Summary
Dit artikel introduceert een methode om uit te broeden zonder een eierschaal te gebruiken voor toxicologisch onderzoek van deeltjesverontreinigende stoffen zoals microplastics.
Abstract
Microplastics zijn een opkomende wereldwijde verontreinigende stof die een grote bedreiging vormt voor de gezondheid van dieren als gevolg van hun opname en translocatie in dierlijke weefsels en organen. Ecotoxicologische effecten van microplastics op de ontwikkeling van vogelembryo's zijn niet bekend. Het vogelei is een compleet ontwikkelings- en voedingssysteem en de hele embryo-ontwikkeling vindt plaats in de eierschaal. Daarom wordt een direct verslag van de ontwikkeling van vogelembryo's onder de stress van verontreinigende stoffen zoals microplastics sterk beperkt door de ondoorzichtige eierschaal in traditionele arcering. In deze studie werden de effecten van microplastics op de ontwikkeling van kwartelembryo's visueel gemonitord door uit te broeden zonder eierschaal. De belangrijkste stappen omvatten het reinigen en desinfecteren van bevruchte eieren, de incubatie vóór blootstelling, de incubatie op korte termijn na blootstelling en de monsterextractie. De resultaten tonen aan dat in vergelijking met de controlegroep het natte gewicht en de lichaamslengte van de aan microplastics blootgestelde groep een statistisch verschil vertoonden en het leveraandeel van de hele blootgestelde groep aanzienlijk steeg. Daarnaast evalueerden we externe factoren die de incubatie beïnvloeden: temperatuur, vochtigheid, eirotatiehoek en andere omstandigheden. Deze experimentele methode biedt waardevolle informatie over de ecotoxicologie van microplastics en een nieuwe manier om de nadelige effecten van verontreinigende stoffen op de ontwikkeling van embryo's te bestuderen.
Introduction
De productie van plastic afval was ongeveer 6300 Mt in 2015, waarvan een tiende werd gerecycled, en de rest werd ondergronds verbrand of begraven. Naar schatting zou tegen 2050 ongeveer 12.000 mt plastic afval ondergronds worden begraven1. Met de aandacht van de internationale gemeenschap voor plastic afval stelde Thompson in 2004 voor het eerst het concept van microplasticsvoor 2. Microplastics (Parlementsleden) verwijzen naar kleine deeltjesplastics met een deeltjesdiameter van minder dan 5 mm. Op dit moment hebben onderzoekers de alomtegenwoordige aanwezigheid van parlementsleden ontdekt in de kustlijn van verschillende continenten, de Atlantische eilanden, binnenmeren, het Noordpoolgebied en diepzeehabitats3,4,5,6,7. Daarom zijn meer onderzoekers begonnen met het bestuderen van de milieurisico's van parlementsleden.
Organismen kunnen parlementsleden in het milieu opnemen. Parlementsleden werden gevonden in het spijsverteringskanaal van 233 mariene organismen wereldwijd (waaronder 100% schildpadsoorten, 36% zeehondensoorten, 59% walvissoorten, 59% zeevogelsoorten, 92 soorten zeevissen en 6 soorten ongewervelden)8. Bovendien kunnen parlementsleden het spijsverteringsstelsel van de organismen blokkeren, zich ophopen en migreren in hun bobies9. Het is gebleken dat parlementsleden via de voedselketen kunnen worden overgedragen en hun inname verschilt met de veranderingen van habitat, groeifase, voedingsgewoonten en voedselbronnen10. Sommige onderzoekers meldden het bestaan van parlementsleden in de uitwerpselen van zeevogels11, wat betekent dat zeevogels fungeren als drager van parlementsleden. Bovendien kan de inname van parlementsleden de gezondheid van sommige organismen beïnvloeden. Parlementsleden kunnen bijvoorbeeld verstrikt raken in het maagdarmkanaal, waardoor de mortaliteit van walvisachtigentoeneemt 12.
Parlementsleden alleen hebben toxische effecten op organismen en gezamenlijke toxische effecten op organismen met andere verontreinigende stoffen. Inname van milieugerelateerde concentraties van plastic afval kan de endocriene systeemfunctie van volwassen vissen verstoren13. De grootte van microplastics is een van de belangrijke factoren die van invloed zijn op hun opname en accumulatie door organismen14,15. De kleine kunststoffen, met name de nanosize kunststoffen, zijn gevoelig voor interactie met cellen en organismen met hoge toxiciteit16,17,18,19. Hoewel de schadelijke effecten van microplastics met nanodeeltjesgrootte op organismen het huidige onderzoeksniveau overschrijden, is de detectie en kwantificering van microplastics met een grootte van minder dan enkele micrometers, met name de submicron/nanoplastics in het milieu, nog steeds een grote uitdaging. Daarnaast hebben nanoplastics ook enkele effecten op embryo's. Polystyreen kan de ontwikkeling van zee-egelsembryo's beschadigen door eiwit- en genprofielen te reguleren20.
Om de mogelijke impact van parlementsleden op organismen te onderzoeken, hebben we deze studie uitgevoerd. Vanwege de gelijkenis tussen vogelembryo's en menselijke embryo's worden ze meestal gebruikt in ontwikkelingsbiologieonderzoek21, waaronder angiogenese en antiangiogenese, weefseltechnologie, biomateriaalimplantaat en hersentumoren22,23,24. De embryo's van de vogel hebben de voordelen van lage kosten, een korte cultuurcyclus en gemakkelijke verrichting25,26. Daarom kozen we kwarteleibryo's met een korte groeicyclus als proefdier in deze studie. Tegelijkertijd kunnen we de morfologische veranderingen van kwartelpembryo's die tijdens de embryonale ontwikkelingsfase aan parlementsleden zijn blootgesteld, direct waarnemen met behulp van een eierschaalvrije broedtechnologie. De gebruikte experimentele materialen waren polypropyleen (PP) en polystyreen (PS). Omdat PP en PS27 het grootste deel van de polymeertypen vertegenwoordigen die wereldwijd in sedimenten en waterlichamen worden verkregen, zijn de meest voorkomende polymeertypen die worden gewonnen uit gevangen mariene organismen ethyleen en propyleen28. Dit experimentele protocol beschrijft het hele proces voor visuele evaluatie van toxicologische effecten van parlementsleden op kwartelembryo's die aan parlementsleden zijn blootgesteld. We kunnen deze methode gemakkelijk uitbreiden om de toxiciteit van andere verontreinigende stoffen voor de embryoontwikkeling van andereovipareuze dieren te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding vóór blootstelling
- Selecteer bevruchte kwarteleitjes die op dezelfde dag zijn geboren voor de blootstellingstest.
- Selecteer kwarteleitjes met vergelijkbare gewichten. Elk bevrucht kwartelei is ongeveer 10-12 g.
- Reinig alle bevruchte kwarteleitjes volledig van externe uitwerpselen en ander vuil.
- Steriliseer elk voorgekomen bevrucht kwartelei en de te gebruiken eieren (Kies eieren met een vergelijkbare schaalvorm, vooral de punt van het ei) met een antibioticumoplossing (penicilline en streptomycine, 1:1000, kamertemperatuur). Steriliseer de incubator met 75% ethanol.
- Open de eieren met het stompe uiteinde van een tandboor, laat de eierschaal aan de punt voor verder gebruik. Voordat de bevruchte eieren worden overgedragen, wordt de inhoud van de eieren uitgestort. Dit is om het vocht van de eierschaal te houden. De openingsdiameter van het ei was ongeveer 3 cm.
OPMERKING: Om de schade aan het kwarteleiembryo te verminderen, gebruikt u een tandboor om het stompe uiteinde van het ei te openen en de scheur zo glad mogelijk te maken. - Plaats na sterilisatie de bevruchte kwarteleitjes gedurende 24-48 uur in een incubator van 38 °C met een luchtvochtigheid van 60%. Zorg ervoor dat het stompe uiteinde van het kwartelei naar boven is.
- Steriliseer tijdens de incubatie van bevruchte kwarteleitjes de gereedschappen die nodig zijn in de daaropvolgende experimenten in een sterilisatiepot. Deze gereedschappen omvatten plasticfolie, een bekerglas, steriel water, pipettips, chirurgische rechte schaar, pincet en een lepel.
OPMERKING: Gebruik een film met een temperatuurtolerantie die hoog genoeg is om problemen met de sterilisatie op hoge temperatuur te voorkomen.
2. Het kwartelei uitbroeden zonder schaal
- Breng de voorgekomen bevruchte kwarteleitjes van de broedmachine naar een schone bank en leg ze plat op de container om ze ongeveer 1-2 minuten te stabiliseren.
- Gebruik een schaar (12,5 cm chirurgische rechte schaar) om een klein gaatje (diameter 3 mm) in de centrale as van de voorgekomen bevruchte kwarteleitjes te prikken en om 1-2 cm kleine opening te snijden. Breng het eiwit en de dooier van de bevruchte kwarteleitjes voorzichtig over op de gesneden eierschaal.
OPMERKING: Wanneer u een kleine opening met een schaar snijdt, vermijd dan het aanraken van de dooier van kwarteleitjes. - Voeg de regeloplossing (zonder parlementsleden) en de blootgestelde oplossing van verschillende massa's (0,1, 0,2 en 0,3 mg) microplastics met drie deeltjesgrootten (100, 200 en 500 nm) per pipet toe aan de eiinhoud. Voeg tegelijkertijd 1 druppel penicilline en 1 druppel streptomycine toe met een spuit van 1 ml.
- Bedek de opening van de eierschaal met de gesteriliseerde film (stap 1.6).
- Volgens stap 2.1-2.4, behandel alle bevruchte kwarteleitjes.
- Plaats de overgedragen kwarteleibryo's gedurende de noodzakelijke periode in de incubator van 38 °C met een luchtvochtigheid van 60%. Gebruik in dit experiment een eirotatiehoek van ±30°. Draai de eieren eens per uur.
OPMERKING: De overdracht moet zo snel mogelijk zijn, wat in een vroeg stadium meer oefening vereist.
3. Monsterverzameling
- Verwijder na zeven dagen kweek goed ontwikkelde embryo's die met het blote oog zijn waargenomen uit de dooier en was met fosfaatbufferoplossing (PBS).
- Droog de overtollige oplossing buiten het gereinigde embryo met absorberend papier en weeg in een schone petrischaal.
- Open de hele borstholte, scheid de lever en het hart van de ingewanden met een naald-neustang en plaats deze onmiddellijk na het opruimen in centrifugebuizen van 1,5 ml.
- Noteer snel het gewicht op een elektronische balans en bereken de hepatosomatische index (HIS = levergewicht / lichaamsgewicht x 100). Meet de lengte van het borstbeen en lichaam.
- Evalueer op basis van de bovenstaande indicatoren het effect van parlementsleden op de embryonale ontwikkeling.
OPMERKING: Embryokwaliteit verwijst hier naar de kwaliteit van dooierverwijdering.
4. Gegevensanalyse
- Rapporteer de experimentele gegevens in de vorm van gemiddelde ± standaardfout (SEM).
- Gebruik een enkele-factor analyse van variantie om de middelen van meerdere groepen monsters te vergelijken. De significante verschilwaarde was α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor de analyse van experimentele gegevens vergeleken we nat gewicht, lichaamslengte, borstbeenlengte en de verandering van hepatosomatische index tussen de controlegroep en de 6 experimentele groepen, waarbij we de groei en ontwikkeling van de kwartelembryo's vanuit een macroperspectief meten en weerspiegelen. We ontdekten zes normale kwarteleibryo's in elke groep. Elk embryo bereikte het vereiste Hamburger en Hamilton (HH) stadium.
In figuur 1hebben we de voorgekomen bevruchte kwartelei-inhoud overgebracht naar de hemisferische eierschalen en in de incubator geplaatst. Vervolgens registreerden we de ontwikkeling van embryo's in de middelste incubatieperiode gedurende drie dagen. Zoals weergegeven in figuur 2,is A-A2 de controlegroep en B-B2 is één behandelingsgroep. Vanuit het perspectief van macroscopische embryoontwikkeling ontwikkelden de embryo's zich normaal zonder de nadelige effecten van microplastics.
Tabel 1 en tabel 2 zijn de gemiddelde ± SEM van nat gewicht, lichaamslengte en borstbeenlengte van kwartelembryo na blootstelling van een week. De tabellen laten zien dat het natte gewicht en de lichaamslengte aanzienlijk veranderen in verschillende blootstellingsgroepen. Het gewicht en de lichaamslengte van de groepen behandeld met 0,1 mg, 0,3 mg, 100 nm en 500 nm parlementsleden daalden licht. Het lichaamsgewicht en de lichaamslengte van 0,2 mg van 200 nm met microplastic behandelde groepen namen licht toe (P < 0,05).
Hepatosomatische index (HIS) toont het aandeel lever in het kwarteleiembryo, wat een belangrijk teken is om de mate van leverontwikkeling te beoordelen. Bovendien speelt HSI een belangrijke rol bij de pathogenese van levercelmembraanletsel en inflammatoire infiltratie. Zoals weergegeven in figuur 3 en figuur 4, is het aandeel lever in de gehele behandelingsgroep na blootstelling aan microplastics aanzienlijk toegenomen. Er was echter geen significant verschil tussen de behandelingsgroepen van 0,2 mg en 0,3 mg van 100 nm MPs en de controlegroep.
Figuur 1: Kwarteleitjes uitbroeden zonder schaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De embryo-ontwikkeling van kwartels op de 6e, 7e en 8e dag in het middenstadium van het uitkomen zonder eierschaal. De groene pijl wijst naar de ogen; de blauwe pijl wijst naar de ledematen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Hepatosomatische index van kwartembryo's na blootstelling aan parlementsleden (nm) gedurende 7 dagen. Significante verschillen tussen controle- en behandelingsgroepen worden aangegeven met * P < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Hepatosomatische index van kwartembryo's na blootstelling aan parlementsleden (μm) gedurende 7 dagen. Significante verschillen tussen controle- en behandelingsgroepen worden aangegeven met * P < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Behandeling van parlementsleden | Gewicht (g) | Lengte (cm) | Borstbeenlengte |
| Beheersen | 2.509±0.324 uur | 5.425±0.477 uur | 1.025±0.094 |
| 100 nm | 1.812±0.155* | 4.632±0.315* | 0.950±0.152 |
| 200 nm | 2.272±0.368 | 5.297±0.268 | 1.025±0.076 |
| 500 nm | 1.785±0.127* | 4.892±0.154* | 1.017±0.082 |
Tabel 1: Nat gewicht, lichaamslengte en borstbeenlengte van kwarteleibryo's na blootstelling aan parlementsleden (nm) gedurende 7 dagen
| Behandeling | Gewicht (g) | Lengte (cm) | Borstbeenlengte |
| Beheersen | 2.161±0.166 | 5.23±0.26 uur | 1.10±0.04 uur |
| 0,1 mg | 1.960±0.338* | 4,82±0,75* | 1.04±0.04 uur |
| 0,2 mg | 2.410±0.366* | 5.25±0.26 uur | 1.07±0.10 uur |
| 0,3 mg | 1.901±0.759 | 4,95±0,15* | 1.02±0.09 uur |
Tabel 2: Nat gewicht, lichaamslengte en borstbeenlengte van kwarteleiembryo's na blootstelling aan parlementsleden (μm) gedurende 7 dagen. In vergelijking met de controlegroep geeft * P < 0,05 aan, ** P < 0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit document biedt een effectief experimenteel schema om de ontwikkeling van kwartelembryo's te evalueren door de basisontwikkelingsindexen te detecteren. Er zijn echter nog enkele beperkingen aan dit experiment.
Ten eerste is de mortaliteit van kwarteleibryo's in het latere stadium van het uitkomen hoger vanwege het schelploze uitkomen. Er zijn kunstmatig oncontroleerbare factoren zoals de vernietiging van de normale eiwitverhouding in het experimentele proces. We hebben de blootstellingstijd van embryo's beperkt om de nauwkeurigheid van het experiment te garanderen. Het onderzoek naar embryotoxiciteit kan alleen plaatsvinden in de vroege en middelste stadia van embryoontwikkeling. Ten tweede vindt de studie van parlementsleden over de ontwikkeling van kwartelembryo's alleen plaats op het niveau van de fundamentele morfologische analyse. De conclusies zijn dus relatief eenvoudig en er kunnen gebreken bestaan. Tegelijkertijd zijn de vereisten voor experimentele omstandigheden en werking relatief hoog in het proces van dit experiment. Daarom worden enkele opmerkelijke punten als volgt opgesomd:
Het is erg belangrijk om bevruchte kwarteleitjes te desinfecteren en te steriliseren in het voorbereidende werk vanwege de schadelijke pathogene micro-organismen op het oppervlak van bevruchte kwarteleitjes. Indien gedesinfecteerd, kunnen de microben tijdens de incubatie in de bevruchte kwarteleitjes binnendringen, wat resulteert in de dood van de kwartelembryo's. Zelfs als de overdracht succesvol is, zal het sterftecijfer hoger zijn. Daarom moet goed werk worden geleverd bij desinfectie en sterilisatie om de experimentele mortaliteit te verminderen.
Wanneer vogels eieren uitbroeden, veranderen ze vaak de positie van de eieren en houden ze de luchtcirculatie om een constante temperatuur voor de eieren en de juiste positie voor de foetus te behouden. Dit experiment gebruikte film om de eierschaal af te dichten. Als de hoek van de eirotatie te groot is, zal het eiwit naar buiten stromen. Als het te klein is, kan hechting tussen de embryofilm en de eierschaalfilm optreden, wat resulteert in dode embryo's. Stel daarom de rotatiehoek in op basis van de werkelijke situatie.
Tijdens de overdracht van kwarteleitjes worden de voorbevruchte kwarteleitjes horizontaal geplaatst en vervolgens in het midden van de eierschaal gesneden. Op deze manier stroomt een klein deel van het eiwit gemakkelijk uit, wat de normale verhouding en verdeling van het dikke en dunne eiwit vernietigt. Dit zorgt ervoor dat de dooier, die aan de bovenkant had moeten zijn, naar één kant leunt, waardoor het embryo sterft. Zorg er daarom voor dat al het eiwit in de nieuwe hemisferische eierschaal stroomt om de normale verhouding en verdeling tijdens de overdracht te garanderen.
Na de succesvolle overdracht moet de experimenteerder voorzichtig zijn om de vloeistof niet direct te laten vallen. De vloeistof moet vertrouwen op de eierschaalwand om deze langzaam te laten stromen tijdens toevoeging van verontreinigende stoffen en antibiotica.
Naast de vier bovengenoemde punten, controleert u strikt de incubatieomstandigheden. Coördineer de balans tussen temperatuur, vochtigheid en ventilatie. Houd het incubatielaboratorium stil en donker om de beste incubatieomgeving te bereiken.
Concluderend biedt dit experiment een basisprotocol voor het bestuderen van de effecten van milieuverontreinigende stoffen op de ontwikkeling van kwartembryo's. Er zijn ook andere soorten indicatoren in de studie van embryonale groei en ontwikkeling, waaronder vasculaire ontwikkeling, oxidatieve stress en celschade. Het bovenstaande experiment is slechts een eenvoudige macroscopische evaluatie van de embryonale ontwikkeling vanuit het morfologische aspect. Ten slotte zou het verbeterde onderzoeksidee en -protocol in de toekomst een nieuwe methode kunnen bieden voor de toxicologische studie van de groei en ontwikkeling van embryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken. Alle auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk van dit artikel hadden kunnen beïnvloeden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door belangrijke onderzoeks- en ontwikkelingsprojecten in de autonome regio Xinjiang Uygur (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi sample tissue grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | Tissuelyser-24 | Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature |
| Electronic balance | OHAUS corporation | PR Series Precision | Used for weighing |
| Fertilized quail eggs | Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd. | Quail eggs for hatching without shell | |
| Fluorescent polypropylene particles | Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd. | Types of plastics selected for the experiment | |
| Incubator | Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd. | 264 pc | Provide a place for embryo growth and development |
| Nanometer-scale polystyrene microspheres | Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. | 100 nm, 200 nm, 500 nm | Types of plastics selected for the experiment |
| Steel ruler | Deli Group | 20 cm | Used to measure length |
| Vertical heating pressure steam sterilizer | Shanghai Shenan Medical Instrument Factory | LDZM-80KCS-II | Sterilize the experimental articles |
References
- Geyer, R., Jambeck, J. R., Law, K. L. Production, use, and fate of all plastics ever made. Science Advances. 3 (7), 5 (2017).
- Thompson, R. C., et al. Lost at sea: Where is all the plastic. Science. 304 (5672), 838-838 (2004).
- Barletta, M., Lima, A. R. A., Costa, M. F. Distribution, sources and consequences of nutrients, persistent organic pollutants, metals and microplastics in South American estuaries. Science of the Total Environment. 651, 1199-1218 (2019).
- Eriksson, C., Burton, H., Fitch, S., Schulz, M., vanden Hoff, J. Daily accumulation rates of marine debris on sub-Antarctic island beaches. Marine Pollution Bulletin. 66 (1-2), 199-208 (2013).
- Zhang, C. F., et al. Microplastics in offshore sediment in the Yellow Sea and East China Sea, China. Environmental Pollution. 244, 827-833 (2019).
- Obbard, R. W., et al. Global warming releases microplastic legacy frozen in Arctic Sea ice. Earths Future. 2 (6), 315-320 (2014).
- Van Cauwenberghe, L., Vanreusel, A., Mees, J., Janssen, C. R.
- Wilcox, C., Van Sebille, E., Hardesty, B. D. Threat of plastic pollution to seabirds is global, pervasive, and increasing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11899-11904 (2015).
- Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
- Ferreira, G. V. B., Barletta, M., Lima, A. R. A. Use of estuarine resources by top predator fishes. How do ecological patterns affect rates of contamination by microplastics. Science of the Total Environment. 655, 292-304 (2019).
- Provencher, J. F., Vermaire, J. C., Avery-Gomm, S., Braune, B. M., Mallory, M. L. Garbage in guano? Microplastic debris found in faecal precursors of seabirds known to ingest plastics. Science of the Total Environment. 644, 1477-1484 (2018).
- Baulch, S., Perry, C. Evaluating the impacts of marine debris on cetaceans. Marine Pollution Bulletin. 80 (1-2), 210-221 (2014).
- Rochman, C. M., Kurobe, T., Flores, I., Teh, S. J. Early warning signs of endocrine disruption in adult fish from the ingestion of polyethylene with and without sorbed chemical pollutants from the marine environment. Science of the Total Environment. 493, 656-661 (2014).
- Mattsson, K., et al. Brain damage and behavioural disorders in fish induced by plastic nanoparticles delivered through the food chain. Scientific Reports. 7, 7 (2017).
- Brown, D. M., Wilson, M. R., MacNee, W., Stone, V., Donaldson, K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine polystyrene particles: A role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicology and Applied Pharmacology. 175 (3), 191-199 (2001).
- Salvati, A., et al. Experimental and theoretical comparison of intracellular import of polymeric nanoparticles and small molecules: toward models of uptake kinetics. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 7 (6), 818-826 (2011).
- Frohlich, E., et al. Action of polystyrene nanoparticles of different sizes on lysosomal function and integrity. Particle and Fibre Toxicology. 9, 13 (2012).
- Bexiga, M. G., Kelly, C., Dawson, K. A., Simpson, J. C. RNAi-mediated inhibition of apoptosis fails to prevent cationic nanoparticle-induced cell death in cultured cells. Nanomedicine. 9 (11), 1651-1664 (2014).
- Lehner, R., Weder, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Emergence of Nanoplastic in the Environment and Possible Impact on Human Health. Environmental Science, Technology. 53 (4), 1748-1765 (2019).
- Pinsino, A., et al. Amino-modified polystyrene nanoparticles affect signalling pathways of the sea urchin (Paracentrotus lividus) embryos. Nanotoxicology. 11 (2), 201-209 (2017).
- El-Ghali, N., Rabadi, M., Ezin, A. M., De Bellard, M. E. New Methods for Chicken Embryo Manipulations. Microscopy Research and Technique. 73 (1), 58-66 (2010).
- Rashidi, H., Sottile, V. The chick embryo: hatching a model for contemporary biomedical research. Bioessays. 31 (4), 459-465 (2009).
- Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo characterization of ultrasound contrast agents: microbubble spectroscopy in a chicken embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Ribeiro, C. A. O., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Li, X. D., et al. Caffeine interferes embryonic development through over-stimulating serotonergic system in chicken embryo. Food and Chemical Toxicology. 50 (6), 1848-1853 (2012).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (11), 2776-2796 (2018).
- Alejo-Plata, M. D., Herrera-Galindo, E., Cruz-Gonzalez, D. G. Description of buoyant fibers adhering to Argonauta nouryi (Cephalopoda: Argonautidae) collected from the stomach contents of three top predators in the Mexican South Pacific. Marine Pollution Bulletin. 142, 504-509 (2019).
