w[+mC]-GAL4-twi.G-2.2, P-w[+mC]-UAS-2xEGFP-AH2.2 | #6662 de Bloomington |
| w-*]; sna[Sco]/CyO, P-w[+mC]-Dfd-EYFP-2 | #8578 de Bloomington |
| w-*]; L[2] Pin[1]/CyO, P-w[+mC]-GAL4-Kr.C-DC3, P-w[+mC]-UAS-GFP. S65T-DC7 | #5194 de Bloomington |
| Df(1)JA27/FM7c, P-w[+mC]-GAL4-Kr.C-DC1, P-w[+mC]-UAS-GFP. S65T-DC5, sn[+] | #5193 de Bloomington |
| w[*]; ry[506] Dr[1]/TM6B, P-w[+mc]-Dfd-EYFP-3, Sb[1] Tb[1] ca[1] | bloomington #8704 |
| y[1] w[*]; D[*] gl[3]/TM3, P-w[+mC]-GAL4-Kr.C-DC2, P-w[+mC]-UAS-GFP. S65T-DC10, Sb[1] | #5195 de Bloomington |
| Oregon R | Múltiples cepas disponibles |
| crudo[1] cn[1] bw[1] sp[1]/CyO | #2749 de Bloomington |
| P-w[+mW.hs]-GawB-elav[C155] | bloomington #458 |
| w[1118]; P-w[+m*]-GAL4-repo/TM3, Sb[1] | Bloomington #7415 |
| P-UAS-GFP | Múltiples cepas disponibles |
Tabla 2: Variedadfly. Las cepas de mosca discutidas a lo largo de este protocolo. El número de stock del Bloomington Drosophila Stock Center se proporciona cuando corresponda.
| Ciclo | Calor | tirar | Velocidad | hora | Presión | Rampa |
| 1 | 590 | 115 | 15 | 250 | 600 | X |
| 2 | 575 | 130 | 60 | 250 | 600 | X |
Tabla 3: Ajustes del tirador de micropipetas. Ajustes del tirador de micropipetas utilizados para generar agujas inyectables en este protocolo.
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Discussion
Este protocolo proporciona una descripción completa de los pasos necesarios para el ensayo para la integridad de BBB durante las etapas larantes de D. melanogaster de D. melanogaster. Se han descrito enfoques similares en otros lugares para probar la integridad del BBB durante el desarrollo, así como en las etapas adultas5,7,29,30. Sin embargo, las descripciones de los procedimientos en las secciones de materiales y métodos son a menudo de naturaleza amplia y carecen de detalles suficientes para una fácil implementación, lo que requiere una solución de problemas significativa en nombre del investigador. Este protocolo proporciona una descripción completa de los pasos necesarios para el ensayo para la integridad de BBB durante las etapas embrionarias y larvales. En cada etapa, hay pasos críticos a seguir para asegurar que se está examinando la etapa correcta de desarrollo y no se interrumpe la arquitectura del tejido, lo que podría comprometer el BBB. Para alcanzar el éxito en estos enfoques era necesario resolver problemas los pasos múltiples del protocolo para producir resultados precisos. A continuación se describen los pasos críticos en los protocolos embrionarios y larvales.
Estudios anteriores han informado de la creación de la BBB por 18,5 h AEL5. Para garantizar una sincronización precisa del desarrollo, es importante mantener las muestras a una temperatura constante durante el envejecimiento. Al recoger embriones, las placas de agar jugo de manzana deben llevarse a 25 oC antes de su uso para su recolección. El uso de placas de jugo de manzana que no han sido precalentadas resulta en un desarrollo más lento y puede producir muestras que aún no han establecido un BBB y por lo tanto exhiben acumulación de 10 kDa dextran en el sistema nervioso. Como tal, es importante asegurarse de que uno está inyectando muestras que son mayores de 18.5 h. Además, al realizar estos experimentos en embriones, es necesario considerar la posibilidad de un retraso en el desarrollo, porque tal retraso podría simplemente resultar en el posterior establecimiento del BBB. Para dar cuenta de posibles retrasos en el desarrollo, las muestras se analizaron a 20 a 21 h de AEL, ligeramente después de la formación de BBB notificada. El uso de la morfología de otros tejidos, en particular el midgut en desarrollo, puede ayudar a establecer la etapa correcta de desarrollo del embrión que se está analizando(Figura 3). Por el contrario, el tiempo experimental inadecuado puede dar lugar a muestras que ya son móviles y han comenzado el proceso de eclosión. Para reducir el número de larvas que ya han comenzado a eclosionar, es importante realizar un mínimo de dos colecciones de 1 h para limpiar embriones mayores de hembras antes de recoger embriones para inyección. Si se desea el análisis de la BBB en las primeras larvas instar, se puede utilizar una breve incubación de larvas en 1x PBS en un plato de 9 pocillos en hielo para reducir la motilidad antes de la inyección. Los portaobjetos también se pueden mantener en una bolsa de hielo durante el procedimiento de inyección para reducir la motilidad.
Con el fin de garantizar imágenes de calidad y resultados precisos con respecto al establecimiento del BBB en el embrión, se deben seguir cuidadosamente pasos adicionales durante todo el procedimiento. Al alinear embriones en la losa de agar, la tráquea debe estar mirando hacia arriba, ya que este es el lado dorsal del embrión(Figura 1B). Cuando los embriones se transfieren a la diapositiva con la cinta de doble cara, el lado ventral del embrión estará mirando hacia arriba, lo que permite una visualización óptima del cordón nervioso durante la toma de imágenes confocales más adelante en el protocolo. Los embriones también deben adherirse firmemente a la cinta de doble cara para inhibir el movimiento durante la inyección. El uso de una almohadilla plana de agarosa del 2% permite al investigador empujar la diapositiva con la cinta de doble cara firmemente sobre los embriones durante el proceso de transferencia sin riesgo de daño a los embriones. Después de la transferencia a la diapositiva, la desecación es necesaria para evitar que el embrión se rompa tras la inyección de tinte. La inyección de demasiado tinte también puede hacer que el embrión se rompa. Es importante insertar sólo la aguja en el embrión lo suficiente para inyectar el tinte, pero no tanto que la aguja potencialmente perfora el sistema nervioso, lo que daría un resultado falso positivo. Demasiado grande de una herida punzante también puede resultar en la inundación de hemolinfa y tinte fuera del embrión, lo que conduce a un experimento fallido. Con estos posibles escollos en mente, la inyección es más exitosa con una aguja que tiene un ligero ángulo en la punta, de tal manera que hay un pequeño punto con el que perforar cuidadosamente el embrión.
En el caso de la reparación de larvas para la integridad de BBB, pueden surgir desafíos debido a la motilidad de la muestra. El uso de cinta adhesiva de doble cara de alta calidad es fundamental, ya que debe ser eficaz en la inmovilización de larvas para inyección. Si la larva se desata, se puede enrollar en la cinta y empujar suavemente hacia abajo para reasegurarla. Cuando se transportan larvas inyectables, es útil llevar el portaobjetos en una placa Petri en caso de que las larvas se desenganchen. Los pasos siguientes a la inyección requieren el mayor cuidado para evitar la interrupción del BBB. Con el fin de minimizar el daño potencial a la muestra, es más fácil diseccionar la muestra directamente en las diapositivas que se utilizarán para la toma de imágenes. Si la larva se adhiere fuertemente a la cinta al transferir la muestra para la disección, se puede añadir una gota de 1pbS a la cinta para aflojar la adhesión y permitir la transferencia a la diapositiva para su disección. Después de la disección, es importante aplanar la muestra lo suficiente para evitar resultados falsos positivos, pero no tanto que la integridad de la muestra se vea comprometida. El emparedado de la larva entre el cubreobjetos y el portaobjetos utilizando tapas adicionales como espaciadores evita que el cerebro se dañe, pero inmoviliza la muestra para obtener imágenes eficaces.
Con el fin de lograr el éxito con los protocolos tanto para embriones como para larvas, es fundamental asegurarse de que el aparato de inyección y el microscopio confocal estén configurados antes de que comience el procesamiento de la muestra. Esto permite una sincronización precisa en la toma de imágenes de las muestras, que es necesaria para la comparación de muestras. Otros enfoques han utilizado configuraciones de inyección más avanzadas, que requieren un microscopio invertido configurado para la inyección de embriones. Este protocolo utiliza un microscopio de disección estándar y un micromanipulador con un regulador de presión. En este caso, una inyección de pez cebra se adaptó simplemente para la inyección de embriones de mosca y larvas. Este protocolo podría simplificarse aún más para utilizar un micromanipulador con una jeringa inyectable también. Muchas de estas herramientas están disponibles en los departamentos de Biología e incluso pueden estar disponibles en entornos de laboratorio en el aula, lo que permite la máxima facilidad de implementación del protocolo.
Durante el procedimiento de diagnóstico por imágenes, puede ser útil etiquetar las células del sistema nervioso para identificar más fácilmente la región deseada para la toma de imágenes. Específicamente, se podría utilizar el sistema GAL4/UAS para expresar gFP en neuronas o glia, utilizando las cepas elav-Gal4 o repo-Gal4, respectivamente(Tabla 2)31,32,33. Tal etiquetado proporcionaría un contraste con el dextran de cloruro ácido sulforhodamine 101 para visualizar la integridad del sistema nervioso.
Si bien este método se centra en decir la integridad del BBB durante el desarrollo de D. melanogaster, este enfoque podría adaptarse para examinar la integridad de otras barreras a través de una variedad de organismos y tejidos. Por ejemplo, se han publicado protocolos similares para la reparación de la BBB en ratones34. Además, la permeabilidad de la barrera hematoento-ojo y la barrera somática que rodea a las células germinales durante la espermatogénesis en D. melanogaster utilizan un enfoque similar29,35. El protocolo también podría adaptarse para su uso en otros tejidos para probar la permeabilidad, incluso en el intestino. Al adaptar este protocolo para su uso en otros tejidos o especies, será necesario considerar el tamaño de las moléculas que pueden penetrar la barrera, ya que es factible que 10 kDa dextran pueda ser lo suficientemente pequeño como para impregnar algunas barreras. En general, este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para el ensayo de la integridad de BBB durante el desarrollo de D. melanogaster que se puede adaptar fácilmente para su uso en otros entornos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. F. Bryan Pickett y al Dr. Rodney Dale por el uso de equipos para inyección. Este trabajo fue financiado por fondos de investigación de la Universidad Loyola de Chicago a M.D., D.T., y J.J.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
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