Summary
Hierin beschrijven we een procedure voor genoombrede analyse van DNA-methylatie bij maag-darmkanker. De procedure is van belang voor studies die onderzoeken relaties tussen methylatiepatronen van genen en factoren die bijdragen aan carcinogenese bij maag-darmkanker.
Abstract
DNA-methylatie is een belangrijke epigenetische verandering die biologisch zinvol is en een frequente focus van kankeronderzoek. Genoombrede DNA-methylatie is een nuttige maatregel om een nauwkeurige analyse te geven van de methylatiestatus van gastro-intestinale (GI) maligniteiten. Gezien de vele potentiële translationele toepassingen van DNA-methylatieanalyse, moeten praktiserende clinici en anderen die nieuw zijn bij DNA-methylatiestudies stap voor stap kunnen begrijpen hoe deze genoombrede analyses worden uitgevoerd. Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde beschrijving te geven van hoe deze methode wordt gebruikt voor de biomarker-identificatie in GI-maligniteiten. Belangrijk is dat we drie kritieke stappen beschrijven die nodig zijn om nauwkeurige resultaten te verkrijgen tijdens genoombrede analyse. Duidelijk en beknopt geschreven, deze drie methoden ontbreken vaak en niet merkbaar aan die nieuw voor epigenetische studies. We gebruikten 48 monsters van een GI maligniteit (maagkanker) om praktisch te benadrukken hoe genoom-brede DNA-methylatie analyse kan worden uitgevoerd voor GI maligniteiten.
Introduction
Epigenetica verwijst naar erfelijke veranderingen in de genfunctie zonder wijziging van de sequentie van DNA1. Dergelijke veranderingen kunnen te wijten zijn aan DNA-methylatie, waarbij methylgroepen op een DNA-basis de genexpressie kunnen veranderen door veranderingen in chromatineverpakking. Kankerontwikkeling en progressie kunnen optreden als dit effect resulteert in een veranderde expressie van tumorsuppressorgenen2. Veroudering en chronische ontsteking zijn beide oorzaken van kanker en de belangrijkste redenen voor veranderingen in DNA-methylatie bij mensen3,4,5. Bijgevolg maakt dit het gebruik van DNA-methylatie als biomarker in de diagnose van kanker mogelijk, en als doelwit voor behandeling en preventie. Voor vroegtijdige opsporing en kankerprognose worden DNA-methylatie gemeten in tumor-, bloed-, urine- en ontlastingsmonsters6, terwijl demethylerende middelen nu worden gebruikt voor de behandeling van leukemie zoals myelodysplastisch syndroom7.
Genoombrede DNA-methylatieanalyse met behulp van een arrayplatform voor complexe evaluatie van DNA-methylatie bij een individuele CpG-locus in het menselijk genoom kan worden gebruikt om de methylatiestatus van meer dan 450.000 CpG-sites in genomisch DNA8,9,die verkenning van kankerepiden ( zie Tabel van Materialen) mogelijk maakt te onderzoeken. Hele genoombiulfie sequencing (WGBS) technologieën hebben onze benaderingen op het gebied van epigenetica10,11veranderd. Er zijn echter enkele nadelen aan de technologieën in termen van een aanzienlijke kosten - en verwerkingstijd voor de epigenetische analyse van een groot aantal monsters10,11. Daarom is het arrayplatform haalbaarder voor complexe evaluatie van DNA-methylatie in het menselijk genoom. De beschikbaarheid van benaderingen voor genoombrede methylatieanalyses is de afgelopen jaren verbeterd en stelt ons in staat om onze kennis uit te breiden over hoe DNA-methylatie bijdraagt aan de ontwikkeling van kanker en progressie12. Recente vooruitgang in microarray-platform benaderingen bieden ons de reden voor genoom-brede methylatie analyse om een nieuwe epigenetische handtekening in gastro-intestinale kankers te identificeren13. Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde beschrijving van hoe deze methode wordt gebruikt voor biomarker identificatie in GI maligniteiten.
Protocol
Alle gevolgde procedures waren in overeenstemming met de ethische normen van de ethische commissie van de instellingen voor menselijk onderzoek. De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Juntendo University Shizuoka Hospital, en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd kwijtgescholden vanwege het retrospectieve ontwerp.
1. Het wassen van de glijbanen
- Bereid 10 μm van niet-gekleurde formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) secties voor.
- Plaats dia's in een glazen schuifhouder: gebruik ongeveer 3-5 grootste dwarsdoorsnededia's, tenzij het weefsel minimaal is en er meer glijbanen nodig zijn.
- Vul de schuifhouder met xyleen en zorg ervoor dat al het weefsel op de glijbaan onder water staat. Laat 15 minuten zitten.
- Giet na 15 minuten de xyleen uit met de glijbanen met een pipettepunt, zodat de glijbanen er niet uitvallen.
- Giet in meer xyleen op hetzelfde niveau als voorheen. Laat nog 15 minuten zitten.
- Na 15 minuten, giet de xyleen weer.
- Vul de schuifhouder met 100% ethanol (EtOH) en zorg ervoor dat al het weefsel op de glijbaan volledig onder water staat. Laat 3 minuten zitten.
- Giet de EtOH af terwijl u de glijbanen zorgvuldig vasthoudt. Bijvullen op hetzelfde niveau met meer EtOH. Laat 2 minuten zitten.
- Giet de EtOH opnieuw af en verwijder de dia. Plaats ze voorzichtig naar boven op een schone papieren handdoek te drogen. Laat 10 minuten zitten.
2. Schrapen van de dia's
- Bereid de digestie/lysebuffer voor met 650 mL diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld water, 100 mL ethyleenediaminetetraacetisch zuur (EDTA), 50 ml Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8 en 200 mL van 10% natrium dodecylsulfaat (SDS) (zie tabel met materialen).
- Vul een polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik van 1,5 mL met 80 μL digestie/lysisbuffer (zie tabel met materialen).
- Doe een schone pipetpunt in de buffer.
- Identificeer kankerweefsels van het tumorgebied dat het meest geschikt is voor macrodissection volgens de juiste H&E-gekleurde sectie.
OPMERKING: Het tumorgebied voor macrodissection moet worden geïdentificeerd door bij voorkeur twee gekwalificeerde pathologen. - Macrodissect kankerweefsel op basis van de gemarkeerde H & E gekleurde sectie.
- Neem een schoon scheermesje en schraap voorzichtig het kankerweefsel van de glijbaan, in een poging om het te houden in een stuk, zodat het gemakkelijker is om mee te werken.
- Neem de pipetpunt uit polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik met buffer en gebruik deze om het afgedankte weefsel over te brengen in de bufferbak (zie Tabel van materialen).
LET OP: De natte tip moet het weefsel aantrekken, wat de overdracht gemakkelijker maakt.
- Herhaal stap 2.5 met de rest van de dia's.
- Na al het weefsel is in eenmalig gebruik polypropyleen buis, gebruik maken van de tip om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig ondergedompeld en is niet vast aan de wand van de buis.
- Voeg 20 μL van een subtilisine-gerelateerde serine protease toe aan de flacon en veeg voorzichtig om te mengen (zie Tabel van Materialen).
- Plaats de flacon minstens 4 uur of 's nachts in een 55 °C-warmteblok. Zorg ervoor dat u iets vortex na 2 uur.
3. Behandeling met bisulfie
- Gebruik 45 μL van de verteerde weefseloplossing als monster.
- Voer de bisulfitebehandeling uit met reagentia in een bisulfite conversiekit volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
- Voeg 5 μL verdunningsbuffer toe aan het DNA-monster en broed gedurende 15 minuten bij 37 °C (zie tabel met materialen).
- Terwijl de monsters uitbroeden, bereidt u het bisulfiteconversiereagereagerensagemiddel voor door 750 μL dH2O en 210 μL verdunningsbuffer toe te voegen aan één buis CT-omzettingsreagensage (zie tabel met materialen). Meng de buizen door vortexing voor 10 min.
- Voeg na de incubatie van 15 minuten 100 μL van het voorbereide CT-conversiereagemiddel toe aan elk monster en meng door inversie.
- Broed de monsters in het donker in het donker bij 50 °C gedurende 12 tot 16 uur.
- Verwijder na de incubatie de monsters en leg 10 minuten op ijs.
- Voeg 400 μL bindende buffer toe en meng elk monster door op en neer te pipetten (zie tabel met materialen). Laad elk monster in een draaikolom en plaats de kolom in een verzamelbuis van 2 mL (zie tabel met materialen).
- Centrifugeren elk monster op volle snelheid (10.000 x g)gedurende 1 min en gooi de doorstroom weg.
- Voeg 200 μL wasbuffer toe aan elke kolom en draai gedurende 1 min op volle snelheid en gooi de doorstroom weg (zie Tabel met materialen).
- Voeg 200 μL desulfonatiebuffer toe aan elke kolom en laat de kolom 15 min op kamertemperatuur staan (zie Tabel met materialen). Na de incubatie draait u de kolommen gedurende 1 min op volle snelheid en gooi de doorstroom weg.
- Voeg 200 μL wasbuffer toe aan elke kolom en draai 1 min op volle snelheid (zie tabel met materialen).
- Herhaal deze stap nog een keer.
- Voeg 46 μL dH2O toe aan elke kolom en plaats elke kolom in een nieuwe steriele 1,5 mL polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik (zie tabel met materialen). Draai elke buis 2 minuten om het DNA te ontwijken.
- Verwijder elke draaikolom uit de polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik en gooi deze weg (zie tabel met materialen). Het DNA is nu klaar voor de analyse.
4. Array platform voor de evaluatie van DNA-methylatie op een CpG locus in het menselijk genoom
- Beoordeel de kwaliteit van DNA (kwaliteitscontrole: QC) met behulp van FFPE QC-test op een real-time PCR-versterkings- en detectie-instrument, met latere gegevensanalyse uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikanten (zie Tabel van materialen).
LET OP: Monsters met ∆Cq-waarden lager dan de aanbevolen 5.0 worden verder verwerkt14. - Analyseer monsters met een arrayplatform voor complexe evaluatie van DNA-methylatie om de methylatiestatus van >450.000 CpG-sites in het genoom te beoordelen (zie Tabel van materialen). Productinformatieblad, gegevensblad en productbestanden voor het arrayplatform zijnbeschikbaar 15.
OPMERKING: De test wordt uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant voor FFPE-materiaal14. - Bereken hoge en lage locusmethylatie in een data-analysetool voor een arrayplatform als β-waarde, met een bereik van respectievelijk 0 tot 1 (zie Tabel met materialen). Gebruik commercieel beschikbare software (zie Tabel van materialen)om een β-waarde te berekenen.
- Importeer gegevens die op het arrayplatform worden gegenereerd voor complexe evaluatie van DNA-methylatieplatform in de R-softwareomgeving (R v.2.15.1) en verwerk ze met behulp van een tool voor het analyseren van methylatiearrays16,17.
OPMERKING: Op de heatmap, die wordt gegenereerd met behulp van een data-analyse tool, kolommen worden besteld door onbewaakte clustering, terwijl de volgorde van rijen is gebaseerd op de afnemende betekenis van de t-statistiek voor differentiële methylatie van boven naar beneden. - Verdeel de heatmap in hoge en lage methylatiegroepen met behulp van de eerste differentiator in de onbewaakte clustering.
OPMERKING: Voor validatie met kwantitatieve methylatie-specifieke PCR (qMSP), kies genen op basis van een grotere β-waarde in relatie tot CpG-eilanden in de promotor regio, en vanwege hun geschiktheid voor primer en sonde ontwerp voor qMSP.
5. Kwantitatieve methylatie-specifieke PCR (qMSP)
- Gebruik het bisulfie-gemodificeerde DNA van stap 3.3 als sjabloon voor op fluorescentie gebaseerde real-time PCR in qMSP om methylatie van het promotorgebied in elke genanalyse te evalueren.
- Voer qMSP uit met behulp van een 96-goed Real-Time PCR-instrument (zie tabel met materialen).
- Controleer op de promotor methylatie status van het doelgen op de bisulfite-gemodificeerde DNA met behulp van 200 nM forward primer, 200 nM reverse primer, en 80 nM sondes. Bereid de mastermix voor met 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris pH 8.8, 10 mM β-mercaptoethanol, 10 nM fluoresceïne, 0,166 mM van elk deoxynucleotide struikelfosfaat en 0,04 U/μl DNA-polymerase (zie tabel met materialen). Het uiteindelijke reactievolume in elke put voor alle tests is 25 μL.
- Het fietsen van qMSP als volgt uitvoeren: 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 55 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 1 min en 72 °C gedurende 1 min.
OPMERKING: Doelgen moet worden gekozen op basis van de criteria van het hebben van grotere bètawaarden, die gerelateerd zijn aan CpG-eilanden in het promotorgebied en geschikt zijn voor primer- en sondeontwerp voor qMSP.
- Gebruik Human genomic behandeld met CpG Methylase (M.SssI) als een positieve methylatie controle (zie Tabel van materialen).
OPMERKING: De uiteindelijke kwantificering van methylatie wordt gedefinieerd als de relatieve methylatiewaarde (RMV) en berekend als 2–ΔΔCt voor elke methylatiedetectiereplicatie in vergelijking met de gemiddelde Ct voor β-Actin (ACTB)18. Primer- en sondesequenties worden weergegeven in tabel 1. Een Ct van 100 wordt gebruikt voor onopgemerkte replicaties, wat een waarde van 2–ΔΔCt dicht bij nul geeft. De volgende formule wordt gebruikt: gemiddelde 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/318.
Representative Results
De kenmerken van 48 patiënten met maagkanker in het opleidingscohort zijn als volgt (Tabel 2): de mediane leeftijd van patiënten was 74 jaar (52-89 jaar), en het cohort omvatte 38 mannetjes (79,2%) en 10 vrouwen (20,8%). Er waren 35 patiënten (72,9%) primaire maagkanker en bij 13 patiënten (27,1%) met restkanker (primaire maagkanker: eerste optreden van een niet-gemetastaseerde maligniteit in de maag; restant maagkanker: kanker in de rest maag die zich meer dan 5 jaar na destalige gastrectomie ontwikkelde, ongeacht de reden voor de oorspronkelijke resectie19). Er waren 23 patiënten (47,9%) met lymfekliermetastase en 25 patiënten (52,1%) Zonder. Ten eerste werden alle 48 monsters (het trainingscohort) geladen voor de identificatie van uitschieters (figuur 1A). Twee monsters gaven pieken die groter waren dan twee standaarddeviaties verplaatst van de anderen, en deze monsters werden verwijderd (Figuur 1B). Daarom werden 46 monsters geclusterd door DNA-promotor hypermethylatie. De resulterende heatmap werd verdeeld in twee groepen op basis van hoge en lage methylatie (figuur 2). Deze heatmap maakt visualisatie van de top 50 sondes binnen 1.500 bp van de transcriptie start site (TSS) in de differentiële methylatie analyse. De hoge en lage methylatiegroepen verschilden in clinicopathologische factoren die verband hielden met een agressief kwaadaardig fenotype. Dat wil zeggen, de vorm van kanker (primaire maagkanker: PGC) (p = 0,01, odds ratio = 9,09 (1,67–50,00)) en aanwezigheid van lymfekliermetastase (positief) (p = 0,03, odds ratio = 6,82 (1,16–40,08)) ontdoken als significante onafhankelijke voorspellende factoren toen de clinicopathologische factoren werden gebruikt als covariaten in multivariate analyse (tabel 3). Ten slotte hebben we het EPB41L3-gen20,21 (primer- en sondesequenties in tabel 1)geïdentificeerd om sterk geassocieerd te worden met het codificeren van het trainingscohort in hoge en lage methylatiegroepen in de microarray-analyse. Met behulp van qMSP werden de resultaten van de microarray-analyse voor EPB41L3 in het testcohort (126 monsters) gevalideerd. De kenmerken van de patiënten in het testcohort zijn weergegeven in tabel 4. MPV's van EPB41L3 in PGC-weefsels waren aanzienlijk hoger dan die bij restkanker (RGC) in univariate analyse (p = 0,01) (figuur 3A). Evenzo waren MPV's in monsters met lymfekliermetastase aanzienlijk hoger dan die zonder lymfekliermetastase (p = 0,03) (figuur 3B). Op deze manier kan DNA-methylatie genoombrede analyse ons helpen om specifieke genen te identificeren om bepaalde klinische status te karakteriseren bij patiënten met GI-maligniteiten.
Figuur 1: Bètawaarden in 48 monsters (trainingscohort). Alle 48 monsters (trainingscohort) werden geladen en uitschieters werden onderzocht (A). Twee monsters hadden pieken die uitschieters waren, en deze werden verwijderd (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: De resulterende heatmap. De overige 46 monsters werden geclusterd door DNA promotor hypermethylatie. De heatmap was verdeeld in hoge en lage methylatiegroepen. Deze heatmap maakt visualisatie van de top 50 sondes binnen 1.500 bp van de transcriptie start site (TSS) in de differentiële methylatie analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Relatieve methylatiewaarden (KMV's) voor EPB41L3 bij primaire maagkanker (PGC) vs. restant maagkanker (RGC), en in gevallen met en zonder lymfekliermetastase. De resultaten van microarray-analyse voor EPB41L3 in het testcohort (126 monsters) werden gevalideerd met behulp van qMSP. (A) In univariate analyse waren de MPV's van EPB41L3 in PGC-weefsels aanzienlijk hoger dan die in RGC (p = 0,01). (B) Evenzo waren MPV's in monsters met lymfekliermetastase aanzienlijk hoger dan bij m'n metastasase zonder lymfeklier (p = 0,03). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Gen | Vooruit 5' - 3' | Reverse 5' - 3' | Sonde |
| B-ACTIN | TAG GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT | AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC | \56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABKFQ\ |
| EPB41L3 | GGG ATA GTG GGG TTG ACG C | ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA | AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A |
Tabel 1: Primer en sonde sequenties.
| Clinicopathologische factoren | Variabelen | |
| Leeftijd | 74 (52 - 89) * | |
| Geslacht | Man / Vrouw | 38 (79.2%) / 10 (20.8%) |
| Type | PGC / RGC | 35 (72.9%) / 13 (27.1%) |
| Lymfekliermetastase | (+) / (-) | 23 (47.9%) / 25 (52.1%) |
| PGC: Primaire maagkanker, RGC: Restant maagkanker | ||
| * Mediaan (minimum-maximum) | ||
Tabel 2: De kenmerken bij 48 patiënten met maagkanker in het trainingscohort.
| P-waarde | Verhouding kansen | 95% Betrouwbaarheidsinterval | |
| Type (PGC) | 0.01 | 9.09 | 1.67 – 50.00 |
| Lymfekliermetastase (+) | 0.03 | 6.82 | 1.16 – 40.08 |
| PGC: Primaire maagkanker | |||
Tabel 3: Voorspellende factoren voor de hoge methylatiegroep (cluster B).
| Clinicopathologische factoren | Variabelen | |
| Leeftijd | 71 (33 - 86) * | |
| Geslacht | Man / Vrouw | 96 (76.2%) / 30 (23.8%) |
| Type | PGC / RGC | 87 (69.0%) / 39 (31.0%) |
| Lymfekliermetastase | (+) / (-) | 50 (39.7%) / 76 (60.3%) |
| PGC: Primaire maagkanker, RGC: Restant maagkanker | ||
| * Mediaan (minimum-maximum) | ||
Tabel 4: De kenmerken bij 126 patiënten met maagkanker in het testcohort.
Discussion
Er zijn drie kritieke stappen in het verkrijgen van nauwkeurige resultaten van DNA-methylatie genoom-brede analyse. De eerste is macrodissection van een tumorgebied door bij voorkeur twee gekwalificeerde pathologen op basis van representatieve H&E gekleurde secties. Onnauwkeurige macrodissection kan besmetting veroorzaken met aangrenzende niet-kankerweefsels, wat onbetrouwbare resultaten oplevert; dus, zorgvuldige macrodissection is vereist. De tweede is de beoordeling van de DNA-kwaliteit (kwaliteitscontrole: QC). Monsters die niet de QC (∆Cq > 5.0) kunnen geven slechte kwaliteit gegevens. Daarom moeten monsters met ∆Cq > 5.0 worden verwijderd en andere worden gebruikt. De derde stap is de berekening van de β-waarde, die wordt bepaald door een data-analyse tool voor de array platform software als de gemethyleerde signaal / het totale (gemethyleerde + onmetide) signaal17. De β-waarde varieert van 0-1 (of 0%-100%), wat eenvoudig biologisch te interpreteren is17. Het belangrijkste probleem met deze waarde is de slechte statistische eigenschappen, omdat de hoge heteroscedasticiteit impliceert dat variantie tussen monsters bij methylatiebereik extremen (β = 0 of β = 1) sterk is verminderd17. Bovendien mogen β-waarden wegens slechte monsterkwaliteit geen reproduceerbare bifasische pieken22vertonen , en moeten monsters zonder dergelijke pieken van verder onderzoek worden uitgesloten. Bovendien moet doelgen worden gekozen op basis van de criteria van het hebben van grotere bètawaarden, die gerelateerd zijn aan CpG-eilanden in het promotorgebied en geschikt zijn voor primer- en sondeontwerp voor qMSP.
Evaluatie van DNA-methylatie op een CpG locus in het menselijk genoom wordt uitgevoerd met behulp van microarray-gebaseerde technologie met een vast aantal sondes om specifieke genomische loci te onderzoeken. Het is de meest gebruikte methode in epigenome-brede associatie studies (EWAS) vanwege de lage kosten, kleine hoeveelheid DNA nodig, en aanzienlijk kortere monster verwerkingstijd, die een hoge doorvoer verwerking van veel klinische monsters23mogelijk maakt. Echter, een array platform voor complexe evaluatie van DNA-methylatie op een individuele CpG locus wordt beperkt door het aantal en de specificiteit van sondes voor epigenetisch veranderde loci, die verkenning van sommige genomische regio's voorkomt. WGBS wordt over het algemeen gezien als de gouden standaardmethode vanwege het bredere spectrum van genomische dekking10,11. Deze methode heeft echter aanzienlijke kosten en een relatief lange verwerkingstijd voor de analyse van een groot aantal monsters10,11. Het is dus niet altijd haalbaar. Ter vergelijking, het array platform voor complexe evaluatie van DNA-methylatie op een individuele CpG locus in het menselijk genoom is redelijk voor gebruik in termen van kosten en genomische dekking. Onlangs hebben de nieuwste verbeterde kraal chips gekregen klaar om te gebruiken24. Deze testen kunnen ons helpen bij het analyseren van bijna dubbel gemeten CpG-sites, die een ideale genoombrede associatiestudie (GWAS) kunnen bereiken voor grote steekproefpopulaties.
Samengevat kan DNA-methylatie genoombrede analyse met het arrayplatform voor complexe evaluatie van DNA-methylatie op een individuele CpG-locus in het menselijk genoom belangrijke informatie verschaffen over epigenetische biomarkers bij maag-darmkanker. In vergelijking met WGBS is deze methode kosteneffectief en vermindert de verwerkingstijd van de steekproef. Daarom is deze methode voor de detectie van DNA-methylatie op een CpG locus is waarschijnlijk op grote schaal worden gebruikt in epigenetische biomarker onderzoek.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn vooral dankbaar voor alle leden van het departement chirurgie, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center aan de Johns Hopkins University School of Medicine voor nuttige discussies en technische ondersteuning. We danken Kristen Rodgers ook voor de genereuze technische begeleiding bij de procedures voor bisulfite behandeling en qMSP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | 14148 | Step 5.2. |
| 10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Quality Biological | 351-032-721 EA | Step 2.1. |
| 100 % Ethanol | Sigma-Aldrich | 24194 | Step 1.7. |
| ABI StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied BioSystems | 4376600 | Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument |
| CT conversion reagent | Zymo Research | D5001-1 | Step 3.2.3. |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) | Invitrogen | 10297-018 | Step 5.2. |
| DEPC-treated water | Quality Biological | 351-068-131 | Step 2.1. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-034-CL | Step 2.1. |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5002 | Step 3.2. |
| Fluorescein | Bio-Rad | #1708780 | Step 5.2. |
| GenomeStudio | omicX | OMICS_00854 | Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a β-value, with a range from 0 to 1 |
| Human genomic DNA | New England Bio Labs | N4002S | Step 5.3. |
| Infinium HD FFPE QC Kit | Illumina | WG-321-1001 | Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification |
| Infinium HumanMethylation450 assay | Illumina | WG-314 | Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of >450,000 CpG sites in the genome |
| LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | Step 4.1. |
| M-Binding Buffer | Zymo Research | D5002-3 | Step 3.2.6. |
| M-Desulphonation Buffer | Zymo Research | D5002-5 | Step 3.2.9. |
| M-Dilution Buffer | Zymo Research | D5002-2 | Step 3.2.1. |
| Minfi package | Bioconductor | N/A | Step 4.4. |
| M-Wash Buffer | Zymo Research | D5002-4 | Step 3.2.10. |
| Platinum Taq polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966-034 | Step 5.2. |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | Step 2.8. |
| Single-use polypropylene (Eppendorf) tube | Eppendorf | 24533495 | Step 2.5.2. |
| Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8 | Quality Biological | 351-092-101 | Step 2.1. |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | Step 1.3. |
| Zymo Spin 1 Column | Zymo Research | C1003 | Step 3.2.6. |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Step 5.2. |
References
- Qiu, J.
- Okugawa, Y., Grady, W. M., Goel, A. Epigenetic alterations in colorectal cancer: emerging biomarkers. Gastroenterology. 149 (5), 1204-1225 (2015).
- Ahuja, N., Li, Q., Mohan, A. L., Baylin, S. B., Issa, J. P. Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer. Cancer Research. 58 (23), 5489-5494 (1998).
- Hsieh, C. J., et al. Hypermethylation of the p16INK4a promoter in colectomy specimens of patients with long-standing and extensive ulcerative colitis. Cancer Research. 58, 3942-3945 (1998).
- Ushijima, T., Okochi-Takada, E. Aberrant methylations in cancer cells: where do they come from. Cancer Science. 96 (4), 206-211 (2005).
- Coppedè, F. Epigenetic biomarkers of colorectal cancer: Focus on DNA methylation. Cancer Letters. 342 (2), 238-247 (2014).
- Vasilatou, D., Papageorgiou, S. G., Dimitriadis, G., Pappa, V. Epigenetic alterations and microRNAs: new players in the pathogenesis of myelodysplastic syndromes. Epigenetics. 8 (6), 561-570 (2013).
- Ma, X., Wang, Y. W., Zhang, M. Q., Gazdar, A. F. DNA methylation data analysis and its application to cancer research. Epigenomics. 5 (3), 301-316 (2013).
- Morris, T. J., Beck, S. Analysis pipelines and packages for Infinium HumanMethylation450 BeadChip (450k) data. Methods. 72, San Deigo, California. 3-8 (2015).
- Rauluseviciute, I., Drabløs, F., Rye, M. B. DNA methylation data by sequencing: experimental approaches and recommendations for tools and pipelines for data analysis. Clinical Epigenetics. 11 (1), 193 (2019).
- Cazaly, E. Making sense of the epigenome using data integration approaches. Frontiers in Pharmacology. 10, 126 (2019).
- Leal, A., Sidransky, D., Brait, M. Tissue and cell-free DNA-based epigenomic approaches for cancer detection. Clinical Chemistry. 66 (1), 105-116 (2020).
- Song, W., Ren, J., Wang, W. J., Wang, C. T., Fu, T. Genome-wide methylation and expression profiling identify a novel epigenetic signature in gastrointestinal pan-adenocarcinomas. Epigenomics. 12 (11), (2020).
- Wong, E. M., et al. Tools for translational epigenetic studies involving formalin-fixed paraffin-embedded human tissue: applying the Infinium HumanMethyation450 Beadchip assay to large population-based studies. BMC Research Notes. 8, 543 (2015).
- Illumina. , Available from: https://jp.support.illumina.com/downloads/infinium_humanmethylation450_product_files.html (2020).
- Fackler, M. J., et al. Genome-wide methylation analysis identifies genes specific to breast cancer hormone receptor status and risk of recurrence. Cancer Research. 71 (19), 6195-6207 (2011).
- Dedeurwaerder, S., et al. A comprehensive overview of Infinium HumanMethylation450 data processing. Briefings in Bioinformatics. 15 (6), 929-941 (2014).
- Hulbert, A., et al. Early detection of lung cancer using DNA promoter hypermethylation in plasma and sputum. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (8), 1998-2005 (2017).
- Shimada, H., Fukagawa, T., Haga, Y., Oba, K. Does remnant gastric cancer really differ from primary gastric cancer? A systematic review of the literature by the Task Force of Japanese Gastric Cancer Association. Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 19 (2), 339-349 (2016).
- Eijsink, J. J., et al. Detection of cervical neoplasia by DNA methylation analysis in cervico-vaginal lavages, a feasibility study. Gynecologic Oncology. 120 (2), 280-283 (2011).
- Sugimoto, K., et al. DNA methylation genome-wide analysis in remnant and primary gastric cancers. Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 22 (6), 1109-1120 (2019).
- Wang, Z., Wu, X., Wang, Y. A framework for analyzing DNA methylation data from Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip. BMC Bioinformatics. 19, Suppl 5 115 (2018).
- Teh, A. L., et al. Comparison of methyl-capture sequencing vs. Infinium 450K methylation array for methylome analysis in clinical samples. Epigenetics. 11 (1), 36-48 (2016).
- Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
