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Biology

चूहों में म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस के वीवो मूल्यांकन में

Published: December 18, 2020 doi: 10.3791/61929
Automatic Translation
1, 1
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

इस प्रकाशन में, हम दोहरी-मोडलेसी रेडियोन्यूक्लाइड इमेजिंग का उपयोग करते हुए वीवो में चूहों में एयरवे म्यूकोसिलीरी क्लीयरेंस (एमसीसी) का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल एक दोहरी SPECT/CT प्रणाली में माउस पूरे शरीर (MWB) कॉलेमेटर का उपयोग करके एक फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (SPECT) और गणना टोमोग्राफी (सीटी) अधिग्रहण प्रोटोकॉल के लिए डिज़ाइन किया गया है ।

Abstract

श्वसन मोटिवल सिलिया, कोशिका के विशेष ऑर्गेनेल्स, श्वसन तंत्र को अस्तर करने वाली एपिथेलियल कोशिकाओं की एपिकल सतह को लाइन करते हैं। मेटाक्रोनल, सिंक्रोनल फैशन में पिटाई करके, ये कई, मोटिवल, ऐक्टिन-आधारित ऑर्गेनेल्स साँस लेने वाले प्रदूषकों और रोगजनकों के श्वसन तंत्र को साफ करने वाला सिफलाड द्रव प्रवाह उत्पन्न करते हैं। बढ़ते पर्यावरण प्रदूषण, उपन्यास वायरल रोगजनकों और उभरते बहु-दवा प्रतिरोधी बैक्टीरिया के साथ, फेफड़ों के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए सिलिया जनित म्यूकोसिलिएरी क्लीयरेंस (एमसीसी) आवश्यक है। एमसीसी प्राथमिक सिलियरी डिस्किनेशिया, सिस्टिक फाइब्रोसिस के साथ-साथ क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज जैसे अधिग्रहीत विकारों जैसे कई जन्मजात विकारों में भी उदास है । इन सभी विकारों की स्थापना की है, कुछ मामले में कई, माउस मॉडल । इस प्रकाशन में, हम वीवो में चूहों में एमसीसी को सही और पुन: उत्पन्न करने के लिए रेडियोधर्मिता और दोहरे-मोडलिटी SPECT/CT इमेजिंग की एक छोटी राशि का उपयोग करके एक विधि का विस्तार करते हैं । विधि इमेजिंग के बाद चूहों की वसूली के लिए अनुमति देता है, धारावाहिक माप संभव बना रही है, और समय के साथ संभावित चिकित्सीय परीक्षण। जंगली प्रकार के चूहों में डेटा एमसीसी माप की पुन: उत्पन्नता को दर्शाता है जब तक विस्तार पर पर्याप्त ध्यान दिया जाता है, और प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन किया जाता है।

Introduction

सिलिया सूक्ष्मतुबुल आधारित सेलुलर ऑर्गेनेल्स हैं जो शैवाल से मनुष्यों तक विकासवादी इतिहास में संरक्षित हैं। वे कोशिका की सतहों से निकलते हैं और1कई कार्य होते हैं, जो स्थानीय पर्यावरणीय संवेदी संकेतों की मान्यता से लेकर गतिशीलता तक होते हैं, ऐसे कार्य जिन्हें मनुष्यों से प्रारंभिक एककोशिकीय यूकेरियोटिक जीवों में वापस खोजा जा सकता है2,3। सिलिया पर्यावरण संकेतों को संसाधित करने के लिए सेल के विशेष एंटीना के रूप में गैर-गतिशील और एकल सेवारत हो सकता है; या मोती और मल्टीपल, सिंक्रोनाइज्ड, मेटाक्रोनल तरंगों में पिटाई तरल प्रवाह उत्पन्न करने के लिए, जैसे फैलोपियन ट्यूबों और ऊपरी और निचले वायुमार्ग की परत में, टर्मिनल ब्रोंकिओल्स को छोड़कर अल्वियोली1,2.

श्वसन तंत्र की व्यापक एपिथेलियल सतह संभावित खतरनाक साँस प्रदूषकों और रोगजनकों की एक किस्म के रूप में संदूषण की एक निरंतर बौछार के संपर्क में है, एक रक्षा की आवश्यकता है । एक प्रमुख रक्षा तंत्र श्वासनली पेड़ का म्यूकोसिलियरी तंत्र है, जहां स्रावित बलगम का एक सतत प्रवाह यांत्रिक रूप से ट्रेको-ब्रोंकियल एपिथेलियल कोशिकाओं की एपिकल सतहों को अस्तर करने वाले कई मोटिवल सिलिया की धड़कन से वायुमार्ग से बाहर ले जाया जाता है। ये सांस लेने वाले संदूषकों को फंसाने के लिए कार्य करते हैं, और उनके निरंतर, समकालिक पिटाई के माध्यम से, उन्हें सिफलाड4,5परिवहन करते हैं।

सिलिया को भ्रूण के विकास में बाएं-दाएं पैटर्निंग के विकास में महत्वपूर्ण भूमिकाओं का प्रदर्शन किया गया है, जहां भ्रूण नोड ब्रेक समरूपता6में मोटिवल सिलिया। सिलिया से संबंधित जीन में उत्परिवर्तन हृदय6की असममित संरचना के कारण जन्मजात हृदय रोग (सीएचडी) जैसी बीमारियों से जोड़ा गया है । हाल के अध्ययनों से सीएचडी वाले रोगियों के श्वसन तंत्र में सिलियरी रोग की उच्च घटनाओं के साथ-साथ ऊपरी औरनिचले वायुमार्ग7,8,9,10में पोस्ट-ऑपरेटिव श्वसन जटिलताओं और पुरानी श्वसन तंत्र के लक्षणों की बढ़ी हुई व्यापकता की सूचना मिली है। एचएचडी और सिलियरी डिसफंक्शन वाले रोगियों के साथ या बिना हेट्रोटैक्सी के रोगियों को श्वसन जटिलताओं और नकारात्मक श्वसन परिणामोंके बाद5,8,10के जोखिम में वृद्धि करने का प्रदर्शन किया गया है। संकेत और विकास में उनकी भूमिकाओं से परे, एयरवे सिलिया के महत्व को सिलिओपैथी द्वारा प्रदर्शित किया गया है, जिनमें से एक प्रमुख उदाहरण प्राथमिक सिलियरी डाइस्किनेशिया (पीसीडी) है। पीसीडी एक जन्मजात विकार है जिसके परिणामस्वरूप मोती श्वसन सिलिया को प्रभावित करने वाले कई उत्परिवर्तन होते हैं, जिससे आवर्ती फेफड़ों के संक्रमण, ब्रोंकिएक्टासिस और संभावित रूप से फेफड़ों के प्रत्यारोपण11की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, भले ही सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) में सिलिया सामान्य हैं, कोकेशियान आबादी में सबसे आम जन्मजात विकार, एमसीसी मोटी, चिपचिपा बलगम के कारण बिगड़ा हुआ है जिसके परिणामस्वरूप सीएफटीआर जीन12में उत्परिवर्तन होता है। पीसीडी और सीएफ के कई माउस मॉडल हैं, साथ ही सीएचडी के मॉडलों की बढ़ती संख्या भी है। अंततः सिलिया कई प्रमुख भूमिकाओं के साथ बहुमुखी संरचनाएं हैं, और वीवो में मोटिवल श्वसन सिलिया के कार्य का आकलन करने की एक विधि पूर्व-नैदानिक अध्ययन के लिए मूल्यवान हो सकती है, और म्यूटेशन के प्रभावों के साथ-साथ म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस (एमसीसी)13पर दवाओं का आकलन कर सकती है। विधि भी इन माउस मॉडल में उपन्यास दवाओं, जीन थेरेपी या एमसीसी पर हस्तक्षेप के प्रभाव का आकलन करने में मूल्यवान होगा ।

एमसीसी का आकलन करने के लिए कई अलग-अलग मॉडल का इस्तेमाल किया गया है। एक उल्लेखनीय विधि में मेथिलीन ब्लू डाई का उपयोग शामिल है जिसे ब्रोंचस में डाला गया है, जिसमें डाई आंदोलन14के फाइबरऑप्टिक माप द्वारा मापा गया निकासी है। यह विधि डाई के आंदोलन का निरीक्षण करने की क्षमता से सीमित है, जो पूर्व-नैदानिक माउस मॉडल की तुलना में मनुष्यों में अधिक दिनचर्या है। एक अन्य उल्लेखनीय विधि सिंक्रोट्रॉन चरण-कंट्रास्ट एक्स-रे इमेजिंग (पीसीएक्सआई) है, जिसका उपयोग वायुमार्ग में व्यक्तिगत कणों को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। यह विधि अपेक्षाकृत नई है और व्यापक रूप सेसुलभनहीं है । वीडियो-माइक्रोस्कोपी के लिए ट्रेकिया को उत्तेजित करके वायुमार्ग का आकलन करने के कई पूर्व वीवो विधियां हैं, हालांकि ये मॉडल मानव रोगियों में थोड़ी उपयोगिता प्रदान करते हैं16। सिलिया इमेजिंग जैसे ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी के लिए उच्च संकल्प तकनीकें उसी तरह सीमित हैं17.

इस लेख में, हम वीवो में एमसीसी को मापने के लिए एक प्रजनन योग्य विधि प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग असंख्य पशु मॉडलों में फेफड़ों की मंजूरी को मापने के लिए किया गया है, साथ ही क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज में एमसीसी का अध्ययन करते हैं और इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं के प्रभावों का आकलन करते हैं18,19। यह विधि फेफड़ों में पैदा करने के बाद रेडियोफार्मास्युटिकल 99 मीटरटेक्नेनियम-सल्फर कॉलॉइड(99 मीटरटीसी-एससी), एक अघुलनशील पार्टिकुलेट रेडियोट्रेसर की निकासी को ट्रैक करती है। इसके बाद रेडियोन्यूक्लाइड को सिंगल फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (SPECT)18,20का उपयोग करके ट्रैक किया जा सकता है । हमने एमसीएसी को मापने के लिए इस तकनीक को दोहरी मोडलाई स्पेक्ट और कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) इमेजिंग का उपयोग करके परिष्कृत किया है, जिसमें रेडियोआइसोटोप के सह-स्थानीयकरण फेफड़ों में गिना जाता है और 6 घंटे से अधिक इन मामलों में कमी को मापने के साथ। दोहरी तौर-तरीके इमेजिंग, सीटी और SPECT छवियों के सह-पंजीकरण के साथ विकिरण के सटीक स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है ब्याज के हमारे क्षेत्र, फेफड़ों के लिए मायने रखता है । यद्यपि हम चूहों में एमसीसी माप के लिए विधि का विस्तार से वर्णन करते हैं, लेकिन चूहों में एमसीसी का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल को समायोजित किया जा सकता है। कॉलिमेटर को विकिरण खुराक के साथ-साथ समायोजित करने की आवश्यकता होगी। हमारे विचार में, माउस एमसीसी स्कैन छोटे जानवरों के आकार के कारण अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं, लेकिन कई मानव विकारों के स्थापित माउस मॉडल की बड़ी संख्या के कारण चूहों की तुलना में अधिक उपयोगी हैं। इसके अतिरिक्त, उनकी कम लागत और पशु कालोनियों में रखरखाव की लागत के कारण, चूहों में एक बड़ा नमूना आकार अधिक व्यवहार्य है।

Protocol

पिट्सबर्ग के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय के सभी पशु इन पशु प्रयोगों में से किसी को शुरू करने से पहले इस प्रकाशन में निर्दिष्ट प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी ।

नोट: यह प्रोटोकॉल विवरण कैसे एक दोहरी तौर-तरीके SPECT/सीटी स्कैनर के साथ रेडियोन्यूक्लाइड इमेजिंग का उपयोग वीवो म्यूकोसिलेरी क्लीयरेंस अध्ययन में प्रदर्शन करने के लिए । प्रदर्शित तकनीकों में सिस्टम अंशांकन, चूहों का एनेस्थेटाइजिंग, चूहों का श्वास नल, फेफड़ों में आइसोटोप को पैदा करना, दोहरे-मोडलेपी इमेजिंग, इन छवियों का सह-पंजीकरण और विश्लेषण चल रहा है।

1. SPECT/CT सिस्टम सेटअप

  1. एक उपयुक्त कार्यप्रवाह डिजाइन करें और जीवित जानवरों का उपयोग करके प्रयोगचलाने से पहले सेट करें।
    1. रोटेशन के 40 सेमी त्रिज्या के साथ अनुमानों के बीच 6ओ के एक कदम आकार के साथ 60 अनुमानों से मिलकर एक SPECT अधिग्रहण का प्रयोग करें। सीटी अधिग्रहण अनुमानों के बीच एक १.६ओ कोण के साथ २२० अनुमानों के होते हैं ।
  2. सुनिश्चित करें कि सिस्टम में चूहों और स्पेक्ट इमेजिंग के लिए सही एमडब्ल्यूबी कॉलेमेटर हैं। यदि अनुचित कॉलेमेटर स्थापित किए गए हैं, तो सही लोगों को स्थापित करने के लिए कोलिमेटर जादूगर का उपयोग करें।
  3. उपयोग के लिए सिस्टम तैयार करने के लिए आवश्यक सिस्टम अंशांकन चलाएं।
    नोट: स्कैनर के स्पेक्ट और सीटी घटकों को अंशांकन की आवश्यकता होती है। एक स्रोत कंडीशनिंग और एक डार्क/लाइट (डी/एल) अंशांकन का उपयोग कर सीटी घटकों अंशांकन एक दिन में एक बार, एक केंद्र ऑफसेट (COS) अंशांकन हर 2 सप्ताह, और एक्स-रे हार्डवेयर हर महीने का मूल्यांकन । स्पेक्ट घटकों को वर्ष में एक बार अंशांकित करने की आवश्यकता होती है।
    1. एक्स-रे हार्डवेयर का मूल्यांकन करने के लिए, सीटी अंशांकन(पूरक सीटी अंशांकन मेनू)के दौरान मूल्यांकन एक्स-रे हार्डवेयर बॉक्स की जांच करें।
    2. स्रोत कंडीशनिंग करने के लिए, सीटी अंशांकन(पूरक सीटी अंशांकन मेनू)के दौरान प्रदर्शन स्रोत कंडीशनिंग बॉक्स की जांच करें ।
    3. डी/एल अंशांकन करने के लिए, सीटी अंशांकन के दौरान प्रयोगों के दौरान उपयोग किए जाने वाले सीटी अधिग्रहण प्रोटोकॉल के बगल में डी/एल बॉक्स की जांच करें । अन्य सभी प्रोटोकॉल(पूरक सीटी अंशांकन मेनू) कोअनचेक करें।
    4. एक COS अंशांकन प्रदर्शन करने के लिए, अंशांकन अंगूठी उपकरण के साथ बिस्तर की जगह, गति नियंत्रण सेटिंग्स में मैच के लिए बिस्तर प्रकार सेटिंग्स को समायोजित करें, और सीटी अंशांकन के दौरान प्रयोगों के दौरान इस्तेमाल सीटी अधिग्रहण प्रोटोकॉल के बगल में COS बॉक्स की जांच करें । अन्य सभी प्रोटोकॉल(पूरक सीटी अंशांकन मेनू, पूरक अंशांकन रिंग)को अनचेक करें।

2. माउस इंडबेशन और इंस्टाइल

  1. चूहों को स्कैन करने के लिए तौलें। यदि कई चूहों को स्कैन करते हैं, तो कान पंचिंग या पूंछ के अंकन जैसे तरीकों का उपयोग करके पहचान उद्देश्यों के लिए चूहों को चिह्नित करने का ध्यान रखें।
  2. पर्याप्त गहराई के संज्ञाहरण का उत्पादन करने के लिए, जब तक सांस लेने के लिए ~55-65 सांस प्रति मिनट 16(चित्रा 1A)के लिए धीमा कर देता है, ~ 55 मिनट के लिए एक गैस कक्ष में 2 एल/मिन O2 के गैस प्रवाह के साथ 1.5% आइसोफ्लुन का उपयोग कर एक माउस एनेस्थेटाइज करें।
  3. कक्ष से माउस निकालें और एक 45ओ झुकाव पर एक intubation स्टैंड पर सामने छेदक द्वारा निलंबित। इंडबेशन स्टैंड को नाक के शंकु से लैस करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि माउस को इंस्टुबेशन(चित्रा 1B)के दौरान एनेस्थेटाइज्ड किया गया है।
  4. एक प्रकाश स्रोत के लिए एक 50 माइक्रोन फाइबर ऑप्टिक तार के एक छोर कनेक्ट और एक गाइड(चित्रा 1C)के रूप में कार्य करने के लिए तार का उपयोग कर उस पर एक 20 गेज कैनुला धागा।
  5. माउस का मुंह खोलें और कुंद संदंश का उपयोग करके जीभ को आगे खींचें। गाइड तार को रोशन करें और मुखर रस्सियों(चित्रा 1D)की कल्पना करने के लिए इसका उपयोग करें।
  6. मुखर रस्सियों के माध्यम से गाइड तार पास इतना है कि तार सिर्फ मुखर रस्सियों से परे है और ऊपरी श्वासनली में आराम कर रहा है। माउस को intubate करने के लिए तार के साथ 1 इंच कैनुला को आगे स्लाइड करें, कैनुला को काफी गहरा पास कर रहा है ताकि इसका हब जानवर के छेदक(चित्रा 1E)के खिलाफ हो। जगह में कैनुला छोड़ने के तार को हटा दें।
  7. एक उंगली के साथ कैनुला को संक्षेप में प्लग करके और सांस लेने में परिवर्तन की जांच करके इंस्टुबेशन का परीक्षण करें। सांस लेने को रोक दिया या तनावपूर्ण सांस लेने जबकि प्लगिंग और रिहाई पर त्वरित श्वास उचित श्वास नली के लक्षण हैं । यदि कैनुला को प्लग करने पर श्वसन पैटर्न में कोई परिवर्तन नहीं होता है, तो बाद घेघा में होने की संभावना है।
  8. 99 मीटर टेक्नेनियम-सल्फर कोलॉयड (99 मीटरटी-एससी) के 0.2 मिलियन एमसीआई को 10 माइक्रोन की मात्रा में तैयार करें, और कैनुला में पिपेट करें। माउस को अनायास 1-2 मिनट(चित्रा 1F)से अधिक फेफड़ों में सांस लेने की अनुमति दें। स्कैनर के फूस के लिए माउस स्थानांतरित करने से पहले कैनुला निकालें।
    नोट: रेडियोन्यूक्लाइड कार्डिनल स्वास्थ्य द्वारा तैयार और फ़िल्टर किया गया था।

3. SPECT/CT इमेजिंग

  1. माउस को नाक शंकु के साथ 25 मिमी फूस में स्थानांतरित करें और टेप के साथ सुरक्षित करें, श्वसन को ख़राब करने से बचने के लिए छाती और पेट को भी कसकर टेप न करने का ख्याल रखें। माउस से जुड़े किसी भी धातु कान टैग को हटाने के लिए ध्यान रखें।
  2. 200 माइक्रोन में 0.05 एमसीआई से मिलकर एक रेडियोधर्मी प्रेत तैयार करें और इस राशि को 0.2 मिलील पीसीआर ट्यूब में रखें। फेफड़ों के साथ ओवरलैप से बचने, माउस के निचले पेट के नीचे फूस को टेप करके ट्यूब की स्थिति।
    नोट: प्रेत का उपयोग सीटी और स्पेक्ट छवियों को सह-पंजीकरण करने के उद्देश्य के साथ-साथ निकासी के लिए नकारात्मक नियंत्रण के लिए किया जाता है।
  3. SPECT/CT सिस्टम में माउस डालें, इमेजिंग वर्कफ्लो का चयन करें, और सेटअपचलाएं ।
  4. माउस पर डिटेक्टरों की स्थिति सेट करें, और इमेजिंग वर्कफ्लो चलाएं।
  5. चूहों के लिए एक पिंजरे तैयार करें जिन्हें रेडियोधर्मिता के बाद प्रक्रिया प्राप्त हुई है, भोजन और पानी तक अप्रतिबंधित पहुंच के साथ, और विकिरण सुरक्षा स्टीकर का उपयोग करके स्पष्ट लेबलिंग।
  6. वर्कफ़्लो के पूरा होने पर, माउस को इमेजिंग फूस से हटा दें, और इसे भोजन और पानी तक विज्ञापन लिबिटम पहुंच के साथ स्कैन (स्कैन 1 के अंत से स्कैन 2 की शुरुआत तक) के बीच 6 घंटे की अवधि के लिए तैयार पिंजरे में ठीक होने की अनुमति दें। 6 एच को चुना गया क्योंकि यह उस समय अवधि से मेल खाता है जिसमें सिलिया फ़ंक्शन के आधार पर रैखिक निकासी बहुत कम अल्वीलर क्लीयरेंस के साथ हो रही है।
  7. 6 घंटे के बाद, वायुमार्ग से मंजूरी देने वाले आइसोटोप की मात्रा को मापने के लिए एक ही वर्कफ़्लो का उपयोग करके, प्रेत के साथ माउस और स्कैन को फिर से एनेस्थेटाइज करें।
    नोट: माउस को 6 घंटे के लिए आइसोफ्लाणे के साथ निर्बाध संज्ञाहरण के रूप में ठीक होने की अनुमति देना महत्वपूर्ण है, जिसके परिणामस्वरूप शून्य म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस के पास होगा।

4. विश्लेषण

  1. इमेजिंग के बाद, पूर्ण 3डी स्टैक छवियों के पुनर्निर्माण के लिए पोस्ट-प्रोसेसिंग करें।
    1. हिस्टोग्राम 99mटीसी के लिए कारखाने मानक सेटिंग्स का उपयोग करके SPECT छवियां, और फिर एक MAP3D एल्गोरिदम और बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) पुनर्निर्माण का उपयोग करके पुनर्निर्माण करें।
      नोट: पुनर्निर्माण 8 पुनरावृत्तियों और 6 सबसेट का उपयोग कर किया गया था । एक प्रभावी पुनर्निर्माण 1:10 पर अनुमानों के लिए सबसेट के अनुपात की जरूरत है या अनुमानों की संख्या में समान रूप से विभाजित है, तो 6 सबसेट ६० अनुमानों का उपयोग कर अधिग्रहण के कारण इस्तेमाल किया गया ।
    2. फेल्डकामप एल्गोरिदम और शेप-लोगान फिल्टर का उपयोग करके सीटी छवियों का पुनर्निर्माण करें।
      नोट: पुनर्निर्माण 4 पुनरावृत्तियों का उपयोग करके किया गया था।
  2. डिफ़ॉल्ट अक्षीय छवियों से कोरोनल दृश्य छवियों को उत्पन्न करने के लिए रेस्लिक टूल का उपयोग करके फिजी इमेजजे21 में सीटी और SPECT छवियों को संसाधित करें। फिर प्रत्येक स्लाइस से गिनती डेटा जोड़ने और विश्लेषण की आसानी के लिए एक छवि उत्पन्न करने के लिए SPECT छवि पर एक जेड-स्टैक राशि प्रक्षेपण करें।
  3. एक संदर्भ(चित्रा 2ए, बी)के रूप में प्रेत एपेंडोर्फ ट्यूब का उपयोग करके सीटी और स्पेक्ट छवियों का आकार और सह-पंजीकरण करें। सभी नमूनों में लगातार आकार का आकार मापन ट्रैक करें और उपयोग करें।
  4. बिनायराइज ऑटो थ्रेसिंग का उपयोग करके सीटी छवि को, स्टैक को उलटने के बाद, और विश्लेषण के लिए फेफड़ों की रूपरेखा उत्पन्न करने के लिए जेड-स्टैक राशि प्रक्षेपण का प्रदर्शन(चित्रा 2 सी)।
  5. सीटी और SPECT छवियों को घुमाएं और चैनल टूल का उपयोग करके छवि को मर्ज करें। सही फेफड़ों के चारों ओर एक आरओआई ड्राइंग और मापने(चित्रा 2D)द्वारा एमसीसी की गणना करें ।
    नोट: यह माप 0 और 6 घंटे के समय अंक के लिए सही फेफड़ों में कुल गिनती का होगा, 6 घंटे के सूत्र का उपयोग कर रेडियोधर्मी क्षय के लिए सही छवियों के साथ: N(t)= N0ई −टी। 99 मीटर टी-एससी का क्षय 3.21ई−5 प्रति सेकंड होता है, जिसमें ~6 घंटे का आधा जीवन होता है। इन मूल्यों को तो एक प्रतिशत निकासी की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    नोट: सही फेफड़ों रॉय ड्राइंग और मापने की गिनती के लिए चुना जाता है के रूप में म्यूकोसिलिएरी निकासी फेफड़ों से बाहर रेडियोआइसोटोप परिवहन होगा pharynx जहां से यह निगल लिया जाएगा और पेट में खत्म हो जाएगा । अक्सर, गिनती पेट में देखा जा सकता है कि बाएं फेफड़ों के साथ ओवरलैप हो सकता है और इसलिए गलत मायने रखता है उत्पादन । केवल दाहिने फेफड़ों में गिनती को मापने से इस भ्रामक से बचा जा सकता है।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने एक आइसोफ्लुने कक्ष(चित्रा 1A)में चूहों को एनेस्थेटाइज्ड किया। संज्ञाहरण के पर्याप्त स्तर को प्राप्त करने के बाद, चूहों को ऊर्ध्वाधर समर्थन(चित्रा 1 बी)पर रखा गया था और मुखर तारों को एक प्रबुद्ध गाइड तार(चित्रा 1सी-1डी)का उपयोग करके कल्पना की गई थी। चूहों को एक कैनुला और चूहों के माध्यम से 10 माइक्रोन की मात्रा में 0.2 एमसीआई 99 मीटरटी-एससी के साथ डालने और डाले गए थे, जो अनायास फेफड़ों में सांस लेने की अनुमति देते थे(चित्रा 1ई-1F)। छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण के बाद, सीटी और SPECT छवियों को एक मील का पत्थर(चित्रा 2B)के रूप में प्रेत ट्यूब का उपयोग कर(चित्रा 2A)को कोलोकैलाइज्ड किया गया था। फेफड़ों के मास्क सीटी छवि(चित्रा 2 सी)से उत्पन्न होते थे और 0(चित्रा 2D)और 6 घंटे(चित्रा2ई-2F)पर विश्लेषण के लिए सही फेफड़ों के आसपास आरओआई आकर्षित करने के लिए उपयोग किए जाते थे। प्रोटोकॉल की प्रजनन क्षमता का परीक्षण करने के लिए, कुल 8 चूहों को समान प्रयोगात्मक स्थितियों के साथ अलग-अलग दिनों में दो बार स्कैन किया गया था, विश्लेषण के साथ एक युग्मित टी-टेस्ट का उपयोग करके दोहराने वाले स्कैन (पी-वैल्यू = 0.9904)(चित्रा 3 ए)के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया गया है। एक अतिरिक्त 2 चूहों को समान प्रयोगात्मक स्थितियों के साथ अलग-अलग दिनों में तीन बार स्कैन किया गया था, विश्लेषण के साथ एक-तरफा एनोवा का उपयोग करके दोहराने वाले स्कैन (पी-वैल्यू 0.0041)(चित्रा 3B)के बीच महत्वपूर्ण मिलान दिखाया गया था। कुल 8 चूहों को स्कैन किया गया और दो प्रतिनिधि छवियां प्रदर्शित की गईं(चित्र 4)।

Figure 1
चित्रा 1: माउस इंस्टुबेशन और आइसोटोप इन्सेलेशन। वायुमार्ग में आइसोटोप को जड़ से मोड़ने और पैदा करने के लिए आवश्यक चरणों की छवियां। A)माउस एक कक्ष में एनेस्थेटाइज्ड है। ख)एनेस्थेटाइज्ड माउस को एक ऊर्ध्वाधर समर्थन पर रखा जाता है, जो सामने के छेदक द्वारा निलंबित किया जाता है। C)गाइड वायर के रूप में परोसने वाला एक प्रबुद्ध 0.5 मिमी फाइबर ऑप्टिक तार 20 जी कैनुला के माध्यम से इसे चलाकर तैयार किया जाता है। घ)माउस का मुंह संदंश का उपयोग करके खोला जाता है और मुखर तारों की कल्पना करने के लिए रोशन गाइडवायर का उपयोग करके प्रकाशित किया जाता है। ई)कैनुला मुखर रस्सियों के पार धकेल दिया है और गाइडवायर हटा दिया जाता है। एफ) घुलनशील आइसोटोप को एक पिपेट का उपयोग करके कैनुला में डाला जाता है और माउस को अनायास आइसोटोप को फेफड़ों में सांस लेने की अनुमति दी जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: SPECT/सीटी एक एमसीसी स्कैन की छवियां । A)एक SPECT छवि जिसे सीटी छवि के साथ सह-स्थानीयकृत किया गया है। B)एक दृश्यमान प्रेत ट्यूब के साथ एक सीटी छवि जिसका उपयोग सह-स्थानीयकरण के लिए किया जाता था। ग)सीटी छवि को बिनारिज करके और जेड-स्टैक योग प्रक्षेपण का प्रदर्शन करके प्राप्त वायुमार्ग का एक मुखौटा । घ)सीटी मास्क SPECT छवि के साथ सह-स्थानीयकृत । विश्लेषण के लिए एक आरओआई सही फेफड़ों के आसपास तैयार किया गया है । ई)6 घंटे में वायुमार्ग का एक मुखौटा। एफ)विश्लेषण के लिए एक आरओआई के साथ 6 घंटे में वायुमार्ग की एक सीटी और स्पेक्ट सह-स्थानीयकृत छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कई स्कैन में एक ही चूहों की निकासी माप। A)प्रायोगिक स्थितियों में कोई परिवर्तन नहीं के साथ 8 चूहों के लिए दो व्यक्तिगत दोहराने निकासी मापा गया । एक युग्मित टी परीक्षण से पता चला है कि ०.९९०४ के पी-वैल्यू के साथ रिपीट स्कैन के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था । ख)प्रायोगिक स्थितियों में कोई परिवर्तन नहीं के साथ दो चूहों के लिए तीन व्यक्तिगत दोहराने मंजूरी मापा गया । एक तरह से ANOVA से पता चला वहां एक पी के साथ दोहराने स्कैन के बीच महत्वपूर्ण मिलान था ०.००४१ के मूल्य । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सह स्थानीय SPECT/0 और 6 घंटे वायुमार्ग के 2 चूहों में ROIs के साथ 0 और 6 घंटे सही फेफड़ों की रूपरेखा के साथ सीटी छवियों । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1: गायन तारों का एक वीडियो एक फाइबर ऑप्टिक तार से प्रकाशित सांस लेने के प्रभाव के साथ कल्पना। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

रोग और विकास दोनों में मोटिवल श्वसन सिलिया की भूमिका विकसित होती रहती है और बेहतर सराहना की जाती है। ट्रेकोब्रोंचियल पेड़ को अस्तर कोशिकाओं की एपिकल सतह पर कई मोटिवल सिलिया की सिंक्रोनस, मेटाकोनल बीटिंग म्यूकोसिलेरी क्लीयरेंस या एमसीसी का उत्पादन करने वाले सेफलाड प्रवाह उत्पन्न करती है। एमसीसी पीसीडी22,सीओपीडी18जैसी अधिग्रहीत बीमारियों जैसी सिलिओपैथी में समझौता किया जाता है, और इसके महत्व को सीएचडी में पहचाना जा रहा है, पारंपरिक रूप से सिलियोपैथी नहीं माना जाता है। हाल के आंकड़ों में दोनों सीएचडी में हेट्रोटैक्सी23 और बिना हेटेरोटैक्सी 7 के साथश्वसनसिलियरी डिसफंक्शन दिखाया गया है । इस तरह के मोटिवल सिलिया डिसफंक्शन को अधिक श्वसन लक्षणों में अनुवाद करने के लिए दिखाया गया था9 के साथ-साथ अधिक पोस्ट-ऑपरेटिव रुग्णता8। अधिकांश, यदि सभी नहीं, इन बीमारियों में से, माउस मॉडल उपलब्ध हैं और चूहों में एमसीसी को मापने के लिए हमारा प्रोटोकॉल एक मूल्यवान उपकरण है जिसका उपयोग संभावित चिकित्सीय परीक्षण के लिए किया जा सकता है।

पशु मॉडल रोगों और उपचारों के विकास को समझने के लिए उपयोगिता प्रदान करते हैं। वीवो पशु इमेजिंग में जानवरों का बलिदान करने की आवश्यकता के बिना, एक ही जानवरों से कई डेटा अंक प्राप्त करने की क्षमता के साथ आगे उपयोगिता प्रदान करता है, जांचकर्ताओं को रोग के देशांतर पाठ्यक्रम के साथ-साथ उपचार प्रभावों की अध्ययन अवधि का पालन करने की अनुमति देता है। एमसीसी के माउस मॉडल को कई जांचकर्ताओं द्वारा दशकों के दौरान विकसित किया गया है, शुरू में प्लानर सिंटिग्राफी, एक दो आयामी परमाणु इमेजिंग तकनीक24का उपयोग करके बीगल कुत्तों पर प्रदर्शन किया जा रहा है। इस तकनीक को एक दशक बाद चूहों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था, जिसके बाद25,26के एक दशक बाद SPECT इमेजिंग के अनुकूलन के बाद। माउस मॉडल में इस तकनीक का विकास पीसीडी जैसे मानव रोगों के कई माउस मॉडल की उपलब्धता के कारण इस तकनीक की प्रासंगिकता में एक प्रमुख विकास था जिसमें सिलियरी फ़ंक्शन में काफी बदलाव आता है। एमसीसी फेफड़ों के denervation और इम्यूनोसप्रेसेशन के माउस मॉडल में मूल्यांकन किया गया है, और अन्य मॉडलों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है19,26। सीएचडी से जुड़े वायुमार्ग रोगों जैसे वायुमार्ग रोगों के साथ मानव रोगों में एमसीसी माप अध्ययन किए गए हैं, और परिणाम मिले हैं कि तकनीक फेफड़ों के शरीर विज्ञान और चिकित्सीय प्रभावकारिता13के दोनों अध्ययनों में सहायता कर सकती है।

इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा मात्राकरण के लिए सटीक छवियों को प्राप्त करने के लिए सही इमेजिंग मापदंडों के साथ अधिग्रहण स्थापित कर रहा है। स्पेक्ट अधिग्रहण सेटिंग्स को डिजाइन करते समय कई कारक महत्वपूर्ण होते हैं, जिनमें कॉलेमेटर्स का उपयोग किया जाता है, प्रति क्रांति प्राप्त करने के लिए अनुमानों की संख्या, और रोटेशन चरण आकार। कोलिमेटर चयन अधिग्रहण की संवेदनशीलता और संकल्प में एक प्रमुख कारक है, और अधिग्रहण सेटिंग्स को27उपयोग किए जा रहे कोलिमेटर के अनुरूप होने की आवश्यकता हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, चूहों जैसे बड़े जानवरों का उपयोग करते समय, कॉलिमेटर को समायोजित करने की आवश्यकता होगी। उदाहरण के लिए कई पिनहोल कॉलेमेटर अधिक संवेदनशील हैं, लेकिन अनुमानों को ओवरलैपिंग से बचने और अवांछित मल्टीप्लेक्सिंग के कारण एक कदम आकार का चयन करते समय देखभाल की जानी चाहिए, जो कुछ छवि अस्पष्टता की कीमत पर अधिग्रहण की संवेदनशीलता को और बढ़ा सकता है जो पुनर्निर्माण कलाकृतियों25का कारण बन सकता है। पुनर्निर्माण सेटअप भी मात्रात्मक छवियों को उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है। MAP3D एक आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला पुनरावर्तक पुनर्निर्माण एल्गोरिदम है, और पीएसएफ एक आम पुनर्निर्माण मॉडल है। दोनों छवियों के पुनर्निर्माण के लिए विश्वसनीय हैं, लेकिन पुनरावृत्तियों और सबसेट की संख्या स्थापित करते समय देखभाल की जानी चाहिए। पुनरावृत्तियों की एक उच्च संख्या पुनर्निर्माण के लिए आवश्यक कम्प्यूटेशनल समय में वृद्धि होगी, और आगे वृद्धि पर रिटर्न ह्रासमान के साथ पुनर्निर्माण की गुणवत्ता में वृद्धि होगी ।

इमेजजे में छवियों की मात्रा निर्धारित करने के लिए, उपयोग करने के लिए आदर्श माप उपकरण RawIntDen है, जो चयन में पिक्सेल के योग मूल्य को आउटपुट करता है। जब अलग-अलग आकार के फेफड़ों के आरओआई में SPECT डेटा की मात्रा निर्धारित की जाती है, तो RawIntDen का उपयोग गिनती का एक पूर्ण उपाय प्रदान करता है और आरओआई के क्षेत्र में माप को समायोजित करने से बचता है, जैसे मतलब माप21होगा।

इस तकनीक में त्रुटि के कई संबद्ध स्रोत हैं जिन्हें इस तकनीक को लागू करते समय अन्वेषक को जानकार होना चाहिए। एक उल्लेखनीय कॉन्फिंडर एनेस्थेटिक एजेंटों का उपयोग है। आइसोफलुरेन एक तेजी से अभिनय, सांस एनेस्थेटिक है कि चूहों एक अधिग्रहण के पूरा होने के बाद तेजी से ठीक हो रहा है । हालांकि, चूहों को उनके पिंजरों में ठीक होने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, और आवश्यक से अधिक समय तक एनेस्थेटाइज्ड नहीं रखा जाना चाहिए। हमारे व्यक्तिगत अनुभव (अप्रकाशित डेटा) चूहों में जिन्हें 0 और 6 घंटे के समय-बिंदु के बीच साँस वाले आइसोफ्लून का उपयोग करके लगातार एनेस्थेटाइज्ड रखा गया था, नगण्य निकासी दिखाया गया। इसी तरह, तेजी से वसूली सुनिश्चित करने के लिए एनेस्थेटिक की एक नियंत्रित खुराक भी आवश्यक है। इमेजिंग के लिए फूस के लिए जानवर को सुरक्षित करते समय, सह-पंजीकरण के लिए उपयोग की जाने वाली प्रेत ट्यूब को फेफड़ों के साथ ओवरलैपिंग से कलाकृतियों से बचने के लिए पेट पर कम रखा जाना चाहिए। इसी तरह, एक गुणवत्ता सीटी छवि सुनिश्चित करने के लिए, एक्स-रे बिखरने से कलाकृतियों से बचने के लिए माउस से किसी भी धातु टैग को हटाने के लिए ध्यान रखना।

वर्तमान एमसीसी प्रोटोकॉल असंख्य पशु मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है । इस तकनीक का स्कैन किए गए जानवरों के स्वास्थ्य पर नगण्य प्रभाव पड़ता है, चूहों द्वारा अच्छी तरह से सहन किया जाता है, और इसकी वजह से इसका उपयोग पहले से ही नाजुक चूहों के स्वास्थ्य को खतरे में डालने के बिना रोग मॉडल के साथ किया जा सकता है। इस पद्धति की ताकत वीवो तकनीक में एक होने से आती है, जो वीडियो-माइक्रोस्कोपी के लिए उत्पादित ट्रेकी के लिए जानवरों के बलिदान के बिना वायुमार्ग फ़ंक्शन के लगातार और दोहराने योग्य माप के अधिग्रहण के लिए अनुमति देती है, कि पूर्व वीवो मॉडल को26की आवश्यकता होती है। एक ही जानवरों के कई स्कैन में दोहराने योग्य माप के उत्पादन में इस तकनीक की निरंतरता, एक ही जानवर के लिए विभिन्न एजेंटों या संभावित चिकित्सा विज्ञान के साथ इलाज करने की अनुमति देता है, और किसी भी पशु मॉडल में निहित जैविक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए एक ही जानवर के बीच की गई सांख्यिकीय तुलना, जिससे सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दिखाने के लिए आवश्यक नमूना आकार को कम किया जा सके।

एमसीसी तकनीक का उपयोग कर एयरवे समारोह के मूल्यांकन पशु मॉडल की एक किस्म के लिए समायोजित किया जा सकता है और वायुमार्ग स्वास्थ्य के कई अलग अलग मॉडल के लिए लागू है, साथ ही नए उपचारों का परीक्षण। पीसीडी के माउस मॉडल के वायुमार्ग का मूल्यांकन इस तकनीक के साथ-साथ सीओपीडी के मॉडलों का उपयोग करके किया जा सकता है। हमारी विधि का उपयोग एमसीसी पर विभिन्न एनेस्थेटिक्स के अंतर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है जो आम नैदानिक उपयोग में हैं। अंत में, वायुमार्ग पर चिकित्सीय एजेंटों के प्रभाव का भी इस मॉडल का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है। जैसा कि पहले कहा गया है लेकिन पुनरावृत्ति होती है, क्योंकि यह वीवो माप में एक बीमारी के दौरान एमसीसी आकलन दोहराने की अनुमति देता है, साथ ही समय के साथ चिकित्सीय हस्तक्षेपों के परीक्षण लाभ भी देता है। इसके अतिरिक्त, चूहों सबसे आम प्रयोगशाला जानवरों की नकल करने के लिए इस्तेमाल कर रहे है/मानव रोगों का अध्ययन, के साथ, कुछ मामलों में, मानव रोग के कई ट्रांसजेनिक माउस मॉडल से चुनने के लिए उपलब्ध है ।

Disclosures

इस काम से संबंधित कोई नहीं।

Acknowledgments

M.Z. और K.S.F. और इस काम को पिट इनोवेशन चैलेंज (PInCh) के तहत प्रदान किए गए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय में नैदानिक और ट्रांसलेशनल साइंस इंस्टीट्यूट के माध्यम से, और NHLBI R01 अनुदान HL153407, M.Z. को सम्मानित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 µm Unjacketed Fiber Optic Wire Edmund Optics 02-532
99mTechnecium-Sulfur Colloid Cardinal Health
Anesthesia Vaporizer Vetland Medical A13480
Durmont #5 Forceps Fine Science Tools 99150-20
FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software
Introcan Safety Catheters 20G 1inch Fisher Scientific NC1534477
Isoflurane Henry Schein 118-2097
Mouse Intubation Stand Kent Scientific ETI-MSE-01
Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT Siemens
Single Channel Anesthesia Stand Summit Anesthesia Solutions 22860

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जीव विज्ञान अंक 166 म्यूकोसिलेरी क्लीयरेंस मोटिवल सिलिया श्वसन कार्य वीवो में
चूहों में म्यूकोसिलियरी क्लीयरेंस के वीवो मूल्यांकन में
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Feldman, K. S., Zahid, M. In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice. J. Vis. Exp. (166), e61929, doi:10.3791/61929 (2020).

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