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Behavior

만성 스트레스는 마우스의 Y-미로 장벽 작업에서 노력과 관련된 선택 행동을 변화시합니다.

Published: August 13, 2020 doi: 10.3791/61548
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Psychology, Behavioral and Systems Neuroscience Area, The State University of New Jersey, 2Graduate Program in Neuroscience, Rutgers, The State University of New Jersey

Summary

Y-미로 장벽 작업은 보상을 위한 노력을 소비하는 동기를 검사하는 행동 테스트입니다. 여기에서는 만성 코르티코스테론과 사회적 패배 스트레스를 비롯한 여러 가지 잘 검증된 만성 스트레스와 여성에게 효과적인 새로운 만성 비차별적 사회적 패배 스트레스(CNSDS)를 테스트하는 데 대해 논의합니다.

Abstract

주요 우울증 장애를 포함 하 여 기분 장애, 만성 스트레스에 의해 침전 될 수 있습니다. Y-미로 장벽 작업은 노력을 소비하고 보상을 받을 동기를 측정하는 노력 관련 선택 테스트입니다. 마우스에서 만성 스트레스 노출은 스트레스가 없는 마우스에 비해 더 적은 가치 보상이 자유롭게 제공될 때 더 높은 가치 보상을 위해 일하도록 동기 부여에 크게 영향을 미칩니다. 여기서 우리는 Y-미로 장벽 작업에 대한 노력의 변화를 낳는 만성 코르티코스테론 관리 패러다임을 설명합니다. Y-미로 작업에서 한 팔에는 4개의 음식 펠릿이 포함되어 있으며, 다른 팔에는 2개의 펠릿만 포함되어 있습니다. 마우스가 높은 보상 팔을 선택하는 법을 배운 후, 점진적으로 높이가 증가하는 장벽은 여러 테스트 세션을 통해 높은 보상 팔에 도입됩니다. 불행히도, 대부분의 만성 스트레스 패러다임 (코르티코스테론 및 사회적 패배를 포함) 남성 마우스에서 개발 하 고 여성 마우스에서 덜 효과적이다. 따라서, 우리는 또한 만성 비 차별적 사회적 패배 스트레스 (CNSDS), 우리가 개발하고 있는 스트레스 패러다임은 남성과 여성 마우스 둘 다에 효과적이다 토론합니다. 남성과 여성 마우스에서 여러 개의 별개의 만성 스트레스와 함께 반복 결과 번역 관련 행동 작업의 증가 사용과 결합 하는 어떻게 만성 스트레스 기분 장애를 침전시킬 수 있는 이해를 발전 하는 데 도움이 될 것입니다.

Introduction

우울증과 불안과 같은 기분 장애는 오늘날의 사회에서 매우 널리 퍼져 있습니다. 수십 년의 작업은 지속적으로 이러한 복잡한 장애를 연구하기 위해 개선 된 치료 및 관련 설치류 모델을검색했다 1. 만성 스트레스는 우울증 과 같은 기분 장애에 대 한 기여 요인2. 따라서 만성 사회적 패배 스트레스(SDS) 및 만성 코르티코스테론 투여(CORT)와 같은 만성 스트레스 패러다임은 남성 마우스에서 개발되었으며, 현재 만성 스트레스 노출의 신경생물학적 및 행동 효과를 평가하는 데 널리 사용되고 있다. 만성 스트레스 효과를 평가하기 위한 가장 널리 사용되는 행동 테스트에는 고가의 미로, 오픈 필드 및 참신억제 수유와 같은 회피 행동과 관련된 작업 또는 강제 수영 테스트와 같은 항우울제 효능이 포함됩니다. 그러나 설치류의 이러한 행동은 틀림없이 얼굴이 부족하며, 더 중요한 것은 우울증과 같은 인간 질환에 대한 예측 타당성 및 번역 관련성이 부족하다는 것입니다.

인기 있는 만성 스트레스 패러다임, 만성 예측할 수 없는 가벼운 스트레스(CUMS)는 자당 선호도3과같은 행동을 광범위하게 사용하여 검증되었습니다. CUMS는 물에 비해 1% 자당 용액에 대한 선호도를 감소시키고 역사적으로 안도니아 관련 동작4,,5로해석된다. 그러나, 자당 선호도에 있는 이 감소는 중요한 우울장애를 가진 인간에서 관찰되지 않습니다6,,7. 또한, 자당 특혜는 노력 보상 동기의 연구를 허용하지 않습니다.

최근, 일부 연구는 동기 부여와8보상8,9와관련된 다른 행동에 초점을 이동했다. 상대적으로 유사한 행동 평가는 인간과 설치류 모두에서 수행 될 수 있기 때문에 이러한 작업은 유망한 번역 값을 가지고있다. 여기에서는 보상을 위한 노력을 기울이기 위한 동기부여를 측정하는 Y-미로 장벽 행동 작업에서 CORT 및 SDS 패러다임과 그 효과를 설명합니다. 그런 다음 우리가 개발한 새로운 만성 스트레스 패러다임, 만성 비 차별적 사회적 패배 스트레스 (CNSDS)에 대해 논의합니다.

만성 코르티코스테론 투여 (CORT)는 실제 스트레스 노출없이 만성 스트레스를 모방하도록 설계된 패러다임입니다. 시상 하부 -뇌하수체-부신축의 활성화는 인간에서 부신 스테로이드 코티솔의 내인성 방출을 초래하여10,,,11,12 및 corticosterone 마우스에서13,,14. 적어도 4주 동안 성인 남성 마우스의 식수를 통해 코르티코세론을 전달하면 개방장, 고액,플러스 미로, 참신억제수10,,10,11,,12,13,,14,15,16등의회피 작업에서 부적응성 행동 반응이 발생한다. 흥미롭게도, CORT는,또한 기악 작업16,17,18,,19에서보상 처리에 영향을 미친다., 여기에 설명된 CORT 패러다임은 100 ng/mL CORT 이하의 일관된 혈청 농도를 생성하며, 이는 강제수영(15)과같은 급성 스트레스에 의해 생성된 것보다 5배 이상 적습니다. 따라서 만성 CORT 투여는 고고체혈증을 유발할 가능성이 낮습니다. 만성 CORT는 남성마우스(20)에서만효과적이지만, 최근에는 Y-미로 장벽작업(21)에서힘있는 반응에 견고한 변화를 일으킨다는 것을 입증했습니다. 우리의 지식에, 이것은 남성 마우스에 있는 노력 관련 선택 행동에 만성 스트레스의 효력을 검토하는 첫번째 연구 결과의 한개이었습니다21. 한 이전 연구는 먼저쥐22의노력 기반 의사 결정에 급성 구속 스트레스의 영향을 보여 주었다. 노력 과 관련된 선택 행동에서, 동물은 고부가가치 보상을 위해 노력을 기울이거나 더 자유롭게 사용할 수있는 낮은 가치의 보상을 수락하기로 결정합니다. 인간에서 보상 작업(EEfRT)에 대한 노력 지출은마우스(23)의노력 관련 선택 작업과 유사하게 개발된 컴퓨터 게임이다. 우울증은 EEfRT에 있는 적응형 반응 귀착됩니다 (고부가가치 보상에 대한 어려운 작업을 선택하는 가능성 감소). 따라서 설치류의 노력 관련 선택 작업은 번역 관련성 때문에 특히 흥미롭습니다.

만성 사회적 패배 스트레스 (SDS)는 남성 마우스에서 보다 널리 사용되는 전임상 스트레스 모델 중 하나입니다. 그것은 10 일 프로토콜 어디 큰, 공격적인 은퇴 개종 CD-1 남성 공격 실험 마우스, 일반적으로 C57BL/6J, 5 분 매일 세션24. 이것은 실험마우스의 하위 집합에 있는 강력한 적응성 행동 표현형을 생성합니다. 사회적 상호 작용 시험은 패배 스트레스에 탄력또는 영향을 받기 쉬운 인구로 마우스를 계층화하는 데 사용되며, 여러 연구는 스트레스 의존과 감수성의 근본적인 분자 및 신경 회로 메커니즘을 조사하기 위해 SDS의 이 독특한 특성을 사용했습니다. 여기에서는 CORT 패러다임의 세부 사항과 Y-미로 장벽 행동 작업에 대한 구현에 대해 설명합니다. 우리는 또한 Y-미로 장벽 작업에 SDS 효과에 대해 논의합니다. Y-미로 장벽 작업은 주로 쥐에 사용되는 T-미로 장벽 작업을 기반으로하며, 주로 쥐가 미로,8,9,925의두 팔에 존재하는 높고 낮은 보상에 대한 노력을 소비하는 동기를 측정합니다. 이 작업은 또한 마우스에서 카페인 또는 도파민 길항제를 투여한 마우스에서 열심히 반응하는 것을 연구하기 위해 구현되었다26. 설치류는 더 높은 보상 값을 위해 미로의 한 팔에 점진적으로 높이증가의 장벽을 등반하여 더 큰 노력을 소비 할 수 있습니다, 일반적으로 4 보상 펠릿, 또는 미로의 다른 팔에 훨씬 적은 노력을 소비만 2 보상 펠릿9. 10일 사회적 패배 패러다임은 약 30일 동안 지속되는 취약한 쥐에서 강력한 적응형 표현형을 생성하므로, 30일 기간내에모든 실험을 완료하기 위해 Y-미로 장벽 작업을 보다 신속하게 훈련하고 테스트하도록 수정하였다. 따라서, 여기에서우리는 또한 만성 스트레스 노출 마우스에 있는 보상을 위한 노력을 소모하기 위하여 동기를 측정하기 위하여 응축된 훈련 세션 및 단 하나 장벽 시험 세션을 포함하는 Y-미로 장벽 행동 작업 프로토콜을 상세히 설명합니다.

불행히도, 만성 코르티코스테론과 만성 사회적 패배 스트레스는 남성 마우스에서 개발되었으며 여성 마우스에서 덜 효과적입니다. 이것은 여자가 불경기1와같은 기분 장애로 진단될 남자 보다는 확률이 높기 때문에 높게 문제가 됩니다. SDS에 영리한 적응은 여성 마우스에서 사용을 허용하지만 어려운 수술이나 지루한 소변 수집26,,27을필요로한다. 우리는 최근에 만성 비 차별적 사회적 패배 스트레스 (CNSDS)에게 불린 SDS 패러다임에 대한 간단한 수정을 기술했습니다. CNSDS는 실험적인 남성 과 여성마우스(28)의민감하고 탄력적인 계층화를 허용한다. CNSDS에 노출된 암컷과 남성 용해성 마우스 모두 높은 플러스 미로와 열린 필드에 있는 중앙에 있는 열린 무기의 증가한 회피를 보여주고 참신억제된 먹이에서 먹기 위하여 증가한 대기 시간을 표시합니다. CNSDS는 또한 SDS에 대한 다른 수정보다 더 효율적이며, 남녀모두 패배 세션에서 결합되기 때문에. 이것은 프로토콜을 완료하는 데 필요한 시간과 노력의 관련 된 증가 없이 실험 마우스의 증가 수율 결과. 따라서, 우리는 최근 개발 된 만성 스트레스 패러다임의 심층적 인 프리젠 테이션으로이 원고를 결론을 내립니다.

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Protocol

이러한 실험은 NIH 실험실 동물 관리 지침에 따라 수행되었으며 러트거스 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 만성 코르티코스테론 (CORT)

  1. 임의로 치료 그룹에 마우스를 할당합니다. 무작위로 차량 및 코르티코스테론 (CORT) 그룹으로 성인 남성 C57BL / 6J 마우스를 분할.
    1. 그들의 처리가 케이지의 물 병을 통해 전달되는 때, 다른 사람의 구별되는 새장에 있는 차체 마우스 및 CORT 마우스를 집.
    2. 동물 관리 직원에게 물병에 실험에 필요한 솔루션이 포함되어 있음을 통보하는 케이지에 특수 워터 카드를 라벨로 지정합니다.
  2. 3.375g의 베타 사이클로덱스트린을 750mL 크기의 L 스크류 톱 유리 용기에 수돗물로 용해하여 차량 용액을 만드십시오.
    1. 이 솔루션으로 차량 케이지 물 병을 채웁니다. 병이 액체 소비를 측정하기 위해 누출되지 않도록 하십시오.
    2. 용기에 라벨을 부착하고 실험실 선반의 실온에서 보관하십시오. 차량 용액을 사용하여 약 1 주일 동안 케이지 병을 채웁니다.
    3. 일주일 내내 차량 병을 리필하십시오. 필요에 따라 주 중에 케이지 병을 1x-2x 리필하십시오. 주 중 시작 또는 끝에 신선한 병 1x로 변경합니다.
      참고: 1주일 후 베타-사이클로덱스트린이 물병 안쪽을 코팅하기 시작하여 용액이 흐리게 됩니다.
    4. 일주일에 두 번 소비되는 액체의 양을 모니터링하고 기록합니다. 각 병의 무게와 기록, 어떤 액체를 유출하지 않도록주의. 각 병을 리필하고 반환합니다.
      참고: 5 마우스의 케이지는 3-4 일 안에 80-120 mL의 액체를 마실 것입니다.
  3. 먼저 크기 1 L 나사 상단 유리 용기에 수돗물의 750 mL에 베타 사이클로덱스트린의 3.375 g을 용해하여 CORT 솔루션을 확인합니다. 그런 다음 26.25 mg의 코르티코스테론을 추가합니다.
    1. CORT 용액을 초음파 처리하여 CORT를 물에 용해시합니다. 용기를 초음파 청정 수조에 놓습니다. 약 30분 동안 40kHz에서 초음파 처리하거나 코티코스테론이 용해되고 액체가 맑아질 때까지 초음파 처리합니다.
      참고: 초음파 균질화제(팁 스타일)도 CORT용용으로 도용됩니다.
    2. 모든 CORT 케이지에 대한 물병을 솔루션으로 채웁니다. 라벨 용기와 실험실에서 선반에 실온에 보관하십시오. CORT 용액은 약 1 주일 동안 케이지 병을 채우는 데 사용할 수 있습니다.
      참고: CORT가 빛에 민감하기 때문에 갈색 유리 물병이나 플라스틱 불투명 병을 사용하십시오.
    3. 일주일에 두 번 소비되는 액체의 양을 모니터링하고 기록합니다. 모든 차량과 CORT 마우스를 매주 계량하여 각 케이지 내의 마우스 중량과 소비되는 액체를 비교합니다.
    4. 소비된 액체의 부피(mL/g/day)를 확인하려면 다음 방정식을 사용하십시오.
      (지난 3~4일 동안 마신 부피 케이지) / (케이지내 마우스의 평균 체중) 차량 또는 CORT 병이 재충전된 이후의 일 수)
      참고: n=5 성인 남성 C57BL/6J 마우스의 평균 케이지는 평균 0.25 – 0.30 mg/g/day로 소비하며, 이는 일반적으로 광고 리비도 및 음식 박탈 기간 동안 일관성을 유지합니다. 이러한 농도의 대략적인 복용량 귀 착24 mg/kg/day 베타-사이클로덱스트린, 그리고 9.5 mg/kg/일 CORT15,,16.
  4. 사회적 패배 스트레스 (SDS)
    1. 다른 곳에서 깊이에 설명 된 표준 사회적 패배 스트레스 프로토콜을 사용24,,29.
  5. Y-미로 장벽 작업
    1. Y-미로 장벽 작업에 대한 식량 박탈
      1. 사회적 상호 작용 테스트를 완료 한 다음 날, 모든 제어 및 실험 마우스의 무게. 이것은 그들의 자유로운 먹이 체중이 될 것입니다.
        참고: 본명, 우리는 각각의 SDS 및 CORT 패러다임에서 SDS 제어 및 SDS 실험 마우스뿐만 아니라 차량 및 CORT 투여 마우스를 지칭하기 위해 "제어"와 "실험"을 사용합니다.
      2. 음식이 마우스를 박탈하기 위해 각 케이지의 C57BL /6J 측에서 실험실 차우만 제거하십시오.
      3. 모든 마우스의 무게, 뿐만 아니라 매일 주어질 실험실 차우의 양, 제대로 에 체중을 유지하기 위해 90% 테스트 기간 동안 무료 공급 무게의.
        참고: 각 마우스 또는 마우스의 홈 케이지에서 전달되는 음식의 양은 체중 변동과 Y-미로에서의 훈련 또는 테스트의 매일 소비되는 보상 펠릿의 양에 따라 달라집니다.
      4. 보상 펠릿에 익숙해. 20 mg의 곡물 기반 식품 펠릿 (Bio-Serv)을 홈 케이지에 작은 국수로 덤프하십시오. 이것은 펠릿에 익숙하게 설치하고 습관과 초기 훈련 세션에서 Y-미로에서 그들을 소비하는 마우스를 동기를 부여합니다.
  6. Y-미로 장치
    1. 불투명한 흰색 3/16" 너비 플렉시글라스의 Y-미로 구조를 구성하고, 길이 26cm, 높이 20cm, 너비 7cm의 3개의 팔을 가진 플렉시글라를 구성합니다.
    2. Y-미로의 슬롯 사이를 미끄러지는 디바이더를 사용하여 연구원이 마우스가 처음 배치되는 시작 상자를 닫거나 마우스를 선택하고 Y-미로의 왼쪽 또는 오른쪽 팔에 입력하면 마우스를 팔에 포함시킬 수 있도록 합니다.
    3. 수직 측에 대한 와이어 메쉬에서 여러 10, 15 및 20cm 높이의 Y-미로 장벽을 만들고, 플렉시글라스는 뒤쪽 각진 면에 약 45° 각도로 만듭니다. 이를 통해 C57BL/6J 마우스는 각 장벽의 수직 와이어 메쉬 측면을 잡고 올라간 다음 장벽의 각진 플렉시글라스 측면을 통과할 수 있습니다.
      1. 각진 측면에 얇은 계단을 추가하여 더 큰 견인력을 허용합니다.
  7. Y-미로 습관
    1. 모든 제어 및 실험 마우스를 Y-미로 장치에 습관화합니다.
      1. 음식 박탈 다음날, 50mL 원심분리기 튜브의 캡에 20 mg 곡물 기반 식품 펠릿 (예를 들어, Bio-Serv)의 큰 숫자를 배치하고 Y-미로의 각 팔의 끝에 배치. 이 모자는 마우스를 위한 작은 음식 소켓으로 봉사하고, 마우스는 음식 펠릿을 먹는 것을 쉽게 배울 것입니다.
      2. 시작 상자 디바이더가 있는 Y-미로의 시작 상자에 각 마우스를 놓습니다.
      3. 몇 초 후, 각 마우스가 15 분 동안 Y-미로를 탐험 할 수 있도록 칸막이를 제거합니다. 이 시간의 양은 마우스가 미로의 모든 팔을 적절하게 탐구하고 장치에 익숙해 할 수 있습니다.
        참고: 일부 마우스는 이 첫 번째 습관의 날에 어떤 음식 펠릿도 섭취하지 않을 수 있습니다.
    2. 다음 날, 동일한 절차를 사용하여 두 번째 15 분 Y-미로 습관을 완료합니다.
      1. 어떤 펠릿을 먹지 않은 쥐에 주의하십시오. 이 마우스를 위해, 그들의 홈 케이지에 펠릿의 또 다른 작은 국수를 덤프.
  8. Y-미로 강제 선택 교육
    1. 각 마우스에 대해 높은 보상(HR) 및 낮은 보상(LR) 암을 지정합니다.
      1. 제어 및 실험 그룹 모두에 마우스를 임의로 할당하여 좌측 암(HR) 팔과 오른팔을 낮은 보상(LR) 팔로 또는 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 따라서, 4개의 펠릿은 왼쪽, HR 팔 및 2개의 펠릿이 오른쪽, LR 암 또는 그 반대에서 유효할 때마다 유효할 것이다.
      2. 대조군과 실험군 모두에서 지정된 LR 및 HR 암의 균형을 맞추기 위해 각 그룹의 약 절반이 왼쪽 팔을 HR 암으로, 절반은 HR 팔로 오른팔을 가졌다.
    2. 강제 선택 시험
      1. Y-미로 습관의 2 일 다음, 마우스는 강제 선택 훈련의 10 시험의 3 일을 시작합니다.
      2. 각 강제 선택 평가판에 대해 마우스를 시작 상자에 넣고 칸막이를 제거하여 마우스 60s가 왼쪽 또는 오른쪽 팔에 들어가 사용 가능한 펠릿을 사용할 수 있도록 합니다. 각 강제 선택 평가판에 대해 칸막이로 반대 쪽 팔을 차단하여 마우스가 다른 팔을 선택하도록 강요합니다. HR 강제 선택 평가판의 경우 LR 암에 대한 액세스를 차단하거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
      3. 시험 후 마우스를 제거하고 먹은 각 펠릿을 보충합니다.
      4. 마우스가 5 HR 및 5 LR 강제 선택 시험을 완료할 수 있도록 각 훈련 일에 걸쳐 각 마우스에 대한 대체 강제 선택 시험.
        참고: 강제 선택 시험은 마우스가 한 쪽 팔을 더 높은 보상과 연결하고 다른 쪽은 더 낮은 보상과 연결하도록 훈련시다.
      5. 마우스를 홈 케이지에 다시 넣은 다음 각 마우스에 대해 5 분 간 간격을 유지하기 위해 3-5 개 이상의 후속 마우스를 실행하지 않습니다.
  9. Y-미로 무료 선택 교육
    1. 무료 선택 시험
      1. HR 및 LR 암 강제 선택 평가판으로 각 무료 선택 세션을 시작합니다. 따라서, 마우스는 10 무료 선택 시험을 시작하기 전에 각 팔에 강제로 되는 경험이 있을 것입니다.
      2. 시작 상자에 각 마우스를 놓고 디바이더를 제거합니다. 마우스가 팔을 선택하고 펠릿이 들어 있는 컵이 있는 끝까지 통과하면 팔 칸막이를 그 쪽에 놓고 펠릿을 소모할 때까지 마우스에 잠급니다.
      3. 마우스를 홈 케이지로 다시 제거하고 해당 주기에 사용된 마우스 3-5마우스를 실행하여 5분 간 시험 간 간격을 허용합니다.
    2. 다음 데이터를 기록합니다: 팔, 팔 선택 및 펠릿 컵에 도달하기 위한 대기 시간을 선택합니다.
      1. 마우스가 들어오고 완전히 펠릿 컵으로 통과하는 팔을 기록합니다. 또한 해당 팔을 선택하고 펠릿 컵에 도달하는 대기 시간을 기록합니다.
      2. 마우스가 팔을 선택하지 못하거나 4 또는 2 개의 펠릿을 모두 생략 된 시험으로 사용하지 않는 시험을 고려하십시오.
    3. 70% 무료 선택 기준
      1. 매일 10개의 무료 선택 시험에서 어떤 팔을 선택하지 않는지 기록합니다.
      2. 마우스가 무료 선택 훈련일(기준 70%)에서 10번의 시험 중 7개에서 HR 암을 선택하면 마우스를 장벽 테스트 세션으로 이동합니다.
        참고: 모든 마우스가 70% HR 암 기준에 도달할 때까지 무료 선택 교육을 계속하여 HR 및 LR 암의 적절한 차별을 보장하고 마우스가 HR 암에 대해 동등한 선호도를 입증합니다.
  10. Y-미로 장벽 테스트
    1. 10cm 배리어 테스트 세션
      1. 10cm 장벽을 Y-미로에 HR 암 의 중간 아래로 놓습니다.
      2. 두 팔에 대한 여러 강제 선택 시험으로 시작합니다. 장벽을 오르는 데 내성있는 마우스는 길고 얇은 플렉시글라스 조각으로 자극될 수 있습니다.
        참고: 경험상 각 세션이 시작될 때 HR 및 LR 암에 대해 최소 2개의 강제 선택 시험을 새로운 장벽 높이에서 권장합니다. 필요한 경우 마우스가 장벽 위로 올라가도록 유도해야 하는 시험을 기록하는 것이 좋습니다. 마우스는 일반적으로 1-2 시험 안에, 참을 수 없는 이렇게 높지 않은 10 cm 장벽을 위로 올라가는 것을 배웁니다. 장벽은 지정된 HR 팔로 반대 팔을 가진 마우스의 반대편에 배치되어야 합니다.
      3. 각 마우스를 시작 상자에 놓고, 칸막이를 제거하고, 마우스가 미로를 통과하고 HR 암에 10cm 장벽을 포함하는 10개의 무료 선택 시험을 위해 팔을 선택할 수 있도록 합니다.
      4. 마우스가 HR 측을 선택하면 더 큰 보상, 4 개의 펠릿을 얻기 위해 장벽 위로 올라갈 것입니다. 그렇지 않으면, 그것은 LR 팔을 선택하고 단순히 적은 보상, 2 펠릿미의 바닥을 통과합니다.
      5. 선택한 팔을 기록하고, 모든 시험을 위해 팔을 선택하고 펠릿 컵에 도달하는 대기 시간을 기록합니다. 마찬가지로 사이클 당 총 4-6 마우스를 회전, 5 분 시험 간 간격을 유지 합니다.
        참고: Y-미로에 70% 에탄올을 뿌리고 각 마우스 사이에 일관되게 건조를 닦아냅니다.
    2. 15cm 장벽 테스트 세션
      1. 다음 날 에는 위에 나열된 모든 단계(1.10.1 단계)를 완료하지만 HR 암에 15cm 높이의 장벽이 있습니다.
    3. 20cm 장벽 테스트 세션
      1. 다음 날 에는 위에 나열된 모든 단계(1.10.1 단계)를 완료하지만 HR 암에 20cm 높이의 장벽이 있습니다.
        참고: 경험에서, 20cm 장벽 높이에 의해 SDS 의 대다수 취약 또는 CORT 실험 마우스 (심지어 여러 제어 마우스) LR 팔에 그들의 응답을 이동 합니다., 그들은 키가 20 cm 장벽을 통해 올라갈 충분히 동기 부여 되지 않습니다. 또한, 플렉시글라스 어댑터는 마우스가 이 장벽의 상단에서 Y-미로 벽의 가장자리까지 올라가는 것을 방지하기 위해 사용될 필요가 있을 수 있다. 실험자가 각 컵의 펠릿을 리필하고 각 시험 후 마우스를 제거하는 것이 더 어려워지기 때문에 더 높은 Y-미로를 만드는 것이 좋습니다.
    4. 보상 차별 테스트 세션
      1. 제어 및 실험 마우스가 보상 차별의 적절하고 유사한 레버를 모두 표시하도록 하려면 차별 테스트 세션을 실시합니다.
      2. 위의 모든 단계 (단계 1.10.1)를 따르지만 LR 암에 10cm 장벽을 놓습니다. 이제 두 팔 모두 10cm 장벽을 포함하고 있으며, 마우스는 4 또는 2 펠릿 보상을 얻기 위해 위로 올라가야 합니다.
      3. 모든 10번의 시험에서 대기 시간 및 암 선택을 기록합니다.
        참고: 마우스는 보상을 얻기 위해 동일한 노력을 소비해야 하므로 마우스는 대부분의 시험에서 HR 암을 선택해야 합니다. HR 및 LR 암을 선택하기 위해 대기 시간을 검사하려면 각 개별 마우스에 대한 평균 HR 암 대기 시간과 평균 LR 암 대기 시간을 계산합니다. 그런 다음, 대기 시간을 비교하여 양방향 혼합 ANOVA를 사용하여 두 팔을 선택하며, SDS(제어, SDS-취약, SDS-탄력성)를 피험자 간 요인으로, 팔(HR 암, LR 암)을 피험자 내 요인으로 선택한다.

2. 만성 비차별적 사회적 패배 스트레스 (CNSDS)

  1. CD-1 마우스에서 공격적인 행동을 위한 화면
    1. 180 s에 대 한 각 CD-1의 홈 케이지에 1 개의 수컷과 하나의 여성 C57BL/6J 마우스를 배치 하거나 CD-1 두 마우스를 공격 할 때까지. 이러한 C57BL6/J 마우스는 순진할 필요가 없으며 추가 실험에서 사용되지 않습니다. 이 가해자 선별 단계 동안, CD-1 마우스와 C57BL/6J 마우스를 공동 수용하지 마십시오.
      1. 각 CD-1에 대해 C57BL/6J 마우스를 모두 공격하기 위한 대기 시간을 기록합니다.
      2. 총 3회 선별 세션 중 60초 이내에 남성과 여성 C57BL/6J 마우스를 공격하는 모든 CD-1 공격자를 선택합니다. 다른 것들은 홈 케이지의 공동 주택에 사용할 수 있습니다.
        참고: 사회적 패배의 중요한 주의사항은 신체적 침략의 결과로 상처가 있다는 것입니다. 스크리닝 및 실험 단계의 각 마우스는 작은 피부 병변이 존재하는 경우 상처를 검사하고 클로로 헥산 소독제로 처리해야합니다. 1cm 이상의 상처를 가진 마우스는 실험에서 제거해야합니다.
  2. 제어 및 실험 그룹에 마우스를 할당합니다.
    1. 모든 순진한 성인 남성과 여성 C57BL/6J 마우스를 수집, 뿐만 아니라 검사 은퇴 남성 CD-1 브리더, 뿐만 아니라 CD-1 남성 공동 하우징에 사용.
      1. 무작위로 성인 남성 및 여성 C57BL/6J 마우스를 제어 하거나 실험 조건을 할당. 각 남성과 여성은 CNSDS 실험 그룹의 모든 사회적 패배 세션에 대해 짝을 이룰 것입니다. CNSDS 대조군의 남성과 여성은 매일 회전합니다.
      2. CD-1 남성을 할당하여 사회적 패배 세션에 사용하거나 각 세션 후 실험적인 남성과 여성과 공동 수용할 수 있으며, 이는 C57BL/6J 남성과 여성 마우스의 각 쌍을 매일 번갈아 가며 합니다.
  3. 만성 비 차별적 사회적 패배 스트레스 (CNSDS)
    1. 모든 CD-1 남성, CNSDS 제어 남성 및 여성 C57BL/6J 마우스, CNSDS 실험 남성 및 여성 C57BL/6J 마우스를 포함한 모든 마우스를 전용 사회 패배실에 데려올 수 있습니다.
      1. C57BL/6J 남성 및 암컷과 CD-1 케이지를 앞면에 CD-1 케이지와 C57BL/6J 케이지로 정렬합니다.
      2. 마우스가 공격중인 케이지 ID 태그를 표시한 다음 모든 마우스의 조직을 보장하기 위해 CD-1과 공동 보관합니다.
        참고: 첫날 실험을 초기화한 후, 마우스는 남은 9개의 패배 세션동안 회전할 수 있으며, 각 C57BL/6J 남성과 여성 쌍은 각 세션마다 하나의 케이지를 왼쪽으로 회전시다. 이를 통해 모든 세션에서 새로운 CD-1과 새로운 상호 작용을 할 수 있습니다.
    2. CNSDS 실험 그룹 절차
      1. 성인 남성 1명과 성인 여성 C57BL/6J 마우스 1개를 각 CD-1 공격자 남성의 홈 케이지에 넣고 5분 간의 사회적 패배 세션을 진행합니다.
      2. 기록 공격 대기 시간 및 남성과 여성 실험 C57BL/6J 마우스에 대 한 공격의 주파수.
      3. 5 분 후, 남성 C57BL / 6J 마우스를 제거하고 명확하고 천공 플렉시 글라스 장벽으로 분리 된 공동 수용 CD-1 남성의 케이지에 배치합니다. 유사한 명확한, 천공 플렉시 글라스 장벽과 별도의 공격 CD-1 및 여성 C57BL /6J 마우스. 남성 또는 여성 C57BL/6J 마우스가 매일 공격자 CD-1로 수용되는지 여부를 대체합니다.
        참고: 각 마우스는 매일 5분 씩 상호 작용한 후 1cm 미만의 경우 치료된 부상과 상처에 대해 평가됩니다. 1cm 보다 큰 상처는 마우스의 제거 및 즉각적인 안락사를 초래할 것입니다. 따라서, 남성과 여성 실험 마우스는 5일 동안 CD-1 공격자와 공동 수용되며, 나머지 5일 동안 공격 세션에서 사용되지 않는 새로운 CD-1을 가진다. 투명하고 천공된 플렉시글라스 장벽은 물리적 상호 작용을 방지하지만 세션 사이의 24시간 동안 CD-1 공격자와의 감각 접촉을 허용합니다. 질 용암은이전에설명된 바와 같이 매일 패배 후 약 30분 동안 모든 여성 마우스에서 수행될 수 있다.
    3. CNSDS 제어 그룹 절차
      1. 하나의 제어 남성 C57BL /6J 마우스의 홈 케이지에 하나의 제어 여성을 배치합니다.
      2. 5 분 후, 마우스를 분리하고 마우스 사이에 명확하고 천공 플렉시 글라스 분할을 배치합니다.
      3. 마우스를 콜로니 룸으로 돌려놓고 CNSDS 실험 케이지로 별도의 선반에 놓습니다. 식민지 방에서 우리는 스트레스 마우스가 식민지 방에있는 다른 마우스와 별도로 보관되는 선반을 지정했습니다. 또한, 그(것)들이 일어나는 침략을 목격한 경우에 비 스트레스 마우스에서, 대리사회적 패배 패러다임30에서 볼 수 있듯이, 효력은 비 스트레스 마우스에서 볼 수 있습니다
      4. 각 제어 상호 작용 중에 공격 또는 장착 동작을 기록합니다.
    4. 대조군 남성과 여성 마우스는 전통적인 사회적 패배 스트레스 조절 그룹에서 수행되는 것과 같이 후속 일에 새로운 동특화에 소개될 것입니다. CNSDS 제어 및 실험 세션의 10일 연속 완료.
      1. 10th 및 최종 제어 또는 실험 CNSDS 세션을 완료한 후 모든 마우스를 공동 수용하고 모든 행동 테스트를 통해 이 공동 하우징을 유지합니다. 각 케이지는 감각 노출을 허용하기 위해 플렉시 유리 칸막이의 양쪽에 분리된 2개의 마우스로 구성됩니다. 대조군 마우스는 다른 이성 조절 마우스와 함께 수용되며, 실험용 마우스는 이성 실험 마우스와 함께 수용된다.
      2. 각 대조군 C57BL/6J 암컷은10회 세션에서 상호작용한 제어 C57BL/6J 남성과 공동 으로 수용되며, 두 마우스를 분리하기 위해 케이지에 배치된 투명플시유리 칸막이가 있다.
      3. 최종 패배 세션 후 약 24시간 동안 표준 사회적 상호작용 테스트를 실행하여 CNSDS가 제어에 비해 새로운 CD-1 마우스로 사회적 행동을 감소시키는지 확인하고, 마우스를 "탄력적" 또는 "민감성"으로 계층화하여응력(24,29)에29대해 "탄력적" 또는 "민감성"을 계층화한다.
    5. 테스트 CNSDS 제어 및 Y-미로 장벽 작업을 포함한 다른 행동에 있는 실험적인 남성 및 여성 마우스를 시험하고, CNSDS-탄력성 및 CNSDS-취약한 단으로 CNSDS 단을 계층화합니다.
  4. 사회적 상호 작용 테스트
    1. 사회적 상호 작용 테스트를 위한 초기 설정
      1. 최종 CNSDS 패배 세션 후 24 시간, 사회적 상호 작용 테스트를 실시.
      2. CNSDS 패러다임에 사용되지 않는 새로운 CD-1 남성뿐만 아니라 모든 쌍 으로 보관된 제어 및 실험 마우스를 별도의 행동실로 가져가 서 사회적 상호 작용 테스트를 실행합니다.
      3. 전용 컴퓨터에서 실행되는 행동 추적 소프트웨어(예: EthoVision)에 연결된 레코딩 카메라 아래에 표준 오픈 필드 챔버(75cm x 75cm)를 설정합니다.
      4. 24cm x 24cm 사회 상호작용 영역을 둘러싼 상호작용 용기(약 10cm x 10cm x 10cm 크기의 작은 천공 플렉시글라스 컨테이너)로 새로운 실험을 설정하여 2회 연속 2.5분 시험의 두 번째 에서 오픈 필드의 한 벽을 따라 새로운 CD-1을 수용할 수 있습니다. 따라서, 상호작용 영역7cm 폭은 새로운 CD-1 마우스를 수용하는 컨테이너를 둘러싸고 있다.
    2. 사회적 상호 작용 테스트에서 마우스 실행
      1. 각 마우스를 열려 있는 필드의 먼 구석에 놓고 CD-1이 없는 2.5분 평가판에 배치하고 녹화 소프트웨어 프로그램을 시작합니다.
        참고: 상호 작용 컨테이너를 열린 필드의 한 벽중앙에 배치해야 하며 이 첫 번째 평가판에는 CD-1 마우스가 포함되어 있지 않습니다.
      2. 2.5분 후 마우스를 다시 홈 케이지로 제거합니다. 70%의 에탄올로 열린 필드를 청소하십시오.
      3. 소설 CD-1 남성을 열린 필드의 한 벽 의 중간을 따라 두 번째 천공 플렉시 글라스 큐브에 놓습니다.
      4. 다시 말하지만, 이제 CD-1이 있는 두 번째 2.5분 평가판에 대한 열린 필드의 모서리에 마우스를 배치하고 기록 소프트웨어 프로그램을 시작합니다.
      5. 마우스를 제거하고 홈 케이지에 다시 배치합니다. CD-1을 제거하고 홈 케이지에 다시 배치합니다. 70%의 에탄올로 열린 필드를 청소하십시오.
    3. 남은 CNSDS 제어 및 실험 마우스를 실행하고 상호 작용 비율을 계산합니다.
      1. 각 CNSDS 제어 및 실험 마우스에 대한 시험 1 과 예심 2 모두에서 상호 작용 영역에서 소요된 시간을 정량화하기 위해 다른 모든 마우스와 이 절차를 반복하십시오.
      2. 상호 작용 비율을 계산하려면 다음 방정식을 사용하여 평가판 2(CD-1 현재)와 시험 1(CD-1 결석)에서 소셜 상호 작용 영역에서 소요된 시간을 비교합니다.
        상호 작용 비율 = (평가판 2의 상호 작용 영역의 시간)/(평가판 1의 상호 작용 영역의 시간)
    4. "CNSDS-탄력성" 또는 "CNSDS-민감성"으로 마우스를 계층화합니다. 탄력성 마우스의 상호 작용 비율을 가지고 > 1.0, 반면 취약한 마우스의 상호 작용 비율을 가지고 <=1.0.
      1. Y-미로 장벽 작업 또는 기타 행동 테스트와 같은 후속 행동 측정에서 CNSDS 실험 마우스를 이러한 CNSDS-탄력성 및 CNSDS-취약한 표현형으로 세분화합니다.
      2. 따라서 여성의 경우 CNSDS 제어, CNSDS 실험-탄력성 및 CNSDS 실험에 취약한 그룹 간에 단방향 ANOVA를 실시하여 적절한 경우 그룹 간의 차이를 결정하는 후 호크 비교를 수행할 수 있습니다.
      3. 성차 비교를 위해, CNSDS (제어, 탄력, 취약) 및 섹스 (남성, 여성)와 양방향 ANOVAs를 주제 간 요인으로 수행합니다. 적절한 경우 사후 비교를 사용합니다.

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Representative Results

만성 CORT는 Y-미로 장벽 훈련 및 테스트(그림 1A)에이어 4 주 동안 투여되었다. 별도의 코호트에서, 10일 SDS 패러다임은 유사하게 Y-미로 장벽작업(도 1C)에서훈련 및 테스트를 거쳐 남성 마우스의 노력 관련 선택 행동에 대한 이러한 만성 스트레스 패러다임의 효과를 결정하였다. 만성 CORT 및 SDS 모두 t-test(표1)에의해 t결정된 차량 마우스 및 SDS 대조군 마우스에 비해 평균 체중을 감소시켰습니다. 이 마우스는 또한 테스트 를 통해 덜 평균 홈 케이지 실험실 차우를 소비(표 1).

CORT 코호트에서, 피험자 인자와 같은 코르트와 의 혼합 ANOVA는 피험자 인자와 주 내인후요인으로서 차량 및 CORT 투여 마우스가 4주 동안 유사한 양의 액체를 소비하고 3주간의 행동 테스트(총 7주)를나타낸다(그림 1B). SDS 코호트에서, 제어 및 실험 남성은 SDS 프로토콜의 10 일을 완료하고, 새로운 CD-1 남성과 상호 작용하는 데 소요된 시간이 CD-1 현재24없이상호 작용 영역에서 시간에 비해 사회적 상호 작용 테스트를 사용하여 SDS 프로토콜에 대한 감수성에 대한 평가되었다. ANOVA는 SDS가 탄력성 마우스(40%)에 비해 취약한 마우스(60%)에서 적응형 표현형을 생성한다고 밝혔습니다. 또는 SDS에 노출되지 않은 제어마우스(도 1D). 구체적으로, SDS-민감성 마우스는 SDS-탄력성 및 제어 마우스와 비교할 때 새로운 CD-1 마우스를 포함하는 상호작용 영역에서 소요되는 시간 감소를 나타낸다.

그런 다음, 우리는 Y-미로 장벽 작업(그림 2A)에서CORT (실험 및 제어 마우스) 및 SDS (민감성 및 제어) 집단을 모두 훈련시켰습니다. 우리는 제어 및 실험 마우스가 단지 2 개의 펠릿을 포함하지만 등반 장벽을 특징으로 Y-미로의 다른 팔을 선택하는 대, 4 펠릿 보상을위한 장벽을 등반하는 노력을 소비 할 시험의 수를 측정했다. SDS의 경우, 양방향 혼합 ANOVA, SDS(대조군, SDS-취약, SDS-탄력성)를 피험자 계수로, 및 팔(HR 팔, LR 암)을 피험자 간 요인으로 하여 Y-maze에서 의욕적인 반응을 검토하는 데 사용되었다. 만성 CORT의 경우, 양방향 혼합 ANOVA, CORT 투여(Vehicle, CORT)를 피험자 간 요인으로, 팔(HR, 팔, LR 암)을 피목계 인자로 한다. 만성 CORT와 SDS 모두 장벽 높이가 15cm로 증가하고 20cm(도2B 및 도 2C)로증가했을 때 힘겨워대응의 변화를 일으켰습니다. 10cm 장벽만 HR 암에 있을 때 어느 쪽도 응답하지 않았습니다. 또한, 테스트 후 보상 차별 세션에서 모든 마우스는 HR 과 LR 암 모두에 10cm 장벽을 두었을 때 HR 암에 대해 유사하게 반응했습니다. 마지막으로, CORT 또는 SDS를 피사체 간 요소와 HR 또는 LR 암으로 사용하는 양방향 ANOVA는 15cm 장벽을 가진 HR 및 LR 암 대기 시간이 CORT 투여에 의해 영향을 받지 않았으며, LR 및 HR암(그림 3)을모두 가진 그룹 모두에 대해 유사함을 드러냈습니다. 따라서, 만성 CORT 및 SDS는 남성 마우스에 있는 Y-미로 장벽 작업에서 힘있게 반응하는 것을 강력하게 이동합니다.

중요한 것은, 만성 CORT 또는 SDS가 Y-미로 장벽 작업의 학습을 손상시키는 경우에(그림 4),이 마우스는 자유 선택 훈련 세션에서 기준에 도달하지 못할 수 있습니다, 장벽 결과의 후속 해석에 영향을 미치는. 따라서, 우리는 별도의 독립적 인 샘플 t-테스트를사용하여 평가이러한 차이를 표시하는 잠재적으로 부정적인 대표 결과를 보여줍니다(그림 4).

CNSDS 절차는 남성과 여성 C57BL/6J 모두의 강력한 적응형 표현형을 생성한다(도5A). 사회적 상호 작용 작업은 쥐를 탄력성으로 계층화하는 데 사용됩니다 (38.3%) 취약하고 (61.7%) 성별(남성: 43.3%, 취약 56.7%, 여성: 36.7%, 63.3% 취약), CNSDS 대조군, CNSDS 실험탄력성, CNSDS 실험용 그룹 간의 편도 ANOVA를 사용하여 성별(남성: 43.3%, 56.7% 취약) 및 CNSDS 실험용 으로 더 세분화될 수 있는인구(그림 5B). 이 수정된 패러다임은 회피행동(28)에서SDS와 유사한 적응 효과를 생성하지만, Y-미로 장벽 작업과 같은 번역 관련 보상 및 동기 부여 관련 행동 테스트와 함께 구현되지는 않았습니다. 남성과 여성 모두에서 Y-미로 장벽 작업과 같은 번역 관련 행동에 CNSDS와 같은 스트레스의 영향을 평가하는 미래 연구에 필수적입니다.

만성 코르트 그룹 체중(g)   일일 음식 제공 (g)  
    의미 Sem 의미 Sem
차량 26.3 0.75 2.8 0.086
Cort 22.4 0.58 2.4 0.065
사회적 패배 스트레스
컨트롤 27.5 0.67 2.9 0.088
Sds 23.8 0.66 2.5 0.074

표 1: 체중과 매일 제공되는 음식의 양. 차량 및 CORT 투여 마우스뿐만 아니라 제어 및 SDS 마우스는 매주 무게를 측정하고 주어진 음식의 양이 기록되었다. Y-미로 테스트를 통해 평균 체중 (g) 주어진 매일 음식 (g)이 표시됩니다.

Figure 1
도 1: SDS는 덜 사회적 상호 작용을 특징으로 하는 우울한 표현형을 유도합니다.
(A)CORT 및 Y-미로 장벽 프로토콜의 타임라인을 묘사한 회로도. (B)차량 및 CORT 투여 마우스에서 소비된 부피(mL/g/day)를 나타내는 대표적인 데이터. (C)SDS 및 Y-미로 장벽 프로토콜의 타임라인을 묘사한 회로도. (D)대표적인 사회적 상호작용 시험에서, SDS 에 취약한 마우스는 SDS 탄력성 또는 대조마우스에 비해 새로운 마우스와 상호작용하는 데 소요되는 시간을 줄였다. 바는 평균 ± SEM. * p & 0.05입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: CORT 및 SDS는 Y-미로 장벽 작업에서 힘겨한 대응을 전환합니다.
(A)CORT 및 SDS용 Y-미로 장벽 작업의 타임라인. (B)만성 CORT는 15cm 및 20cm 장벽 높이에서 HR 암 선택을 감소시킵니다. 이 수치는 디트리히 외 202021에서수정되었습니다. (C)SDS-민감성 마우스가 대조군 또는 SDS-탄력성 마우스에 비해 15cm 및 20cm 장벽 높이에서 HR 암의 선택을 감소시키는 대표적인 결과를 보여줍니다. 바는 평균 ± SEM. * p & 0.05입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: Y-미로 대기 시간은 만성 CORT에 의해 영향을 받지 않습니다.
만성 CORT는 Y-미로에서 LR 또는 HR 무기를 선택하는 대기 시간에 영향을 미치지 않습니다. 또한 차량 및 CORT 마우스는 모두 유사한 대기 시간을 가진 LR 또는 HR 암을 선택합니다. 이 수치는 디트리히 외 202021에서재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 만성 CORT 및 SDS는 자유로운 선택 HR 암 선택을 저해합니다.
만성 CORT 또는 SDS에 노출된 마우스가 무료 선택 훈련에서 쥐를 제어하는 것에 비해 높은 보상 팔 선택의 수를 감소시키고, 결과의 해석을 복잡하게 하고, 장벽 테스트로의 전환을 지연시키거나 방지하는 대표적인 결과를 보여줍니다. 바는 평균 ± SEM. * p & 0.05입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: CNSDS에 노출된 수컷과 암컷 마우스의 계층화가 취약하고 탄력적인 집단으로 증가합니다.
(A) CNSDS 실험 및 제어 패러다임의 회로도. 이 수치는 Yohn et al. 201928에서재인쇄됩니다. (B) CNSDS는 CNSDS-탄력성(RES) 및 CNSDS-취약한(SUS) 마우스의 견고한 계층화를 생성한다. 이 수치는 Yohn et al. 201928에서재인쇄됩니다. 바는 평균 ± SEM. *p< 0.05, **p< 0.01, ***p & 0.001, ****p & 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

만성 CORT 패러다임은 식수에서 일정한 CORT 복용량을 제공하지만, 경험에서 마우스에 의해 소비 되는 양에 약간의 가변성이 있을 수 있습니다. 또한, 소비는 전체 케이지에 대해서만 평가될 수 있으며, 케이지내의 마우스 수에 따라 평균적인 채취를 받을 수 있다. 또한, 유출은 병을 계량하거나, 행동 테스트를 위해 마우스를 옮기거나, 신선한 케이지로 변경할 때 발생할 수 있습니다. 그러나 차량 및 CORT 소비를 추적하는 것은 치료 및 행동 테스트 의 주 동안 여전히 가능하고 정확합니다. 우리는 강력하게 일주일에 한 번 차량 이나 CORT를 포함 하는 신선한 병으로 변경 하는 것이 좋습니다., 무게와 병을 교환 하는 설정 된 시간을 유지. 예를 들어, 병에 무게를 두고 리필할 때 신선한 병으로 교체한 다음, 목요일이나 금요일에 다시 수행되는 모든 병을 계량하고 다시 채울 수 있습니다. 마찬가지로, 매주 지정된 날에 모든 마우스를 동시에 계량하는 것이 가장 좋습니다. 마지막으로, 이 CORT 패러다임은 HPA 축에 의한 코르티코스테론의 내인성 생산을 무디게 한다는 점을 지적하는 것이 중요합니다. 따라서, 마우스는 희생될 때까지 행동 테스트를 통해 CORT에 남아 있어야 합니다. 마우스가 CORT에서 벗어난 경우에, 그(것)들은 급성 부신 부족의 애디소니언 위기를 겪을 수 있습니다. 대체 절차는 2-3 주 CORT 노출을 사용하고, 코르트에서 진보적 인 젖을 짜고 내인성 CORT 수준이 정상17,,19로돌아오면서 약 3-4 주의 행동 테스트 창을 사용했습니다.

Y-미로 장벽 작업에서는 SDS프로토콜(그림 2A)에따라 미로 습관및 훈련을 시작하는 것이 중요합니다. 이 실험 적인 타임 라인의 잠재적인 주의 는 쥐 훈련 성능에 따라 동등 하 게 분할 될 수 있는 사전에 보다는 조작에 따라 훈련. 그러나 CORT 투여 전과 이후의 경험 훈련에서 기악행동(16)에큰 영향을 미치지는 않습니다. 모든 마우스는 장벽 테스트에 진출하기 전에 철저하게 훈련되고 기준(무료 선택 세션에서 70% HR 암 선택)에 도달합니다. 마우스는 먼저 미로에 제대로 습관화되어야하므로 후속 훈련 단계에서 도움이 된다는 것을 발견했기 때문에 익숙한 장치가됩니다. 각 마우스를 훈련할 때, 각 개별 마우스에 대해 설계된 높고 낮은 보상 팔을 유지하는 것이 중요하므로 마우스는 4개의 펠릿을 기대하고 2를 찾거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 모든 제어 및 SDS 마우스에 대한 균형 잡힌 높고 낮은 보상 암을 나타내는 대용량 원시 데이터 파일의 종이 및 디지털 사본을 보관하는 것이 좋습니다.

미로 모양(Y-미로 대 T-미로)의 정확한 사양으로 인해 미로 성능에 차이가 있다고 생각하지 않으며, 연구자들이 노력과 관련된 선택 행동 실험에서 사용할 수 있다고 믿습니다. 또한, 이전에는 차량 투여마우스(21)에서10cm에 비해 15cm에서 HR 암 선택이 약간 증가했다고 보고하였다. 그러나, 연구원은 20cm 장벽 마우스에 의해 거의 HR 암(21)을선택하지 않는 바와 같이, 장벽 높이가 15cm 를 지나 가므로 유사하거나 감소 된 HR 팔 선택을 기대해야한다.

또한, 미로를 청소하고 모든 세션 후 잔류 냄새를 제거하기 위해 70 % 에탄올 스프레이를 사용하는 것이 중요합니다. 우리는 또한 모든 마우스에 대 한 상대적으로 일정 한 시험 간 간격이 있도록 일관 된 방식으로 마우스를 실행 하는 것이 좋습니다. 우리는 약 의 간격을 제공해야 한 번에 약 4-6 마우스를 사이클링하는 것이 좋습니다 5 분. 마지막으로 마지막 무료 선택 세션에서 모든 장벽 테스트 세션에서 는 모든 시험에서 어느 쪽의 팔을 선택하도록 대기 시간을 기록하는 것이 중요합니다. 또한, 마우스는 때때로 플렉시글라스 벽의 꼭대기로 이동관리, 또는 장벽의 상단에서 더 자주. 이 경우 미로의 측면을 따라 키가 큰 플렉시글라스 벽 어댑터를 추천합니다. 이들은 플렉시 글라스 (20cm의 폭, 80cm의 길이)의 단순히 직사각형 조각이 될 수 있습니다. 우리는 마우스가 60 초 이내에 팔을 선택하지 못하거나 팔을 선택하지만 생략 된 시험으로 음식 펠릿을 먹지 않는 모든 시험을 표시합니다. 마지막으로, 만성 CORT와 SDS 는21의시험의 주에 걸쳐 소모되는 음식의 양에 영향을 미치는 체중을 감소시킬 수 있습니다. 연구원은 정기적으로 쥐의 무게와 그들의 자유 먹이 체중의 약 90%에서 마우스를 유지 하기 위해 홈 케이지에 주어진 음식의 양을 조정 한다.

여기에서는 또한 최근 개발된 패러다임, 만성 비차별적 사회적 패배 스트레스(CNSDS)(도5A)에대해 논의하고 있으며, 남성과 여성 마우스의 스트레스에 취약하고 탄력적인 집단을 유도하기 위한것입니다(그림 5B). CNSDS 패러다임 스트레스 또는 기분 장애에 관심이 있는 전임상 연구원에 의해 사용할 수 있습니다. CNSDS 패러다임에서 실험적인 여성이 세션 당 적어도 한 번 공격받는 것이 중요합니다. 거의 모든 사회적 패배 세션에서 실험남성은 여러 번 공격을 받습니다. 각 CD-1 공격자는 CNSDS 프로토콜을 시작하기 전에 남성과 여성 C57BL/6J 마우스로 엄격하게 검사되어야 하며 각 세션에서 모든 공격을 기록해야 합니다. 우리는 1명의 남성과 1명의 여성이 상호 작용하는 CNSDS 방법론에 있는 이중 성 통제 조건을 기술하는 동안, 따라서 CNSDS 절차에서 사용된 2명의 남성과 1명의 여성을 모방하는, 이 통제 상호 작용을 위한 추가 남성을 포함하는 것이 몇몇을 위해 적일 지도 모릅니다. 이러한 대체 대조절차는 회피동작(28)에서마우스의 동작에 영향을 미치지 않는다. 또한, 사회적 상호작용 시험은 10일 패배 프로토콜 이후에 24시간 시행되어야 하며, 이 방법의 효과를 보장하고 남성과 여성 마우스를 CNSDS24에탄력적이거나 취약하다고 계층화해야 한다.

사회적 상호 작용 테스트를 기반으로 마우스를 탄력적이고 취약한 인구로 세분화하는 역사적 접근 방식을 사용하는 한 가지 문제는 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 모든 혐오 동작을 정확하게 측정할 수 없다는 것입니다. 상호작용 점수및 gt;1을 가진 "탄력성" 마우스는 CD1마우스(31)를하우징하는 용기 주위의 복종 동작을 입증할 수 있다. 현장이 이러한 미세 행동을 더 잘 추적하는 소프트웨어를 개발하는 것이 중요합니다. 설치류의 복잡한 사회적 행동에 대한 행동 분류자를 허용하기 위해 골든 연구소에서 개발한 간단한 행동 분석(SimBA32)과같은 도구는 이점에서 유용할 수 있습니다.

일부 마운팅은 CNSDS 프로토콜 중에 발생할 수 있습니다. 우리는이 패러다임에 있는 어떤 임신든지 관찰하지 않는 동안, 연구원은 이 가능성을 알고 있어야 합니다.

CNSDS를 포함한 사회적 패배 프로토콜의 또 다른 제한은 사회적 패배 세션을 완료 한 후 행동에 대한 스트레스 효과를 조사하는 제한된 시간 기간입니다. 따라서 기존의 미로 장벽 프로토콜을 모든 습관, 교육 및 테스트 세션을 30일 의 기간으로 조정했습니다. 그러나, 이것은 일부 마우스에 대한 전반적인 훈련을 서두를 수 있습니다, 누가 에 도달하기 위해 투쟁 할 수있다 70% 무료 선택 세션을 완료하는 데 필요한 높은 보상 팔 선택에 대한 기준(그림 4). 또한 적절한 계획 없이 다른 행동 테스트를 완료할 수 있는 일은 제한되어 있습니다. 그러나, 최근 연구는 사회적 패배 스트레스 두뇌와 행동에 더 지속적인 영향을 생산할 수 있습니다 나타냅니다. Miczek 실험실에서 연구 보여주었다 10 사회적 패배 스트레스의 일 적어도 지속 하는 쥐에서 자발적인 알코올 소비를 증가 시킬 수 있습니다 4 주31,,33. 사회적 패배 프로토콜은 5-10 분 에서 어디서나 지속되는 패배 세션을 사용합니다. 우리는 CNSDS에 대한 5 분 노출을 사용하여 실험C57BL /6J 마우스28에서부상가능성을 감소시다. CNSDS 프로토콜은 C57BL/6J 암컷 마우스가 상주 스위스 웨버마우스(28)에노출되는 뉴만 과 동료가 개발한 사회적 패배 프로토콜에 여성의 유사한 결과를 생성한다. CNSDS와 유사하게, 사회적 패배 프로토콜의 이 변이는 만성 응력 표현형을 유도하기 위하여 5 분 상호 작용의 10 일을 이용합니다.

이러한 방법은 만성 스트레스가 마우스의 보상 처리 및 동기 부여에 미치는 영향을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 보상 처리, 그리고 여성 과목 모두, 역사적으로 전임상 기분 장애 분야에서 과소 공부. 향후 연구는 만성 스트레스가 남성과 여성의 보상 동기부여에 미치는 영향을 결정하고 취약한마우스(그림 5B)에비해 탄력성을 계층화해야 합니다. 이 계층화가 오픈 필드, 고지대 미로 및 참신억제 수유와 같은 회피 행동에서 볼 수 있듯이 Y-미로 장벽 성능에 다른 영향을 미치는지 여부를 아는 것이 중요합니다. 미래 연구는 스트레스 반응 또는 보상 동기부여를 중재하는 신경 회로를 조사하기 위하여 광유전학 또는 DREADDS 기술과 같은 그밖 기술과 이 방법론을 결합할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 Y-미로, 장벽, 사회적 패배 케이지를 건설한 토마스 그레이스에게 감사를 표하고 싶습니다. 저자는 제이 리, 카리나 스텍, 프라치 스리바스타바에게 데이터 수집에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 NIMH 그랜트 R01 MH112861 (BAS)에 의해 투자되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic Sheet McMaster Carr 8560K215 Clear, 3/16" thick, 24" X 36"
Beta-cyclodextrin Sigma-Aldrich C4767 500 mg
C57BL/6J Mice Jackson Labs 000664 Adults age 7-8 weeks
Corticosterone Sigma-Aldrich C2505 or C27840 100 or 500 mg
Male CD-1 Mice Charles River 022 "Retired Breeders"
PVC Acrylic Sheet McMaster Carr 8560K215 White, 3/16" thick, 48" X 48"
Solidstate Ultrasonic Cleaner Fisher Scientific FS-28 Must reach 40 kHz
Steel Wire Cloth McMaster Carr 9219T143 1 ft X 2 ft

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References

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행동 문제 162 우울증 만성 스트레스 노력 관련 선택 사회적 패배 스트레스 코르티코스테론 기분 장애 보상 성차이
만성 스트레스는 마우스의 Y-미로 장벽 작업에서 노력과 관련된 선택 행동을 변화시합니다.
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Dieterich, A., Yohn, C. N., Samuels, B. A. Chronic Stress Shifts Effort-Related Choice Behavior in a Y-Maze Barrier Task in Mice. J. Vis. Exp. (162), e61548, doi:10.3791/61548 (2020).

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