Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Il progresso di nuovi metodi di coltura, come la tecnologia organoide, ha permesso la coltura degli organi in un piatto¹. Gli organoidi crescono in strutture tridimensionali (3D) che ricopriono il loro tessuto di origine mentre conservano tratti fenotipici e funzionali. Gli organoidi sono ora strumentali per affrontare le questioni biologiche^{fondamentali 2}, modellare le malattie tra cui^{il cancro 3}e sviluppare strategie di trattamento^{personalizzate 4,5,6,7}. Dal momento che il primo protocollo per la generazione di organoidi derivati da cellule staminali adulte intestinali⁸, la tecnologia organoide si è estesa per includere una vasta gamma di tessuti sani e cancerosi derivati da organi tra cui prostata⁹, cervello¹⁰, fegato^11,12, stomaco¹³, seno^14,15, endometrio¹⁶, ghiandola salivare¹⁷, papino del gusto 18 ,¹⁹, e renale²⁰.¹⁹

Lo sviluppo degli organoidi è concordato con l'aumento di nuove tecniche di microscopia volumetrica in grado di visualizzare l'architettura dell'intero tessuto di montaggio in 3D^21,,22,23,24. L'imaging 3D è superiore all'imaging tradizionale della sezione dei tessuti 2D nella visualizzazione della complessa organizzazione di campioni biologici. Le informazioni 3D si rivelano essenziali per comprendere la composizione cellulare, la forma delle cellule, le decisioni sul destino delle cellule e le interazioni cellulare-cellula di campioni biologici intatti. Le tecniche di sessazione ottica non distruttiva, come la microscopia a scansione laser confocale o multi-fotone (CLSM e MLSM) e la microscopia a fluorescenza dei fogli di luce (LSFM), ora consentono la visualizzazione combinata di dettagli fini, nonché l'architettura generale dei tessuti, all'interno di un singolo esemplare biologico. Questo potente approccio di imaging offre l'opportunità di studiare la complessità strutturale che può essere modellata con organoidi^{25 e} mappare la distribuzione spaziale, l'identità fenotipica e lo stato cellulare di tutte le singole cellule che compongono queste strutture 3D.

Recentemente abbiamo pubblicato un protocollo dettagliato per l'imaging 3D ad alta risoluzione di organoidi fissi e cancellati²⁶. Questo protocollo è specificamente progettato e ottimizzato per l'elaborazione di strutture organoide delicate, a differenza delle metodologie per grandi tessuti intatti come DISCO^27,28, CUBIC^29,30,31e CLARITY^32,33. Come tale, questo metodo è generalmente applicabile a una vasta gamma di organoidi diversi per origine, dimensione e forma e contenuto cellulare. Inoltre, rispetto ad altri protocolli di imaging volumetrico che spesso richiedono molto tempo e fatica, il nostro protocollo è poco presente e può essere completato entro 3 giorni. Abbiamo applicato il nostro protocollo di imaging 3D per visualizzare l'architettura e la composizione cellulare dei sistemi organoidi di recente sviluppo derivati da vari tessuti, tra cui le vie^{aeree umane 34}, rene²⁰,^{fegato 11}e organoidi del cancro al seno^{umano 15}. In combinazione con il tracciamento del lignaggio fluorescente multicolore, questo metodo è stato utilizzato anche per rivelare la biopotenza delle cellule basali negli organoidi mammari del topo¹⁴.

Qui, affiniamo il protocollo introducendo l'agente di compensazione non-xic FUnGI³⁵. La compensazione FUnGI si ottiene in un'unica fase di incubazione, è più facile da montare a causa della sua viscosità e conserva meglio la fluorescenza durante lo stoccaggio. Inoltre, introduciamo il sodio solfato di dodecile (SDS) nel buffer di lavaggio per migliorare le colorazione nucleare e un metodo di montaggio basato sul silicone per una facile preparazione del vetrato prima della microscopia. Nella Figura 1 vengono forniti una panoramica grafica del protocollo (Figura 1A) e esempi di organoidi con immagini 3D (Figura 1B-D). In breve, gli organoidi vengono recuperati dalla loro matrice 3D, fissa e immunoelicata, otticamente cancellata, immagine con microscopia confocale e quindi renderizzate in 3D con software di visualizzazione.

L'uso di organoidi derivati dai topi è conforme agli standard normativi ed è stato approvato dal Walter and Eliza Hall Institute (WEHI) Animal Ethics Committee. Tutti i campioni di organoidi umani sono stati recuperati dalle biobanche attraverso la tecnologia organoide Hubrecht (HUB, www.hub4organoids.nl). Le autorizzazioni sono state ottenute dal Comitato etico medico di UMC Utrecht (METC UMCU) su richiesta dell'HUB al fine di garantire il rispetto della legge olandese sulla ricerca medica che coinvolge i soggetti umani e il consenso informato è stato ottenuto dai donatori quando appropriato.

1. Preparazione dei reagenti

1. Per preparare la paraformaldeide (PFA) del 4% (w/v), riscaldare 400 mL di salina tamponata di fosfato (PBS) a poco meno di 60 gradi centigradi in un bagno d'acqua. Aggiungere 20 g di polvere di PFA e sciogliere con un agitatore.
   1. Successivamente, aggiungere alcune gocce di 10 M NaOH. Lasciar raffreddare sul ghiaccio e aggiungere qualche goccia di 10 M HCl per regolare il pH a 7.4. Con il PBS a 500 mL e l'aliquot (negozio a -20 gradi centigradi per un massimo di 2 mesi).
      NOTA: Non riscaldare al di sopra dei 60 gradi centigradi per evitare la degradazione del PFA. Tempo di preparazione : 4 h.
2. Per preparare pbS con Tween-20 (PBT) (0,1% v/v), aggiungere 1 mL di Tween-20 a 1 L di PBS (negozio a 4 gradi centigradi per un massimo di 4 settimane).
   NOTA: Tempo di preparazione : 10 min.
3. Per preparare 100 mL di acido etilenediatetraacetico (EDTA) 0,5 ML, aggiungere 18,6 g di EDTA e 2,5 g di NaOH a 80 mL di dH₂O. Regolare il pH a 8 con 1 M NaOH e riempire a 100 mL con dH₂O.
4. Per preparare 500 mL di 1 M Tris, sciogliere 60,55 g di Tris con 42 mL di concentrato (36-38%) HCl in 300 mL di dH₂O. Regolare il pH a 8 e riempire a 500 mL.
5. Per preparare il buffer di lavaggio organoide (OWB), aggiungere 1 mL di Triton X-100, 2 mL del 10% (w/v) SDS e 2 g di albumina di siero bovino (BSA) a 1 L di PBS (negozio a 4 gradi centigradi fino a 2 settimane).
   NOTA: Tempo di preparazione : 10 min.
6. Per realizzare 220 mL di FUnGI, mescolare 110 mL di glicerolo con 20 mL di dH₂O, 2,2 mL di buffer Tris (1 M, pH 8.0) e 440 lL di EDTA (0,5 M). Aggiungere 50 g di fruttosio e mescolare a temperatura ambiente (RT) al buio fino a dissoluzione. Quando è chiaro, aggiungere 49 g di fruttosio e mescolare fino a dissoluzione. Quindi aggiungere 33,1 g di urea e mescolare fino a dissoluzione (conservare a 4 gradi centigradi al buio).
   NOTA: Non riscaldare come fruttosio caramella a temperature più elevate. FUnGI è costituito da 50% (v/v) glicerolo, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 mM tris base, 1,1 mM EDTA, 2,5 M fruttosio e 2,5 M urea. Tempo di preparazione : 1 giorno.
7. Per preparare il PBS-BSA (1% w/v), sciogliere 1 g di BSA in 100 mL di PBS (conservare a 4 gradi centigradi fino a 2 settimane).
   NOTA: Tempo di preparazione : 10 min.

2. Recupero organoide

NOTA: I seguenti passaggi si applicano agli organoidi coltivati in estratto di membrana seminterrato (BME) che sono stati coltivati in una piastra di 24 pongimi con una dimensione di 100-500 m .

1. Aspirare il mezzo di coltura e lavare 1x con PBS ghiacciato. Evitare di interrompere la matrice 3D.
2. Mettere la piastra sul ghiaccio e aggiungere 1 mL di soluzione di recupero celle ghiacciate (Tabella dei materiali) ad ogni pozzo. Incubate 30-60 min a 4 gradi centigradi su uno shaker orizzontale (40 rpm).
   NOTA: le goccioline a matrice 3D devono essere completamente dissolte.
3. Rivestire una punta di pipetta da 1 mL con BSA immergendo l'1% PBS-BSA e pipettando su e giù 2x. Questo rivestimento impedirà agli organoidi di attaccarsi alla punta. Per rivestire il lato interno di un tubo conico da 15 mL, riempire con 5 mL dell'1% PBS-BSA, invertire 2x e scartare il PBS-BSA.
   NOTA: Questo rivestimento è necessario per tutti i materiali di consumo in plastica fino alla fissazione (punto 3.3).
4. Utilizzando una punta rivestita, risuondere delicatamente il contenuto del pozzo 5x e trasferire gli organoidi su tubi rivestiti da 15 mL. Gli organoidi di pozzi diversi con la stessa identità possono essere uniti nello stesso tubo.
5. Aggiungere 1 mL di ghiaccio-freddo 1% PBS-BSA per ogni coltura bene per risciacquare e raccogliere tutti gli organoidi.
6. Aggiungere PBS freddo a 10 mL e girare verso il basso per 3 min a 70 x g e 4 gradi centigradi per ottenere un pellet stretto senza uno strato visibile di matrice 3D. Rimuovere con attenzione il supernatant.

3. Fissaggio e blocco

1. Rispendere con cura gli organoidi in 1 mL di PFA ghiacciato utilizzando una punta rivestita di 1 mL.
2. Fissare a 4 gradi centigradi per 45 minuti. Rispendere delicatamente gli organoidi a metà del tempo di fissazione utilizzando una punta rivestita di 1 mL per garantire una fissazione uniforme tra tutti gli organoidi.
3. Aggiungere 10 mL di PBT ghiacciato al tubo, mescolare delicatamente invertendo il tubo, incubare per 10 min e girare verso il basso a 70 x g, entrambi a 4 gradi centigradi.
   NOTA: Da questo passaggio in poi il rivestimento delle punte non è generalmente necessario in quanto la maggior parte dei tipi di organoidi non si attaccano alla punta dopo la fissazione. Tuttavia, alcuni organoidi possono richiedere plastica rivestita anche dopo la fissazione.
4. Bloccare gli organoidi riempendo il pellet in OWB ghiacciato (almeno 200 L di OWB per pozzo) e trasferire gli organoidi su una piastra di sospensione a 24 gradi.
   NOTA: Gli organoidi di un grande pellet possono essere suddivisi su più pozzetti per eseguire diverse colorazione.
5. Incubare a 4 gradi centigradi per almeno 15 minuti.

4. Immunolabeling

1. Pipette 200 L di OWB in un pozzo vuoto per servire bene come riferimento.
   NOTA: L'immunoetichetta può essere eseguita anche in piastre da 48 o 96 pozzetti per ridurre l'uso degli anticorpi. Tuttavia, l'utente deve essere consapevole che sia la colorazione e le prestazioni di lavaggio potrebbero essere ridotte a causa del volume più piccolo.
2. Lasciare che gli organoidi si stabiliscano nella parte inferiore della piastra.
   NOTA: Questo può essere controllato utilizzando uno stereomicroscopio ed è reso più facile utilizzando uno sfondo scuro.
3. Inclinare la piastra di 45 gradi e rimuovere l'OWB lasciando gli organoidi in 200 L di OWB (utilizzare bene il riferimento per stimare 200 L).
4. Aggiungere 200 L di OWB con anticorpi primari 2x concentrati (ad esempio, E-cadherin [1:400] e Ki67 [1:200] per i risultati nella Figura 1; cheratina 5 [1:500], cheratina 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], e Ki67 [1:200] per i risultati in Figura 2) e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi, mentre leggermente a dondolo / agitazione (40 rpm su shaker orizzontale).
5. Il giorno successivo, aggiungere 1 mL di OWB.
6. Lasciare che gli organoidi si stabiliscano sul fondo della piastra per 3 minuti. Rimuovere l'OWB lasciando 200 L nella piastra. Aggiungere 1 mL di OWB e lavare 2 h con lieve dondolo / agitazione.
7. Ripetere il passaggio 4.6 altre due volte.
8. Lasciare che gli organoidi si stabiliscano sul fondo della piastra per 3 minuti. Rimuovere l'OWB lasciando 200 L nel pozzo.
9. Aggiungere 200 L di OWB con anticorpi secondari, anticorpi coniugati e coloranti 2x concentrati (ad esempio, DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], mouse-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] per i risultati nella figura 1; DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], coniglio-AF555 [1:500], mouse-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] per i risultati nella Figura 2; DAPI [1:1000], phalloidin-AF647 [1:100] per i risultati nella Figura 3) e incubare durante la notte a 4 gradi centigradi mentre leggermente a dondolo / agitazione.
10. Il giorno successivo, ripetere i passaggi 4.5-4.7.
11. Trasferire gli organoidi in un tubo da 1,5 mL e girare verso il basso a 70 x g per 3 min.

5. Sgombero ottico degli organoidi

1. Rimuovere il più possibile l'OWB pipettando senza interrompere gli organoidi.
2. Aggiungere FUnGI (almeno 50 L, RT) utilizzando una punta da 200 L con l'estremità tagliata e riesferare delicatamente per prevenire la formazione di bolle. Incubare a RT per 20 min.
   NOTA: la compensazione ottica di FUnGI può causare un minore restringimento del tessuto. Questo non influenzerà la morfologia generale degli organoidi monostrati e multistrato; tuttavia, gli organoidi monostrati a forma sferica con grandi lumen possono collassare. Il protocollo può essere messo in pausa qui e i campioni possono essere conservati a 4 gradi centigradi (per almeno 1 settimana) o a -20 gradi centigradi (per almeno 6 mesi).

6. Preparazione dello scivolo per l'imaging confocale

1. Preparare una siringa da 10 mL con un sigillante in silicone(Tabella dei Materiali). Fissare una punta da 200 L e tagliare l'estremità per consentire un leggero flusso del silicone viscoso dopo aver premuto la siringa. Utilizzare la siringa per disegnare un rettangolo di 1 cm x 2 cm al centro di una diapositiva.
2. Tagliare l'estremità di una punta da 200 L e trasferire gli organoidi in FUnGI al centro del rettangolo.
3. Posizionare un coperture sulla parte superiore. Per ridurre al minimo le bolle d'aria intrappolate, posizionare prima il lato sinistro del cosopermento, quindi abbassare lentamente il costolo da sinistra a destra fino a quando non c'è aria intrappolata e quindi rilasciare il cosopermento.
   NOTA: i distanziatori di dimensioni simili agli organoidi possono essere utilizzati per evitare che vengano danneggiati.
4. Applicare delicatamente la pressione su tutti i bordi del cosepevolmento per attaccarlo saldamente al sigillante in silicone. La diapositiva è ora pronta per l'imaging.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui e il campione può essere conservato a 4 gradi centigradi (per almeno 1 settimana) o a -20 gradi centigradi (per almeno 6 mesi).

7. Acquisizione ed elaborazione delle immagini

1. Utilizzando un microscopio a scansione laser confocale (Tabella dei Materiali), immagini lo scivolo con un'immersione multi-immersione 25x o un'immersione ad olio 40x obiettivo per l'imaging confocale.
   1. Utilizzare le seguenti impostazioni di acquisizione per l'obiettivo 25x: frame della modalità di scansione, dimensione fotogramma 1024 x 1024, dimensione voxel 332 nm x 332 nm x 1,2 m, pixel dwell time <2 s, scansione bidirezionale, numero medio 1, profondità di bit 8. Per ridurre la fotobleaching, utilizzare una bassa potenza laser (<5% in generale, <10% per la colorazione debole).
   2. Utilizzare la modalità stack z per definire i limiti inferiore e superiore e impostare la dimensione del passo z su ottimale. Quando si imaging grandi strutture organoidi o più organoidi insieme, utilizzare la modalità di affiancamento con 10% sovrapposizione e indicare l'area di interesse.
      NOTA: con queste impostazioni, la dimensione dei dati per un organoide tipico con un diametro di <300 m è <1 GB.
2. Per i set di dati di scansione dei riquadri, unire i file di imaging nel software accompagnati dal microscopio (Tabella dei materiali). Nella sezione di lavorazione, selezionare Cucitura come metodo, scegliere Nuovo output in Parametri e selezionare il file da unire. Premere Applica per avviare la cucitura.
3. Ottenere una rappresentazione 3D dell'immagine nella scheda Vista 3D del software di imaging (Tabella dei materiali) e successivamente ottimizzare le proprietà di luminosità, contrasto e rendering 3D. Esportare le istantanee RGB dei risultati come file TIFF.

L'imaging degli organoidi in 3D consente la visualizzazione dell'architettura, della composizione cellulare e dei processi intracellulari in grande dettaglio. La tecnica presentata è poco osificante e può presumibilmente essere applicata a una vasta gamma di sistemi organoidi derivati da vari organi o specie ospitanti.

La forza dell'imaging 3D rispetto all'imaging 2D è illustrata da immagini di organoidi della ghiandola mammaria del topo che sono stati generati utilizzando i metodipubblicati di recente 14. Lo strato centrale di questi organoidi è costituito da cellule luminali A forma di colonna K8/K18 e lo strato esterno contiene cellule basali G5-postive allungate (Figura 2A), che ricapitola la morfologia della ghiandola mammaria in vivo. Questa organizzazione polarizzata è difficile da apprezzare da una sezione ottica 2D dello stesso organoide (Figura 2B, pannello centrale). Un altro esempio di struttura complessa che è impossibile da interpretare senza informazioni 3D è la rete di canaliculi MRP2-positivi che facilitano la raccolta del liquido biliare degli organoidi del fegato umano11 (Figura 2B). Questo esemplifica come il nostro metodo consente la visualizzazione delle caratteristiche strutturali essenziali degli organoidi. Inoltre, la qualità e la risoluzione ottenute consentono la segmentazione semiautomatica e l'analisi delle immagini. Pertanto, i numeri di cellulare totali e la presenza di marcatori possono essere quantificati in specifici sottotipi cellulari in organoidi interi. Lo illustriamo segmentando i nuclei di un intero organoide contenente 140 cellule, di cui 3 celle mostrano un'elevata positività per il marcatore del ciclo cellulare Ki67 (Figura 2C). Il canale DAPI viene selezionato come canale sorgente e i segmenti vengono generati in base a un passo di soglia dell'intensità e a un diametro della sfera di 10 m. Gli oggetti toccanti vengono divisi per regione che crescono dai punti di inizializzazione. Infine, viene applicato un filtro di dimensioni di 10 voxel per rimuovere piccoli segmenti indotti dal rumore. Per ogni segmento che rappresenta un nucleo, l'intensità media del canale Ki67 viene quindi esportata per la stampa.

Recentemente abbiamo sviluppato l'agente di compensazione ottica FUnGI35, che ora abbiamo integrato in questo protocollo per affinare la trasparenza degli organoidi. FUnGI è facile da usare, in quanto la compensazione è prontamente ottenuta da una singola fase di incubazione dopo la colorazione immunofluorescente. Un ulteriore vantaggio dell'agente è la sua viscosità, che rende più facile la gestione del campione durante il montaggio del flusso. I campioni fluorescenti in FUnGI conservano la loro fluorescenza anche se conservati per più mesi a -20 gradi centigradi. Dimostriamo che FUnGI supera gli organoidi non chiariti e il fruttosio-glicerolo nella qualità del segnale fluorescente in profondità nell'organoide (Figura 3A,B) e che gli organoidi cancellati da FunGI hanno un'intensità di fluorescenza complessiva migliorata rispetto agli organoidi non chiariti (Figura 3C).

In sintesi, descriviamo una tecnica di imaging 3D non deducibile e riproducibile per l'acquisizione di dati volumetrici di organoidi immunoelettici. Questo protocollo può essere facilmente utilizzato per immagini di una varietà di organoidi tra cui quelli di origine sia del topo che dell'uomo, da modelli sani e di malattia. La semplice preparazione del campione può essere adattata per facilitare microscopi fluorescenti confocali, multifocali e fogli di luce per ottenere la risoluzione cellulare a subcellulare di interi organoidi.

Figura 1: panoramica schematica del protocollo di imaging 3D ad alta risoluzione. Gli organoidi vengono recuperati dalla loro matrice 3D. La fissazione e il blocco vengono eseguiti prima dell'immunoetichettazione con anticorpi e coloranti. La compensazione ottica viene ottenuta in un unico passaggio utilizzando l'agente di compensazione FUnGI. Il rendering 3D delle immagini può essere eseguito utilizzando un software di imaging. (A) Panoramica schematica della procedura. (B) Cancellata l'immagine confocale 3D di un organoide colonico umano immunoi labeled for F-actin and E-cadherin (E-cad) (25x oil objective). Barra della scala di 40 m. (C) Cancellato l'immagine confocale 3D con montata intera. Barra della scala di 20 m. (D) Sezione ottica ingrandita di un organoide colonico umano immunoimatichettato per F-actin, E-cadherin (E-cad) e Ki67 (obiettivo olio 25x). Barra della scala di 5 m. Questa cifra è stata modificata da Dekkers et al.26. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: L'imaging volumetrico visualizza un'architettura 3D complessa. Immagini confocali che rappresentano set di dati 3D (pannello sinistro), sezioni ottiche 2D (pannello centrale) e aree 3D di un'area ingrandita (pannello destro). (A) Un organoide derivato da una singola cellula basale della ghiandola mammaria del topo che illustra l'organizzazione 3D di cellule basali mammifero allungate che circondano cellule luminali o etichettate per K8/18, K5 e F-actin (compensazione del fruttosio-glicerolo; obiettivo dell'olio 25x). Le barre di scala rappresentano 55 m (pannello sinistro) e 40 m (pannelli centrale e destro). (B) Un organoide del fegato fetale umano con una complessa rete 3D di canaliculi positivi MRP2, etichettati per DAPI, MRP2 e F-actin (compensazione del fruttosio-glicerolo; obiettivo dell'olio 40x). Le barre di scala rappresentano 25 m (pannello sinistro) e 8 m (pannelli centrale e destro). (C) Immagine confocale 3D intera montata di un organoide epatico fetale umano etichettato con DAPI e Ki67 (pannello sinistro) e un'immagine segmentata sul canale DAPI utilizzando un software di imaging (pannello centrale). Barra della scala di 15 m. Grafico tracciato che rappresenta l'intensità media Ki67 in tutte le celle (segmentate DAPI) dell'intero organoide (140 celle) (pannello destro). Questa cifra è stata modificata da Dekkers et al.26. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: compensazione ottica degli organoidi con FUnGI. (A) Immagini rappresentative di organoidi colonici umani etichettati con F-actin (verde) e DAPI (grigio) e immagini senza compensazione, cancellate con fruttosio-glicerolo o cancellate con FUnGI (obiettivo olio 25x). Pannello sinistro: rendering 3D dell'organoide. Pannello destro: sezione ottica dell'organoide a 150 m di profondità. Per la condizione "nessuna compensazione" la luminosità dell'immagine doveva essere aumentata rispetto alle condizioni "fructose-glicerrol" e "FUnGI" per visualizzare l'organoide. Barra della scala di 50 m. (B) Adattamento di regressione non lineare che mostra la diminuzione dell'intensità DAPI con l'aumento della profondità di z per diversi metodi di compensazione ottica. I valori rappresentano intensità delle singole cellule rilevate dalla segmentazione DAPI e sono normalizzati all'intensità DAPI media dei primi 50 m dell'organoide. Per evitare di sottovalutare l'attenuazione causata da cellule più luminose sui bordi più profondi e sulle strutture in erba, sono state analizzate solo le regioni centrali degli organoidi. (C) Tre organoidi per condizione di dimensioni e profondità simili verso il coverslip sono stati illustrati utilizzando impostazioni al microscopio identiche. I set di dati 3D completi sono stati segmentati a singola cella sul segnale DAPI per il confronto. Grafico a barre che mostra l'intensità media daPI con diversi metodi di compensazione su set di dati segmentati completi. I dati sono raffigurati come ± SD. I valori sono intensità di >3800 singole celle rilevate dalla segmentazione DAPI. p < 0.0001, test Kruskal-Wallis con test post-hoc a confronto multiplo di Dunn a due lati. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.