微塑料对鸟胚胎发育的生态毒性影响，无需蛋壳孵化

Summary

本文介绍了一种无需使用蛋壳进行微塑料等颗粒污染物毒理学研究的孵化方法。

Abstract

微塑料是一种新兴的全球污染物类型，由于动物组织和器官的吸收和转移，对动物的健康构成巨大威胁。微塑料对鸟类胚胎发育的生态毒性影响尚不清楚。鸟蛋是一个完整的发育和营养系统，整个胚胎发育发生在蛋壳中。因此，在微塑料等污染物的压力下，鸟类胚胎发育的直接记录受到传统孵化中不透明蛋壳的极大限制。在这项研究中，微塑料对卵壳发育的影响通过没有蛋壳的孵化进行视觉监测。主要步骤包括受精卵的清洁和消毒、暴露前的孵化、暴露后的短期孵化以及样品提取。结果表明，与对照组相比，微塑料暴露组的湿重和体长呈统计差异，整个暴露组的肝比例显著增加。此外，我们评估了影响孵化的外部因素：温度、湿度、卵子旋转角度和其他条件。这种实验方法为微塑料的生态毒理学提供了宝贵的信息，是研究污染物对胚胎发育的不利影响的新方法。

Introduction

2015年塑料废物的产量约为6300万吨，其中十分之一被回收利用，其余被焚烧或埋在地下。据估计，到2050年1月1日，约有12，000吨塑料废物将被埋入地下。随着国际社会对塑料废物的关注，汤普森于2004^年首次提出了微塑料的概念。微塑料（MP）是指颗粒直径小于5毫米的小颗粒塑料。目前，研究人员已经探测到，在各大洲、大西洋群岛、内陆湖泊、北极和深海栖息地^的海岸线上，议员^{无处不在。}因此，更多的研究人员开始研究议员的环境危害。

生物体可以在环境中摄入议员。在全球233种海洋生物的消化道中发现了MPS（包括100%龟类、36%海豹物种、59%鲸鱼物种、59%海鸟物种、92种海鱼和6种无脊椎动物^）8种。此外，议员们可能会阻止生物体的消化系统，积累和迁移在他们的波比^9。研究发现，议员可以通过食物链转移，他们的摄入量因栖息地、生长阶段、喂养习惯和^{食物来源的变化}而异。一些研究人员报告说，在海鸟¹¹号的粪便中存在议员，这意味着海鸟充当了议员的载体。此外，摄入议员会影响某些生物体的健康。例如，MP可以纠缠在胃肠道，从而增加鲸目动物^{的死亡12。}

仅议员就对生物体有毒性影响，对具有其他污染物的生物体有联合毒性影响。摄入与环境有关的塑料碎片浓度可能会干扰成年鱼¹³的内分泌系统功能。微塑料的大小是影响生物^体吸收和积累的重要因素之^一。小尺寸塑料，特别是纳米大小的塑料，容易与高毒性^{16、17、18、19}等高毒性的细胞和生物体相互作用。虽然纳米颗粒大小的微塑料对生物体的有害影响超过了目前的研究水平，但检测和量化大小小于几微米的微塑料，特别是环境中的亚微子/纳米塑料，仍然是一项巨大的挑战。此外，纳米塑料也对胚胎有一定的影响。聚苯乙烯可以通过调节蛋白质和基因特征²⁰来破坏海胆胚胎的发育。

为了探讨议员对生物体的潜在影响，我们进行了这项研究。由于鸟类胚胎和人类胚胎的相似性，它们通常用于发育生物学研究^21，包括血管生成和抗血管生成、组织工程、生物材料植入物和脑肿瘤22、23、24。鸟类胚胎具有成本低、培养周期短^{、操作方便}等^优点。因此，在这项研究中，我们选择了生长周期短的胚胎作为实验动物。同时，我们可以通过无蛋壳孵化技术直接观察胚胎发育阶段暴露在 MP 的卵壳胚胎的形态变化。使用的实验材料是聚丙烯（PP）和聚苯乙烯（PS）。由于PP和^PS27占全世界沉积物和水体中聚合物类型的最大比例，从捕获的海洋生物中提取的最常见的聚合物类型是乙烯和丙烯^28。这个实验协议描述了对议员们对暴露在议员面前的胚胎的毒理学影响进行视觉评估的全过程。我们可以很容易地扩展这种方法来检查其他污染物对其他动物胚胎发育的毒性。

Protocol

1. 暴露前的准备

1. 选择同一天出生的受精卵进行暴露测试。
2. 选择重量相似的鸡蛋。每个受精卵大约为10-12克。
3. 完全清洁外部粪便和其他碎屑中的所有受精卵。
4. 用抗生素溶液（青霉素和链霉素，1：1000，室温）对每个预孵化受精卵和要使用的卵子（选择壳形相似的卵子，尤其是蛋尖）进行消毒。用75%的乙醇对孵化器进行消毒。
5. 用牙科钻头的钝端打开鸡蛋，将蛋壳放在尖端以供进一步使用。在转移受精卵之前，将卵子中的内容倒出来。这是为了保持蛋壳的水分。鸡蛋的开口直径约为3厘米。
   注意：为了减少对卵胚的损害，使用牙科钻头打开卵子的钝端，使裂纹尽可能光滑。
6. 绝育后，将受精卵放在 38 °C 孵化器中，湿度为 60%，为 24-48 小时。确保鸡蛋的钝端朝上。
7. 在受精卵的孵育过程中，对随后在灭菌锅中实验所需的工具进行消毒。这些工具包括塑料包装、烧嘴、无菌水、移液器尖、手术直剪刀、钳子和勺子。
   注意：使用耐温度足够高的薄膜，以避免高温灭菌问题。

2. 在没有壳的情况下孵化鸡蛋

1. 将预孵化受精卵从孵化器转移到干净的长凳上，平放在容器上，使其稳定约1-2分钟。
2. 使用剪刀（12.5 厘米手术直剪刀）在预孵化受精卵的中轴戳一个小孔（直径 3 毫米），并切开 1-2 厘米的小开口。小心地将受精卵的蛋清和蛋黄转移到切蛋壳中。
   注意：用剪刀切小开口时，避免触摸蛋黄。
3. 通过移液器将具有三粒大小（100、200 和 500 nm）的不同质量（0.1、0.2 和 0.3 毫克）微塑料的控制溶液（无 MP）和暴露溶液添加到鸡蛋中。同时，用1mL注射器加入1滴青霉素和1滴链霉素。
4. 用消毒膜盖住蛋壳的开口（第 1.6 步）。
5. 根据第2.1-2.4步，治疗所有受精卵。
6. 将移植的胚胎放入湿度为 60% 的 38°C 孵化器中，以备不时之需。在这个实验中，使用±30°的卵子旋转角度。每小时转一次鸡蛋。
   注：转移应尽可能快，这需要在早期阶段进行更多的实践。

3. 样品收集

1. 经过七天的培养，从蛋黄中取出肉眼观察到的发育良好的胚胎，然后用磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗。
2. 用吸水纸干燥清洁胚胎外的剩余溶液，并在干净的培养皿中称重。
3. 打开整个胸腔，用针鼻钳将肝脏和心脏从内脏中分离出来，并在清理后立即放入 1.5 mL 离心机管中。
4. 快速记录电子天平上的重量并计算肝功能指标（HIS = 肝脏重量/体重 x 100）。测量胸骨和身体的长度。
5. 基于上述指标，评估议员对胚胎发育的影响。
   注：这里的胚胎质量是指蛋黄去除的质量。

4. 数据分析

1. 以平均±标准误差 （SEM） 的形式报告实验数据。
2. 使用方差的单因子分析来比较多个样本组的方法。显著差值为 α = 0.05。

Representative Results

在实验数据分析中，比较了湿重、体长、胸骨长度以及对照组与6个实验组肝病指数的变化，从宏观角度测量和反映了胚胎的生长发育。我们在每组中检测到六个正常的胚胎。每个胚胎都达到了所需的汉堡和汉密尔顿（HH）阶段。

在 图1中，我们把预孵化的受精卵含量转移到半球蛋壳中，并把它们放入孵化器中。然后，我们记录了胚胎在潜伏期中期的发育三天。 如图2所示，A-A2是对照组，B-B2是一个治疗组。从宏观胚胎发育的角度来看，胚胎发育正常，没有微塑料的不良影响。

表1 和 表2 是湿重、体长和胸骨在接触一周后胚胎的±平均SEM。表显示，湿的体重和身体长度在不同的暴露组显著变化。治疗组的体重和身体长度为0.1毫克、0.3毫克、100纳米和500纳米，略有下降。体重和身体长度0.2毫克的200纳米微塑料处理组略有增加（P<0.05）。

肝病学指数（HIS）显示了肝脏在胚胎中的比例，这是判断肝脏发育程度的重要标志。此外，HSI在肝细胞膜损伤和炎症渗透的发病机制中起着重要作用。如图 3 和 图4所示，与对照组相比，整个治疗组的肝脏比例在接触微塑料后显著增加。然而，0.2毫克和0.3毫克的100纳米 MP 治疗组和对照组之间没有显著差异。

图1：没有壳的孵化蛋。请点击这里查看这个数字的较大版本。

图2：在没有蛋壳的孵化中阶段，6日、7日、8日胚胎发育。 绿色箭头指向眼睛：蓝色箭头指向四肢。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3：接触议员（nm）7天后，胚胎肝病指数。 控制组和治疗组之间的显著差异由 * P < 0.05 表示。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4：接触议员（μm）7天后胚胎肝病学指数。 控制组和治疗组之间的显著差异由 * P < 0.05 表示。 请单击此处查看此图的较大版本。

议员待遇	重量 （g）	长度（厘米）	斯特纳姆长度
控制	2.509±0.324	5.425±0.477	1.025±0.094
100纳米	1.812±0.155*	4.632±0.315*	0.950±0.152
200 纳米	2.272±0.368	5.297±0.268	1.025±0.076
500纳米	1.785±0.127*	4.892±0.154*	1.017±0.082

表1：接触 MPS （nm） 7 天后，胚胎的湿重、体长和胸骨长度

治疗	重量 （g）	长度（厘米）	斯特纳姆长度
控制	2.161±0.166	5.23±0.26	1.10±0.04
0.1毫克	1.960±0.338*	4.82±0.75*	1.04±0.04
0.2毫克	2.410±0.366*	5.25±0.26	1.07±0.10
0.3毫克	1.901±0.759	4.95±0.15*	1.02±0.09

表2：接触 MPS （μm） 7 天后，胚胎的湿重、体长和胸骨长度。 与对照组相比，* 表示 P < 0.05，** 表示 P < 0.01。

Discussion

本文通过检测基本发育指标，为评估胚胎发育提供了有效的实验方案。然而，这个实验还是有一些局限性的。

首先，由于无壳孵化，孵化后期胚胎的死亡率较高。在实验过程中，有人为的无法控制的因素，如正常蛋白质比的破坏。我们限制胚胎的暴露时间，以确保实验的准确性。胚胎毒性的研究只能在胚胎发育的早期和中期进行。其次，对胚胎发育的议员们的研究只在基本形态分析层面进行。因此，结论相对简单，可能存在缺陷。同时，在实验过程中对实验条件和操作的要求也比较高。因此，一些值得注意的要点如下：

由于受精卵表面有害致病微生物，在准备工作中对受精卵进行消毒和消毒非常重要。如果消毒，微生物可能会在孵化过程中侵入受精的卵子，导致幼崽胚胎死亡。即使转移成功，死亡率也会更高。因此，应做好消毒和灭菌工作，以降低实验死亡率。

当鸟类孵化卵子时，它们通常会改变卵子的位置，保持空气循环，以保持卵子的恒温和胎儿的正确位置。这个实验用薄膜密封蛋壳。如果蛋旋转的角度太大，那么蛋清就会流出来。如果太小，则胚胎膜和蛋壳膜之间可能会粘附，导致胚胎死亡。因此，根据实际情况设置旋转角度。

在卵胚的转移过程中，先将受精的卵子水平放置，然后切入蛋壳中间。这样，一小部分蛋清很容易流出，从而破坏了厚薄蛋清的正常比例和分布。这使得蛋黄，本应在顶部，靠在一边，导致胚胎死亡。因此，注意使所有的蛋清流入新的半球蛋壳，以确保转移过程中的正常比例和分布。

成功转移后，实验者必须小心，不要直接掉落液体。液体应依靠蛋壳壁，使其在添加污染物和抗生素时缓慢流动。

除上述四点外，严格控制孵化条件。协调温度、湿度和通风的平衡。保持孵化实验室安静和黑暗，以达到最佳的孵化环境。

最后，这个实验为研究环境污染物对胚胎发育的影响提供了基本方案。在胚胎生长发育研究中还有其他类型的指标，包括血管发育、氧化应激和细胞损伤。上述实验只是从形态学上对胚胎发育的简单宏观评价。最后，未来改进的研究思路和方案将为胚胎生长发育的毒理学研究提供一条新方法。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi sample tissue grinder	Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	Tissuelyser-24	Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature
Electronic balance	OHAUS corporation	PR Series Precision	Used for weighing
Fertilized quail eggs	Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd.		Quail eggs for hatching without shell
Fluorescent polypropylene particles	Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd.		Types of plastics selected for the experiment
Incubator	Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd.	264 pc	Provide a place for embryo growth and development
Nanometer-scale polystyrene microspheres	Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd.	100 nm, 200 nm, 500 nm	Types of plastics selected for the experiment
Steel ruler	Deli Group	20 cm	Used to measure  length
Vertical heating pressure steam sterilizer	Shanghai Shenan Medical Instrument Factory	LDZM-80KCS-II	Sterilize the experimental articles