Summary
本論文では、マイクロプラスチックなどの粒子汚染物質の毒物学的研究に卵殻を用いずに孵化する方法を紹介する。
Abstract
マイクロプラスチックは、動物組織や臓器の取り込みと転座のために動物に大きな健康上の脅威をもたらす新興の世界的な汚染物質タイプです。小プラスチックが鳥の胚の発達に及ぼす生態毒性学的影響は知られていない。鳥の卵は完全な発達と栄養システムであり、胚の発達全体が卵殻で起こります。したがって、マイクロプラスチックなどの汚染物質のストレス下での鳥の胚発生の直接的な記録は、従来の孵化における不透明な卵殻によって非常に制限される。本研究では、マイクロプラスチックがウズラ胚の発達に及ぼす影響を、卵殻を使わずに孵化することによって視覚的に監視した。主なステップは、受精卵の洗浄および消毒、暴露前のインキュベーション、暴露後の短期インキュベーション、およびサンプル抽出を含む。結果は、対照群と比較して、マイクロプラスチック暴露群の湿重量および体長が統計的差を示し、露出群全体の肝臓割合が有意に増加したことを示す。また、温度、湿度、卵の回転角度など、インキュベーションに影響を与える外部要因を評価しました。この実験方法は、マイクロプラスチックの生態毒性学に関する貴重な情報と、胚の発達に及ぼす汚染物質の悪影響を研究する新しい方法を提供する。
Introduction
2015年のプラスチック廃棄物の生産量は約6300山で、その10分の1はリサイクルされ、残りは焼失または地下に埋もれた。2050年までに約12,000山のプラスチック廃棄物が地下に埋もれ、2050年までに地下に埋もれ、と推定されている。国際社会がプラスチック廃棄物に注目して、トンプソンは2004年2月にマイクロプラスチックの概念を最初に提案した。マイクロプラスチック(MP)とは、粒子径が5mm未満の小さな粒子プラスチックを指します。現在、研究者たちは、様々な大陸、大西洋諸島、内陸湖、北極、深海の生息地3、4、5、6、7の海岸線におけるMPのユビキタスな存在を検出しました。したがって、より多くの研究者がMPの環境上の危険を研究し始めています。
生物は環境中でMPを摂取することができます。世界中の233の海洋生物(100%のカメ種、36%のアザラシ種、59%のクジラ種、59%の海鳥種、92種類の海魚、6種類の無脊椎動物を含む)の消化管でMPが見つかりました8。さらに、MPは生物の消化器系をブロックし、蓄積し、彼らのボビー9に移動する可能性があります。MPは食物連鎖を介して移動することができ、その摂取量は生息地、成長段階、摂食習慣、食料源10の変化と異なることを発見した。一部の研究者は、海鳥11の滴にMPの存在を報告しました, これは海鳥がMPのキャリアとして機能することを意味します.さらに、MPの摂取は、いくつかの生物の健康に影響を与える可能性があります。例えば、MPは消化管に絡み合い、したがって鯨類12の死亡率を増加させることができる。
MPだけでも、他の汚染物質との生物に対する共同毒性効果と同様に、生物に毒性効果があります。プラスチックデブリの環境関連濃度の摂取は、成魚13の内分泌系機能を乱す可能性がある。マイクロプラスチックのサイズは、生物による取り込みと蓄積に影響を与える重要な要因の1つです 14,15.小型プラスチック、特にナノサイズのプラスチックは、毒性の高い細胞や生物との相互作用を起こしやすい16,17,18,19.ナノ粒子サイズマイクロプラスチックが生物に及ぼす有害な影響は現在の研究レベルを超えていますが、数マイクロメートル未満のマイクロプラスチック、特に環境中のサブミクロン/ナノプラスチックの検出と定量は依然として大きな課題です。さらに、ナノプラスチックは胚にもいくつかの影響を及ぼす。ポリスチレンは、タンパク質および遺伝子プロファイル20を調節することによってウニ胚の発達を損なう可能性がある。
MPが生物に及ぼす潜在的な影響を調べるには、この研究を実施しました。鳥の胚とヒト胚の類似性のために、それらは通常、血管新生および抗血管新生、組織工学、生体材料インプラント、および脳腫瘍22、23、24を含む発生生物学研究21で使用される。鳥の胚は、低コスト、短い培養サイクルと簡単な操作25、26の利点を有する。そこで、今回の実験動物として、短い成長サイクルを有するウズラ胚を選んだ。同時に、卵殻を含まない孵化技術を用いて、胚発生段階でMPに曝露されたウズラ胚の形態学的変化を直接観察することができる。使用した実験材料は、ポリプロピレン(PP)およびポリスチレン(PS)であった。PPおよびPS27は、世界中の堆積物および水域で得られるポリマータイプの割合が最も高いため、捕獲された海洋生物から抽出される最も一般的なポリマータイプはエチレンおよびプロピレン28である。この実験プロトコルは、MPに曝露されたウズラ胚に対するMPの毒物学的影響を視覚的に評価するための全プロセスを記述する。この方法を簡単に拡張して、他の排卵動物の胚発生に対する他の汚染物質の毒性を調べることができます。
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Protocol
1. 暴露前の準備
- 同じ日に生まれた受精ウズラの卵を選択して、暴露試験を行います。
- 同じような重みを持つウズラの卵を選択します。各受精ウズラの卵は約10〜12gです。
- 外的な便および他の破片からすべての受精したウズラの卵を完全にきれいにしなさい。
- 各孵化前の受精ウズラの卵と使用する卵(同様の殻の形をした卵、特に卵の先端を選ぶ)を抗生物質溶液(ペニシリンとストレプトマイシン、1:1000、室温)で殺菌する。75%エタノールでインキュベーターを殺菌します。
- 歯のドリルの鈍い端で卵を開き、卵殻を先端に残してさらに使用します。受精卵を移す前に、卵の内容物を注ぎ出します。これは、卵殻の水分を保つためにです。卵の開口径は約3cmであった。
注:ウズラ胚の損傷を減らすには、歯のドリルを使用して卵の鈍い端を開き、できるだけ亀裂を滑らかにします。 - 滅菌後、受精したウズラの卵を38°Cインキュベーターに入れ、湿度は60%で24~48時間とします。ウズラの卵の鈍い端が上向きであることを確認してください。
- 受精したウズラの卵の孵化の間に、殺菌鍋の後続の実験で必要な用具を殺菌する。これらのツールには、ラップ、ビーカー、滅菌水、ピペットチップ、外科用ストレートハサミ、ピンセット、スプーンが含まれます。
メモ:高温滅菌の問題を回避するために、温度許容度の高いフィルムを使用してください。
2. ウズラの卵を殻なしで孵化させる
- 孵化前の受精ウズラの卵をインキュベーターからクリーンベンチに移し、容器の上に平らにして約1〜2分間安定させます。
- ハサミ(12.5 cm外科ストレートハサミ)を使用して、孵化前の受精ウズラの卵の中心軸に小さな穴(直径3mm)を突き刺し、1〜2cmの小さな開口部を切断します。慎重にカット卵殻に受精ウズラの卵子と黄身を転送します。
注意:小さな開口部をはさみで切るときは、ウズラの卵の黄身に触れないようにしてください。 - 3つの粒度(100、200、および500 nm)のマイクロプラスチックの異なる質量(0.1、0.2、および0.3 mg)の対照溶液(MPなし)と露出した溶液をピペットで卵の内容物に加えます。同時に、ペニシリン1滴、ストレプトマイシン1滴を1mLシリンジで加えます。
- 卵殻の開口部を殺菌フィルムで覆う(ステップ1.6)。
- ステップ2.1-2.4によると、すべての受精ウズラの卵を治療します。
- 移されたウズラ胚を、必要な期間湿度60%の38°Cインキュベーターに入れる。この実験では、卵の回転角度±30°を使用します。卵を1時間に1回回します。
注: 転送はできるだけ速くする必要があり、早い段階でより多くの練習が必要です。
3. サンプルコレクション
- 7日間培養した後、裸眼で観察されたよく発達した胚を黄身から取り出し、リン酸緩衝溶液(PBS)で洗浄する。
- 洗浄した胚の外に余剰溶液を吸収性紙で乾燥させ、きれいなペトリ皿で重量を量る。
- 胸腔全体を開き、肝臓と心臓を針鼻ペンチで内臓から分離し、クリアした直後に1.5 mL遠心分離管に入れます。
- 迅速に電子バランスに体重を記録し、肝体系指数(HIS =肝体重/体重x 100)を計算します。胸骨と体の長さを測定します。
- 上記の指標に基づいて、胚発生に対するMPの影響を評価する。
注:ここでの胚の品質は、黄身除去の品質を指します。
4. データ分析
- 実験データを平均±標準誤差(SEM)の形式で報告する。
- 分散の単一因子分析を使用して、複数のサンプルグループの平均を比較します。有意差値はα= 0.05であった。
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Representative Results
実験データの解析では、湿重量、体長、胸骨長、対照群と6つの実験群との間の肝細胞学的指標の変化を比較し、ウズラ胚の成長と発達をマクロの観点から測定し、反映した。我々は、各群で6つの正常なウズラ胚を検出した。各胚は必要なハンバーガーとハミルトン(HH)の段階に達した。
図1では、孵化前の受精ウズラの卵の内容物を半球卵殻に移し、インキュベーターに入れた。その後、インキュベーションの中間期における胚の発達を3日間記録した。図2に示すように、A-A2は対照群であり、B-B2は1つの治療群である。巨視的な胚の発達の観点から、胚はマイクロプラスチックの悪影響を及ぼさずに正常に発達した。
表1 および 表2 は、1週間の暴露後のウズラ胚の湿重量、体長、胸骨長の平均±SEMである。表は、湿潤重量と体長が異なる露光群で有意に変化することを示す。0.1mg、0.3mg、100nm、および500nmのMPで治療されたグループの体重および体長はわずかに減少した。体重および200 nmマイクロプラスチック処理群の0.2mgの体長はわずかに増加した(P<0.05)。
肝体系指数(HIS)は、ウズラ胚における肝臓の割合を示し、これは肝臓の発達の程度を判断する重要な兆候である。さらに、HSIは肝細胞膜損傷および炎症性浸潤の病因において重要な役割を果たす。 図3 および 図4に示すように、対照群と比較して、マイクロプラスチックへの暴露後に治療群全体における肝臓の割合が有意に増加した。しかし、100nm MPs治療群と対照群の0.2mgと0.3mgの間に有意な差はなかった。
図1:ウズラの卵を殻なしで孵化させる。この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。
図2:卵殻を使わずに孵化した6日目、7日目、8日目のウズラの胚発生 緑色の矢印は目を指し示します。青い矢印が手足を指しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:7日間のMP(nm)への曝露後のウズラ胚の肝細胞学的指標。 対照群と治療群の有意差は、* P<0.05で示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:7日間のMP(μm)曝露後のウズラ胚の肝細胞学的指標 対照群と治療群の有意差は、* P<0.05で示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| MP治療 | 重量 (g) | 長さ(cm) | 胸骨の長さ |
| コントロール | 2.509±0.324 | 5.425±0.477 | 1.025±0.094 |
| 100 nm | 1.812±0.155* | 4.632±0.315* | 0.950±0.152 |
| 200 nm | 2.272±0.368 | 5.297±0.268 | 1.025±0.076 |
| 500 nm | 1.785±0.127* | 4.892±0.154* | 1.017±0.082 |
表1:7日間のMP(nm)への暴露後のウズラ胚の湿重量、体長および胸骨の長さ
| 処遇 | 重量 (g) | 長さ(cm) | 胸骨の長さ |
| コントロール | 2.161±0.166 | 5.23±0.26 | 1.10±0.04 |
| 0.1 mg | 1.960±0.338* | 4.82±0.75* | 1.04±0.04 |
| 0.2 mg | 2.410±0.366* | 5.25±0.26 | 1.07±0.10 |
| 0.3 mg | 1.901±0.759 | 4.95±0.15* | 1.02±0.09 |
表2:7日間のMP(μm)に曝された後のウズラ胚の湿重量、体長、胸骨の長さ。 対照群と比較して、* は P < 0.05 を示し、** は P < 0.01 を示します。
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Discussion
本論文は、基礎的な開発指標を検出することによってウズラ胚の発生を評価するための効果的な実験スキームを提供する。しかし、この実験にはまだいくつかの制限があります。
まず、殻のない孵化のために、孵化の後の段階におけるウズラ胚の死亡率が高くなる。実験過程での正常タンパク質比の破壊など、人為的に制御不能な因子があります。実験の正確性を確保するために胚の暴露時間を制限した。胚毒性の研究は、胚発生の初期段階と中間段階でのみ起こり得る。第二に、ウズラ胚発生に関するMPの研究は、基本的な形態学的分析レベルでのみ行われる。したがって、結論は比較的単純であり、欠陥が存在する可能性があります。同時に、実験条件および動作の要件は、この実験の過程で比較的高い。したがって、注目すべき点をいくつか次に示します。
受精したウズラの卵の表面に有害な病原性微生物のために準備作業で受精したウズラの卵を消毒し、滅菌することは非常に重要です。もし、感染した場合、微生物はインキュベーション中に受精したウズラの卵に侵入し、ウズラ胚の死をもたらす。転写が成功しても死亡率は高くなります。したがって、実験死亡率を減らすために、消毒と殺菌で良い仕事をする必要があります。
鳥が卵を孵化させると、卵の位置を変え、卵の温度を一定に保ち、胎児の正しい位置を維持するために空気循環を保つことが多い。この実験では、フィルムを使って卵殻を密封した。卵の回転角度が大きすぎると、卵白が流出します。小さすぎると、胚膜と卵殻フィルムとの密着が生じ、胚が死んでしまう可能性がある。そのため、実際の状況に応じて回転角度を設定します。
ウズラ胚の移動中に、受精前のウズラの卵は水平に配置され、卵殻の真ん中で切断される。このようにして、卵白の小さな部分が容易に流出し、厚くて薄い卵白の正常な割合と分布を破壊する。これにより、上にあったはずの黄身が片側に傾き、胚が死ぬ。したがって、新しい半球卵殻に全ての卵白を流し込み、転写時の正常な割合と分布を確保するように注意してください。
転送が成功した後、実験者は液体を直接落とさないように注意する必要があります。液体は、汚染物質や抗生物質の添加中にゆっくりと流れるように卵殻壁に依存する必要があります。
上記の4点に加え、インキュベーション条件を厳しく制御する。温度、湿度、換気のバランスを調整します。インキュベーションラボを静かに保ち、最高のインキュベーション環境を実現します。
結論として、この実験は、環境汚染物質がウズラ胚の発達に及ぼす影響を研究するための基本的なプロトコルを提供する。また、胚の成長と発達の研究には、血管の発達、酸化ストレス、細胞損傷など、他のタイプの指標もあります。上記実験は、形態学的側面からの胚発生の単純な巨視的評価に過ぎない。最後に、将来の研究アイデアとプロトコルの改善は、胚の成長と発達の毒物学的研究のための新しい方法を提供する可能性があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。すべての著者は、この論文の仕事に影響を与えるように見える既知の競合する金銭的利益や個人的な関係を持っていないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、新疆ウイグル自治区の主要な研究開発プロジェクト(2017B03014、2017B03014-1、2017B03014-2、2017B03014-3)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi sample tissue grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | Tissuelyser-24 | Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature |
| Electronic balance | OHAUS corporation | PR Series Precision | Used for weighing |
| Fertilized quail eggs | Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd. | Quail eggs for hatching without shell | |
| Fluorescent polypropylene particles | Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd. | Types of plastics selected for the experiment | |
| Incubator | Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd. | 264 pc | Provide a place for embryo growth and development |
| Nanometer-scale polystyrene microspheres | Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. | 100 nm, 200 nm, 500 nm | Types of plastics selected for the experiment |
| Steel ruler | Deli Group | 20 cm | Used to measure length |
| Vertical heating pressure steam sterilizer | Shanghai Shenan Medical Instrument Factory | LDZM-80KCS-II | Sterilize the experimental articles |
References
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