Summary
Detta dokument introducerar en metod för kläckning utan att använda ett äggskal för toxikologiska studier av partikelföroreningar som mikroplaster.
Abstract
Mikroplaster är en framväxande global föroreningstyp som utgör ett stort hälsohot mot djur på grund av deras upptag och flyttning i djurvävnader och organ. Ekotoxikologiska effekter av mikroplaster på utvecklingen av fågelembryon är inte kända. Fågelägget är ett komplett utvecklings- och näringssystem, och hela embryoutvecklingen sker i äggskalet. Därför är ett direkt register över utvecklingen av fågelembryon under stress av föroreningar som mikroplaster mycket begränsad av det ogenomskinliga äggskalet i traditionell kläckning. I denna studie övervakades effekterna av mikroplaster på vaktebryonutveckling visuellt genom kläckning utan äggskal. De viktigaste stegen inkluderar rengöring och desinfektion av befruktade ägg, inkubation före exponering, kortvarig inkubation efter exponering och provextraktion. Resultaten visar att jämfört med kontrollgruppen uppvisade den mikroplastexponerade gruppens våtvikt och kroppslängd en statistisk skillnad och leverandelen för hela den exponerade gruppen ökade avsevärt. Dessutom utvärderade vi externa faktorer som påverkar inkubationen: temperatur, fuktighet, äggrotationsvinkel och andra förhållanden. Denna experimentella metod ger värdefull information om mikroplasternas ekotoxikologi och ett nytt sätt att studera föroreningars negativa effekter på utvecklingen av embryon.
Introduction
Produktionen av plastavfall var cirka 6300 miljoner ton 2015, varav en tiondel återvanns och resten brändes eller begravdes under jord. Det uppskattas att cirka 12 000 Mt plastavfall skulle begravas under jord år 20501. Med det internationella samfundets uppmärksamhet på plastavfall föreslog Thompson först begreppet mikroplaster 20042. Mikroplaster (MPs) avser små partikelplaster med en partikeldiameter mindre än 5 mm. För närvarande har forskare upptäckt den allestädes närvarande närvaron av parlamentsledamöter i kusten på olika kontinenter, Atlanten, inlandssjöar, Arktis och djuphavsmiljöer3,4,5,6,7. Därför har fler forskare börjat studera parlamentsledamöternas miljörisker.
Organismer kan inta parlamentsledamöter i miljön. Parlamentsledamöter hittades i mag-tarmkanalen hos 233 marina organismer över hela världen (inklusive 100% sköldpaddsarter, 36% sälarter, 59% valarter, 59% sjöfågelarter, 92 typer av havsfisk och 6 typer av ryggradslösa djur)8. Dessutom kan parlamentsledamöter blockera organismers matsmältningssystem, ackumulera och migrera i sina bobies9. Det har visat sig att parlamentsledamöter kan överföras via livsmedelskedjan, och deras intag skiljer sig från förändringarna av livsmiljö, tillväxtstadium, utfodringsvanor och livsmedelskällor10. Vissa forskare rapporterade förekomsten av parlamentsledamöter i spillning av sjöfåglar11, vilket innebär att sjöfåglar fungerar som bärare av parlamentsledamöter. Dessutom kan intag av parlamentsledamöter påverka hälsan hos vissa organismer. Till exempel kan parlamentsledamöter trassla in sig i mag-tarmkanalen, vilket ökar dödligheten hos valar12.
Enbart parlamentsledamöter har toxiska effekter på organismer samt gemensamma toxiska effekter på organismer med andra föroreningar. Intag av miljörelaterade koncentrationer av plastskräp kan störa den vuxna fiskens endokrinasystemfunktion 13. Storleken på mikroplaster är en av de viktiga faktorerna som påverkar deras upptag och ackumulering av organismer14,15. Den lilla plasten, särskilt nanosizeplasterna, är benägna att interagera med celler och organismer med högtoxicitet 16,17,18,19. Även om de skadliga effekterna av mikroplaster av nanopartikelstorlek på organismer överskrider den nuvarande forskningsnivån är det fortfarande en stor utmaning att upptäcka och kvantifiera mikroplaster med storlekar som är mindre än flera mikrometer, särskilt submicron/nano-plast i miljön. Dessutom har nanoplast också vissa effekter på embryon. Polystyren kan skada utvecklingen av sjöborrembryon genom att reglera protein- och genprofiler20.
För att undersöka parlamentsledamöternas potentiella inverkan på organismer genomförde vi denna studie. På grund av likheten mellan fågelembryon och mänskliga embryon används de vanligtvis i utvecklingsbiologiskforskning 21 inklusive angiogenes och antiangiogenes, vävnadsteknik, biomaterialimplantat och hjärntumörer22,23,24. Fågelembryon har fördelarna med låg kostnad, en kort kulturcykel och enkel drift25,26. Därför valde vi vaktembryon med en kort tillväxtcykel som försöksdjur i denna studie. Samtidigt kan vi direkt observera de morfologiska förändringarna av vaktebryon som exponeras för parlamentsledamöter under det embryonala utvecklingsstadiet med hjälp av en äggskalsfri kläckningsteknik. De experimentella material som användes var polypropylen (PP) och polystyren (PS). Eftersom PP och PS27 står för den största andelen polymertyper som erhålls i sediment och vattenförekomster över hela världen, är de vanligaste polymertyperna som extraheras från fångade marina organismer etylen och propen28. Detta experimentella protokoll beskriver hela processen för visuell utvärdering av toxikologiska effekter av parlamentsledamöter på vaktebryon som exponeras för parlamentsledamöter. Vi kan enkelt utvidga denna metod för att undersöka andra föroreningars toxicitet till embryoutveckling av andra oviparösa djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse före exponering
- Välj befruktade vaktelägg födda samma dag för exponeringstestet.
- Välj vaktelägg med liknande vikter. Varje befruktat vaktelägg är ca 10-12 g.
- Rengör alla befruktade vaktelägg helt från yttre avföring och annat skräp.
- Sterilisera varje förkläckt befruktat vaktelägg och de ägg som ska användas (Välj ägg med liknande skalform, särskilt äggspetsen) med en antibiotikalösning (penicillin och streptomycin, 1:1000, rumstemperatur). Sterilisera inkubatorn med 75% etanol.
- Öppna äggen med den trubbiga änden av en tandborr och lämna äggskalet vid spetsen för vidare användning. Innan de befruktade äggen överförs hälls äggens innehåll ut. Detta för att hålla äggskalets fukt. Äggets öppningsdiameter var ca 3 cm.
OBS: För att minska skadorna på vaktembryon, använd en tandborr för att öppna äggets trubbiga ände och göra sprickan så jämn som möjligt. - Efter sterilisering, placera de befruktade vakteläggen i en 38 °C inkubator med 60% fuktighet i 24-48 h. Se till att vakteläggets trubbiga ände är vänd uppåt.
- Sterilisera de verktyg som behövs i de efterföljande experimenten i en steriliseringskruka under inkubationen av befruktade vaktelägg. Dessa verktyg inkluderar plastfolie, en bägare, sterilt vatten, pipettspetsar, kirurgisk rak sax, pincett och en sked.
OBS: Använd en film med en temperaturtolerans som är tillräckligt hög för att undvika problem med steriliseringen vid höga temperaturer.
2. Kläckning av vaktelägget utan skal
- Överför de förkläckta befruktade vakteläggen från inkubatorn till en ren bänk och lägg dem platt på behållaren för att stabilisera dem i ca 1-2 minuter.
- Använd sax (12,5 cm kirurgisk rak sax) för att peta ett litet hål (diameter 3 mm) i den centrala axeln på de förkläckda befruktade vakteläggen och för att skära 1-2 cm liten öppning. Överför försiktigt äggvitan och äggulan på de befruktade vakteläggen till det skurna äggskalet.
OBS: Undvik att vid beröring av äggulan med vaktelägg skära en liten öppning med sax. - Tillsätt styrlösningen (utan parlamentsledamöter) och den exponerade lösningen av olika massor (0,1, 0, 2 och 0, 3 mg) mikroplaster med tre partikelstorlekar (100, 200 och 500 nm) till ägginnehållet med pipett. Tillsätt samtidigt 1 droppe penicillin och 1 droppe streptomycin med en 1 ml spruta.
- Täck äggskalets öppning med den steriliserade filmen (steg 1.6).
- Enligt steg 2.1-2.4, behandla alla befruktade vaktelägg.
- Placera de överförda vaktebryon i inkubatorn 38 °C med 60 % luftfuktighet under den nödvändiga perioden. I detta experiment, använd en äggrotationsvinkel på ±30°. Vänd äggen en gång i timmen.
OBS: Överföringen bör ske så snabbt som möjligt, vilket kräver mer övning i ett tidigt skede.
3. Provtagning
- Efter sju dagars kultur, ta bort välutvecklade embryon som observerats av blotta ögat från äggulan och tvätta med fosfatbuffrad lösning (PBS).
- Torka överskottslösningen utanför det rengjorda embryot med absorberande papper och väg in en ren Petri-skål.
- Öppna hela brösthålan, separera levern och hjärtat från inälvorna med nål-näsa-tång och placera i 1,5 ml centrifuger omedelbart efter röjning.
- Registrera snabbt vikten på en elektronisk balans och beräkna det hepatosomatiska indexet (HIS = levervikt / kroppsvikt x 100). Mät bröstbenets och kroppens längd.
- På grundval av ovanstående indikatorer utvärderar du parlamentsledamöternas inverkan på embryonal utveckling.
OBS: Embryokvalitet här avser kvaliteten på äggulaborttagning.
4. Dataanalys
- Rapportera experimentella data i form av genomsnittligt ± standardfel (SEM).
- Använd enfaktorsanalys av varians för att jämföra medel för flera grupper av prover. Det signifikanta differensvärdet α = 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För analys av experimentella data jämförde vi våtvikt, kroppslängd, bröstbenslängd och förändringen av hepatosomatiskt index mellan kontrollgruppen och de 6 experimentella grupperna, vilket mätte och återspeglade vaktebryonens tillväxt och utveckling ur ett makroperspektiv. Vi upptäckte sex normala vakte embryon i varje grupp. Varje embryo nådde det nödvändiga Hamburger- och Hamilton -HH-stadiet.
I figur 1överförde vi det förkläckta befruktade vakteläggsinnehållet till de halvklotformade äggskalen och lade dem i inkubatorn. Sedan registrerade vi utvecklingen av embryon i mitten av inkubationstiden i tre dagar. Som visas i figur 2är A-A2 kontrollgruppen, och B-B2 är en behandlingsgrupp. Ur ett makroskopiskt embryoutveckling utvecklades embryona normalt utan mikroplasternas negativa effekter.
Tabell 1 och tabell 2 är medelvärdet ± SEM med våtvikt, kroppslängd och bröstbenslängd för vaktebryon efter en veckas exponering. Tabellerna visar att den våta vikten och kroppslängden förändras avsevärt i olika exponeringsgrupper. Vikten och kroppslängden hos de grupper som behandlades med 0, 1 mg, 0, 3 mg, 100 nm och 500 nm parlamentsledamöter minskade något. Kroppsvikten och kroppslängden på 0, 2 mg 200 nm mikroplastbehandlade grupper ökade något (P < 0,05).
Hepatosomatiskt index (HIS) visar andelen lever i vaktembryon, vilket är ett viktigt tecken för att bedöma graden av leverutveckling. Dessutom spelar HSI en viktig roll i patogenesen vid levercellsmembranskada och inflammatorisk infiltration. Som framgår av figur 3 och figur 4,jämfört med kontrollgruppen, ökade andelen lever i hela behandlingsgruppen betydligt efter exponering för mikroplaster. Det fanns dock ingen signifikant skillnad mellan behandlingsgrupperna 0, 2 mg och 0, 3 mg 100 nm parlamentsledamöter och kontrollgruppen.
Bild 1:Kläcka vaktelägg utan skal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Embryoutvecklingen av vaktel den 6: e, 7: e och 8: e dagen i mitten av kläckning utan äggskal. Den gröna pilen pekar mot ögonen; den blå pilen pekar på lemmarna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Hepatosomatiskt index för vaktebryon efter exponering för parlamentsledamöter (nm) i 7 dagar. Signifikanta skillnader mellan kontroll- och behandlingsgrupper indikeras av * P < 0, 05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Hepatosomatiskt index för vaktebryon efter exponering för parlamentsledamöter (μm) i 7 dagar. Signifikanta skillnader mellan kontroll- och behandlingsgrupper indikeras av * P < 0, 05. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Behandling av riksdagsledamöter | Vikt (g) | Längd (cm) | Bröstbenets längd |
| Kontroll | 2.509±0.324 | 5.425±0.477 | 1.025±0.094 |
| 100 nm | 1.812±0.155* | 4.632±0.315* | 0.950±0.152 |
| 200 nm | 2.272±0.368 | 5.297±0.268 | 1.025±0.076 |
| 500 nm | 1.785±0.127* | 4.892±0.154* | 1.017±0.082 |
Tabell 1: Våtvikt, kroppslängd och bröstbenslängd för vaktebryon efter exponering för parlamentsledamöter (nm) i 7 dagar
| Behandling | Vikt (g) | Längd (cm) | Bröstbenets längd |
| Kontroll | 2.161±0.166 | 5.23±0.26 | 1.10±0.04 |
| 0,1 mg | 1.960±0.338* | 4.82±0.75* | 1.04±0.04 |
| 0,2 mg | 2.410±0.366* | 5.25±0.26 | 1.07±0.10 |
| 0,3 mg | 1.901±0.759 | 4.95±0.15* | 1.02±0.09 |
Tabell 2: Våtvikt, kroppslängd och bröstbenslängd för vaktebryon efter exponering för parlamentsledamöter (μm) i 7 dagar. Jämfört med kontrollgruppen anger * P < 0,05 anger ** P < 0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument ger ett effektivt experimentellt system för att utvärdera utvecklingen av vaktebryon genom att upptäcka de grundläggande utvecklingsindexen. Det finns dock fortfarande vissa begränsningar för detta experiment.
För det första är dödligheten hos vaktebryon i det senare skedet av kläckningen högre på grund av den skalfria kläckningen. Det finns artificiellt okontrollerbara faktorer som förstörelse av normalt proteinförhållande i försöksprocessen. Vi begränsade exponeringstiden för embryon för att säkerställa experimentet. Forskningen om embryotoxicitet kan endast förekomma i de tidiga och mellersta stadierna av embryoutveckling. För det andra sker studien av parlamentsledamöter om utveckling av vaktebryon endast på den grundläggande morfologiska analysnivån. Slutsatserna är således relativt enkla och defekter kan förekomma. Samtidigt är kraven på experimentella tillstånd och drift relativt höga i processen för detta experiment. Därför listas några anmärkningsvärda punkter enligt följande:
Det är mycket viktigt att desinficera och sterilisera befruktade vaktelägg i det förberedande arbetet på grund av de skadliga patogena mikroorganismerna på ytan av befruktade vaktelägg. Om desinficeras kan mikroberna tränga in i de befruktade vakteläggen under inkubation, vilket resulterar i vaktebryonens död. Även om överföringen lyckas kommer dödstalen att vara högre. Därför bör ett bra jobb göras vid desinfektion och sterilisering för att minska den experimentella dödligheten.
När fåglar kläcker ägg ändrar de ofta äggets position och håller luftcirkulationen för att upprätthålla en konstant temperatur för äggen och rätt position för fostret. Detta experiment använde film för att försegla äggskalet. Om vinkeln på äggrotationen är för stor, kommer äggviten att strömma ut. Om den är för liten kan vidhäftning mellan embryofilmen och äggskalsfilmen uppstå, vilket resulterar i döda embryon. Ställ därför in rotationsvinkeln enligt den faktiska situationen.
Under överföring av vaktebryon placeras de förbefruktade vakteläggen horisontellt och skärs sedan i mitten av äggskalet. På detta sätt strömmar en liten del av äggviten lätt ut, vilket förstör den normala proportionen och fördelningen av den tjocka och tunna äggviten. Detta gör att äggulan, som borde ha varit på toppen, lutar åt ena sidan, vilket gör att embryot dör. Se därför till att göra allt äggviteflöde till det nya halvklotformade äggskalet för att säkerställa normal andel och fördelning under överföringen.
Efter den lyckade överföringen måste experimenteraren vara försiktig så att vätskan inte tappas direkt. Vätskan bör förlita sig på äggskalväggen för att få den att flöda långsamt under tillsats av föroreningar och antibiotika.
Förutom de fyra punkter som nämns ovan, kontrollera strikt inkubationsförhållandena. Koordinera balansen mellan temperatur, luftfuktighet och ventilation. Håll inkubationslaboratoriet tyst och mörkt för att uppnå den bästa inkubationsmiljön.
Sammanfattningsvis utgör detta experiment ett grundläggande protokoll för att studera miljöföroreningarnas effekter på utvecklingen av vaktebryon. Det finns också andra typer av indikatorer i studien av embryonal tillväxt och utveckling, inklusive vaskulär utveckling, oxidativ stress och cellskador. Ovanstående experiment är bara en enkel makroskopisk utvärdering av embryonal utveckling från den morfologiska aspekten. Slutligen skulle den förbättrade forskningsidén och forskningsprotokollet i framtiden kunna ge en ny metod för toxikologiska studier av embryotillväxt och embryoutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja. Alla författare förklarar att de inte har några kända konkurrerande ekonomiska intressen eller personliga relationer som kunde ha verkat påverka arbetet i detta dokument.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av viktiga forsknings- och utvecklingsprojekt i den autonoma regionen Xinjiang Uygur (2017B03014, 2017B03014-1, 2017B03014-2, 2017B03014-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi sample tissue grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | Tissuelyser-24 | Grind large-sized plastics into small-sized ones at low temperature |
| Electronic balance | OHAUS corporation | PR Series Precision | Used for weighing |
| Fertilized quail eggs | Guangzhou Cangmu Agricultural Development Co., Ltd. | Quail eggs for hatching without shell | |
| Fluorescent polypropylene particles | Foshan Juliang Optical Material Co., Ltd. | Types of plastics selected for the experiment | |
| Incubator | Shandong, Bangda Incubation Equipment Co., Ltd. | 264 pc | Provide a place for embryo growth and development |
| Nanometer-scale polystyrene microspheres | Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. | 100 nm, 200 nm, 500 nm | Types of plastics selected for the experiment |
| Steel ruler | Deli Group | 20 cm | Used to measure length |
| Vertical heating pressure steam sterilizer | Shanghai Shenan Medical Instrument Factory | LDZM-80KCS-II | Sterilize the experimental articles |
References
- Geyer, R., Jambeck, J. R., Law, K. L. Production, use, and fate of all plastics ever made. Science Advances. 3 (7), 5 (2017).
- Thompson, R. C., et al. Lost at sea: Where is all the plastic. Science. 304 (5672), 838-838 (2004).
- Barletta, M., Lima, A. R. A., Costa, M. F. Distribution, sources and consequences of nutrients, persistent organic pollutants, metals and microplastics in South American estuaries. Science of the Total Environment. 651, 1199-1218 (2019).
- Eriksson, C., Burton, H., Fitch, S., Schulz, M., vanden Hoff, J. Daily accumulation rates of marine debris on sub-Antarctic island beaches. Marine Pollution Bulletin. 66 (1-2), 199-208 (2013).
- Zhang, C. F., et al. Microplastics in offshore sediment in the Yellow Sea and East China Sea, China. Environmental Pollution. 244, 827-833 (2019).
- Obbard, R. W., et al. Global warming releases microplastic legacy frozen in Arctic Sea ice. Earths Future. 2 (6), 315-320 (2014).
- Van Cauwenberghe, L., Vanreusel, A., Mees, J., Janssen, C. R.
- Wilcox, C., Van Sebille, E., Hardesty, B. D. Threat of plastic pollution to seabirds is global, pervasive, and increasing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11899-11904 (2015).
- Wright, S. L., Thompson, R. C., Galloway, T. S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: A review. Environmental Pollution. 178, 483-492 (2013).
- Ferreira, G. V. B., Barletta, M., Lima, A. R. A. Use of estuarine resources by top predator fishes. How do ecological patterns affect rates of contamination by microplastics. Science of the Total Environment. 655, 292-304 (2019).
- Provencher, J. F., Vermaire, J. C., Avery-Gomm, S., Braune, B. M., Mallory, M. L. Garbage in guano? Microplastic debris found in faecal precursors of seabirds known to ingest plastics. Science of the Total Environment. 644, 1477-1484 (2018).
- Baulch, S., Perry, C. Evaluating the impacts of marine debris on cetaceans. Marine Pollution Bulletin. 80 (1-2), 210-221 (2014).
- Rochman, C. M., Kurobe, T., Flores, I., Teh, S. J. Early warning signs of endocrine disruption in adult fish from the ingestion of polyethylene with and without sorbed chemical pollutants from the marine environment. Science of the Total Environment. 493, 656-661 (2014).
- Mattsson, K., et al. Brain damage and behavioural disorders in fish induced by plastic nanoparticles delivered through the food chain. Scientific Reports. 7, 7 (2017).
- Brown, D. M., Wilson, M. R., MacNee, W., Stone, V., Donaldson, K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine polystyrene particles: A role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicology and Applied Pharmacology. 175 (3), 191-199 (2001).
- Salvati, A., et al. Experimental and theoretical comparison of intracellular import of polymeric nanoparticles and small molecules: toward models of uptake kinetics. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine. 7 (6), 818-826 (2011).
- Frohlich, E., et al. Action of polystyrene nanoparticles of different sizes on lysosomal function and integrity. Particle and Fibre Toxicology. 9, 13 (2012).
- Bexiga, M. G., Kelly, C., Dawson, K. A., Simpson, J. C. RNAi-mediated inhibition of apoptosis fails to prevent cationic nanoparticle-induced cell death in cultured cells. Nanomedicine. 9 (11), 1651-1664 (2014).
- Lehner, R., Weder, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Emergence of Nanoplastic in the Environment and Possible Impact on Human Health. Environmental Science, Technology. 53 (4), 1748-1765 (2019).
- Pinsino, A., et al. Amino-modified polystyrene nanoparticles affect signalling pathways of the sea urchin (Paracentrotus lividus) embryos. Nanotoxicology. 11 (2), 201-209 (2017).
- El-Ghali, N., Rabadi, M., Ezin, A. M., De Bellard, M. E. New Methods for Chicken Embryo Manipulations. Microscopy Research and Technique. 73 (1), 58-66 (2010).
- Rashidi, H., Sottile, V. The chick embryo: hatching a model for contemporary biomedical research. Bioessays. 31 (4), 459-465 (2009).
- Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo characterization of ultrasound contrast agents: microbubble spectroscopy in a chicken embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Ribeiro, C. A. O., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Li, X. D., et al. Caffeine interferes embryonic development through over-stimulating serotonergic system in chicken embryo. Food and Chemical Toxicology. 50 (6), 1848-1853 (2012).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (11), 2776-2796 (2018).
- Alejo-Plata, M. D., Herrera-Galindo, E., Cruz-Gonzalez, D. G. Description of buoyant fibers adhering to Argonauta nouryi (Cephalopoda: Argonautidae) collected from the stomach contents of three top predators in the Mexican South Pacific. Marine Pollution Bulletin. 142, 504-509 (2019).
