Summary
I denne publikasjonen beskriver vi protokoller for vurdering av luftveismukociliær clearance (MCC) hos mus in vivo ved hjelp av dual-modalitet radionuklidavbildning. Denne protokollen er utformet for en enkelt fotonutslipps computertomografi (SPECT) og computertomografi (CT) oppkjøpsprotokoll ved hjelp av mus hele kroppen (MWB) collimators i et dobbelt SPECT / CT-system.
Abstract
Respiratorisk motil cilia, spesialiserte organeller av cellen, linje den a apiske overflaten av epitelceller langs luftveiene. Ved å slå på en metachronal, synkron måte, genererer disse flere, motile, actin-baserte organeller en cephaladvæskestrøm som fjerner luftveiene av inhalerte forurensende stoffer og patogener. Med økende miljøforurensning, nye viruspatogener og nye multiresistente bakterier, er flimmerhårgenerert mucociliary clearance (MCC) avgjørende for å opprettholde lungehelsen. MCC er også deprimert i flere medfødte lidelser som primær ciliary dyskinesi, cystisk fibrose samt ervervede lidelser som kronisk obstruktiv lungesykdom. Alle disse lidelsene har etablert, i noen tilfeller flere musemodeller. I denne publikasjonen beskriver vi en metode ved hjelp av en liten mengde radioaktivitet og dual-modalitet SPECT / CT-bildebehandling for å nøyaktig og reprodusere MCC hos mus in vivo. Metoden gjør det mulig å gjenopprette mus etter avbildning, gjøre seriemålinger mulig, og teste potensielle terapeutiske midler langsgående over tid. Dataene i villtypemus viser reproduserbarheten til MCC-målingen så lenge tilstrekkelig oppmerksomhet på detaljer er betalt, og protokollen følges nøye.
Introduction
Cilia er mikrotubulibaserte cellulære organeller bevart over evolusjonær historie fra alger til mennesker. De kommer fra celleoverflater og har en rekke funksjoner1, alt fra anerkjennelse av lokale miljøsensoriske signaler til motilitet, funksjoner som kan spores tilbake fra mennesker til tidlige encellede eukaryotiskeorganismer 2,3. Cilia kan være ikke-motil og enkelt fungerer som en celle spesialisert antenne for å behandle miljøsignaler; eller motile og flere, slo i synkroniserte, metachronale bølger for å generere væskestrøm, for eksempel i slimhinnen i egglederne og øvre og nedre luftveier, med unntak av terminal bronkioler som fører til alveolene1,2.
Den omfattende epiteloverflaten i luftveiene er utsatt for en konstant kryssild av forurensning i form av en rekke potensielt farlige inhalerte forurensende stoffer og patogener, noe som krever et forsvar. En viktig forsvarsmekanisme er mucociliary apparatet av tracheobronchial treet, hvor en kontinuerlig strøm av utskilles slim er mekanisk transportert ut av luftveiene ved juling av flere motile cilia fôr de apiske overflatene av tracheo-bronkial epitelceller. Disse funksjonen for å fange inhalerte forurensninger, og gjennom deres kontinuerlige, synkron juling, transportere dem cephalad4,5.
Flimmerhår har vist seg å ha sentrale roller som i utviklingen av venstre-høyre mønster i utviklingen av embryoer, hvor motile cilia på embryonal node brytesymmetri 6. Mutasjoner i flimmerhårrelaterte gener har vært knyttet til sykdommer som medfødt hjertesykdom (CHD) på grunn av den asymmetriske strukturen i hjertet6. Nyere studier har rapportert en høy forekomst av ciliary dysfunksjon i luftveiene til pasienter med CHD, samt økt forekomst av postoperative luftveiskomplikasjoner og kroniske luftveissymptomer i øvre og nedreluftveier 7,8,9,10. Pasienter med CHD og ciliary dysfunksjon, med eller uten heterotaxy, har vist seg å ha økt risiko for respiratoriske komplikasjoner og negative respiratoriske utfall etter operativt5,8,10. Utover deres roller i signalisering og utvikling, har betydningen av luftveisflimmeri blitt demonstrert av ciliopathies, hvorav et godt eksempel er primær ciliary dyskinesi (PCD). PCD er en medfødt lidelse som følge av en rekke mutasjoner som påvirker motile respiratoriske flimmerhår, fører til tilbakevendende lungeinfeksjoner, bronkiektasi, og potensielt behovet forlungetransplantasjon 11. I tillegg, selv om flimmerhår er normalt i cystisk fibrose (CF), den vanligste medfødte lidelsen i den kaukasiske befolkningen, er MCC svekket på grunn av tykt, viskøs slim som følge av mutasjoner i CFTR-genet12. Det finnes flere musemodeller av PCD og CF, samt et stadig økende antall modeller av CHD. Til syvende og sist er flimmerhårene allsidige strukturer med mange nøkkelroller, og en metode for å vurdere funksjonen til motile respiratoriske flimmerhårin vivo kan være verdifull for preklinisk studie, og vurdere effekter av mutasjoner samt legemidler på mucociliary clearance (MCC)13. Metoden vil også være verdifull i å vurdere effekter av nye legemidler, genterapi eller intervensjoner på MCC i disse musemodellene.
Det er mange forskjellige modeller som har blitt brukt til å vurdere MCC. En bemerkelsesverdig metode innebærer bruk av metylenblå fargestoff som har blitt innpodet i bronkiene, med klaring målt ved fiberoptisk måling av fargestoffbevegelse14. Denne metoden er begrenset av evnen til å observere bevegelsen av fargestoffet, som er mer rutine hos mennesker enn i prekliniske musemodeller. En annen bemerkelsesverdig metode er synchrotron fase-kontrast røntgenbilde (PCXI), som kan brukes til å spore individuelle partikler i en luftvei. Denne metoden er relativt ny og ikke allment tilgjengelig15. Det finnes mange ex vivo metoder for å vurdere luftveiene ved å eksitere en luftrør for videomikroskopi, men disse modellene gir lite nytte hos menneskelige pasienter16. Teknikker med høy oppløsning for cilia-bildebehandling som optisk sammenhengtomografi er begrenset på samme måtesom 17.
I denne artikkelen presenterer vi en reproduserbar metode for å måle MCC in vivo som har blitt brukt til å måle lungeclearances i utallige dyremodeller, samt studere MCC i kronisk obstruktiv lungesykdom og vurdere effekten av immunsuppressive legemidler18,19. Denne metoden sporer clearance av den radiofarmasøytiske 99mtechnetium-svovelcolloid (99mTc-Sc), en uoppløselig partikkel radiotracer, etter drypping i lungene. Radionuklidet kan deretter spores ved hjelp av enkelt fotonutslipps computertomografi (SPECT)18,20. Vi har ytterligere raffinert denne teknikken for måling av MCC ved hjelp av dual modality SPECT og computertomografi (CT) avbildning med samtidig lokalisering av radioisotop teller til lungene og måle nedgangen i disse tellingene over 6 timer. Dual-modalitetsavbildning, med medregistrering av CT- og SPECT-bilder, gir nøyaktig lokalisering av strålingstellinger til vår interesseregion, lungene. Selv om vi beskriver i detalj metoden for MCC-måling hos mus, kan protokollen justeres for å studere MCC hos rotter. Collimatorene må justeres samt strålingsdose. Etter vår mening er MCC-skanninger av mus mer teknisk utfordrende på grunn av den lille dyrestørrelsen, men mer nyttig enn rotter på grunn av det store antallet etablerte musemodeller av en rekke menneskelige lidelser. I tillegg, på grunn av deres lavere kostnader og vedlikeholdskostnader i dyrekolonier, er en større prøvestørrelse mer mulig hos mus.
Protocol
University of Pittsburgh's Institutional Animal Care and Use Committee godkjente alle dyreprotokoller spesifisert i denne publikasjonen før de gjennomførte noen av disse dyreforsøkene.
MERK: Denne protokollen beskriver hvordan du utfører in vivo mucociliary clearance studier ved hjelp av radionuklelid bildebehandling med en dual-modalitet SPECT / CT skanner. Teknikkene som er demonstrert kjører systemkalibreringer, bedøver mus, trakeal intubasjon av mus, instilling isotop i lungene, dual-modalitet avbildning, co-registrering av disse bildene, og analyse.
1. OPPSETT AV SPECT/CT-system
- Ut designe en passende arbeidsflyt og konfigureres før du kjører eksperimenter ved hjelp av levende dyr.
- Bruk et SPECT-oppkjøp bestående av 60 projeksjoner med en trinnstørrelse på 6o mellom projeksjoner med en rotasjonsradius på 40 cm. CT-oppkjøpet består av 220 anslag med en 1,6o vinkel mellom anslagene.
- Kontroller at systemet har de riktige MWB-kollatorene for mus og SPECT-avbildning på plass. Hvis de upassende collimatorene er installert, kan du bruke collimatorveiviseren til å installere de riktige.
- Kjør de nødvendige systemkalibreringene for å klargjøre systemet for bruk.
MERK: SPECT- og CT-komponentene i skanneren trenger kalibrering. Kalibrer CT-komponentene ved hjelp av en kildekondisjonering og en D/L-kalibrering (Dark/Light) én gang om dagen, en COS-kalibrering (Center Offset) annenhver uke, og evaluere røntgenmaskinvaren hver måned. SPECT-komponentene må kalibreres en gang i året.- Hvis du vil evaluere røntgenmaskinvaren, merker du av for Evaluer røntgenmaskinvare under CT-kalibreringer (tilleggsmenyen CT-kalibrering).
- Hvis du vil utføre kildekondisjonering, merker du av for Utfør kildekondisjonering under CT-kalibreringer (Tilleggsmeny for CT-kalibrering).
- Hvis du vil utføre en D/L-kalibrering, merker du av i D/L-boksen ved siden av CT-anskaffelsesprotokollen som ble brukt under eksperimenter under CT-kalibreringer. Fjern merket for alle andre protokoller (Tilleggsmeny for CT-kalibrering).
- Hvis du vil utføre en COS-kalibrering, erstatter du sengen med kalibreringverktøyet, justerer sengetypeinnstillingene slik at de samsvarer med bevegelseskontrollinnstillingene, og merker av i COS-boksen ved siden av CT-anskaffelsesprotokollen som ble brukt under eksperimenter under CT-kalibreringer. Fjern merket for alle andre protokoller (Tilleggsmeny for CT-kalibrering, tilleggskalibreringsring).
2. Mus intubasjon og drypping
- Vei musene som skal skannes. Hvis du skanner flere mus, må du være forsiktig med å markere musene for identifikasjonsformål ved hjelp av metoder som øreslag eller merking av halen.
- Bedøve en mus ved hjelp av 1,5% isofluran med en gassstrøm på 2 L / min O2 i et gasskammer i ~ 5 minutter for å produsere anestesi av tilstrekkelig dybde, til pusten bremser til ~ 55-65 åndedrag per minutt 16 (Figur 1A).
- Fjern musen fra kammeret og suspender ved fortenner på et intubasjonsstativ på en 45o helling. Utstyr intubasjonsstativet med en nesekjegle for å sikre at musen blir bedøvet under intubasjonen (figur 1B).
- Koble den ene enden av en 50 μm fiberoptisk ledning til en lyskilde og tre en 20-gauge kanyle over den ved hjelp av ledningen til å fungere som en guide (figur 1C).
- Åpne munnen på musen og trekk tungen fremover ved hjelp av stumpe tang. Belys ledevaieren og bruk den til å visualisere stemmebåndene (figur 1D).
- Før ledevaieren gjennom stemmebåndene slik at ledningen er like utenfor stemmebåndene og hviler i øvre luftrør. Skyv kanylen 1 tomme fremover langs ledningen for å intubere musen, og passerer kanylen dypt nok slik at navet på den er mot dyrets fortenner (figur 1E). Fjern ledningen og la kanylen være på plass.
- Test intuberingen ved kort å koble kanylen med en finger og se etter endringer i pusten. Halt pusting eller anstrengt pust mens du plugger og akselerert pust ved frigjøring er tegn på riktig trakeal intubasjon. Hvis det ikke er noen endring i respiratoriske mønstre ved plugging av kanylen, er sistnevnte sannsynligvis i spiserøret.
- Forbered 0,2 mCi av 99mtechnetium-svovelcolloid(99mTc-Sc) i et volum på 10 μL, og pipette inn i kanylen. La musen spontant inhalere den i lungene over 1-2 min (Figur 1F). Fjern kanylen før du overfører musen til pallen på skanneren.
MERK: Radionuklidet ble utarbeidet og filtrert av Cardinal Health.
3. SPECT/CT-bildebehandling
- Overfør musen til en 25 mm pall med en nesekjegle og fest med tape, og ta vare på å ikke tape brystet og magen for tett for å unngå å svekke åndedrett. Vær forsiktig med å fjerne eventuelle metalløremerker festet til musen.
- Forbered et radioaktivt fantom bestående av 0,05 mCi i 200 μL og legg denne mengden i et 0,2 ml PCR-rør. Plasser røret ved å teipe til pallen under musens underliv, unngå overlapping med lungene.
MERK: Fantomet brukes til å registrere CT- og SPECT-bilder samtidig, samt en negativ kontroll for klaring. - Sett inn musen i SPECT/CT-systemet, velg bildearbeidsflyten og kjør installasjonsprogrammet.
- Konfigurer plasseringen av detektorene på musen, og kjør bildearbeidsflyten.
- Forbered et bur for mus som har fått radioaktivitet etter prosedyren, med ubegrenset tilgang til mat og vann, og klar merking ved hjelp av et strålingssikkerhetsmerke.
- Når arbeidsflyten er fullført, fjerner du musen fra bildepallen, og lar den komme seg i det forberedte buret i en varighet på 6 timer mellom skanninger (slutten av skanning 1 til begynnelsen av skanning 2) med ad libitum tilgang til mat og vann. 6 timer ble valgt da det tilsvarer tidsperioden hvor lineær clearance avhengig av flimmerhårfunksjonen finner sted med svært lite alveolær clearance.
- Etter 6 timer, re-bedøve musen og skanne, sammen med fantomet, ved hjelp av samme arbeidsflyt for å måle mengden isotop ryddet fra luftveiene.
MERK: Det er viktig å la musen gjenopprette som uavbrutt anestesi med isofluran i 6 timer vil føre til en betydelig cilia-depressiv effekt, noe som resulterer i nær null mucociliary clearances.
4. Analyse
- Etter bildebehandling utfører du etterbehandling for å rekonstruere fullstendige 3D-stakkbilder.
- Histogrammet SPECT-bildene ved hjelp av fabrikkstandardinnstillingene for 99mTc, og rekonstruer deretter ved hjelp av en MAP3D-algoritme og punktspredningsfunksjon (PSF) rekonstruksjon.
MERK: Rekonstruksjonen ble utført ved hjelp av 8 iterasjoner og 6 undergrupper. En effektiv rekonstruksjon trenger et forhold mellom undergrupper og projeksjoner klokken 1:10 eller deler jevnt inn i antall projeksjoner, slik at 6 undergrupper ble brukt på grunn av oppkjøpet ved hjelp av 60 projeksjoner. - Rekonstruere CT-bildene ved hjelp av Feldkamp-algoritmen og et Shepp-Logan-filter.
MERK: Rekonstruksjonen ble utført ved hjelp av 4 iterasjoner.
- Histogrammet SPECT-bildene ved hjelp av fabrikkstandardinnstillingene for 99mTc, og rekonstruer deretter ved hjelp av en MAP3D-algoritme og punktspredningsfunksjon (PSF) rekonstruksjon.
- Behandle CT- og SPECT-bildene i FIJI ImageJ21 ved hjelp av reslice-verktøyet til å generere koronarvisningsbilder fra standard aksiale bilder. Utfør deretter en z-stack sum projeksjon på SPECT-bildet for å legge til telledataene fra hvert stykke og generere ett enkelt bilde for enkel analyse.
- Endre størrelse og samtidig registrere CT- og SPECT-bildene ved hjelp av fantomet Eppendorf-røret som referanse (figur 2A,B). Spor og bruk konsekvente målinger for endring av størrelse på tvers av alle eksemplene.
- Binarize CT-bildet ved hjelp av automatisk tersklering, etterfulgt av å invertere stabelen, og utføre en z-stack sum projeksjon for å generere en omriss av lungene for analyse (Figur 2C).
- Roter CT- og SPECT-bildene og slå sammen bildet ved hjelp av kanalverktøyene. Beregn MCC ved å tegne en avkastning rundt høyre lunge og måling (figur 2D).
MERK: Denne målingen vil være av de totale tellingene i høyre lunge for 0 og 6 timers tidspunkter, med 6 timers bilder korrigert for radioaktivt forfall ved hjelp av formelen: N(t) = N0e−t. 99m (99m) Tc-Sc har en forfall konstant på 3,21e-5 per sekund med en halveringstid på ~ 6 timer. Disse verdiene kan deretter brukes til å beregne en prosentklarering.
MERK: Høyre lunge er valgt for roi tegning og måling teller som mucociliary clearance vil transportere radioisotop ut av lungene til svelget fra hvor det vil bli svelget og ende opp i magen. Ganske ofte kan det ses tellinger i magen som kan overlappe med venstre lunge og dermed produsere feilaktige tellinger. Denne forvirrende kan unngås ved å måle teller i høyre lunge bare.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen bedøvet vi mus i et isoflurankammer (figur 1A). Etter å ha oppnådd et tilstrekkelig anestesinivå, ble mus plassert på vertikale støtter (figur 1B) og stemmebåndene ble visualisert ved hjelp av en opplyst ledning (figur 1C-1D). Musene ble intubert og innpodet med 0,2 mCi 99mTc-Sc i volumer på 10 μL gjennom en kanyle og mus lov til å spontant inhalere i lungene (figur 1E-1F). Etter bildeanskaffelse og behandling ble CT- og SPECT-bildene colocalized (Figur 2A) ved hjelp av fantomrøret som landemerke (figur 2B). Masker av lungene ble generert fra CT-bildet (figur 2C) og brukes til å tegne ROIer rundt høyre lunge for analyse ved 0 (figur 2D) og 6 timer (figur 2E-2F). For å teste reproduserbarheten av protokollen ble totalt 8 mus skannet to ganger på forskjellige dager med identiske eksperimentelle forhold, med analyse ved hjelp av en paret t-test som ikke viser noen signifikant forskjell mellom gjentakelsesskanninger (p-verdi = 0,9904) (figur 3A). Ytterligere 2 mus ble skannet tre ganger på forskjellige dager med identiske eksperimentelle forhold, med analyse ved hjelp av enveis ANOVA som viste signifikant matching mellom gjentatte skanninger (p-verdi på 0,0041) (figur 3B). Totalt 8 mus ble skannet og to representative bilder ble vist (figur 4).
Figur 1: Mus intubasjon og isotop instillasjon. Bilder av trinnene som trengs for å intubere og innpode isotop i luftveiene. A) Musen er bedøvet i et kammer. B) Den bedøvede musen er plassert på en vertikal støtte, suspendert av forteren. C) En opplyst 0,5 mm fiberoptisk ledning som fungerer som en ledevaier, tilberedes ved å kjøre den gjennom en 20 G kanyle. D) Munningen av musen åpnes ved hjelp av tang og opplyst ved hjelp av den opplyste ledetråden for å visualisere stemmebåndene. E) Kanylen skyves over stemmebåndene og ledevaieren fjernes. F) Løselig isotop er innpodet i kanylen ved hjelp av en pipette og musen lov til å spontant inhalere isotopen i lungene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: SPECT/CT-bilder av en MCC-skanning. A) Et SPECT-bilde som er samentisert med et CT-bilde. B) Et CT-bilde med et synlig fantomrør som ble brukt til sam lokalisering. C) En maske av luftveiene avledet ved å binarisere CT-bildet og utføre en z-stack sum projeksjon. D) CT-masken er samentisert med SPECT-bildet. En avkastning for analyse har blitt trukket rundt høyre lunge. E) En maske på luftveiene ved 6 timer. F) Et CT- og SPECT-sam lokalisert bilde av luftveiene etter 6 timer med en avkastning for analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Klaringsmålinger av de samme musene på tvers av flere skanninger. A)To individuelle gjentakelsesclearance ble målt for 8 mus uten endringer i eksperimentelle forhold. En paret t-test viste at det ikke var noen signifikant forskjell mellom gjentakelsesskanninger med en p-verdi på 0,9904. B) Tre individuelle gjentakelsesklareringer ble målt for to mus uten endringer i eksperimentelle forhold. En enveis ANOVA viste at det var betydelig matching mellom gjentakelsesskanninger med en p-verdi på 0,0041. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sam lokaliserte SPECT/CT-bilder av 0- og 6-timers luftveiene i 2 mus med ROIer trukket ved 0 og 6 timer som beskriver høyre lunge. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: En video av vokalakkordene opplyst av en fiberoptisk ledning med effekten av å puste visualisert. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfiler. Vennligst klikk her for å laste ned disse filene.
Discussion
Rollen som motil respiratorisk flimmerhår i både sykdom og utvikling fortsetter å utvikle seg og bli bedre verdsatt. Synkron, metachronal juling av flere motile cilia på den apiske overflaten av celler langs tracheobronchial treet generere cephalad flyt produsere mucociliary clearance eller MCC. MCC er kompromittert i ciliopathies som PCD22,ervervede sykdommer som KOLS18, og dens betydning blir anerkjent i CHDs, ikke tradisjonelt anses å være ciliopathies. Nyere data har vist respiratorisk ciliary dysfunksjon i både CHD med heterotaxy23 og uten heterotaxy7. Slike motile cilia dysfunksjon ble vist å oversette til større respiratoriske symptomer9 samt større postoperativ sykelighet8. De fleste, om ikke alle, av disse sykdommene, har musemodeller tilgjengelig, og vår protokoll for måling av MCC hos mus er et verdifullt verktøy som kan brukes til å teste potensielle terapeutiske midler.
Dyremodeller gir verktøy for å forstå sykdommer og utvikling av terapier. In vivo dyreavbildning gir ytterligere nytte med muligheten til å skaffe seg flere datapunkter fra de samme dyrene, uten behov for å ofre dyrene, slik at etterforskerne kan følge langsgående sykdomsforløp samt studievarighet for behandlingseffekter. Musemodellen av MCC har blitt utviklet i løpet av flere tiår av flere etterforskere, først blir utført på beagle hunder ved hjelp av planar scintigraphy, en todimensjonal kjernefysisk bildeteknikk24. Teknikken ble tilpasset for bruk hos mus et tiår senere, etterfulgt av tilpasning til SPECT-avbildning et tiår etterat 25,26. Utviklingen av denne teknikken i musemodeller var en stor utvikling i relevansen av denne teknikken, på grunn av tilgjengeligheten av flere musemodeller av menneskelige sykdommer som PCD der ciliary-funksjonen endres betydelig. MCC har blitt vurdert i musemodeller av lunge denervasjon og immunsuppresjon, og har potensial til å bli brukt sammen med andremodeller 19,26. MCC-målingsstudier hos humane pasienter med luftveissykdommer som CF, astma, PCD og ciliopatier forbundet med CHD er utført, og har gitt resultater at teknikken kan hjelpe både studier av lungefysiologi og terapeutisk effekt13.
En viktig del av denne protokollen er å sette opp oppkjøp med de riktige bildeparametrene for å skaffe nøyaktige bilder for kvantifisering. En rekke faktorer er viktige når du utformer SPECT-oppkjøpsinnstillinger, inkludert hvilke collimators som brukes, antall projeksjoner for å skaffe per omdreining og rotasjonstrinnstørrelse. Collimator-valg er en viktig faktor i følsomheten og oppløsningen av oppkjøpet, og oppkjøpsinnstillingene må kanskje skreddersys til at collimatoren brukes27. Alternativt, når du bruker større dyr som rotter, må collimatorene justeres. Flere pinhole collimators for eksempel er mer følsomme, men forsiktighet bør tas når du velger en trinnstørrelse for å unngå overlappende projeksjoner og forårsaker uønsket multipleksing, noe som kan ytterligere øke følsomheten for oppkjøpet på bekostning av noen bilde tvetydighet som kan forårsake rekonstruksjon artefakter25. Rekonstruksjon oppsett er også nøkkelen til å generere kvantifiserbare bilder. MAP3D er en vanlig iterativ rekonstruksjonsalgoritme, og PSF er en vanlig rekonstruksjonsmodell. Begge er pålitelige for å rekonstruere bilder, men forsiktighet bør tas når du angir antall iterasjoner og undergrupper. Et høyere antall iterasjoner vil øke beregningstiden som kreves for gjenoppbyggingen, og øke kvaliteten på gjenoppbyggingen med avtagende avkastning ved ytterligere økning.
For å kvantifisere bilder i ImageJ, er det ideelle måleverktøyet som skal brukes RawIntDen, som utdata summeringsverdien av piksler i et utvalg. Når du kvantifiserer SPECT-data på tvers av lunge-ROIer i ulik størrelse, gir bruken av RawIntDen et absolutt mål på antall og unngår å justere målingen til området av avkastningen, som den gjennomsnittlige målingenville 21.
Denne teknikken har en rekke tilknyttede feilkilder som etterforskeren bør være oppmerksom på når du bruker denne teknikken. En bemerkelsesverdig confounder er bruken av bedøvelsesmidler. Isofluran er en hurtigvirkende, inhalert bedøvelse som musene gjenoppretter fra raskt etter ferdigstillelse av et oppkjøp. Det bør imidlertid tas hensyn til å gi musene god tid til å komme seg i burene sine, og ikke holdes bedøvet lenger enn nødvendig. I vår personlige erfaring (upubliserte data) mus som ble holdt bedøvet kontinuerlig ved hjelp av inhalert isofluran mellom 0 og 6 timers tidspunkt viste ubetydelig clearance. På samme måte er en kontrollert dose bedøvelse også nødvendig for å sikre rask gjenoppretting. Ved sikring av dyret til pallen for avbildning, bør fantomrøret som brukes til samregistrering holdes lavt på magen for å unngå gjenstander fra overlapping med lungene. Likeledes, for å sikre en kvalitet CT bilde, ta vare på å fjerne metall koder fra musen for å unngå gjenstander fra røntgen spredning.
Den nåværende MCC-protokollen kan brukes på utallige dyremodeller. Denne teknikken har en ubetydelig effekt på helsen til dyret skannet, tolereres godt av mus, og på grunn av dette kan den brukes med sykdomsmodeller uten å risikere helsen til allerede delikate mus. Styrken av denne metodikken kommer fra at det er en in vivo teknikk, noe som gjør det mulig å anskaffe konsekvente og repeterbare målinger av luftveisfunksjonen uten offer av dyr for å avgiftsde tracheas for videomikroskopi, at ex vivo-modeller krever26. Konsistensen av denne teknikken i å produsere repeterbare målinger på tvers av flere skanninger av de samme dyrene, gjør det mulig for det samme dyret å bli behandlet med forskjellige midler eller potensielle terapeutiske midler, og statistiske sammenligninger gjort mellom samme dyr for å redusere biologisk variasjon iboende i enhver dyremodell, og dermed redusere prøvestørrelsen som trengs for å vise statistisk signifikante forskjeller.
Vurderingen av luftveisfunksjonen ved hjelp av MCC-teknikken kan justeres til en rekke dyremodeller og brukes på mange forskjellige modeller av luftveishelse, samt testing av nye terapier. Luftveiene av musemodeller av PCD kan vurderes ved hjelp av denne teknikken, samt modeller av KOLS. Vår metode kan også benyttes til å studere differensialeffekter av ulike anestetika på MCC som er i vanlig klinisk bruk. Til slutt kan effekten av terapeutiske midler på luftveiene også vurderes ved hjelp av denne modellen. Som tidligere nevnt, men bærer repetisjon, da det er en in vivo måling det tillater gjentatte MCC vurderinger i løpet av en sykdom, samt teste fordelene med terapeutiske inngrep over tid. I tillegg er mus de vanligste laboratoriedyrene som brukes til å etterligne / studere menneskelige sykdommer, med i noen tilfeller flere transgene musemodeller av menneskelig sykdom tilgjengelig å velge mellom.
Disclosures
Ingen relatert til dette arbeidet.
Acknowledgments
M.Z. og K.S.F. og dette arbeidet ble støttet av et stipend tildelt under Pitt Innovation Challenge (PInCh), gjennom Clinical and Translational Science Institute ved University of Pittsburgh, og NHLBI R01 stipend HL153407, tildelt M.Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 µm Unjacketed Fiber Optic Wire | Edmund Optics | 02-532 | |
| 99mTechnecium-Sulfur Colloid | Cardinal Health | ||
| Anesthesia Vaporizer | Vetland Medical | A13480 | |
| Durmont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software | |||
| Introcan Safety Catheters 20G 1inch | Fisher Scientific | NC1534477 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 118-2097 | |
| Mouse Intubation Stand | Kent Scientific | ETI-MSE-01 | |
| Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT | Siemens | ||
| Single Channel Anesthesia Stand | Summit Anesthesia Solutions | 22860 |
References
- Afzelius, B. A.
- Mitchell, D. R. The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles. Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).
- Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella. Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).
- Randell, S. H., Boucher, R. C. University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).
- Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. G.
- Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521 (7553), 520-524 (2015).
- Zahid, M., et al. Airway ciliary dysfunction and respiratory symptoms in patients with transposition of the great arteries. PLoS One. 13 (2), 0191605 (2018).
- Stewart, E., et al. Airway ciliary dysfunction: Association with adverse postoperative outcomes in nonheterotaxy congenital heart disease patients. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (2), 755-763 (2018).
- Garrod, A. S., et al. Airway ciliary dysfunction and sinopulmonary symptoms in patients with congenital heart disease. Annals of the American Thoracic Society. 11 (9), 1426-1432 (2014).
- Harden, B., et al. Increased postoperative respiratory complications in heterotaxy congenital heart disease patients with respiratory ciliary dysfunction. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 147 (4), 1291-1298 (2014).
- Leigh, M. W., et al. Clinical and genetic aspects of primary ciliary dyskinesia/Kartagener syndrome. Genetics in Medicine. 11 (7), 473-487 (2009).
- Donaldson, S. H., et al. Effect of ivacaftor on mucociliary clearance and clinical outcomes in cystic fibrosis patients with G551D-CFTR. JCI Insight. 3 (24), (2018).
- Donaldson, S. H., Corcoran, T. E., Laube, B. L., Bennett, W. D. Mucociliary clearance as an outcome measure for cystic fibrosis clinical research. Proceedings of the American Thoracic Society. 4 (4), 399-405 (2007).
- Ledowski, T., Hilmi, S., Paech, M. J. Bronchial mucus transport velocity in patients receiving anaesthesia with propofol and morphine or propofol and remifentanil. Anaesthesia. 61 (8), 747-751 (2006).
- Donnelley, M., Morgan, K. S., Siu, K. K., Parsons, D. W. Dry deposition of pollutant and marker particles onto live mouse airway surfaces enhances monitoring of individual particle mucociliary transit behaviour. Journal of Synchrotron Radiation. 19, Pt 4 551-558 (2012).
- Christopher, A. B., et al. The effects of temperature and anesthetic agents on ciliary function in murine respiratory epithelia. Frontiers in Pediatrics. 2, 111 (2014).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Lam, H. C., et al. Histone deacetylase 6-mediated selective autophagy regulates COPD-associated cilia dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5212-5230 (2013).
- Bhashyam, A. R., et al. A pilot study to examine the effect of chronic treatment with immunosuppressive drugs on mucociliary clearance in a vagotomized murine model. PLoS One. 7 (9), 45312 (2012).
- Ortiz, J. L., et al. Evaluation of Mucociliary Clearance by Three Dimension Micro-CT-SPECT in Guinea Pig: Role of Bitter Taste Agonists. PLoS One. 11 (10), 0164399 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Solomon, G. M., et al. Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography. JCI Insight. 2 (5), 91702 (2017).
- Nakhleh, N., et al. High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy. Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).
- Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. K. Technique for aerosol deposition restricted to the nose in beagle dogs. Journal of Toxicology and Environmental Health. 23 (4), 519-525 (1988).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. Journal of Applied Physiology. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Bhashyam, A. R., et al. Vagal control of mucociliary clearance in murine lungs: a study in a chronic preparation. Autonomic Neuroscience. 154 (1-2), 74-78 (2010).
- Van Audenhaege, K., et al. Review of SPECT collimator selection, optimization, and fabrication for clinical and preclinical imaging. Medical Physics. 42 (8), 4796-4813 (2015).
