Summary
Heri beskriver vi en procedure for genom-dækkende analyse af DNA methylering i gastrointestinale kræftformer. Proceduren er relevant for undersøgelser, der undersøger forholdet mellem methyleringsmønstre af gener og faktorer, der bidrager til carcinogenese i gastrointestinale kræftformer.
Abstract
DNA methylering er en vigtig epigenetisk ændring, der er biologisk meningsfuld og et hyppigt fokus for kræftforskning. Genom-dækkende DNA methylering er en nyttig foranstaltning til at give en nøjagtig analyse af methylering status mave (GI) maligne. I betragtning af de mange potentielle translationelle anvendelser af DNA methylering analyse, praktiserende klinikere og andre nye til DNA methylering undersøgelser skal være i stand til at forstå trin for trin, hvordan disse genom-dækkende analyser udføres. Målet med denne protokol er at give en detaljeret beskrivelse af, hvordan denne metode anvendes til biomarkøridentifikation i gi-maligniteter. Det er vigtigt, at vi beskriver tre kritiske trin, der er nødvendige for at opnå nøjagtige resultater under genom-dækkende analyse. Disse tre metoder mangler klart og koncist og er ofte ikke mærkbare for de nye epigenetiske undersøgelser. Vi brugte 48 prøver af en GI malignitet (mavekræft) til at fremhæve praktisk talt, hvordan genom-dækkende DNA methylering analyse kan udføres for GI maligne.
Introduction
Epigenetik refererer til arvelige ændringer i genfunktionen uden ændring af sekvensen af DNA1. Sådanne ændringer kan skyldes DNA-methylering, hvor methylgrupper på en DNA-base kan ændre genekspressionen gennem ændringer i kromatinpakning. Kræft udvikling og progression kan forekomme, hvis denne effekt resulterer i ændret udtryk for tumor suppressor gener2. Aldring og kronisk inflammation er både årsager til kræft og de vigtigste årsager til ændringer i DNA methylering hos mennesker3,4,5. Derfor, Dette giver mulighed for udnyttelse af DNA methylering som biomarkør i kræftdiagnose, og som et mål for behandling og forebyggelse. For tidlig påvisning og kræft prognose, DNA methylering bliver målt i tumor, blod, urin, og afføringsprøver6, mens demethyleringsmidler nu bliver brugt til behandling af leukæmi såsom myelodysplastisk syndrom7.
Genom-dækkende DNA methylering analyse ved hjælp af en array platform for kompleks evaluering af DNA methylering på en individuel CpG locus i det menneskelige genom kan anvendes til at undersøge methylering status mere end 450.000 CpG steder i genomisk DNA8,9, som tillader udforskning af kræft epigenetik (se Tabel over Materialer). Hele genom bisulfit sekventering (WGBS) teknologier har ændret vores tilgange inden for epigenetics10,11. Der er dog visse ulemper ved teknologierne i form af betydelige omkostninger og behandlingstid for epigenetisk analyse af et stort antal prøver10,11. Derfor er arrayplatformen mere mulig for kompleks evaluering af DNA-methylering i det menneskelige genom. Tilgængeligheden af tilgange til genom-dækkende methylering analyser er forbedret i de seneste par år og giver os mulighed for at udvide vores viden om, hvordan DNA methylering bidrager til kræft udvikling og progression12. Nylige fremskridt inden for microarray-platform tilgange giver os begrundelsen for genom-dækkende methylering analyse for at identificere en ny epigenetisk signatur i gastrointestinal kræft13. Målet med denne protokol er at give en detaljeret beskrivelse af, hvordan denne metode bruges til biomarkøridentifikation i gi-maligniteter.
Protocol
Alle procedurer, der blev fulgt, var i overensstemmelse med de etiske standarder i institutionernes etiske komité for menneskelig forskning. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board på Juntendo University Shizuoka Hospital, og skriftligt informeret samtykke blev givet afkald på på grund af det retrospektive design.
1. Vask af objektglas
- Der klargør 10 μm uindgroede formalinfaste paraffininddete (FFPE) sektioner.
- Placer dias i en glasdiasholder: Brug ca. 3-5 største tværsnitsdias, medmindre vævet er minimalt, og der er behov for flere dias.
- Fyld slideholderen med xylen, og sørg for, at alt væv på diaset er nedsænket. Lad det sidde i 15 min.
- Efter 15 min, hæld xylen ud med dias holdt med en pipette spids, så dias ikke falder ud.
- Hæld mere xylen til samme niveau som før. Lad det sidde i yderligere 15 min.
- Efter 15 min, hæld xylen igen.
- Fyld diasholderen med 100% ethanol (EtOH), og sørg for, at alt væv på diaset er helt nedsænket. Lad det sidde i 3 min.
- Hæld EtOH, mens du holder diasene forsigtigt. Refill til samme niveau med mere EtOH. Lad det sidde i 2 min.
- Hæld EtOH igen og fjern diaset. Læg dem forsigtigt med billedsiden oppe på en ren køkkenrulle til tørre. Lad det sidde i 10 minutter.
2. Skrabning af objektglas
- Der klargør fordøjelses-/lysisbuffer med 650 ml diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandlet vand 100 ml ethylenediamintetraacetic syre (EDTA), 50 ml Tris hydrochlorid (Tris-HCL) 2 M pH 8,8 og 200 ml 10% natrium dodecylsulfat (SDS) (se tabel over materialer).
- Fyld et 1,5 ml engangssydrør med 80 μL fordøjelses-/lysisbuffer (se Materialetabel).
- Sæt en ren pipettespids ind i bufferen.
- Identificer kræft væv af tumorområdet mest egnet til makrodissektion i henhold til den relevante H & E farves sektion.
BEMÆRK: Tumorområdet for makrodissektion bør identificeres ved helst to kvalificerede patologer. - Macrodissect kræft væv baseret på den markerede H & E farves sektion.
- Tag en ren barberblad og forsigtigt skrabe kræftvæv fra diaset, forsøger at holde det i ét stykke, så det er lettere at arbejde med.
- Tag pipettespidsen ud af engangsspolypropylenrør, der indeholder buffer, og brug det til at overføre det kasserede væv til bufferhætteglasset (se Materialetabel).
BEMÆRK: Den våde spids skal tiltrække vævet, hvilket gør overførslen lettere.
- Gentag trin 2.5 med resten af diasene.
- Efter alt væv er i engangs-polypropylen rør, bruge spidsen for at sikre vævet er helt nedsænket og ikke sidder fast på væggen af røret.
- Der tilsættes 20 μL subtilisin-relateret serinprotease til hætteglasset, og svip forsigtigt for at blande (se Tabel over materialer).
- Hætteglasset sættes i en varmeblok på 55 °C i mindst 4 timer eller natten over. Sørg for at lidt vortex efter 2 timer.
3. Behandling med Bisulfit
- Brug 45 μL af den fordøjede vævsopløsning som prøve.
- Udfør behandling med bisulfit ved hjælp af reagenser i et bisulfitomdannelsessæt i overensstemmelse med producentens anvisninger (se Materialetabel).
- Der tilsættes 5 μL fortyndingsbuffer til DNA-prøven, og inkuberes ved 37 °C i 15 minutter (se materialetabel).
- Mens prøverne inkuberes, klargøres bisulfitomdannelsesreagesage ved tilsætning af 750 μL dH2O og 210 μL fortyndingsbuffer til et rør af CT-omdannelsesreagesegenage (se tabel over materialer). Bland rørene ved at hvirvle i 10 min.
- Efter inkubationen på 15 minutter tilsættes 100 μL af det forberedte CT-omdannelsesgendannelsesgenage til hver prøve og blandes ved inversion.
- Prøverne inkuberes i mørke ved 50 °C i 12 til 16 timer.
- Efter inkubationen fjernes prøverne og på isen i 10 min.
- Der tilsættes 400 μL bindingsbuffer, og hver prøve blandes ved at pipettere op og ned (se Tabel over materialer). Hver prøve anbringes i en spinkolonne, og kolonnen anbringes i et 2 ml opsamlingsrør (se Materialetabel).
- Centrifuge hver prøve ved fuld hastighed (10.000 x g)i 1 min. og kassér gennemstrømningen.
- Der tilsættes 200 μL vaskebuffer til hver kolonne, og der drejes ved fuld hastighed i 1 min. og kasseres (se Materialetabel).
- Der tilsættes 200 μL desulfonationsbuffer til hver kolonne, og kolonnen kan stå ved stuetemperatur i 15 minutter (se Materialetabel). Efter inkubationen drejes kolonnerne ved fuld hastighed i 1 min. og afsmid gennemstrømningen.
- Der tilsættes 200 μL vaskebuffer til hver kolonne, og der drejes ved fuld hastighed i 1 min (se Materialetabel).
- Gentag dette trin en gang til.
- Der tilsættes 46 μL dH2O i hver kolonne, og hver kolonne anbringes i et nyt sterilt 1,5 ml engangssylterør (se Materialetabel). Drej hvert rør i 2 min for at elute DNA.
- Hver spinkolonne fjernes fra engangssylterøret og kassér den (se materialetabel). DNA'et er nu klar til analysen.
4. Array platform for evaluering af DNA methylering på en CpG locus i det menneskelige genom
- Vurdere kvaliteten af DNA (kvalitetskontrol: QC) ved hjælp af FFPE QC-analysen på et PCR-forstærknings- og detektionsinstrument i realtid, hvor efterfølgende dataanalyse udføres i overensstemmelse med producentens anvisninger (se Materialetabel).
BEMÆRK: Prøver med ∆Cq-værdier, der er mindre end de anbefalede 5.0, behandlesyderligere 14. - Analysere prøver med en array platform for kompleks evaluering af DNA methylering at vurdere methylering status > 450.000 CpG steder i genomet (se Tabel over Materialer). Produktinformationsark, dataark og produktfiler til arrayplatformen er tilgængelige15.
BEMÆRK: Analysen udføres i overensstemmelse med producentens anvisninger for FFPE-materiale14. - Beregn høj og lav locusmethylering i et dataanalyseværktøj for en arrayplatform som en β-værdi med et interval fra henholdsvis 0 til 1 (se Tabel over materialer). Brug kommercielt tilgængelig software (se Materialetabel)til at beregne β værdi.
- Importér data, der genereres på arrayplatformen til kompleks evaluering af DNA-methyleringsplatformen, til R-softwaremiljøet (R v.2.15.1), og bearbejde dem ved hjælp af et værktøj til analyse af methyleringsarrays16,17.
BEMÆRK: På heatmap, som genereres ved hjælp af et dataanalyseværktøj, bestilles kolonner ved hjælp af ikke-overvåget klyngedannelse, mens rækkefølgen af rækker er baseret på den faldende betydning af t-statistikken for differentialmethylering fra top til bund. - Opdel heatmap i høj og lav methylering grupper ved hjælp af den første differentiator i den uovervågede klyngedannelse.
BEMÆRK: Til validering med kvantitativ methyleringsspecifik PCR (qMSP) skal du vælge gener baseret på en større β-værdi i forhold til CpG-øerne i arrangørregionen og på grund af deres egnethed til primer- og sondedesign til qMSP.
5. Kvantitativ methyleringsspecifik PCR (qMSP)
- Brug det bisulfit-modificerede DNA fra trin 3.3 som skabelon for fluorescensbaseret PCR i realtid i qMSP til at evaluere methylering af promotorregionen i hver genanalyse.
- Udfør qMSP ved hjælp af et 96-brønds PCR-instrument i realtid (se Materialetabel).
- Kontroller for promotormethylering status af målet genet på bisulfit-modificerede DNA ved hjælp af 200 nM fremad primer, 200 nM omvendt primer, og 80 nM sonder. Forbered master mix med 16,6 mM (NH4)2SO4,67 mM Tris pH 8,8, 10 mM β-mercaptoethanol, 10 nM fluorescein, 0,166 mM af hver deoxynucleotitid tripfosfat og 0,04 U/μl DNA polymerase (se Tabel over materialer). Det endelige reaktionsvolumen i hver brønd for alle analyser er 25 μL.
- Der cykles qMSP således: 95 °C i 5 minutter efterfulgt af 55 cyklusser på 95 °C i 15 s, 60 °C i 1 min. og 72 °C i 1 min.
BEMÆRK: Målgenet bør vælges ud fra kriterierne for at have større betaværdier, være relateret til CpG-øer i promotorregionen og være egnet til primer- og sondedesign til qMSP.
- Brug humant genomisk behandlet med CpG Methylase (M.SssI) som en positiv methyleringskontrol (se Materialetabel).
BEMÆRK: Den endelige kvantificering af methylering defineres som den relative methyleringsværdi (RMV) og beregnes som 2-ΔΔCt for hver methyleringsdetektionsrelikt sammenlignet med den gennemsnitlige Ct for β-Actin (ACTB)18. Primer- og sondesekvenser er vist i tabel 1. En Ct på 100 bruges til uopdagede replikater, hvilket giver en værdi på 2-ΔΔCt tæt på nul. Følgende formel anvendes: gennemsnitlig 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/318.
Representative Results
De særlige kendetegn ved 48 patienter med mavekræft i uddannelse kohorte er som følger(tabel 2):medianalderen for patienter var 74 år (52-89 år), og kohorten omfattede 38 mænd (79,2%), og 10 kvinder (20,8%). Der var 35 patienter (72,9 %) med primær mavekræft og hos 13 patienter (27,1 %) med rest gastrisk kræft (primær mavekræft: første forekomst af en ikke-metastatisk malignitet i maven; rest gastrisk kræft: kræft i rest maven, der udviklede sig mere end 5 år efter distal gastrektomi, uanset årsagen til den oprindelige resektion19). Der var 23 patienter (47,9 %) med lymfeknudemetastase og 25 patienter (52,1 %) Uden. For det første blev alle 48 prøver (træningskohorten) indlæst til identifikation af afvigende værdier (figur 1A). To prøver gav toppe, der var større end to standardafvigelser forskudt fra de andre, og disse prøver blev fjernet (Figur 1B). Derfor blev 46 prøver grupperet af DNA-promotorhypermethylering. Den resulterende heatmap blev opdelt i to grupper baseret på høj og lav methylering (Figur 2). Dette heatmap giver mulighed for visualisering af top 50 sonder inden for 1.500 bp af transskriptionelle start site (TSS) i differentialmethylering analyse. De høje og lave methyleringsgrupper varierede i klinikopatologiske faktorer relateret til en aggressiv ondartet fænotype. Det vil sige, at den type kræft (primær mavekræft: PGC) (p = 0,01, odds ratio = 9,09 (1,67-50,00)) og tilstedeværelsen af lymfeknude metastase (positiv) (p = 0,03, odds ratio = 6,82 (1,16-40,08)) fremstod som betydelige uafhængige prædiktive faktorer, når de klinikpatologiske faktorer blev brugt som kovariater i multivariate analyse (Tabel 3). Endelig identificerede vi EPB41L3-genet20,21 (primer- og sondesekvenser vist i tabel 1) som værende stærkt forbundet med kodificering af træningskohorten i høj- og lavmethyleringsgrupper i mikroarray-analysen. Ved hjælp af qMSP blev resultaterne af microarray-analysen for EPB41L3 i testkohorten (126 prøver) valideret. Patienternes karakteristika i testkohorten er vist i tabel 4. RMVs af EPB41L3 i PGC-væv var signifikant højere end i restgastrisk kræft (RGC) i univariatanalyse (p = 0,01) (Figur 3A). Tilsvarende var RMVs i prøver med lymfeknudemetastase signifikant højere end dem uden lymfeknudemetastase (p = 0,03) (Figur 3B). På denne måde kan DNA-methyleringsgenomanalyse hjælpe os med at identificere specifikke gener til at karakterisere visse kliniske status hos patienter med GI-maligniteter.
Figur 1: Betaværdier i 48 prøver (træningskohorte). Alle 48 prøver (uddannelse kohorte) blev lastet og outliers blev undersøgt (A). To prøver havde toppe, der var outliers, og disse blev fjernet (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Det resulterende heatmap. De resterende 46 prøver blev grupperet af DNA-promotorhypmethylering. Heatmap blev opdelt i høj og lav methylering grupper. Dette heatmap giver mulighed for visualisering af top 50 sonder inden for 1.500 bp af transskriptionelle start site (TSS) i differentialmethylering analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Relative methyleringsværdier (RMVs) for EPB41L3 i primær mavekræft (PGC) vs. rest gastrisk kræft (RGC) og i tilfælde med og uden lymfeknudemetastase. Resultaterne af microarray-analysen for EPB41L3 i testkohorten (126 prøver) blev valideret ved hjælp af qMSP. a)I univariate analyse var RMVs for EPB41L3 i PGC-væv betydeligt højere end i RGC (p = 0,01). (B) På samme måde var RMVs i prøver med lymfeknudemetastase signifikant højere end hos dem uden lymfeknudemetastase (p = 0,03). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Gen | Fremad 5' - 3' | Omvendt 5' - 3' | Sonde |
| B-ACTIN | TAG GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT | AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC | \56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT Tag \3IABkFQ\ |
| EPB41L3 | GGG ATA GTG GGG TTG ACG C | ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA | AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A |
Tabel 1: Primer- og sondesekvenser.
| Kliniktiske faktorer | Variabler | |
| Alder | 74 (52 - 89) * | |
| Køn | Mand / Kvinde | 38 (79.2%) / 10 (20.8%) |
| Type | PGC / RGC | 35 (72.9%) / 13 (27.1%) |
| Lymfeknudemetastase | (+) / (-) | 23 (47.9%) / 25 (52.1%) |
| PGC: Primær mavekræft, RGC: Rest gastrisk kræft | ||
| * Median (minimum-maksimum) | ||
Tabel 2: Egenskaberne hos 48 patienter med mavekræft i træningskohorten.
| P-værdi | Odds ratio | 95 % konfidensinterval | |
| Type (PGC) | 0.01 | 9.09 | 1.67 – 50.00 |
| Lymfeknudemetastase (+) | 0.03 | 6.82 | 1.16 – 40.08 |
| PGC: Primær mavekræft | |||
Tabel 3: Prædiktive faktorer for den høje methyleringsgruppe (Klynge B).
| Kliniktiske faktorer | Variabler | |
| Alder | 71 (33 - 86) * | |
| Køn | Mand / Kvinde | 96 (76.2%) / 30 (23.8%) |
| Type | PGC / RGC | 87 (69.0%) / 39 (31.0%) |
| Lymfeknudemetastase | (+) / (-) | 50 (39.7%) / 76 (60.3%) |
| PGC: Primær mavekræft, RGC: Rest gastrisk kræft | ||
| * Median (minimum-maksimum) | ||
Tabel 4: Egenskaberne hos 126 patienter med mavekræft i testkohorten.
Discussion
Der er tre kritiske trin i at opnå nøjagtige resultater fra DNA methylering genom-dækkende analyse. Den første er makrodissektion af et tumorområde ved helst to kvalificerede patologer baseret på repræsentative H & E farvede sektioner. Unøjagtig makrodissektion kan forårsage forurening med tilstødende ikke-kræft væv, som skaber upålidelige resultater; derfor er omhyggelig makrodissektion påkrævet. Den anden er vurdering af DNA-kvaliteten (kvalitetstjek: QC). Prøver, der ikke har QC (∆Cq > 5.0), kan give data af dårlig kvalitet. Derfor skal prøver med ∆Cq > 5.0 fjernes, og andre skal anvendes. Det tredje trin er beregning af β-værdi, som bestemmes af et dataanalyseværktøj til array platform software som methyleret signal / den samlede (methyleret + unmethylated) signal17. Den β-værdi spænder fra 0-1 (eller 0%-100%), hvilket er let at fortolke biologisk17. Det største problem med denne værdi er dens dårlige statistiske egenskaber, da dens høje heteroscedasticity indebærer, at variansen på tværs af prøver på methyleringsområdet ekstremer (β = 0 eller β = 1) er stærkt reduceret17. På grund af dårlig prøvekvalitet viser β-værdier muligvis ikke reproducerbare bifasiske toppe22, og prøver uden sådanne toppe bør udelukkes fra yderligere undersøgelser. Desuden bør målgenet vælges ud fra kriterierne for at have større betaværdier, være relateret til CpG-øer i promotorregionen og være egnet til primer- og sondedesign til qMSP.
Evaluering af DNA-methylering på en CpG locus i det menneskelige genom udføres ved hjælp af microarray-baseret teknologi med et fast antal sonder til undersøgelse af specifikke genomiske loci. Det er den mest udbredte metode i epigenome-dækkende forening undersøgelser (EWAS) på grund af sin lave omkostninger, lille mængde DNA, der kræves, og markant kortere prøve behandlingstid, som giver mulighed for høj-throughput behandling af mange kliniske prøver23. Men en array platform for kompleks evaluering af DNA methylering på en individuel CpG locus er begrænset af antallet og specificiteten af sonder for epigenetisk ændret loci, som forhindrer udforskning af nogle genomiske regioner. WGBS betragtes generelt som guldstandardmetoden på grund af dens bredere spektrum af genomdækning10,11. Denne metode har imidlertid en betydelig omkostning og en forholdsvis lang behandlingstid til analyse af et stort antal prøver10,11. Det er således ikke altid muligt. Til sammenligning er arrayplatformen for kompleks evaluering af DNA-methylering på et individuelt CpG-locus i det menneskelige genom rimelig til brug med hensyn til omkostninger og genomisk dækning. For nylig har de nyeste opgraderede perle chips fået klar til brug24. Disse analyser kan hjælpe os med at analysere næsten fordoblet målt CpG steder, som kan opnå ideelle genom-dækkende forening undersøgelse (GWAS) for store stikprøvepopulationer.
Sammenfattende kan DNA-methyleringsgenomeanalyser med arrayplatformen for kompleks evaluering af DNA-methylering på en individuel CpG-locus i det menneskelige genom give vigtige oplysninger om epigenetiske biomarkører i mave-tarm-kræft. Sammenlignet med WGBS er denne metode omkostningseffektiv og reducerer prøvebehandlingstiden. Derfor, denne metode til påvisning af DNA methylering på en CpG locus vil sandsynligvis være meget udbredt i epigenetiske biomarkør forskning.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er især taknemmelige for alle medlemmer af Department of Surgery, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center på Johns Hopkins University School of Medicine for nyttige diskussioner og teknisk support. Vi takker også Kristen Rodgers for generøs teknisk vejledning om procedurerne for bisulfitbehandling og qMSP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | 14148 | Step 5.2. |
| 10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Quality Biological | 351-032-721 EA | Step 2.1. |
| 100 % Ethanol | Sigma-Aldrich | 24194 | Step 1.7. |
| ABI StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied BioSystems | 4376600 | Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument |
| CT conversion reagent | Zymo Research | D5001-1 | Step 3.2.3. |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) | Invitrogen | 10297-018 | Step 5.2. |
| DEPC-treated water | Quality Biological | 351-068-131 | Step 2.1. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-034-CL | Step 2.1. |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5002 | Step 3.2. |
| Fluorescein | Bio-Rad | #1708780 | Step 5.2. |
| GenomeStudio | omicX | OMICS_00854 | Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a β-value, with a range from 0 to 1 |
| Human genomic DNA | New England Bio Labs | N4002S | Step 5.3. |
| Infinium HD FFPE QC Kit | Illumina | WG-321-1001 | Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification |
| Infinium HumanMethylation450 assay | Illumina | WG-314 | Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of >450,000 CpG sites in the genome |
| LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | Step 4.1. |
| M-Binding Buffer | Zymo Research | D5002-3 | Step 3.2.6. |
| M-Desulphonation Buffer | Zymo Research | D5002-5 | Step 3.2.9. |
| M-Dilution Buffer | Zymo Research | D5002-2 | Step 3.2.1. |
| Minfi package | Bioconductor | N/A | Step 4.4. |
| M-Wash Buffer | Zymo Research | D5002-4 | Step 3.2.10. |
| Platinum Taq polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966-034 | Step 5.2. |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | Step 2.8. |
| Single-use polypropylene (Eppendorf) tube | Eppendorf | 24533495 | Step 2.5.2. |
| Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8 | Quality Biological | 351-092-101 | Step 2.1. |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | Step 1.3. |
| Zymo Spin 1 Column | Zymo Research | C1003 | Step 3.2.6. |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Step 5.2. |
References
- Qiu, J.
- Okugawa, Y., Grady, W. M., Goel, A. Epigenetic alterations in colorectal cancer: emerging biomarkers. Gastroenterology. 149 (5), 1204-1225 (2015).
- Ahuja, N., Li, Q., Mohan, A. L., Baylin, S. B., Issa, J. P. Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer. Cancer Research. 58 (23), 5489-5494 (1998).
- Hsieh, C. J., et al. Hypermethylation of the p16INK4a promoter in colectomy specimens of patients with long-standing and extensive ulcerative colitis. Cancer Research. 58, 3942-3945 (1998).
- Ushijima, T., Okochi-Takada, E. Aberrant methylations in cancer cells: where do they come from. Cancer Science. 96 (4), 206-211 (2005).
- Coppedè, F. Epigenetic biomarkers of colorectal cancer: Focus on DNA methylation. Cancer Letters. 342 (2), 238-247 (2014).
- Vasilatou, D., Papageorgiou, S. G., Dimitriadis, G., Pappa, V. Epigenetic alterations and microRNAs: new players in the pathogenesis of myelodysplastic syndromes. Epigenetics. 8 (6), 561-570 (2013).
- Ma, X., Wang, Y. W., Zhang, M. Q., Gazdar, A. F. DNA methylation data analysis and its application to cancer research. Epigenomics. 5 (3), 301-316 (2013).
- Morris, T. J., Beck, S. Analysis pipelines and packages for Infinium HumanMethylation450 BeadChip (450k) data. Methods. 72, San Deigo, California. 3-8 (2015).
- Rauluseviciute, I., Drabløs, F., Rye, M. B. DNA methylation data by sequencing: experimental approaches and recommendations for tools and pipelines for data analysis. Clinical Epigenetics. 11 (1), 193 (2019).
- Cazaly, E. Making sense of the epigenome using data integration approaches. Frontiers in Pharmacology. 10, 126 (2019).
- Leal, A., Sidransky, D., Brait, M. Tissue and cell-free DNA-based epigenomic approaches for cancer detection. Clinical Chemistry. 66 (1), 105-116 (2020).
- Song, W., Ren, J., Wang, W. J., Wang, C. T., Fu, T. Genome-wide methylation and expression profiling identify a novel epigenetic signature in gastrointestinal pan-adenocarcinomas. Epigenomics. 12 (11), (2020).
- Wong, E. M., et al. Tools for translational epigenetic studies involving formalin-fixed paraffin-embedded human tissue: applying the Infinium HumanMethyation450 Beadchip assay to large population-based studies. BMC Research Notes. 8, 543 (2015).
- Illumina. , Available from: https://jp.support.illumina.com/downloads/infinium_humanmethylation450_product_files.html (2020).
- Fackler, M. J., et al. Genome-wide methylation analysis identifies genes specific to breast cancer hormone receptor status and risk of recurrence. Cancer Research. 71 (19), 6195-6207 (2011).
- Dedeurwaerder, S., et al. A comprehensive overview of Infinium HumanMethylation450 data processing. Briefings in Bioinformatics. 15 (6), 929-941 (2014).
- Hulbert, A., et al. Early detection of lung cancer using DNA promoter hypermethylation in plasma and sputum. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (8), 1998-2005 (2017).
- Shimada, H., Fukagawa, T., Haga, Y., Oba, K. Does remnant gastric cancer really differ from primary gastric cancer? A systematic review of the literature by the Task Force of Japanese Gastric Cancer Association. Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 19 (2), 339-349 (2016).
- Eijsink, J. J., et al. Detection of cervical neoplasia by DNA methylation analysis in cervico-vaginal lavages, a feasibility study. Gynecologic Oncology. 120 (2), 280-283 (2011).
- Sugimoto, K., et al. DNA methylation genome-wide analysis in remnant and primary gastric cancers. Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 22 (6), 1109-1120 (2019).
- Wang, Z., Wu, X., Wang, Y. A framework for analyzing DNA methylation data from Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip. BMC Bioinformatics. 19, Suppl 5 115 (2018).
- Teh, A. L., et al. Comparison of methyl-capture sequencing vs. Infinium 450K methylation array for methylome analysis in clinical samples. Epigenetics. 11 (1), 36-48 (2016).
- Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
