Articolo metodologico

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

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DOI:

10.3791/61753

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22 settembre 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Endometrium, Endometriosis and Reproductive Medicine, Department of Development and Regeneration, KU Leuven, 2Laboratory of Ion Channel Research, VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, Leuven, Belgium and Department of Molecular Medicine, KU Leuven

Autori corrispondenti: Katharina Held <kathi.held@kuleuven.vib.be>

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo articolo ha lo scopo di descrivere un protocollo sistematico per ottenere fette orizzontali del cervello ippocampale nei topi. L'obiettivo di questa metodologia è preservare l'integrità delle vie della fibra ippocampale, come il percorso perforante e il tratto di fibra muschiata per valutare i processi neurologici correlati al giro dentato.

Abstract

L'ippocampo è una struttura altamente organizzata nel cervello che fa parte del sistema limbico ed è coinvolto nella formazione e consolidamento della memoria, nonché nella manifestazione di gravi disturbi cerebrali, tra cui il morbo di Alzheimer e l'epilessia. L'ippocampo riceve un alto grado di intra- e inter-connettività, garantendo una corretta comunicazione con strutture cerebrali interne ed esterne. Questa connettività viene effettuata attraverso diversi flussi informativi sotto forma di percorsi in fibra. Le fette cerebrali sono una metodologia frequentemente utilizzata quando si esplorano le funzioni neurofisiologiche dell'ippocampo. Le fette cerebrali ippocampali possono essere utilizzate per diverse applicazioni, tra cui registrazioni elettrofisiologiche, misurazioni microscopiche leggere e diverse tecniche molecolari biologiche e istochimiche. Pertanto, le fette cerebrali rappresentano un sistema modello ideale per valutare le funzioni proteiche, per indagare i processi fisiopatologici coinvolti nei disturbi neurologici e per scopi di scoperta di farmaci.

Esistono diversi modi di tagliare i preparati. I preparati a fette cerebrali con vibratoma consentono una migliore conservazione della struttura tissutale e garantiscono un sufficiente apporto di ossigeno durante l'affettare, che presentano vantaggi rispetto all'uso tradizionale di un elicottero tissutale. Inoltre, diversi piani di taglio possono essere applicati per i preparati a fette cerebrali vibratome. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per una preparazione di successo di fette ippocampali orizzontali tagliate con vibratome di cervelli di topo. A differenza di altre preparazioni a fette, l'affettamento orizzontale consente di mantenere le fibre del percorso di input ippocampale (percorso perforante) in uno stato completamente intatto all'interno di una fetta, il che facilita l'indagine delle interazioni entorinale-ippocampale. Qui, forniamo un protocollo completo per la dissezione, l'estrazione e l'affezione orizzontale acuta del cervello murino e discutiamo le sfide e le potenziali insidie di questa tecnica. Infine, mostreremo alcuni esempi per l'uso di fette cerebrali in ulteriori applicazioni.

Introduzione

L'ampia esplorazione dell'ippocampo iniziò quando Scoville e Milner riportarono l'incapacità di un paziente (H.M.) di formare una nuova memoria dichiarativa dopo la rimozione chirurgica dell'ippocampo e delle vicine strutture del lobo temporale come trattamento per l'epilessia grave1. Da quel momento in poi, l'ippocampo è stato ampiamente studiato a partire dalle proprietà e dalle funzioni neuronali generali fino allo sviluppo di gravi disturbi cerebrali, come l'epilessia e il morbo di Alzheimer2,3,4,5. L'ippocampo fa parte del sistema limbico, costituito da un gruppo di strutture cerebrali correlate coinvolte nell'emozione e nella formazione dellamemoria 6,7. Una fitta rete di diversi percorsi in fibra realizza una stretta connettività ippocampale alle strutture cerebrali interne ed esterne. Questi percorsi includono il percorso perforante mediale e laterale (corteccia entorinale per dentare il giro, CA3 - CA1 e subicolo)8, il percorso della fibra muschiata (giro dentato a CA3)9 e il percorso commissurale collaterale / associativo schaffer (da CA3 a CA1)10 (Figura 1). L'ippocampo presenta una delle aree cerebrali più ampiamente esplorate finora a causa della sua organizzazione laminare altamente conservata della formazione di strati neuronali e della possibilità di ottenere culture neuronali vitali e fette cerebrali con relativa facilità5.

Diagramma dei neuroni dell'ippocampo, che mostra i percorsi: CA1, CA2, CA3, DG, subiculum, LPP, MPP, EC.
Figura 1: Cartone animato che illustra le diverse regioni ippocampali e i principali percorsi delle fibre. Le diverse regioni ippocampali sono indicate da linee di colore solido: corteccia entorinale (CE; nero), giro dentato (DG; arancione), Cornu Ammonis (CA) 3 (ciano), 2 (giallo) e 1 (magenta) e subicolo (verde). I percorsi in fibra sono mostrati con una linea tratteggiata colorata: il percorso mediale (MPP, rosso) e laterale perforante (LPP, blu) (dalla corteccia entorinale al giro dentato, CA3, CA1 e subicolo), la via della fibra muschiata (MF, viola) (dal giro dentato a CA3) e il collaterale schaffer (SC, marrone) (ipsilaterale da CA3 a CA1)/percorsi commissurali associativi (AC, verde chiaro) (contralto da CA3 a CA1). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I protocolli brain slice spesso vengono utilizzati per la perdita di connessioni da aree cerebrali più distanti all'area diinteresse 5. Inoltre, i capillari non sono più funzionali5 e la circolazione sanguigna viene privata11. Nonostante questi limiti, le fette cerebrali sono ancora utilizzate principalmente per lo studio delle funzioni neurofisiofisioiche dell'ippocampo a causa di una serie di vantaggi. In primo luogo, l'estrazione dell'ippocampoè veloce 12 e non richiede molti materiali. Gli unici strumenti essenziali includono un kit di dissezione, un bagno d'acqua di laboratorio, l'accesso al carbogeno e un microtomo vibrante (vibratomo)13. Altre risorse della tecnica della fetta cerebrale sono l'elusione della barriera ematico-encefalica (BBB) e il lavaggio delle molecole rilasciate endogenamente primadell'inizio dell'esperimento 5, che consente di studiare l'effetto dei farmaci con controllo del dosaggio relativamente preciso14. Inoltre, le fette cerebrali preservano i circuiti cito-architettonici e sinaptici all'interno dell'ippocampo15,16,dove la neuroanatomia e l'ambiente locale con connettività neuronale e complesse interazioni neuronale-gliasono preservate 4,11,17. Inoltre, le connessioni in fibra ippocampale sono prevalentemente neuroni unidirezionali e ippocampali hanno un'alta plasticità sinaptica, che semplifica enormemente la raccolta e l'interpretazione di registrazioni elettrofisiotiche di alta qualità al fine di comprendere i processi neurologici18,19. È importante sottolineare che le fette cerebrali presentano una risorsa preziosa applicabile in una vasta gamma di diverse tecniche scientifiche, che vanno dalle tecniche biologiche molecolari alle registrazioni di imaging fino alle misurazioni elettrofisiologiche12,20,21,22,23,24,25,26.

Come accennato in precedenza, le fette cerebrali ippocampali presentano un potente strumento sperimentale per studiare le caratteristiche strutturali e funzionali della connettività sinaptica. Ciò offre l'opportunità di valutare gli effetti di sostanze chimiche o mutazioni sull'eccitabilità neuronale e sulla plasticità16.

I preparati acuti delle fette cerebrali presentano una tecnica relativamente sensibile e la qualità ottimale delle fette dipende fortemente dalle condizioni sperimentali ideali, tra cui l'età dell'animale, il metodo di eutanasia, la velocità di dissezione e affettare, le soluzioni e i parametri di affettare (ad esempio, la velocità di affettare) nonché le condizioni per il recupero dellefette 4. Pertanto, un protocollo ben progettato è della massima importanza e garantisce la riproducibilità tra diverse unità di ricerca13.

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per i preparati acuti di fette ippocampali orizzontali, con l'obiettivo di preservare l'integrità del percorso laterale ippocampale e mediale perforante e della via della fibra muschiata, consentendo l'indagine dei processi correlati al giro dentato9. Descriveremo in dettaglio i passaggi chiave per sezionare, estrarre e tagliare orizzontalmente il cervello murino, seguiti dai risultati rappresentativi delle registrazioni calcio-microfluorimetriche e delle registrazioni del potenziale postinaptico eccitatorio sul campo (fEPSPs) in condizioni di base e durante i protocolli di induzione LTP in fette cerebrali di topi selvatici di tipo C57BL/ 6J.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali per questo studio sono stati approvati dal comitato di revisione etica del KU Leuven (Belgio) (P021/2012).

1. Preparazione di una soluzione di fette di saccarosio elevato e di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF)

  1. Prima della giornata sperimentale
    1. Preparare 1 L di pre-soluzione a fette 10x con acqua di grado laboratorio di tipo 1 contenente (in mM): 25 KCl, 20 CaCl2, 10 MgSO4, 12.5 KH2PO4 (Tabella 1). Al fine di prevenire la precipitazione di fosfati di calcio, mescolare lentamente le sostanze chimiche in un bicchiere preriempato con 800 mL H2O mescolando costantemente con un agitatore magnetico. Conservare la soluzione a 4 °C o a temperatura ambiente (RT).
  2. Nel giorno sperimentale
    1. Preparare 1 L di 1x ACSF con acqua di grado di laboratorio di tipo 1 contenente (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgSO4, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 25 Glucosio(Tabella 2). Utilizzare un osmometro a pressione di vapore per convalidare l'osmolarità tra 305-315 mOsm (pH ~ 7,55-7,6).
      NOTA: Al fine di prevenire la precipitazione di fosfati di calcio, mescolare lentamente tutte le sostanze chimiche solide in un bicchiere preriempato con 800 mL di H2O mescolando costantemente con un agitatore magnetico. Aggiungere MgSO4 e CaCl2 alla fine, gocciolando lentamente nella quantità necessaria da soluzioni stock da 1 M.
    2. Bolla continuamente 1x soluzione ACSF a RT con carbogeno per impostare il pH tra 7,3 e 7,4.
      NOTA: Se il pH è leggermente troppo alto o troppo basso, sarebbero sufficienti piccole regolazioni della resistenza alla carbogenazione. Se il pH è superiore a 7,45 con carbogenazione, regolarlo aggiungendo poche gocce di soluzione NaH2PO4 da 1 M.
    3. Preparare 250 mL (per cervello) di soluzione di 1 fetta di saccarosio alto in un bicchiere contenente 25 mL di pre-soluzione di fette 10x e (in mM): 252 Saccarosio, 26 NaHCO3e 10 Glucosio(tabella 3). Verificate che l'osmolarità sia compresa tra 320 e 325 mOsm (pH ~ 7,55–7,6).
    4. Bollare la soluzione a fette di saccarosio alto per 10-15 minuti con carbogeno per controllare il pH tra 7,3 e 7,4.
      NOTA: Se il pH è superiore a 7,45 con carbogenazione, regolarlo aggiungendo alcune gocce di soluzione KH2PO4 da 1 M.
    5. Conservare la soluzione a fette di saccarosio alto per 20-30 min nell'ultra congelatore (-80 °C) fino a quando non viene parzialmente congelata.

2. Preparazione dello spazio di lavoro per la dissezione cerebrale

  1. Durante il raffreddamento della soluzione ad alto contenuto di saccarosio, preparare quanto segue.
    1. Riscaldare il bagno d'acqua a 32 °C.
    2. Riempire la camera di recupero (Figura 2A) con la soluzione ACSF carbogenata e posizionare la camera nel bagno d'acqua. Applicare continuamente il carbogeno sul flacone ACSF principale e l'ACSF nella camera di recupero.
    3. Inaugurare l'animale nella stanza sperimentale.
      NOTA: L'età, il sesso e il ceppo dell'animale devono essere determinati dal singolo sperimentatore e dipendono dalla domanda specifica di studio. Tuttavia, i parametri dell'animale dovrebbero rimanere costanti all'interno di uno studio al fine di garantire la comparabilità tra i diversi giorni sperimentali. Questo protocollo è stato progettato per l'uso di topi maschi C57BL/6J all'età di 2-6 settimane. Se verranno utilizzati animali più anziani, le soluzioni di affettazione erecupero potrebberoessere adattate di conseguenza 4,27 (ad esempio, soluzioni basate su NMDG+23,28) al fine di preservare la salute cerebrale delle fette acute.
    4. Preparare la camera di anestesia.
    5. Stendere carta velina, pipetta Pasteur in plastica con ampia apertura (aperta), piatto di coltura da 90 mm pieno di ghiaccio, un quadrato di carta filtrante sopra il piatto di coltura refrigerato, forbici forti per la decapitazione, forbici di dissezione, forcette curve, spatola, piatto di coltura da 35 mm, pennello fine, lama, piatto campione (viene fornito con vibratome), super colla, punta di pipetta, quattro cinghie di carta da filtro (~ 2 cm x 0,5 cm)(Figura 2A).
    6. Impostare il vibratomo: In primo luogo, programmare il vibratomo per le impostazioni corrette (velocità di marcia della lama: 0,08 mm/s, ampiezza di taglio: 1,4 mm, frequenza di taglio: 85 Hz) e fissare la linea di carbogeno nella camera a fette. Quindi, posizionare la camera a fette nel supporto, riempire il supporto che circonda la camera a fette con ghiaccio e attaccare tutto al vibratoma. Infine, posizionare la lama del rasoio nel porta lama del vibratomo (Figura 2B).
  2. Dopo il congelamento della soluzione ad alto saccarosio eseguire i seguenti passaggi.
    1. Dopo 20-30 minuti, togliere la soluzione di fette di saccarosio alto dall'ultra-congelatore a -80 °C e tenere il becher sul ghiaccio.
    2. Posizionare la soluzione ad alto saccarosio accanto al vibratomo sulla panca, schiacciare e mescolare la soluzione parzialmente congelata con una spatola per ottenere una bella granita e iniziare a gorgogliare con carbogeno.
    3. Prendi una soluzione a fette di saccarosio con la pipetta Pasteur in plastica per immergere la carta filtrante squadrata sopra il piatto di coltura refrigerato da 90 mm.
    4. Riempire il piatto di coltura da 35 mm (o qualsiasi piccolo contenitore equivalente adatto a conservare l'intero cervello) fino al 75% con la soluzione a fette di saccarosio alto (sufficiente a coprire tutto il cervello) e raffreddare il piatto di coltura sul ghiaccio tenuto accanto al becher con il resto della soluzione. Carbogenare la soluzione nel piatto da coltura da 35 mm.

3. Dissezione e posizionamento del cervello murino

  1. Anestetizza l'animale con il 5% di isoflurane. Determinare la giusta profondità dell'anestesia pizzicando la zampa. Non dovrebbe verificarsi alcun riflesso di prelievo della zampa.
  2. Trasferire l'animale su carta velina e decapitarlo con forbici forti o una piccola ghigliottina animale.
  3. Utilizzare le forbici di dissezione per aprire il cuoio capelluto.
  4. Aprire la calvaria lungo la sutura sagittale e rimuoverla con l'aiuto di forcep curve fino a quando tutto il cervello, compresi i bulbi olfattivi, è visibile.
    NOTA: Fare attenzione a non danneggiare il cervello con i bordi affilati della calvaria o delle fusa.
  5. Usa una spatola per raccogliere attentamente il cervello (i bulbi olfattivi dovrebbero rimanere attaccati).
  6. Trasferire il cervello nel piatto di coltura refrigerato da 35 mm e rimuovere tutti i capelli o le particelle di sangue dal tessuto lavando delicatamente il cervello con una pipetta Pasteur riempita di ACSF (il sangue ha effetti citotossici sul tessutocerebrale 29).
  7. Trasferire il cervello con l'aiuto della spatola sulla carta filtrante imbevuta sopra il piatto di coltura refrigerato da 90 mm (Figura 2A).
  8. Usa una lama per tagliare il cervello a metà, separando i due emisferi, e posiziona entrambi gli emisferi sul lato mediale appena tagliato.
  9. Utilizzare una lama per rimuovere la parte dorsale (5%-10%) del cervello da ogni emisfero con un taglio parallelo alla parte dorsale(Figura 2C)30 e posizionare entrambi gli emisferi sul lato appena tagliato con la parte ventrale del cervello rivolta verso l'alto.
  10. Posizionare una goccia di super colla sulla piastra del campione e stendere correttamente con una punta di pipetta per ospitare entrambi gli emisferi.
  11. Utilizzare un cinturino in carta da filtro per raccogliere un emisfero con forze capillari toccando il lato ventrale con il cinturino della carta filtrante, non danneggiando così il tessuto.
  12. Utilizzare un'altra cinghia di carta filtrante per semi-asciugare con cura il lato dorsale del cervello prima di posizionare l'emisfero con il lato dorsale verso il basso sopra la colla sulla piastra del campione. Ripetere la stessa procedura con il secondo emisfero.
    NOTA: Gli emisferi devono essere posizionati in allineamento orizzontale in modo specchiato sulla piastra del vibratoma, con i lati rostrali rivolti verso l'esterno e i lati caudali rivolti (ma non toccanti) l'uno verso l'altro al centro. I lati mediali di entrambi gli emisferi devono puntare verso la lama del vibratomo e i lati laterali verso lo sperimentatore (Figura 2D).
  13. Posizionare la piastra del campione nella camera di affettare e coprirla rapidamente, ma con attenzione, con una soluzione di fetta di saccarosio ad alto contenuto di saccarosio ghiacciata. Non appena la soluzione tocca la colla, solidifica e incolla correttamente gli emisferi alla piastra del campione.
  14. Assicurarsi che gli emisferi siano adeguatamente coperti con soluzione di fette di saccarosio elevato e confermare che la soluzione è bollata con carbogeno.
    NOTA: L'intera procedura di dissezione deve essere eseguita il più velocemente possibile. Si prega di assicurarsi che il cervello non rimanga senza la fornitura di ossigeno per molto tempo. Dovrebbero essere necessario solo circa 1-1,5 minuti dalla decapitazione alla sommersione cerebrale nella soluzione di fette di saccarosio. Questo è il requisito più critico per i preparati acuti delle fette cerebrali al fine di garantire un'alta qualità della fetta.

4. Affezione orizzontale del cervello

  1. Posizionare la lama del vibratomo davanti al lato mediale degli emisferi e abbassarla alla stessa altezza dei lati ventrali degli emisferi che ora sono rivolti verso l'alto. Abbassare la lama con l'aiuto del controllo del vibratomo a 600 μm più avanti nella direzione dorsale e iniziare a affeggiare. La lama dovrebbe colpire il tessuto (in caso contrario, invertire la lama e abbassarla un po 'di più). Affettare fino a quando le prime due fette sono completamente separate dai due emisferi.
  2. Invertire la lama e abbassare altri 300 μm e affettare di nuovo.
  3. Quando l'ippocampo diventa visibile (utilizzare l'atlantecerebrale 31 del mouse per chiedere aiuto, se necessario) (Figura 2E) raccogliere le fette con la pipetta Pasteur in plastica allargata. Raccogli le fette fino a quando il putamen caudato diventa visibile accanto all'ippocampo. Tipicamente, tra 8-12 fette di 300 μm (4-6 per emisfero) possono essere raccolte per il cervello del topo.
  4. Utilizzare la pipetta Pasteur in plastica per raccogliere le fette e trasferirle nella camera di recupero nel bagno d'acqua (Figura 2F) (raccogliere le fette dopo ogni giro di affettare per evitare che galleggiano nella camera a fette).
    NOTA: Lavorare il più velocemente possibile e assicurarsi che la soluzione a fette di saccarosio elevato sia ghiacciata e carbogenata durante l'intera procedura. Se necessario, riempire il ghiaccio che circonda la camera a fette.

5. Recupero di fette cerebrali per registrazioni elettrofisiopatiche

  1. Lasciare le fette nella camera di recupero riempita di ACSF nel bagno d'acqua a 32 °C per 1 h.
    NOTA: Anche le camere di recupero sono disponibili in commercio.
  2. Togliere la camera di recupero dal bagno d'acqua.
  3. Posizionare le fette a RT per almeno altri 30 minuti per il recupero prima di iniziare qualsiasi ulteriore applicazione.

6. registrazioni fEPSP nel percorso perforante mediale (MPP) dell'ippocampo

  1. Estrarre pipette di registrazione dai capillari di vetro borosilicato con un estrattore di pipetta orizzontale per ricevere pipette delle dimensioni di ~ 2 MΩ quando riempite con soluzione ACSF e immerse nella camera di registrazione riempita con ACSF.
  2. Riempire la soluzione da bagno ACSF e la soluzione ACSF contenente le sostanze chimiche appropriate (ad esempio bicucullina) in un sistema di perfusione multi-barile controllato dalla gravità collegato alla camera di registrazione. Carbogenare continuamente tutte le soluzioni.
  3. Accendere una pompa peristaltica o sottovuoto collegata a un tubo di aspirazione che termina di fronte alla linea di perfusione nella camera di registrazione. Aprire la canna riempita con ACSF e iniziare a stabilire un flusso continuo (1-2 gocce al secondo). Verificare che l'elettrodo di riferimento sia immerso nella soluzione ACSF.
  4. Accendere il computer di configurazione, l'amplificatore, il micromanipolatore, lo stimolatore, la luce del microscopio, la fotocamera e il monitor (se applicabile).
  5. Aprire il software appropriato per le registrazioni elettrofisiotiche (esistono diversi fornitori di hardware e software per apparecchiature elettrofisiotiche).
  6. Trasferire un emisfero affetta cerebrale dalla camera di recupero alla camera di registrazione della configurazione della fetta e posizionarlo nell'orientamento corretto con lo strato cellulare del granulo di giro dentato e lo strato molecolare nel campo visivo. Assicurarsi che l'elettrodo di stimolazione possa raggiungere l'MPP nella fetta dalla direzione della corteccia entorinale e che l'elettrodo di registrazione abbia accesso all'MPP dall'esatto lato opposto dalla direzione di CA3.
  7. Stabilizzare la fetta nella camera di registrazione con una graffetta (Figura 3A) o una griglia di fette cerebrali disponibile in commercio.
    NOTA: Può essere utile disattivare la perfusione durante il trasferimento e il posizionamento delle fette. Tuttavia, questo non dovrebbe richiedere troppo tempo per garantire la qualità della fetta cerebrale.
  8. Abbassare e posizionare gli elettrodi di registrazione e stimolazione nell'MPP nel terzo inferiore dello strato molecolare vicino allo strato cellulare del granulo (Figura 3B), uno di fronte all'altro ad una distanza di circa 100-150 μm. L'elettrodo di stimolazione deve contattare minimamente la superficie, mentre l'elettrodo di registrazione dovrebbe infiltrarsi leggermente nel livello superiore della fetta.
  9. Applicare uno stimolo a bassa intensità (30-50 μA per 0,1 ms) sulla fetta cerebrale per ottenere il segnale fEPSP. Adattare la posizione degli elettrodi se necessario (ad esempio, segnale fEPSP a forma bassa o atipica).
  10. Inizia a registrare le curve input-output: applica crescenti intensità di stimolo alla fetta cerebrale a intervalli di 30 s.
  11. Impostare l'intensità dello stimolo sul 50% della risposta massima fEPSP e avviare registrazioni fEPSP di base applicando l'intensità di stimolo del 50% per 20-40 minuti in intervalli di 30 s alla fetta cerebrale.
  12. Se la linea di base sembra essere stabile, procedere con registrazioni aggiuntive (ad esempio, protocolli LTP/LTD e/o applicazioni farmacologiche). (Per l'induzione LTP nell'MPP, qui è stato utilizzato un protocollo composto da impulsi quattro volte 1 s 100 Hz applicati in un intervallo di 5 min. La bicucullina è stata applicata 10 minuti prima e durante la fase di condizionamento.)
    NOTA: tutte le registrazioni devono essere eseguite in modalità clamp corrente con un filtro passa-basso appropriato (<5 kHz) e frequenze di campionamento (>10 kHz).
  13. Estrarre i dati in un formato di file appropriato e analizzare i parametri fEPSP, ad esempio fiber volley, ampiezza fEPSP e pendenza fEPSP.

7. Registrazioni di imaging calcisico di fette cerebrali

  1. Trasferire un emisfero affetta cerebrale in una camera da 12 pozze e caricarlo per 30 minuti a 1 h con un colorante di calcio appropriato. Carbogenare continuamente la soluzione di carico inserendo un tubo di carbogenazione attraverso un foro autoprodato (con un ago caldo 18G) nel coperchio della piastra da 12 poggia.
    NOTA: Questo passaggio non è necessario in caso di preparati a fette cerebrali di animali geneticamente modificati che esprimono endogenamente un reporter fluorescente come GCaMP.
  2. Preparare l'impostazione della registrazione come descritto nei passaggi da 6.2 a 6.5.
    NOTA: Nessun amplificatore o micromanipolatore è necessario per esperimenti di imaging microfluorimetrico. L'uso di uno stimolatore dipende dall'esperimento. Un software specifico per esperimenti di imaging a fluorescenza è essenziale.
  3. Regola il software alle impostazioni di imaging corrette: ciò include l'amplificatore della fotocamera e l'impostazione del binning, l'impostazione della lunghezza d'onda, il tempo di esposizione e il protocollo di temporizzazione. Le impostazioni possono variare a seconda degli esperimenti esatti. (Per l'esempio tracce, binning 1 x 1, guadagno preamplificatore 2.4x, guadagno della fotocamera 300 EM, esposizione di 50 ms a 488 nm ripetuta ogni 500 ms per la durata dell'esperimento è stata utilizzata.
  4. Dopo il caricamento con il colorante al calcio, trasferire l'emisfero della fetta cerebrale dal pozzo 12 alla camera di registrazione e posizionarlo sullo stadio del microscopio.
  5. Stabilizzare la fetta nella camera di registrazione con una graffetta (Figura 3A) o una griglia di fette cerebrali disponibile in commercio simile a quella descritta al passaggio 6.7.
  6. Assicurarsi che l'area di interesse sia nel corretto campo microscopico e a fuoco.
  7. Utilizzare il software di imaging a fluorescenza per selezionare diverse regioni di interesse (ROM) nella sezione.
    NOTA: Può essere utile selezionare l'intero campo visivo per seguire le fluttuazioni generali di luminosità, dovute al fotobleaching.
  8. Avviare la registrazione e applicare i test-farmaci sperimentali nei punti di tempo scelti.
    NOTA: Si consiglia di applicare una soluzione K+ alta alla fine di ogni esperimento per verificare il carattere neuronale delle cellule e la qualità della fetta.
  9. Estrarre i dati in un formato di file appropriato e analizzare le modifiche del segnale di fluorescenza che si verificano nei ROM durante l'intera misurazione. Le ROM possono anche essere adattate durante l'analisi off-line.
    NOTA: Altri protocolli che descrivono le registrazioni fEPSP e la microfluorimetria del calcio nelle fette cerebrali sono disponibili inletteratura 24,32,33,34,35.

Risultati

Panoramica generale degli strumenti e dei passaggi critici necessari per il protocollo
La figura 2 presenta tutti gli strumenti e le fasi critiche necessari per la preparazione di fette cerebrali ippocampali acute orizzontali come descritto in questo protocollo. In generale, è necessario un numero limitato di strumenti chiave, tra cui alcuni strumenti di dissezione e una camera di recupero delle fette(figura 2A),un bagno d'acqua di laboratorio e un vibratomo(figura 2B). Figura 2C-E visualizza i passaggi e gli orientamenti importanti del cervello e degli emisferi durante il protocollo di preparazione delle fette. La figura 2F è un'illustrazione di un risultato atteso di fette cerebrali orizzontali.

Registrazioni fEPSP nel percorso perforante mediale
Dopo il periodo di recupero, le fette cerebrali possono essere utilizzate per registrazioni elettrofisiotiche di fEPS. Qui abbiamo utilizzato un microscopio verticale dotato di un sistema di perfusione a gravità controllata multicanale(Figura 3A e Figura 3B). Una micropipetta di vetro (~ 2 MΩ) è stata riempita con soluzione ACSF e attaccata sopra un elettrodo d'argento rivestito di cloruro che è montato su un amplificatore operativo in circuito con un elettrodo da bagno clorurato. I fEPS sono stati registrati e visualizzati con un amplificatore e un software di registrazione appropriato inserendo la micropipetta di vetro nell'MPP dell'ippocampo nello strato superiore della fetta cerebrale. I fEPSP sono stati indotti dalla stimolazione con un microelettrodo a cluster a 2 contatti, applicando diverse intensità di corrente all'MPP a monte dell'elettrodo di registrazione. Si noti che questo protocollo non ha lo scopo di spiegare come ottenere registrazioni MPP, ma utilizza semplicemente le registrazioni nell'MPP come esempio per dimostrare il successo del protocollo di preparazione delle sezioni descritto qui. Se qualcuno tenta di eseguire registrazioni MPP, potrebbero essere necessari alcuni controlli (ad esempio, registrazioni di impulsi accoppiati) per garantire il sito di registrazione corretto e distinguere l'MPP dall'LPP8,36,37.

La figura 3C illustra un esempio negativo (pannello sinistro, fetta di bassa qualità) e positivo (pannello destro, fetta di alta qualità) di una registrazione fEPSP. La traccia di esempio negativa mostra una grande ampiezza di volley in fibra (FV) che è anche superiore all'ampiezza fEPSP effettiva (≈0,5 mV). Al contrario, l'esempio di sezione di alta qualità (pannello destro) mostra un piccolo rapporto FV-fEPSP e un'ampiezza fEPSP elevata (>0,5 mV). La fibra volley è il segnale che si verifica sulla depolarizzazione delle fibre neuronali stimolate e quindi precede la potenziamento postsinaptica (fEPSP). La relazione tra le proprietà FV e fEPSP fornisce importanti informazioni sulla conservazione delle proprietà assonali e sinaptiche. Le fette di alta qualità con fibre nervose intatte dovrebbero mostrare un elevato rapporto fEPSP e FV. Al contrario, le fette di bassa qualità con proprietà di conduzione compromesse avranno un rapporto fEPSP-FV ridotto. Allo stesso modo, la vitalità di una fetta cerebrale può essere analizzata tracciando le pendenze fEPSP rispetto alle ampiezze del volley in fibra (Figura 3D).

Inoltre, le curve input-output (pendenza fEPSP e ampiezza FV rispetto all'intensità dello stimolo) vengono utilizzate standardmente per determinare la qualità della fetta. Tali curve si ottengono applicando stimoli di corrente crescenti alla fetta cerebrale e monitorando le successive risposte fEPSP. Le fette cerebrali di bassa qualità mostrano una curva input-output ridotta a causa delle proprietà di conduzione non ottimale del tessuto cerebrale scarsamente conservato (Figura 3E,F). Inoltre, le curve input-output sono necessarie per definire l'intervallo di intensità di stimolazione ideale per lo studio dei processi sinaptici. Idealmente, l'intensità dello stimolo dovrebbe essere impostata intorno al 50% dell'intensità per le risposte massime. A questa intensità di stimolo scelta, le risposte fEPSP sono altamente sensibili per eventuali cambiamenti nella plasticità sinaptica, che offre l'opportunità di indagare sia il potenziamento a lungo termine (LTP) che la depressione a lungo termine (LTD).

Al fine di studiare la plasticità sinaptica, la trasmissione sinaptica della fetta cerebrale (pendenza fEPSP) all'intensità di stimolo del 50% scelta viene monitorata per un periodo di tempo più lungo (di solito tra 20-40 minuti) prima della fase di condizionamento. Le fette cerebrali vitali avranno linee di base stabili, mentre le fette cerebrali con una linea di base instabile non possono essere utilizzate per ulteriori protocolli di condizionamento al fine di studiare la plasticità sinaptica deicircuiti cerebrali (Figura 3G, pannello superiore). Le registrazioni di base fEPSP possono anche essere utili per monitorare gli effetti dei farmaci sulla trasmissione sinaptica stessa(Figura 3G,pannello inferiore). La media dei segnali di base fEPSP registrati viene in genere utilizzata per normalizzare un percorso di tempo fEPSP ed è impostata standardmente al 100%.

La plasticità sinaptica può essere studiata applicando specifici protocolli di condizionamento alle fette cerebrali. Questi protocolli dipendono dal circuito cerebrale studiato e dal meccanismo di interesse (ad esempio, LTP o LTD). Al fine di indurre l'LTP nell'MPP del giro dentato, è necessario un forte protocollo di condizionamento a causa della forte inibizione GABAergica presente nelle sinapsi MPP38. È riportato che l'inibizione GABAergica è ancora più pronunciata nelle fette cerebrali preparate con soluzioni di affettare ad alto saccarosio39. Qui, usiamo un protocollo composto da quattro stimolazioni di impulsi lunghi 100 Hz applicati in un intervallo di 5 minuti durante il trattamento con l'antagonista del recettore GABAA Bicuculline (Figura 3H). La co-aggiunta di NMDA e Bicuculline durante il periodo di condizionamento si traduce in un aumento dell'LTP (Figura 3H). La bassa qualità della fetta e la trasmissione sinaptica instabile (linea di base fEPSP) potrebbero comportare un'induzione alterata o non riuscita di LTP e LTD. Pertanto, è di grande importanza lavorare con preparazioni a fette di alta qualità e utilizzare rigorosi criteri di esclusione (basso rapporto fEPSP e fibra di volley (<3), piccola pendenza fEPSP (<0,5 mV/ms) o ampiezza (<0,5 mV) e linea di base fEPSP instabile (variazione superiore al 5%) per fette non praticabili quando si indagano processi sinaptici.

Misurazioni microfluorimetriche del calcio nello strato cellulare granulo del giro dentato
Dopo il recupero, una fetta cerebrale è stata incubata a temperatura ambiente con 2 μM di un colorante sensibile al calcio per 1 h in ASCF carbogenato, schermato dalla luce. La fetta è stata trasferita in una camera di registrazione (Figura 3A) su un microscopio a fluorescenza verticale dotato di un sistema di perfusione multicanale controllato dalla gravità. Le immagini di emissione di fluorescenza sono state acquisite ogni 500 millisecondi dopo l'illuminazione a 488 nm (Figura 4A,B). L'eccitazione è stata fatta con una lampada allo xeno e un monocromatore di diffrazione montato su scanner e l'acquisizione di immagini è stata eseguita con una telecamera CCD controllata dal computer. Durante le misurazioni, la fetta è stata trattata con l'antagonista del recettore NMDA APV, che ha portato a una diminuzione della concentrazione di calcio intracellulare. La stimolazione della fetta con una soluzione extracellulare contenente un'alta concentrazione di potassio (50 mM) ha comportato un massiccio afflusso di calcio extracellulare a causa della depolarizzazione dei neuroni e dell'apertura di canali ionici gated di tensione (Figura 4C).

compostoConcentrazione (mM)Peso molecolare (g/mol)Importo (g)
Kcl2574.551.86
CaCl2 * 2H2O20147.012.94
MgSO4 * 7H2O10246.482.46
KH2PO4 12.5136.081.7

Tabella 1: 10 x fetta pre-soluzione (1 L).

compostoConcentrazione (mM)Peso molecolare (g/mol)Importo (g)
NaCl12558.447.3
Kcl2.574.550.19
CaCl2 * 2H2O2da 1 soluzione CaCl22 mL
MgSO4 * 7H2O1da 1 M MgSO4 soluzione1 mL
NaH2PO4 * 2H2O1.25156.020.2
NaHCO3 2684.012.18
Glucosio * H2O25198.174.95

Tabella 2: 1x ACSF (1 L) (osmolarità compresa tra 305 e 315 mOsm).

compostoConcentrazione (mM)Peso molecolare (g/mol)Importo (g)
Presoluzione fetta 10xN/DN/D25 mL
saccarosio252342.321.57
NaHCO3 2684.010.55
Glucosio * H2O10198.170.49

Tabella 3: 1 soluzione di fette di saccarosio elevato (250 mL) (osmolarità compresa tra 320 e 325 mOsm).

Configurazione sperimentale e orientamento delle fette per il sezionamento del cervello; Include strumenti di dissezione, microtomo, diagrammi.
Figura 2: Informazioni dettagliate sulla preparazione delle fette orizzontali del cervello ippocampale. (A) Immagine degli strumenti necessari per la dissezione e l'affezione del cervello del roditore: a) cinghie di carta filtrante lunghe ±2 cm e larghe ±0,5 cm (ad esempio, grado 413); b lama; c super colla; d punta della pipetta; (e) piastra del campione (viene fornita con vibratoma); f piatto di coltura da 35 mm; g pennello fine; h spatola; — forcep curve; j forbici per la dissezione; k forbici forti (lunghezza della lama superiore a 10 cm); (l pipetta Pasteur in plastica con ampia apertura (di diametro compreso tra 0,6 e 0,8 cm); m camera di recupero (autoprodetta con becher da 250 mL, anello di plastica, rete di nylon, pezzo di pipetta sierologica da 10 mL); n piatto di coltura da 90 mm riempito con ghiaccio e (o) quadrato di carta da filtro sopra il piatto di coltura refrigerato. (B) Immagine di un vibratomo con a) supporto di camera a fette riempita di ghiaccio; b camera a fette; c linea di carbogeno e d lama di taglio. (C) Cartone animato che illustra l'orientamento del taglio del lato dorsale di un emisfero per preparare il cervello all'affezione orizzontale (vedere fase 3.9). (D) Proiezione isometrica dell'orientamento cerebrale sulla piastra campione del vibratomo. (E) Cartone animato che illustra una vista dall'alto della posizione dei due emisferi sulla piastra del campione. (F) Cartone animato che mostra la posizione dell'ippocampo in una fetta di cervello orizzontale. Sono indicate le regioni dentate giro (DG) e Cornu Ammonis (CA)–Subiculum (SB) dell'ippocampo. (G) Immagine di una camera di recupero con ACSF carbogenato contenente dieci fette cerebrali orizzontali appena tagliate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagrammi di esperimenti di neuroscienze che mostrano il posizionamento degli elettrodi, i grafici delle fibre volley e l'analisi degli effetti dei farmaci.
Figura 3: Registrazioni elettrofisiopatiche di fette cerebrali ippocampali. (A) Immagine di una camera di registrazione con perfusione e aspirazione, utilizzata al microscopio verticale. Una fetta cerebrale verrà posizionata nella camera e immobilizzata con un pezzo di una graffetta prima dell'inizio delle registrazioni. (B) Immagine in campo luminoso di una fetta cerebrale ippocampale al microscopio verticale (obiettivo 10x). Sono indicati il giro dentato (DG) e la regione CA3, nonché gli elettrodi di stimolazione (in basso a sinistra) e registrazione (in basso a destra), mirati al percorso perforante mediale durante le registrazioni fEPSP. (C) A sinistra: rappresentazione di un esempio di fetta di bassa qualità di una registrazione fEPSP con una robusta raffica di fibre e una piccola ampiezza. A destra: esempio di fetta di alta qualità di una registrazione fEPSP. La linea grigia indica il livello di base. Le linee tratteggiate indicano l'ampiezza di taglio di 0,5 mV. (D) Grafico della pendenza fEPSP rispetto all'ampiezza dell'FV per le fette cerebrali di alta qualità (nero; n=10) e di bassa qualità (grigio; n=4). Dati rappresentati come media ± SEM. (E) Grafico input-output (pendenza fEPSP) per diverse intensità di stimolazione (μA) per fette di alta qualità (nero; n = 10) e fette di bassa qualità (grigio; n = 4)). (F) Come in (E) ma per le ampiezze della FV rispetto alle intensità di stimolo. (G) Percorso a tempo di tre diverse registrazioni fEPSP di base (pendenza di fEPSP in %; normalizzata alla pendenza fEPSP media dei primi 5 minuti). Il pannello superiore rappresenta un esempio positivo (nero) e negativo (rosso), in cui quest'ultimo ha una linea di base instabile a causa dell'omissione del carbogen durante la registrazione. Il pannello inferiore mostra due registrazioni stabili della linea di base in trattati (dopo 20 minuti di linea di base stabile, i recettori AMPA sono stati bloccati dall'applicazione dell'antagonista del recettore AMPA DNQX (10 μM)) (blu) e condizione non trattata (nero). (H) Decorso a tempo delle registrazioni LTP per diverse condizioni di trattamento (indicato nel pannello inferiore). Colore nero per l'applicazione della bicucullina (20 μM) durante il condizionamento e blu per la co-applicazione della bicucullina (20 μM) e della NMDA (10 μM) durante il condizionamento. Le frecce nel pannello superiore indicano i punti di tempo in cui è stata applicata la stimolazione ad alta frequenza (4 x 1 di 100Hz). Il grafico a barre nel pannello inferiore rappresenta le pendenze fEPSP media (%) per 50-60 minuti dopo l'induzione LTP degli esperimenti mostrati nel pannello superiore (registrazione rappresentativa singola per ogni condizione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Imaging a fluorescenza Hippocampus CA3, analisi del ROI, grafico dell'intensità della fluorescenza, attività sinaptica.
Figura 4: Calcio-microfluorimetria delle fette cerebrali ippocampali. (A e B) Immagine di fluorescenza (eccitata a 488 nm) (A) e mappa termica corrispondente (B) di una fetta cerebrale ippocampale orizzontale del cervello del topo. Il giro dentato (DG), la regione CA3 e un esempio di regione di interesse (ROI) sono indicati nel pannello A. (C) Ciclo temporale delle risposte al calcio (F488 nm)da un ROI nel giro dentato di una fetta cerebrale ippocampale acuta durante il trattamento con l'antagonista del recettore NMDA APV (50 μM) e soluzione contenente alto potassio extracellulare (K+) (50 mM). La traccia viene normalizzata alla più alta risposta di calcio durante l'altaperfusione K + ed è corretta per la fotobleaching. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Sebbene comunemente usati tra la comunità delle neuroscienze, i preparati per le fette cerebrali si trovano anche di fronte a diversi svantaggi. Ad esempio, le connessioni di input e output alle aree cerebrali di interesse non sono più collegate in una fetta cerebrale. Inoltre, una volta isolato, il tessuto inizia a degradarsi lentamente nel tempo e questo processo potrebbe alterare le condizioni fisiologiche della fetta cerebrale. Questo argomento in particolare è molto preoccupante perché la maggior parte delle registrazioni delle fette cerebrali durano diversi minuti o ore, il che si traduce in lunghi giorni sperimentali con registrazioni eseguite su tessuti che sono stati isolati fino a 6-8 ore prima dell'inizio dell'esperimento. Inoltre, il liquido cerebrospinale e la circolazione sanguigna vengono interrotti durante i preparati a fette, il che può portare alla mancanza di importanti composti endogeni all'interno di una fetta cerebrale. E, ovviamente, la procedura di affezione stessa può causare danni meccanici ai tessuti che potrebbero compromettere i risultati ottenuti. Tuttavia, i benefici effettivi dei preparati per le fette cerebrali stanno ancora superando i loro svantaggi, motivo per cui presentano una tecnica molto apprezzata e impiegata nella ricerca sulle neuroscienze.

Le fette cerebrali ippocampali acute presentano una tecnica potente e quindi ampiamente utilizzata per indagare i processi neuronali da un livello molecolare fino a complessi studi sul circuito cerebrale. Questo si basa sulla neuroanatomia ideale dell'ippocampo che può essere facilmente conservato in una preparazione di fette18. Di conseguenza, le fette cerebrali ippocampali sono utilizzate in un'ampia varietà di progetti di ricerca scientifica, tra cui screeningfarmacologici 17,studi sulle proprietà neuronali e sinaptiche coinvolte nelle funzioni cognitive40,41e indagini sulle condizioni patologiche delcervello 14,42,43. Tuttavia, un ampio spettro di applicazioni diverse causa anche una vasta gamma di protocolli di preparazione delle fette disponibili che possono differire in vari parametri, come le condizioni di dissezione e l'orientamento del piano di taglio, tra gli altri. Pertanto, l'esatta questione della ricerca di un progetto scientifico deve essere determinata al fine di scegliere un protocollo di preparazione delle sezioni appropriato.

L'elicottero tissutale presenta una delle più antiche tecniche utilizzate per preparare le fette cerebrali ippocampali44,45. I principali vantaggi di questo metodo di preparazione includono il basso costo dell'elicottero e l'uso rapido e facile46. Tuttavia, gli elicotteri tissutali causano stress meccanico che si traduce in alterazioni morfologiche e morte cellulare47. In confronto, il vibratomo è una macchina piuttosto costosa e il tempo per la preparazione delle fette è significativamente aumentato, il che potrebbe avere un impatto sulla qualità della fetta. Tuttavia, il vibratoma di solito offre un modo più delicato di separare le fette dal tessuto e consente di mantenere il cervello ben raffreddato e ossigenato durante l'intera procedura di isolamento, migliorando così le proprietà dellefette 46. Pertanto, diversi gruppi stanno impiegando standardmente questa tecnica e hanno portato avanti protocolli per la preparazione di fette cerebrali ippocampali acute utilizzando il vibratomo16,30,48. Mentre alcuni protocolli forniscono solo alcuni dettagli per l'affettare se stesso, ma piuttosto concentrarsi suun'applicazionespecifica di tale preparazione della fetta 48 , altri forniscono protocolli slice dettagliati che differiscono nel piano di taglio o in altri dettagli del protocollo (ad esempio, incorporamento di agarosio o soluzioni slice / recovery) fornite inquesto articolo 27,30.

Il protocollo qui descritto presenta un metodo semplice per preparare fette acute di cervello di topo ippocampale orizzontali di alta qualità da giovani animali. Il protocollo è particolarmente utile per preservare il percorso perforante (mediale e laterale) che presenta il percorso di input ippocampale, che proietta dalla corteccia entorinale all'ippocampo8,49,50. Le preparazioni di fette trasversali di ippocampo sagittale, coronale e isolate non preservano correttamente il percorso perforante, che proviene principalmente dagli strati II e V della corteccia entorinale e si proietta in diverse aree all'interno dell'ippocampo18. A causa del posizionamento anatomico della corteccia entorinale in relazione all'ippocampo, le fette cerebrali orizzontali sono una necessità per mantenere le fibre del percorso perforante completamente intatte all'interno della preparazione dellafetta 31. Inoltre, l'affezione orizzontale preserva idealmente le fibre muschiato che si proiettano dal giro dentato ai neuroni CA3 all'interno dell'ippocampo9,30,50. Pertanto, questo metodo di preparazione è di alto valore per gli studi che indagano i percorsi di input ippocampali e i processi relativi alla DG. Inoltre, questo protocollo consente l'indagine del percorso collaterale Schaffer50. Tuttavia, i preparati affetta cerebrale sagittale e coronale sono più comunemente usati quando si studiano le proiezioni di fibre da CA3 a CA1, presumibilmente a causa del loro tempo di preparazione leggermente più veloce che può aumentare la possibilità di ottenere fette di alta qualità. Tuttavia, i preparati orizzontali a fette ippocampali presentano un potente strumento di ricerca poiché consente la conservazione e l'indagine di tutte le vie della fibra ippocampale all'interno di un emisfero a una fetta. Ciò può essere particolarmente utile quando le risposte ai circuiti sono studiate, ad esempio, nelle registrazioni di saggi multielettro.

Una delle principali preoccupazioni quando si preparano le fette cerebrali è la corretta conservazione del tessuto cerebrale. Ciò si ottiene con diverse fasi critiche del nostro protocollo, tra cui una dissezione rapida, l'ossigenazione e il raffreddamento continui e sufficienti del tessuto e la protezione del tessuto cerebrale mediante l'uso del metodo di taglio protettivo con una soluzione di affezione a basso contenuto di sodio e ad alto saccarosio39,51. Nonostante il protocollo qui descritto produca un tasso di successo intorno al 90%, potrebbero essere necessarie misure protettive potenzialmente aggiuntive quando si lavora con tessuti derivati da animali più vecchi o geneticamente diversi o quando si cerca di preservare una specifica popolazione cellulare. Diversi metodi sono già stati segnalati per proteggere i preparati sensibili del tessuto cerebrale. Questi metodi includono l'uso di soluzioni di affettamento a base di NMDG per ridurre la permeazione del sodio52,l'uso di alti livelli di magnesio nella soluzione di affettamento al fine di bloccare l'attività del recettore NMDA53,e l'uso prolungato di soluzioni protettive anche durante il periododi recupero 23. Tutte queste misure si tradurranno in una ridotta eccitotossicità. Inoltre, una perfusione trans-cardiale con soluzioni ACSF protettive a freddo freddo viene spesso utilizzata e necessaria quando si lavora con animali più anziani27.

Le fette cerebrali ippocampali acute sono ideali e ampiamente utilizzate per studi elettrofisiologici per motivi come i segnali di ampiezza elevata che possono essere ottenuti da una fetta cerebrale acuta relativamente spessa (300-500 μm), che garantisce un alto rapporto segnale/rumore11. Le applicazioni elettrofisiotiche usate standard includono registrazioni di campi extracellulari e registrazioni intracellulari inter cellulari in modalità tensione o morsetto di corrente. Al fine di acquisire dati elettrofisiologici di alta qualità, la salute della fetta è di primaria importanza e può essere garantita seguendo rigorosamente il protocollo presentato. Tuttavia, poiché i preparati a fette presentano una tecnica altamente sensibile, prima dell'inizio di ogni esperimento dovrebbe essere regolarmente incluso un controllo di qualità. Diversi parametri possono essere utilizzati come controllo di qualità della fetta e vengono valutati standardmente tramite curve input-output e registrazioni fEPSP o EPSC di base19. Tuttavia, va notato che le proprietà elettrofisiologiche non ottimale possono derivare da errori sperimentali come il posizionamento degli elettrodi, l'orientamento o persino i danni e non rappresentano solo la salute della fetta preparata. Pertanto, è consigliabile eseguire ulteriori controlli di qualità come la semplice visualizzazione e valutazione delle cellule sotto un obiettivo 40x o una colorazione del nucleo DAPI. Tali controlli di qualità possono essere utilizzati per confermare l'integrità costante delle sezioni durante diverse sessioni di preparazione delle sezioni.

La microfluorimetria del calcio presenta una tecnica meno comunemente usata per studiare le fette cerebrali ippocampali. Tuttavia, questa tecnica è di valore aggiuntivo per le registrazioni standard di elettrodi extracellulari e intracellulari, in quanto consente di visualizzare e quantificare i flussi di calcio intracellulare, che sono di grande importanza nella segnalazione neuronale e sinaptica. I cambiamenti nelle concentrazioni intracellulari di calcio sono coinvolti nel rilascio di vescicola del neurotrasmettitore, nella generazione di potenziale postinaptico, nella regolazione della plasticità sinaptica e nella conduzione del nervo assonale54,55,56. Come illustrazione di questa tecnica (Figura 4), abbiamo fatto uso di un colorante al calcio disponibile in commercio. Indiscutibilmente, il trattamento delle fette di tessuto con coloranti di calcio può produrre difficoltà come un aumento dei tempi sperimentali e un carico inefficiente delle cellule neuronali situate più in basso. Tuttavia, le variazioni su questa tecnica potrebbero essere utilizzate per aggirare queste sfide tecniche. Ad esempio, è possibile combinare misurazioni del calcio e registrazioni di patch clamp in fette ippocampali. In questo modo, un colorante fluorescente al calcio potrebbe essere caricato in una cella specifica attraverso la pipetta patch, consentendo le misurazioni della dinamica del calcio in una specifica celladi interesse 57. In alternativa, potrebbero essere utilizzati animali geneticamente modificati che esprimono l'indicatore di calcio, GCaMP58, in tutto il cervello o guidati da un promotore specifico per cellule. È interessante notare che il tessuto cerebrale degli animali GCaMP con un linker diretto a una proteina di interesse potrebbe fornire l'opportunità di determinare il modello di espressione neuronale o indagare il coinvolgimento in scintille e onde di calcio.

Complessivamente, forniamo le linee guida per la preparazione di successo di fette cerebrali ippocampali orizzontali sane e vitali dai topi per registrazioni elettrofisiotiche e di imaging. Questa metodologia è molto utile per accedere ai cambiamenti neurologici che si verificano nelle patologie cerebrali descritte nel giro dentato.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo l'unità di elettrofisiologia del VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research sotto la supervisione del Dr. Keimpe Wierda e del Prof. Inoltre, ringraziamo tutti i membri del Laboratorio di Ricerca del Canale ionico e del Laboratorio di Endometrio, Endometriosi e Medicina Riproduttiva presso il KU Leuven per le loro utili discussioni e commenti.

Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dalla Fondazione per la ricerca-Fiandre (G.084515N e G.0B1819N a J.V.) e dal Consiglio di ricerca del KU Leuven (C1-finanziamento C14/18/106 a J.V.). K.P. è una borsista di ricerca e innovazione FWO [PEGASUS]2 Marie Skłodowska-Curie e ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie (665501) con la Fondazione di ricerca Fiandre (FWO) (12T0317N). K.H. è post-dottorato della Fondazione per la ricerca fiandre, Belgio (12U7918N).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Camera per anestesiafatta in casa - GenericoN/Aplexiglas
Vaporizzatore per anestesiaDrä ger & MSS International LtdIsoflurano Vapor 19.3 & MSS Isofluranoper vaporizzare isoflurano per anestesia dei roditori
Cilindri per il sistema di perfusioneTERUMOSiringhe ipodermiche senza agohttps://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html
Bilicullina metiodurohellobioHB0893https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html
capillari in vetro borosilcatoGB150F-8Phttps://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished
Cloruro di calcio diidratoMerck102382https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Software per l'imaging del calcioTill PhotonicsLiveAcquisition v2.3.0.18
Serbatoio per carbogeniAria LiquideMiscela Alphagaz B50Miscela di gas CO2/O2: 5/95, purezza 5
Microelettrodo clusterFHCCE2C55https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/
Piatto di coltura (35 mm)Corning Life Sciences353001https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001
Piatto di coltura (90 mm)Thermo Fisher Scientific101VR20https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
Pinza curvaStrumenti per scienze11270-20https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-AP5hellobioHB0225https://www.hellobio.com/dap5.html
D-(+)-Glucosio monoidratoSigma Aldrich16301https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en®ion=BE
Fotocamera CMOS digitaleHAMAMATSUORCA-spark C11440-36Uhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html
Forbici da dissezioneStrumenti per scienze fini14058-09https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09
DNQXhellobioHB0262https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html
Telecamera EMCCDAndoriXon TM + DU-897E-CSO-#BVhttps://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE
EPC10 USB Doppio Patch Clamp AmplificatoreHEKA Elektronik895278https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf
Carta da filtroVWR516-0818grado 413
Pennello fineRaffaello Kaerell8204Misura #1
18G agoHenke Sass Wolf Fine-Ject18G X 1 1/2" 4710012040https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/
IsofluranoDechra Veterinary ProductsIso-Vet 1000mg/g250 ml flacone
Loctite 406Henkel Tecnologie adesiveLoctite 406Super colla
Solfato di magnesio eptaidratoMerck105886https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MicromanipolatoreLuigs & NeumannSM-10 con sistema di controllo remoto SM-7https://www.luigs-neumann.org
Microscopio (per imaging del calcio)OlympusBX51WIhttps://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/
Microscopio (per registrazioni elettroniche)ZeissAxio Examiner.A1https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/
Fonte di luce per microscopioCAIRN Researchdoppio alimentatore OptoLedhttps://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/
MonocromatoreTill PhotonicsPolychrome V
Acido N-metil-D-aspartico (NMDA)Sigma AldrichM3262https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en®ion=BE
Oregon Green® 488 BAPTA-1Sonde molecolari Invitrogen#06807Osmometro 10x50ug
Osmometro a pressione di vapore Wescor5500per verificare l'osmolarità delle soluzioni saline
Pompa peristalticaThermo Fisher ScientificMasterflex C/L 77120-62https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229
pHmetroserie WTWinoLab pH 720https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf
Estrattore per pipetteSutter InstrumentP-1000https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html
Cloruro di potassioChem-labCL00.1133https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528
Diidrogeno fosfato di potassioMerck104873https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Lama di rasoio per preparare gli emisferiSPI fornisceDispenser di cartucce di sicurezza - Pkg/10Lame di rasoio GEM Scientific a filo singolo
Lama di rasoio per vibratomoTed Pella Inc121-6lame di rasoio a doppio taglio stile frangibile (acciaio inossidabile rivestito in PTFE)
Camera di recuperofatta in casa - GenericoN/Aper raccogliere e conservare fette di cervello (vedi dettagli nel manoscritto)
ForbiciQualsiasi aziendaN/ALa lama deve essere ben affilata e lunga almeno 15 cm per una facile decapitazione
Filo per elettrodi d'argentoQualsiasi aziendaper la registrazione e il riferimento di elettrodi
Sodio diidrogeno fosfato diidratoMerck106342https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Carbonato acido di sodioAlfa Aesar14707https://www.alfa.com/en/catalog/014707/
Cloruro di sodioFisher ScientificS/3160/60https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420
Software per registrazioni sul campoHEKA ElektronikPatchMasterhttps://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf
SpatolaSigma AldrichS9147-12EAhttps://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en®ion=BE
StimolatoreA.M.P.IISO-FLEX
SaccarosioVWR International Ltd.102745Chttps://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf
Tubi per linee di carbogeno, perfusione e aspirazione 1Warner Instruments64-0167Tygon Tubing (TY-50) per sistemi di valvole standard
Tubi per carbogen, perfusione e linee di aspirazione 2Fisher Scientific800/100/200 & 800/100/280Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE
Tubing Pompaper vuotofatto in casa - GenericoN / A
8 valvole multi-barile sistema di perfusionefatto in casaN / Aè costituito da barili, tubi e un controllo automatizzato della valvola autocostruito (le specifiche di tutte le parti acquistate possono essere trovate in questa tabella)
Valvole magnetiche (per controllare le linee di perfusione)NResearch Inc.cod. 161P011https://nresearch.com/
VibratomeLeica14912000001Lama vibrante semiautomatica microomei VT1200
Bagno d'acquaMemmertWNB 7https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf
Sistema di purificazione dell'acquaMerckSynergy milliporeper ottenere acqua altamente purificata
a 12 pozzetti piastreGreiner Bio-OneCELLSTAR, 665180http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf
http://www.ampi.co.il/isoflex.html

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