Summary
Dette papir introducerer en metode til udklækning uden at bruge en æggeskal til toksikologiske undersøgelser af partikelforurenende stoffer såsom mikroplast.
Abstract
Mikroplast er en ny global forurenende type, der udgør en stor sundhedstrussel for dyr på grund af deres optagelse og omplantning i animalsk væv og organer. Økotoksikologiske virkninger af mikroplast på udviklingen af fugleembryoner kendes ikke. Fugleægget er et komplet udviklings- og ernæringssystem, og hele embryoudviklingen forekommer i æggeskallen. Derfor er en direkte registrering af udviklingen af fugleembryoner under stress af forurenende stoffer som mikroplast stærkt begrænset af den uigennemsigtige æggeskal i traditionel udklækning. I denne undersøgelse blev mikroplasts indvirkning på udviklingen af vagtlers embryoner visuelt overvåget ved udklækning uden en æggeskal. De vigtigste trin omfatter rengøring og desinfektion af befrugtede æg, inkubation før eksponering, kortvarig inkubation efter eksponering og prøveekstraktion. Resultaterne viser, at i forhold til kontrolgruppen viste den våde vægt og kropslængde i den mikroplasteksponerede gruppe en statistisk forskel, og leverandelen af hele den eksponerede gruppe steg betydeligt. Derudover evaluerede vi eksterne faktorer, der påvirker inkubationen: temperatur, fugtighed, ægrotationsvinkel og andre forhold. Denne eksperimentelle metode giver værdifulde oplysninger om mikroplasts økotoksikologi og en ny måde at undersøge de negative virkninger af forurenende stoffer på udviklingen af embryoner.
Introduction
Produktionen af plastaffald var omkring 6300 Mt i 2015, hvoraf en tiendedel blev genanvendt, og resten blev brændt eller begravet under jorden. Det anslås, at omkring 12.000 Mt plastaffald vil blive begravet under jorden i 20501. Med det internationale samfunds opmærksomhed på plastaffald foreslog Thompson først begrebet mikroplast i 20042. Mikroplast (parlamentsmedlemmer) henviser til små partikelplast med en partikeldiameter på under 5 mm. På nuværende tidspunkt har forskere opdaget den allestedsnærværende tilstedeværelse af parlamentsmedlemmer i kystlinjen på forskellige kontinenter, Atlanterhavsøerne, indre søer, Arktis og dybhavshabitater3,4,5,6,7. Derfor er flere forskere begyndt at studere de miljømæssige farer for parlamentsmedlemmer.
Organismer kunne indtage parlamentsmedlemmer i miljøet. Parlamentsmedlemmer blev fundet i fordøjelseskanalen af 233 marine organismer på verdensplan (herunder 100% skildpadde arter, 36% sæl arter, 59% hvalarter, 59% havfugle arter, 92 slags havfisk, og 6 slags hvirvelløse dyr)8. Desuden kan parlamentsmedlemmer blokere organismernes fordøjelsessystem, akkumulere og migrere i deres bobies9. Det er blevet konstateret, at parlamentsmedlemmer kan overføres via fødekæden, og deres indtag adskiller sig med ændringer i habitat, vækststadium, fodringsvaner og fødekilder10. Nogle forskere rapporterede eksistensen af parlamentsmedlemmer i ekskrementer af havfugle11, hvilket betyder, at havfugle fungerer som bærer af parlamentsmedlemmer. Desuden kan indtagelse af parlamentsmedlemmer påvirke sundheden for nogle organismer. For eksempel kan parlamentsmedlemmer være viklet ind i mave-tarmkanalen og dermed øge dødeligheden af hvaler12.
Parlamentsmedlemmer alene har toksiske virkninger på organismer samt fælles toksiske virkninger på organismer med andre forurenende stoffer. Indtagelse af miljørelaterede koncentrationer af plastaffald kan forstyrre voksenfisks endokrine systemfunktion13. Størrelsen af mikroplast er en af de vigtige faktorer, der påvirker deres optagelse og akkumulering af organismer14,15. Den lille størrelse plast, især nanosize plast, er tilbøjelige til interaktion med celler og organismer med højtoksicitet 16,17,18,19. Selv om de skadelige virkninger af mikroplast i nanopartikelstørrelse på organismer overstiger det nuværende forskningsniveau, er påvisning og kvantificering af mikroplast med størrelser mindre end flere mikrometer, især submicron/nanoplast i miljøet, stadig en stor udfordring. Derudover har nanoplast også en vis indvirkning på embryoner. Polystyren kan skade udviklingen af søpindsvinembryoner ved at regulere protein- og genprofiler20.
For at undersøge parlamentsmedlemmernes potentielle indvirkning på organismer gennemførte vi denne undersøgelse. På grund af ligheden mellem fuglefostre og menneskelige embryoner bruges de normalt i udviklingsbiologisk forskning21, herunder angiogenese og antiangiogenese, vævsteknik, biomaterialeimplantat og hjernetumorer22,23,24. Fuglefostre har fordelene ved lave omkostninger, en kort kulturcyklus og nem betjening25,26. Derfor valgte vi vagtelefostre med en kort vækstcyklus som forsøgsdyr i denne undersøgelse. Samtidig kan vi direkte observere de morfologiske ændringer af vagte embryoner udsat for parlamentsmedlemmer i embryonale udviklingsfasen ved hjælp af en æggeskal-fri rugeteknologi. De anvendte forsøgsmaterialer var polypropylen (PP) og polystyren (PS). Da PP og PS27 tegner sig for den største andel af polymertyper, der er opnået i sedimenter og vandområder på verdensplan, er de mest almindelige polymertyper, der udvindes fra optagne marine organismer, ethylen og propylen28. Denne forsøgsprotokol beskriver hele processen for visuel vurdering af parlamentsmedlemmers toksikologiske virkninger på vagte embryoner, der udsættes for parlamentsmedlemmer. Vi kan nemt udvide denne metode til at undersøge andre forurenende stoffers toksicitet til udvikling af embryoner fra andre fåredyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Præparat før eksponering
- Vælg befrugtede vagtelæg, der er født samme dag til eksponeringstesten.
- Vælg vagtelæg med lignende vægte. Hvert befrugtet vagtelæg er ca. 10-12 g.
- Rengør alle befrugtede vagtelæg fra eksterne afføring og andet snavs.
- Steriliser hvert forklækket befrugtet vagtelæg og de æg, der skal bruges (Vælg æg med lignende skalform, især spidsen af ægget) med en antibiotisk opløsning (penicillin og streptomycin, 1:1000, stuetemperatur). Steriliser inkubatoren med 75% ethanol.
- Åbn æggene med den stumpe ende af en tandboremaskine, og lad æggeskallen stå på spidsen til videre brug. Før du overfører de befrugtede æg, hældes æggenes indhold ud. Dette er for at holde æggeskallens fugt. Æggets åbningsdiameter var ca. 3 cm.
BEMÆRK: For at reducere skaderne på vagtebryoet skal du bruge en tandboremaskine til at åbne den stumpe ende af ægget og gøre revnen så glat som muligt. - Efter sterilisering anbringes de befrugtede vagtelæg i en 38 °C inkubator med 60% fugtighed i 24-48 timer. Sørg for, at den stumpe ende af vagtelægget vender op.
- Under inkubationen af befrugtede vagtelæg steriliseres de nødvendige værktøjer i de efterfølgende eksperimenter i en steriliseringspotte. Disse værktøjer omfatter plastfolie, et bægerglas, sterilt vand, pipettespidser, kirurgisk lige saks, pincet og en ske.
BEMÆRK: Brug en film med en temperaturtolerance, der er høj nok til at undgå problemer med højtemperatursterilisering.
2. Udklækning af vagtelæg uden skal
- Overfør de forklækkede befrugtede vagtelæg fra inkubatoren til en ren bænk og læg dem fladt på beholderen for at stabilisere dem i ca. 1-2 minutter.
- Brug en saks (12,5 cm kirurgisk lige saks) til at stikke et lille hul (diameter 3 mm) i den centrale akse af de forklækkede befrugtede vagtelæg og til at skære 1-2 cm lille åbning. Overfør forsigtigt æggehvide og æggeblomme af de befrugtede vagtelæg til den afskårne æggeskal.
BEMÆRK: Når du skærer en lille åbning med en saks, skal du undgå at røre ved æggeblommen af vagtelæg. - Kontrolopløsningen (uden parlamentsmedlemmer) og den eksponerede opløsning af forskellige masser (0,1, 0,2 og 0,3 mg) mikroplast med tre partikelstørrelser (100, 200 og 500 nm) til ægindholdet med pipette. Samtidig tilsættes 1 dråbe penicillin og 1 dråbe streptomycin med en 1 ml sprøjte.
- Dæk åbningen af æggeskallen med den steriliserede film (trin 1.6).
- Ifølge trin 2.1-2.4 skal du behandle alle de befrugtede vagtelæg.
- De overførte vagte embryoner anbringes i 38 °C-inkubatoren med en fugtighed på 60 % i den nødvendige periode. I dette eksperiment skal du bruge en ægrotationsvinkel på ±30°. Vend æggene en gang i timen.
BEMÆRK: Overførslen skal ske så hurtigt som muligt, hvilket kræver mere øvelse på et tidligt tidspunkt.
3. Prøvesamling
- Efter syv dages kultur fjernes veludviklede embryoner, der observeres med det blotte øje, fra æggeblommen og vaskes med fosfatbufferopløsning (PBS).
- Overskudsopløsningen tørres uden for det rensede embryo med absorberende papir og vejes i en ren petriskål.
- Åbn hele brysthulen, adskil leveren og hjertet fra indvoldene med nåle-næse tænger, og læg i 1,5 mL centrifuge rør umiddelbart efter rydning.
- Optag hurtigt vægten på en elektronisk balance og beregn det hepatosomatiske indeks (HIS = levervægt / kropsvægt x 100). Mål længden af brystbenet og kroppen.
- På grundlag af ovenstående indikatorer skal man evaluere parlamentsmedlemmernes indvirkning på embryonal udvikling.
BEMÆRK: Embryo kvalitet her henviser til kvaliteten af æggeblomme fjernelse.
4. Dataanalyse
- Anmeld forsøgsdataene i form af middelværdi ± standardfejl (SEM).
- Brug enkeltfaktoranalyse af varians til at sammenligne midlerne til flere grupper af prøver. Den betydelige forskelsværdi var α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til analyse af eksperimentelle data sammenlignede vi vådvægt, kropslængde, brystbenslængde og ændringen af hepatosomatisk indeks mellem kontrolgruppen og de 6 eksperimentelle grupper og målte og reflekterede vagte embryonernes vækst og udvikling fra et makroperspektiv. Vi fandt seks normale vagtegebryoner i hver gruppe. Hvert foster nåede den krævede Hamburger og Hamilton (HH) fase.
I figur 1overførte vi det præklækkede befrugtede vagtelægindhold til de halvkugleformede æggeskaller og satte dem i inkubatoren. Derefter registrerede vi udviklingen af embryoner i den midterste inkubationsperiode i tre dage. Som vist i figur 2er A-A2 kontrolgruppen, og B-B2 er en behandlingsgruppe. Set ud fra makroskopisk embryoudvikling udviklede embryonerne sig normalt uden de negative virkninger af mikroplast.
Tabel 1 og tabel 2 er gennemsnittet ± SEM af vådvægt, kropslængde og brystbenslængde af vagtelæg efter eksponering på en uge. Tabellerne viser, at den våde vægt og kropslængde ændrer sig betydeligt i forskellige eksponeringsgrupper. Vægten og kropslængden af de grupper, der blev behandlet med 0,1 mg, 0,3 mg, 100 nm og 500 nm parlamentsmedlemmer, faldt en smule. Kropsvægten og kropslængden på 0,2 mg af 200 nm mikroplast behandlede grupper steg en smule (P < 0,05).
Hepatosomatic index (HIS) viser andelen af lever i vagtelembryoet, hvilket er et vigtigt tegn til at bedømme graden af leverudvikling. Desuden spiller HSI en vigtig rolle i patogenese af levercellemembranskade og inflammatorisk infiltration. Som vist i figur 3 og figur 4steg andelen af lever i hele behandlingsgruppen betydeligt efter eksponering for mikroplast sammenlignet med kontrolgruppen. Der var imidlertid ingen signifikant forskel mellem de 0,2 mg og 0,3 mg 100 nm parlamentsmedlemmer behandlingsgrupper og kontrolgruppen.
Figur 1: Ruge vagtelæg uden skal. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Embryoudviklingen af vagtler den 6., 7. og 8. dag i den midterste fase af udklækning uden æggeskal. Den grønne pil peger på øjnene; den blå pil peger på lemmerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:Hepatosomatisk indeks over vagtelægoner efter eksponering for parlamentsmedlemmer (nm) i 7 dage. Signifikante forskelle mellem kontrol- og behandlingsgrupper er angivet med * P < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:Hepatosomatisk indeks over vagtelige embryoner efter eksponering for parlamentsmedlemmer (μm) i 7 dage. Signifikante forskelle mellem kontrol- og behandlingsgrupper er angivet med * P < 0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Behandling af parlamentsmedlemmer | Vægt (g) | Længde (cm) | Brystbenslængde |
| Kontrol | 2.509±0.324 | 5.425±0.477 | 1.025±0.094 |
| 100 nm | 1.812±0.155* | 4.632±0.315* | 0,950±0,152 |
| 200 nm | 2.272±0.368 | 5.297±0.268 | 1.025±0.076 |
| 500 nm | 1.785±0.127* | 4.892±0.154* | 1.017±0.082 |
Tabel 1: Vådvægt, kropslængde og brystbenslængde af vagteobryoner efter udsættelse for parlamentsmedlemmer (nm) i 7 dage
| Behandling | Vægt (g) | Længde (cm) | Brystbenslængde |
| Kontrol | 2.161±0.166 | 5.23±0.26 | 1.10±0.04 |
| 0,1 mg | 1.960±0.338* | 4.82±0.75* | 1.04±0.04 |
| 0,2 mg | 2.410±0.366* | 5.25±0.26 | 1.07±0.10 |
| 0,3 mg | 1.901±0.759 | 4.95±0.15* | 1.02±0.09 |
Tabel 2: Vådvægt, kropslængde og brystbenslængde af vagteobryoner efter udsættelse for parlamentsmedlemmer (μm) i 7 dage. Sammenlignet med kontrolgruppen, * angiver P < 0,05, ** angiver P < 0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette dokument giver en effektiv eksperimentel ordning til evaluering af vagtler embryon udvikling ved at opdage de grundlæggende udvikling indekser. Der er dog stadig nogle begrænsninger for dette eksperiment.
For det første er dødeligheden af vagte embryoner i det senere stadium af udklækning højere på grund af den skal-mindre udklækning. Der er kunstigt ukontrollable faktorer såsom ødelæggelsen af det normale proteinforhold i forsøgsprocessen. Vi begrænsede eksponeringstiden for embryoner for at sikre eksperimentets nøjagtighed. Forskning i embryotoksicitet kan kun forekomme i de tidlige og midterste stadier af embryoudvikling. For det andet forekommer undersøgelsen af parlamentsmedlemmer om udvikling af vagtler kun på det grundlæggende morfologiske analyseniveau. Konklusionerne er således relativt enkle, og der kan være mangler. Samtidig er kravene til forsøgsbetingelser og drift relativt høje i processen med dette eksperiment. Derfor er nogle bemærkelsesværdige punkter opført som følger:
Det er meget vigtigt at desinficere og sterilisere befrugtede vagtelæg i det forberedende arbejde på grund af de skadelige patogene mikroorganismer på overfladen af befrugtede vagtelæg. Hvis mikroberne desinficeres, kan de trænge ind i de befrugtede vagtelæg under inkubationen, hvilket resulterer i vagteulembrystrenes død. Selv hvis overførslen lykkes, vil dødeligheden være højere. Derfor bør der gøres et godt stykke arbejde med desinfektion og sterilisering for at reducere den eksperimentelle dødelighed.
Når fugle klækker æg, ændrer de ofte æggenes position og holder luftcirkulationen for at opretholde en konstant temperatur for æggene og den korrekte position for fosteret. Dette eksperiment brugte film til at forsegle æggeskallen. Hvis vinklen på ægrotation er for stor, vil æggehvide strømme ud. Hvis den er for lille, kan der forekomme vedhæftning mellem embryofilmen og æggeskalfilmen, hvilket resulterer i døde embryoner. Sæt derfor rotationsvinklen i henhold til den faktiske situation.
Under overførsel af vagtelæg er de præbefrugtede vagtelæg placeret vandret og derefter skåret midt i æggeskallen. På denne måde strømmer en lille del af æggehvide let ud, hvilket ødelægger den normale andel og fordeling af den tykke og tynde æggehvide. Dette gør æggeblommen, som skulle have været på toppen, magert til den ene side, hvilket får embryoet til at dø. Sørg derfor for at få hele æggehvide til at strømme ind i den nye halvkugleformede æggeskal for at sikre den normale andel og distribution under overførslen.
Efter den vellykkede overførsel skal eksperimentatoren passe på ikke at tabe væsken direkte. Væsken skal stole på æggeskalvæggen for at få den til at flyde langsomt under tilsætning af forurenende stoffer og antibiotika.
Ud over de fire ovennævnte punkter skal inkubationsbetingelserne nøje kontrolleres. Koordiner balancen mellem temperatur, fugtighed og ventilation. Hold inkubationslaboratoriet stille og mørkt for at opnå det bedste inkubationsmiljø.
Afslutningsvis vil jeg sige, at dette eksperiment indeholder en grundlæggende protokol til undersøgelse af miljøforurenende stoffers indvirkning på udviklingen af vagtegebryoner. Der er også andre typer indikatorer i undersøgelsen af embryonal vækst og udvikling, herunder vaskulær udvikling, oxidativ stress og celleskader. Ovenstående eksperiment er kun en simpel makroskopisk evaluering af embryonal udvikling fra det morfologiske aspekt. Endelig kunne den forbedrede forskningsidé og -protokol i fremtiden udgøre en ny metode til toksikologisk undersøgelse af embryonvækst og -udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre. Alle forfattere erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende finansielle interesser eller personlige relationer, der kunne have syntes at påvirke arbejdet i dette papir.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af centrale forsknings- og udviklingsprojekter i den autonome region Xinjiang Uygur (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi sample tissue grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | Tissuelyser-24 | Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature |
| Electronic balance | OHAUS corporation | PR Series Precision | Used for weighing |
| Fertilized quail eggs | Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd. | Quail eggs for hatching without shell | |
| Fluorescent polypropylene particles | Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd. | Types of plastics selected for the experiment | |
| Incubator | Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd. | 264 pc | Provide a place for embryo growth and development |
| Nanometer-scale polystyrene microspheres | Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. | 100 nm, 200 nm, 500 nm | Types of plastics selected for the experiment |
| Steel ruler | Deli Group | 20 cm | Used to measure length |
| Vertical heating pressure steam sterilizer | Shanghai Shenan Medical Instrument Factory | LDZM-80KCS-II | Sterilize the experimental articles |
References
- Geyer, R., Jambeck, J. R., Law, K. L. Production, use, and fate of all plastics ever made. Science Advances. 3 (7), 5 (2017).
- Thompson, R. C., et al. Lost at sea: Where is all the plastic. Science. 304 (5672), 838-838 (2004).
- Barletta, M., Lima, A. R. A., Costa, M. F. Distribution, sources and consequences of nutrients, persistent organic pollutants, metals and microplastics in South American estuaries. Science of the Total Environment. 651, 1199-1218 (2019).
- Eriksson, C., Burton, H., Fitch, S., Schulz, M., vanden Hoff, J. Daily accumulation rates of marine debris on sub-Antarctic island beaches. Marine Pollution Bulletin. 66 (1-2), 199-208 (2013).
- Zhang, C. F., et al. Microplastics in offshore sediment in the Yellow Sea and East China Sea, China. Environmental Pollution. 244, 827-833 (2019).
- Obbard, R. W., et al. Global warming releases microplastic legacy frozen in Arctic Sea ice. Earths Future. 2 (6), 315-320 (2014).
- Van Cauwenberghe, L., Vanreusel, A., Mees, J., Janssen, C. R.
- Wilcox, C., Van Sebille, E., Hardesty, B. D. Threat of plastic pollution to seabirds is global, pervasive, and increasing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11899-11904 (2015).
- Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
- Ferreira, G. V. B., Barletta, M., Lima, A. R. A. Use of estuarine resources by top predator fishes. How do ecological patterns affect rates of contamination by microplastics. Science of the Total Environment. 655, 292-304 (2019).
- Provencher, J. F., Vermaire, J. C., Avery-Gomm, S., Braune, B. M., Mallory, M. L. Garbage in guano? Microplastic debris found in faecal precursors of seabirds known to ingest plastics. Science of the Total Environment. 644, 1477-1484 (2018).
- Baulch, S., Perry, C. Evaluating the impacts of marine debris on cetaceans. Marine Pollution Bulletin. 80 (1-2), 210-221 (2014).
- Rochman, C. M., Kurobe, T., Flores, I., Teh, S. J. Early warning signs of endocrine disruption in adult fish from the ingestion of polyethylene with and without sorbed chemical pollutants from the marine environment. Science of the Total Environment. 493, 656-661 (2014).
- Mattsson, K., et al. Brain damage and behavioural disorders in fish induced by plastic nanoparticles delivered through the food chain. Scientific Reports. 7, 7 (2017).
- Brown, D. M., Wilson, M. R., MacNee, W., Stone, V., Donaldson, K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine polystyrene particles: A role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicology and Applied Pharmacology. 175 (3), 191-199 (2001).
- Salvati, A., et al. Experimental and theoretical comparison of intracellular import of polymeric nanoparticles and small molecules: toward models of uptake kinetics. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 7 (6), 818-826 (2011).
- Frohlich, E., et al. Action of polystyrene nanoparticles of different sizes on lysosomal function and integrity. Particle and Fibre Toxicology. 9, 13 (2012).
- Bexiga, M. G., Kelly, C., Dawson, K. A., Simpson, J. C. RNAi-mediated inhibition of apoptosis fails to prevent cationic nanoparticle-induced cell death in cultured cells. Nanomedicine. 9 (11), 1651-1664 (2014).
- Lehner, R., Weder, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Emergence of Nanoplastic in the Environment and Possible Impact on Human Health. Environmental Science, Technology. 53 (4), 1748-1765 (2019).
- Pinsino, A., et al. Amino-modified polystyrene nanoparticles affect signalling pathways of the sea urchin (Paracentrotus lividus) embryos. Nanotoxicology. 11 (2), 201-209 (2017).
- El-Ghali, N., Rabadi, M., Ezin, A. M., De Bellard, M. E. New Methods for Chicken Embryo Manipulations. Microscopy Research and Technique. 73 (1), 58-66 (2010).
- Rashidi, H., Sottile, V. The chick embryo: hatching a model for contemporary biomedical research. Bioessays. 31 (4), 459-465 (2009).
- Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo characterization of ultrasound contrast agents: microbubble spectroscopy in a chicken embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Ribeiro, C. A. O., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Li, X. D., et al. Caffeine interferes embryonic development through over-stimulating serotonergic system in chicken embryo. Food and Chemical Toxicology. 50 (6), 1848-1853 (2012).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (11), 2776-2796 (2018).
- Alejo-Plata, M. D., Herrera-Galindo, E., Cruz-Gonzalez, D. G. Description of buoyant fibers adhering to Argonauta nouryi (Cephalopoda: Argonautidae) collected from the stomach contents of three top predators in the Mexican South Pacific. Marine Pollution Bulletin. 142, 504-509 (2019).
