Summary
Her præsenterer vi en protokol til mikropatternceller ved encellet opløsning ved hjælp af DNA-programmeret vedhæftning. Denne protokol bruger en bænkefotolitografiplatform til at skabe mønstre af DNA-oligonukleotider på et glasrutschebane og derefter etiketter cellemembraner med kommercielt tilgængelige komplementære oligonukleotider. Hybridisering af oligoerne resulterer i programmeret celle vedhæftning.
Abstract
Den relative placering af celler er et centralt element i mikromiljøet, der organiserer cellecelleinteraktioner. For at studere samspillet mellem celler af samme eller forskellige type har mikropatteringsteknikker vist sig nyttige. DNA Programmeret samling af celler (DPAC) er en mikropatterning teknik, der er rettet mod vedhæftning af celler til et substrat eller andre celler ved hjælp af DNA hybridisering. De mest grundlæggende operationer i DPAC begynder med at dekorere cellemembraner med lipid-modificerede oligonukleotider og flyder dem derefter over et substrat, der er mønstret med komplementære DNA-sekvenser. Celler klæber selektivt kun til substratet, hvor de finder en komplementær DNA-sekvens. Ikke-klæbende celler vaskes væk og afslører et mønster af klæbende celler. Yderligere operationer omfatter yderligere runder af celle-substrat eller celle-celle vedhæftning, samt overføre de mønstre dannet af DPAC til en indlejring hydrogel for langsigtet kultur. Tidligere krævede metoder til mønstreoliigonuleotider på overflader og udsmykning af celler med DNA-sekvenser henholdsvis specialiseret udstyr og brugerdefineret DNA-syntese. Vi rapporterer en opdateret version af protokollen, ved hjælp af en billig benchtop photolithography setup og kommercielt tilgængelige kolesterol modificerede oligonukleotider (CMOs) indsat ved hjælp af et modulært format. CMO-mærkede celler klæber med høj effektivitet til DNA-mønstrede substrater. Denne tilgang kan bruges til at mønstre flere celletyper på én gang med høj præcision og til at skabe arrays af microtissues indlejret i en ekstracellulær matrix. Fordelene ved denne metode omfatter dens høje opløsning, evne til at integrere celler i et tredimensionelt mikromiljø uden at forstyrre mikropatternen og fleksibilitet i at mønstre enhver celletype.
Introduction
Placeringen af celler i forhold til hinanden i et væv er et vigtigt træk ved mikromiljøet1,2,3,4. Teknikker, der anvendes til at mønstre levende celler i rumligt kontrollerede arrangementer er værdifulde eksperimentelle værktøjer til at studere differentiering4,5,6,7,8, celle motilitet9,morfogenese10,11,12, metabolisme13og celle-celle interaktioner7,14 . Der findes en række forskellige metoder til mønstrende celler, hver med deres egne fordele og ulemper3,4. Metoder, der skaber klæbende øer af ekstracellulære matrix (ECM) proteiner, såsom mikrokontakt udskrivning og laser-cut stencils, er enkle og skalerbare. Det er dog svært at mønstre mere end en eller to celletyper ad gangen, fordi klæbeegenskaberne for forskellige celletyper til forskellige ECM-molekyler ofte ligner15,16,17. Mere komplekse mikropatterns kan oprettes med lys-induceret molekylær adsorption (LIMAP), en teknik, der bruger UV-lys til at ablate PEG-belagt regioner og giver mulighed for efterfølgende protein adsorption18,19. Denne proces kan gentages for at oprette mikropatterner i høj opløsning med flere celletyper. Der kan dog forekomme krydsbinding af celler til de forskellige proteinplastre, hvilket resulterer i dårlig mønsterspecifikitet19. Fysiske metoder som såning af celler på mikromekaniske omkonfigurerbare kulturenheder kan skabe strukturerede samkulturer med dynamisk kontrol, men uden fleksibilitet i mønsterdesign af mikrokontaktudskrivning eller LIMAP14,8. I modsætning til de andre teknikker, bioprinting kan skabe tre-dimensionelle arrangementer af celler inden hydrogels20,21. Men bioprintede konstruktioner har meget lavere opløsning end andre mikropatterning teknikker, med en gennemsnitlig funktion størrelse på rækkefølgen af hundredvis af microns22. En ideel celle mønstre metode ville have høj opløsning, mønster flere celletyper, bruge udstyr og reagenser, der er let tilgængelige, og har evnen til at integrere vellykkede mønstre i en hydrogel for tre-dimensionelle (3D) cellekultur. I denne artikel præsenterer vi CMO-DPAC, en cellemikrotteringsteknik, der bruger fleksibiliteten og hastigheden af DNA-hybridisering til at målrette celle vedhæftning til et substrat. Denne metode er blevet tilpasset fra vores tidligere protokoller23,24 for at gøre den mere overkommelig, modulær og tilgængelig. Ved hjælp af den nuværende protokol, bør ethvert laboratorium være i stand til at oprette et fuldt funktionelt system uden specialiseret udstyr eller ekspertise.
DNA Programmeret samling af celler (DPAC) er en kraftfuld vævsteknik, der mønstrer celler ved encelleopløsning med præcis kontrol over cellecelleafstand og vævsgeometri. I DPAC er cellemembraner dekoreret med DNA-oligonuleotider (oligoer) ved hjælp af to lipid-modificerede oligoer designet til at hybridisere på cellemembranen. Fordi oligoerne er konjugeret til hydrofobiske lipider, de hurtigt opdele til cellemembranen25, hvor de hybridisere, øge netto hydrofobicity af de ikke-kovalent bundet molekyler, og dermed øge deres levetid på celleoverfladen26. Oligoerne præsenteres på celleoverfladen på en måde, hvor de kan hybridisere med komplementære oligoer på andre celler eller DNA-funktionaliserede glasrutschebaner for at skabe definerede 2D- eller 3D-cellemønstre med foreskrevet sammensætning, celleafstand og geometri23,24. De mønstrede microtissues kan spaltes ud af overfladen enzymatisk og indlejret i en hydrogel for langvarig 3D-kultur. Når de anvendes i kombination med primære celler eller stamceller, kan de resulterende samlinger af celler gennemgå morfogenese og form i organoider23,27,28. DPAC er blevet anvendt til at undersøge dynamikken i voksne neurale stamcelle skæbne som reaktion på konkurrerende signaler6,29, at studere selvorganisering af bryst epitelceller23,28, og til at generere "væv origami" gennem mesenkymal kondens27.
DPAC giver mulighed for præcis placering af flere cellepopulationer og har væsentligt bedre opløsning end ekstruderingsbaserede bioprintere (i rækkefølge efter mikron)22,23. I modsætning til ECM-baserede mønstremetoder som f.eks. mikrokontaktudskrivning kræver DPAC desuden ikke differentieret vedhæftning af de forskellige celletyper til en ECM-belagt overflade15,23. Det er ideelt til at besvare spørgsmål om, hvordan sammensætningen af et væv påvirker dets adfærd, hvordan celler integrerer flere cellulære og mikromiljømæssige signaler, når de træffer beslutninger6,29, og hvordan par celler interagerer med hinanden. En fordel ved denne metode i forhold til andre mikropatterningsmetoder er, at den kan bruges til 3D-cellekultur i et enkelt billedplan, hvilket letter time-lapse undersøgelser af vævselvorganisation og organoid morfogenese23,27,30.
På trods af disse fordele har en vellykket gennemførelse af DPAC krævet syntese af brugerdefineredeoligonucleotidreagenser og adgang til specialiseret udstyr til DNA-mønstre23,24, hvilket begrænser udbredt adoption. For eksempel skal de optimale lipid-modificerede oligoer (LMOs), der anvendes i den oprindelige protokol, være specialsyntetiseret, modificeret med lignocersyre eller palmitisk syre og renset26. Denne proces kræver brug af en DNA synthesizer og en højtydende flydende kromatografi instrument, samt køb af de tilhørende reagenser såsom methylamin, et kontrolleret stof, der er underlagt både institutionelle og føderale regler. Som et alternativ kan LMOs specialindkøbes i løs vægt, men det kræver en betydelig up-front investering i teknologien.
For at overvinde disse begrænsninger har vi udviklet en revideret version af DPAC, der bruger kommercielt tilgængelige kolesterol-modificerede oligoer (CMOs) i stedet for de specialsyntetiserede LMOs. For yderligere at reducere omkostningerne og øge platformens fleksibilitet har vi ændret os til et modulært, tre-oligo-system. I stedet for at bestille en ny kolesterol-modificeret oligo for hver unik cellepopulation, kan en bruger af denne protokol i stedet bruge de samme kolesterol-modificerede oligoer ("Universal Anchor" og "Universal Co-Anchor") for hver cellepopulation og derefter ansætte en billig, uændret oligo ("Adapter Strand"), der hybridiserer med både Universal Anchor og enten amine-funktionaliseret DNA på overfladen eller Adapter Streng af en anden celletype.
En anden begrænsning af den oprindelige DPAC-protokol var, at den skabte de DNA-mønstrede dias ved hjælp af en væskeprinter i høj opløsning (f.eks. Nano eNabler, BioForce Nanosciences)23,24. Mens dette instrument kan prale af ekstraordinær opløsning og lave reagenskrav, er det ikke tilgængeligt for de fleste institutioner og har en relativt lav udskrivningshastighed (ca. 1 funktion mønstret pr. Sekund). For nylig er der udviklet to fotolitografiske metoder til at mønstre DNA-funktioner på overflader. Bratsch og kolleger brugte en polyacrylamid- og benzophenonbelægning, der kovalent bundet enkeltstrengede DNA-oligoer ved eksponering for UV-lys30. Ved hjælp af denne metode var de i stand til at skabe vævsstillad, der gennemgik store, programmerede formændringer som følge af cellekontraktilitet og selvorganisering. Scheideler et al. udviklet en metode, der bruger UV-eksponering af en positiv fotoresist til selektivt at udsætte amine-modificerede DNA oligos til en aldehyd-funktionaliseret dias29. Efter bagning og reduktiv amination er det amin-modificerede DNA kovalent bundet til overfladen. Denne metode blev brugt til at undersøge reaktionen af voksne neurale stamceller til rumligt præsenteret selvfornyelse og differentiering signaler. Denne artikel tilpasser Scheideler et al.'s protokol til at skabe DNA-mønstre, der vil fange CMO-mærkede celler. Denne fotopatterning protokol kan udføres uden brug af et rent rum. Det bruger billigt og kommercielt tilgængeligt udstyr, der er let indsat på en bordplade eller røghætte. Brugen af billig eller DIY (gør-det-selv) fotolitografi udstyr øger adgangen til forskere uden adgang til renrum faciliteter og giver forskerne mulighed for at prøve teknikken uden en stor investering af tid eller ressourcer31,32. Men bedre opløsning og tilpasning af flere DNA-funktioner kan opnås ved hjælp af den kommercielle spin coater og maske aligner almindeligt forekommende i renrum faciliteter.
Her beskriver vi en metode til at mønstre celler ved encellet opløsning ved hjælp af DNA-baseret vedhæftning. For det første bruges fotopatterning med en positiv fotoresist til at skabe mønstre i høj opløsning af amin-modificeret DNA på et aldehyd modificeret glassubstrat. Derefter behandles diaset for at reducere ikke-specifikke celletilbehør, og PDMS-flowceller oprettes for at begrænse celler over mønstrede områder. Celler er derefter mærket med korte DNA-oligonukleotider, der er funktionaliseret med kolesterol og som følge heraf indsætte i cellemembranen. Cellerne flyder derefter over DNA-mikropatternerne. Hybridisering mellem celleoverfladens DNA og DNA'et på glasoverfladen resulterer i specifik vedhæftning af cellerne til DNA-mønsteret. Ikke-klæbende celler vaskes væk, hvilket afslører klæbecellemønsteret. Denne proces kan gentages for at mønstere flere celletyper eller for at oprette strukturer i flere lag. Hvis det ønskes, kan cellerne integreres fuldt ud i en ECM for 3D-cellekultur.
Protocol
1. Designeksperiment
- Planlæg det ønskede eksperiment, i betragtning af funktionsstørrelse, funktionsafstand, antal involverede celletyper og placeringen af celler i forhold til hinanden. Se supplerende fil 1, en vejledning til eksperimentelt design og supplerende fil 2, som indeholder eksempel på oligosekvenser.
- Design fotomaske ved hjælp af computerstøttet designsoftware. Der findes et eksempel på en fotomaske i supplerende fil 3.
- Tegn et rektangel af dimensionerne af et standardmikroskopdias (25 mm x 75 mm).
- Tegn fire rektangulære områder, der er 10 mm brede og 10 mm lange, fordelt jævnt over rutsjebanen.
- I hvert område skal du tegne funktioner, der er den ønskede størrelse, form og afstand for eksperimentet. Celler vil kun overholde disse funktioner i eksperimentet.
- Hvis du vil oprette justerede fotomasker til flere celletyper, skal du oprette en mastertegning med alle sæt funktioner og derefter gemme versioner, der svarer til hver celletype.
- Bestil en gennemsigtighedsfotomaske med høj opløsning (mindst 20.000 prikker pr. tomme) fra denne CAD-tegning med de funktioner, der er tegnet i 1.2.3 transparente og de større områder sorte.
2. Fotopattern DNA på aldehyd-funktionaliserede dias (protokol tilpasset fra Scheideler et al.29 )
- Hvis du mønstrer flere celletyper, fremstilles fiducialmarkører på det aldehydfunktionaliserede dias før dna-mønstre for at lette justeringen af funktioner. Der foreslås alternative metoder til oprettelse af fiducialmarkører i supplerende fil 1.
- For at skabe metal fiducial markører, anvende S1813 positiv fotoresist som beskrevet i trin 2.3 - 2.11. Brug en fotomaske, der indeholder store funktioner, der er nemme at justere senere. Indarbejde disse funktioner i udformningen af fotomasker, der vil blive brugt til DNA-mønstre.
- Sæt en tynd film (100 Angstroms) af titanium på diaset ved hjælp af elektron-pistol fordampning29. Fjern overskydende metal og fotoresist ved hjælp af acetone, og fortsæt derefter til DNA-fotomaling.
- Der fremstilles en 20 μM-opløsning af en 5'-amin-modificeret oligo i DNA-buffer (50 mM natriumphosphat i vand, pH = 8,5). Se supplerende fil 2 for foreslåede oligosekvenser.
BEMÆRK: Det er muligt at bruge så lidt som 5 μM amine-modificeret oligo til nogle mønstre og applikationer, så overfladens DNA-koncentration kan være nødvendigt at optimere. - Forvarm en kogeplade til 100 °C.
- Brug dobbeltsidet tape eller et vakuum til at fastgøre en aldehyd-funktionaliseret glasrutschebane til rotoren på en spin coater.
FORSIGTIG: Glideafskribning under spin-coating er en sikkerhedsrisiko. Brug altid spin coater i en lukket beholder med låg, såsom en akrylkasse.
BEMÆRK: Mærk et hjørne af diaset ved hjælp af en diamantskriver eller lignende redskab til at ridse glasset. Dette hjælper med diasidentifikation og -retning, efter at fotoresisten er blevet vasket væk. - Brug en engangspipette til at slippe den positive fotoresisten på aldehyd slide. For lige belægninger, tilsæt små dråber af fotoresisten på tværs af diaset, i stedet for et stort fald i midten (Supplerende figur 1A).
- Brug spin coater, drej diaset ved 3000 rpm for 30 s.
- Rutsjebanen placeres på 100 °C kogeplade i 1,5 min (blød bagning) for at krydslinke fotoresisten.
- Fjern rutsjebanen fra kogepladen. Placer en fotomaske med de funktioner, der ønskes til dette eksperiment på toppen af diaset og vejer fotomasken ned med et stykke glas (Supplerende figur 1B, C). Dæk hele opsætningen i en uigennemsigtig boks (supplerende figur 1D). Eksponer med en UV-lampe (365 nm bølgelængde, 360 mW, 5 tommer fra dias, total strålende energitæthed 100 mJ/cm2) i 2 min.
BEMÆRK: UV-lys vil bryde polymerbindingerne i fotoresisten under gennemsigtige områder af fotomasken og skabe regioner, hvor DNA senere vil kunne klæbe. - Udvikl diaset ved at nedsænke i udviklerløsning i 3-5 min (Supplerende figur 1E).
- Skyl overskydende udvikleropløsning med vand væk. Tør under en strøm af luft eller kvælstof. (Supplerende figur 1F).
- Bekræft, at fotolitografien lykkedes ved at se på diaset under mikroskopet. Da fotoresisten er UV-lysfølsom, skal du gøre dette trin hurtigt og derefter gemme diaset i mørke, mens du forbereder andre dias (hvis det er relevant).
BEMÆRK: Et vellykket mønstret dias skal have skarpt definerede kanter for hver funktion, ingen revner og ingen funktionsforvrængning i kanterne. Eksempler på korrekt og forkert fotolitografi findes i supplerende figur 2A. Se tabel 1 for at få oplysninger om fejlfindingsforslag, hvis fotolitografi ikke giver den ønskede funktionskvalitet. - Der tilsættes en dråbe af den 20 μM amine-modificerede oligoopløsning (trin 2.1) på hvert fotopatterned område af diaset. Brug en pipettespids til forsigtigt at sprede dråben over hele regionen, og pas på ikke at ridse diaset. (Supplerende figur 1G).
- Bag rutsjebanen i en 65-70 °C ovn, indtil DNA-opløsningen er helt tørret på diasoverfladen (ca. 1 time).
- Udfør reduktiv amination ved at placere de mønstrede, bagte dias i en 15 cm cellekultur skål og læg i en røghætte oven på en shaker. Afvej 100 mg natriumborohydrid. I en røghætte tilsættes 40 mL fosfatbufferet saltvand (PBS), bland forsigtigt og tilsæt til fadet, der indeholder de mønstrede dias. Lad reaktionen fortsætte i 15 minutter med blid rysten.
BEMÆRK: Aminen på oligoen danner først en Schiff-base med aldeherne på diasoverfladen. Dette er en vendbar kovalent obligation, der skal konverteres til en uigenkaldelig obligation inden brug i DPAC. Tilsætning af et reducerende middel (natriumborohydrid) omdanner Schiff-basen til en sekundær amin ved reduktiv amination.
FORSIGTIG: Reaktionen af natriumborohydrid med vand skaber brintgas og vil fortsætte med at gøre det i timer eller dage efter reaktionen begynder. Udfør det reduktive aminationstrin i en røghætte, og opbevar alt natriumborohydridopløsningsaffald i en åben eller løst afgrænset beholder i røghætten i mindst 24 timer. - Fjern ureageret DNA ved at vaske to gange med 0,1% natrium dodecyl sulfat (SDS) i vand, derefter tre gange med destilleret vand. Tør rutsjebanen under en strøm af kvælstof eller luft.
- Skyl diaset med acetone for at fjerne den resterende fotoresist.
BEMÆRK: På dette tidspunkt er DNA'et blevet uigenkaldeligt og kovalent fastgjort til diaset, og alle ureakterede aldehyd funktionelle grupper er blevet konverteret til alkoholer. Fotoresisten er ikke længere nødvendig. - Hvis der vil blive mønstret flere oligoer, skal du vende tilbage til trin 2.4, justere fotomasken med fiducialtegn og gentage.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her. Opbevar dias i en vakuumafsikkator. Under tørre forhold kan diasene opbevares i op til 3 måneder uden tab af kvalitet.
3. Gør dias hydrofobisk (valgfri) (protokol tilpasset fra Todhunter et al.24 )
BEMÆRK: Det er fordelagtigt, men ikke nødvendigt, at ændre diasets overfladekemi for at gøre det mere inaktivt og hydrofobisk. Ikke-specifik celletilbehør reduceres på disse overflader33, hvorved ikke-specifik binding af celler til ikke-mønstrede områder af diaset. Derudover, hvis de mønstrede celler i sidste ende vil blive indlejret i en hydrogel og overført fra diaset, er overfladebehandlingen afgørende for pålidelig bevægelse af den cellebelastede hydrogel over diaset uden forvrængning eller rive. Silanisering med (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) dimethylchlorosilane resulterer i tilstedeværelsen af hydrofobiske fluorokylalgrupper på diasoverfladen.
FORSIGTIG: Udfør alle trin fra 3.1 og fremefter i en kemisk røghætte for at forhindre udsættelse for eddikesyre og methylenchloriddampe.
- Skyl dias med 10% eddikesyre og derefter tørre under en luftstrøm.
- I et glas Coplin krukke, forberede en opløsning på 60 mL methylenchlorid (dichlormethan), 0,6 mL triethylamin, og 0,6 mL (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) dimethylchlorosilane. Rør med en metalspatel for at blande.
BEMÆRK: Disse reagenser er følsomme over for vand. De skal opbevares under tørre forhold og anvendes så friske som muligt. - Skub til Coplin-krukken, der indeholder silanopløsningen. Placer Coplin krukke på en orbital shaker (indstillet til 60-80 rpm) og lad reaktionen af silan og dias til fremskridt i 15 min.
- Brug metaltant til at fjerne rutsjebanen fra silanopløsningen. Fordyb rutsjebanen i en Coplin-krukke, der indeholder methylenchlorid i 1 minut, for at fjerne overskydende silan fra diaset.
- Sænk rutsjebanen i et 50 mL konisk rør, der indeholder ethanol. Agitere. Sænk rutsjebanen i et 50 mL konisk rør, der indeholder destilleret vand. Agitere.
BEMÆRK: Methylenchlorid og vand kan ikke fejlcibles, så en ethanol skylning er nødvendig for at fjerne overskydende methylenchlorid før den endelige vand skylning. - Fjern rutsjebanen fra vandet og undersøg den. Diaset skal være ret tørt, idet eventuelle vanddråber har en kontaktvinkel på mere end 90 °. Lad lysbilleder tørre helt og opbevares i vakuumafsikkator, indtil de anvendes.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her. Opbevar rutsjebanen under tørre forhold.
4. Forberede PDMS-flowceller og dias til eksperiment
BEMÆRK: Rektangulære PDMS-flowceller bruges til at koncentrere cellerne over de mønstrede områder af diaset. Til eksperimenter, der dyrkes i 3D, danner flowcellerne en form for hydrogel.
- Lav SU-8 master til brug som skimmelsvamp til PDMS flowceller.
- Forvarmende kogeplade til 95 °C.
- Tilføj 5 mL SU-8 2075 til en silicium wafer.
- Spincoat SU-8 på wafer ved 500 rpm for 10s, efterfulgt af 1.000 rpm for 30'erne. Dette skal skabe funktioner op til 240 μm i højde34.
- Blød bag vafler på kogepladen i mindst 45 min.
- Fjern waferen fra kogepladen. Sæt fotomasken (se supplerende fil 4) (emulsionsiden nedad) oven på waferen og afvej den ned med en glasskive for at sikre kontakt mellem fotomasken og diaset.
- Udsæt med UV-lys (365 nm) for en strålende energitæthed på 350 mJ/cm2.
- Bag wafer på kogepladen i 12-15 min.
- Placer wafer i bred glasbeholder. Dæk wafer med SU-8 udviklerløsning. Placer på en shaker og udvikle mens omrøring i mindst 15 min.
- Brug tving til at fjerne waferen fra udviklerløsningen. Skyl i 5 s ved at sprøjte mere udvikleropløsning fra en sprøjteflaske. Spray med isopropylalkohol til skylning. Hvis der vises et hvidt bundfald, skal du returnere waferen til udviklerløsningen og udvikle sig i længere tid.
- Tør wafer under en strøm af luft eller kvælstof.
- Bages slide i 5 min.
BEMÆRK: Når master waferen er oprettet, kan den genbruges på ubestemt tid, så længe funktionerne forbliver intakte.
- Forbered PDMS.
- I en vejebåd tilsættes polydimethylsiloxan elastomer og crosslinker i et 10:1-forhold (efter masse). Rør kraftigt for at sikre jævn blanding.
- De-gas PDMS i et vakuum ekssikkator i 15-30 min, indtil der ikke er flere bobler er synlige.
- Placer master wafer i en 15 cm vævskultur skål. Hæld PDMS over waferen. Hvis der opstår bobler, skal du de-gasse i en vakuumudsikkator i et par minutter.
- Bages i 60 °C ovn i 3 timer.
BEMÆRK: Efter bagning kan PDMS-flowceller opbevares på bordpladen på ubestemt tid.
- Forbered PDMS-flowceller til eksperimentet.
- Kort før du starter et CMO-DPAC-eksperiment, skal du skære det nødvendige antal PDMS-flowceller ud af master waferen. Plasma oxiderer med 10 cc/min rumluft i 90 s for at gøre overfladen hydrofil.
- Skær hver enkelt flowcelle ud, så der er 1-2 mm PDMS tilbage på hver side, og skær derefter toppen og bunden af flowcellen op for at oprette et indløb og udløb.
- Hent mønstret dias, der er oprettet i trin 2 og 3. Juster oven på fotomasken.
- Brug fotomasken som reference til at placere PDMS-flowcellerne på diaset på placeringen af hvert mønstret område.
- Der tilsættes 50 μL fosfatbuffered saltvand (PBS) + 1% kvæg serum albumin (BSA) til indløbet af hver flowcelle, som vist i supplerende figur 1H. Bekræft, at flowcellen er helt fyldt af PBS + 1% BSA, og at der ikke er store bobler. Fortsæt straks til trin 5 og 6.
BEMÆRK: Blokering med BSA minimerer ikke-specifik celle vedhæftning til diasoverfladen.
5. Løft og mærk celler med kolesterol-modificeret DNA
- Forbered de kolesterol-modificerede DNA-løsninger.
- For hvert sæt celler i forsøget blandes 3 μL af en 100 μM lageropløsning af den kolesterol modificerede Universal Anchor Strand med 3 μL af en 100 μM lageropløsning af en adapterstreng. Inkuber i 1 minut. Dette vil pre-hybridize oligos. Tilsæt 69 μL fosfatbuffered saltvand (PBS) for at skabe en 4 μM Universal Anchor + Adapter løsning.
- For hvert sæt celler i forsøget tilsættes 3 μL af en 100 μM Universal kolesterol-modificeret Co-Anchor Strand lageropløsning til 12 μL PBS, hvilket skaber en 20 μM opløsning.
- Forbered enkeltcelleaffjedringen(e).
- For klæbende celler skal du bruge trypsin eller andet dissociationsmiddel til at fjerne cellerne fra kulturkolben. Tilføj kulturmedier for at neutralisere trypsin og centrifuge for at pille cellerne. For ikke-klæbende celler skal celleaffjedringen og centrifugen opsamles for at pille cellerne.
- Brug cellepillen igen i 1 mL iskold PBS eller serumfrie medier. Overfør 1-3 millioner celler til et 1,5 ML mikrocentrifugerør. Centrifuge ved 160 x g i 4 min.
BEMÆRK: Hvis den anvendte celletype er tilbøjelig til at klumpe/aggregere, skal du bruge PBS uden calcium- og magnesiumioner til alle vasketrin for at reducere uønsket celleaggregation. Hvis levedygtighed er et særligt problem for den celletype, der anvendes, skal du bruge serumfrie medier i stedet for PBS. Medier, der indeholder fosterkvægsserum, anbefales ikke til cellemærkning, da det kan hindre inkorporering af lipid-modificerede oligoer. 35
- Mærk cellerne med kolesterol-modificerede oligoer.
- Brug cellepillen igen i 75 μL iskold PBS eller serumfrie medier. Opbevar cellerne i en isspand under hele mærknings- og vaskeprocessen for at maksimere celleleveligheden og minimere tabet af de kolesterol-modificerede oligoer fra celleoverfladen.
BEMÆRK: At genopsmitere cellerne, før DNA'et tilføjes, sikrer, at fordelingen af DNA er ensartet på tværs af cellepopulationen. - 75 μL af den 4 μM Universal Anchor + Adapter-opløsning, der er oprettet i trin 5.1.1, til mikrocentrifugerøret, der indeholder celleaffjedringen. Bland grundigt ved pipettering. Inkuber i 5 minutter på is.
- Der tilsættes 15 μL af universalkomperkeropløsningen til mikrocentrifugerøret. Bland grundigt ved pipettering. Inkuber i 5 minutter på is.
- Fjern overskydende oligoer fra celleaffjedringen. Der tilsættes 1 mL iskold PBS eller serumfrie medier til mikrocentrifugrøret. Bland med en P1000 pipette. Centrifuge ved 160 x g i 4 min ved 4 °C. Kassér supernatanten. Gentag to gange mere.
BEMÆRK: Hvis cellerne er tilbøjelige til at klumpe sig sammen, skal celleaffjedringen passeres gennem et 40 μm filter før den endelige vask. Hvis celler er tilbøjelige til adsorption på siden af mikrocentrifugerøret, overveje at for blokere røret med kasein.
- Brug cellepillen igen i 75 μL iskold PBS eller serumfrie medier. Opbevar cellerne i en isspand under hele mærknings- og vaskeprocessen for at maksimere celleleveligheden og minimere tabet af de kolesterol-modificerede oligoer fra celleoverfladen.
6. Mønster de DNA-mærkede celler
- Brug cellerne i iskolde PBS- eller serumfrie medier igen for at skabe en celletæt opløsning på mindst 25 millioner celler/mL.
BEMÆRK: For et dias ved hjælp af fire af de 10 mm x 15 mm x 200 μm PDMS-flowceller, der er beskrevet i trin 4, kræves ca. 100 μL af denne tætte celleaffjedring. Selv om de fleste af disse celler ikke vil overholde mønsteret og i sidste ende vil blive kasseret, at have en ekstremt koncentreret opløsning af celler over mønsteret dramatisk forbedrer effektiviteten af celle mønstre. - Tag rutsjebanen op og vip den lidt. Der tilsættes 25 μL celleaffjedring til indløbet af hver flowcelle på det mønstrede dias. Fjern PBS + 1% BSA-opløsningen fra stikkontakten, så celleaffjedringen kan fylde PDMS-flowcellen. Inkuber på is eller ved stuetemperatur i 30 s.
BEMÆRK: På dette tidspunkt skal man se på flowcellen under et mikroskop vise tætpakkede celler med lidt eller ingen huller synlige mellem cellerne. Se supplerende figur 2B. - Aspirere 5 μL celle suspension fra udløbet af diaset og tilføje det tilbage i indløbet. Gentag 10 gange pr. flowcelle.
BEMÆRK: Vedhæftningen af CMO-mærkede celler til det DNA-mønstrede dias er næsten øjeblikkelig. Flyder cellerne over mønsteret flere gange øger sandsynligheden for, at en celle vil flyde over en given DNA-spot og blive fanget. - Rør forsigtigt PBS eller serumfrie medier ind i hver flowcelles indløb for at vaske overskydende celler ud. Saml celleaffjedringen fra stikkontakten. Gentag 2-4 gange, eller indtil en visuel inspektion af diaset under mikroskopet bekræfter, at der ikke er overskydende celler tilbage.
BEMÆRK: Det kan være en fordel at gemme de overskydende celler fra den første vask. Hvis mønstereffektiviteten er utilfredsstillende, kan de overskydende celler centrifugeres og suspenderes igen i en lavere mængde PBS for at skabe en mere celletæt opløsning, og derefter kan processen gentages fra trin 6.2. - Gentag trin 6.1-6.4 for hvert sæt celler i mønsteret. For mønstre, hvor flere celletyper er direkte mønstret af overfladeskabelonen, skal du starte med den mindst rigelige celletype af mønsteret og afslutte med den mest rigelige celletype.
BEMÆRK: Det er tilrådeligt at gøre hver runde af cellulær samling sekventielt i stedet for at samle cellerne, selv under forhold, hvor cellerne alle er mærket med ortogonale DNA-sekvenser. Samling af cellerne effektivt fortynder hver celle befolkning og reducerer mønstre effektivitet. - Når den sidste runde af cellesamlingen er fuldført, varierer de næste trin afhængigt af det specifikke eksperiment. Hvis cellerne er beregnet til at forblive på glasset, skal du føje medier til en petriskål, der indeholder diaset, og derefter forsigtigt bruge sammenkæbere til at skubbe PDMS-flowcellerne ud af diaset. Hvis cellerne vil blive indlejret i en hydrogel og dyrkes i 3D, gå videre til trin 7.
7. Overfør til hydrogel til 3D-kultur (valgfrit)
- Forbered en hydrogel prækursoropløsning indeholdende 2% DNase.
BEMÆRK: Sammensætningen af løsningen vil variere baseret på eksperimentel opsætning. Matrigel og blandinger af Matrigel og kollagen Jeg arbejder godt i denne protokol, men andre hydrogels er også mulige. - Der tilsættes 50 μL hydrogelopløsning, der indeholder 2 % DNase, til indløbet af hver flowcelle. Aspirere overskydende væske fra stikkontakten, kørsel hydrogel opløsning i flowcellen. For tyktflydende hydrogel prækursorer, vippe diaset lidt kan være nødvendigt at hjælpe hydrogel flow ind i flowcellen.
- Inkuberes ved 37 °C i 30-45 min (afhængigt af hydrogelgelgelgelgel kinetik), så hydrogelen kan indstilles, og den dna-baserede vedhæftning mellem cellerne og overfladen.
- Fjern hver flowcelle fra diaset, og placer oven på hydrogelprækursoropløsningen.
- Tilsæt 50 μL hydrogelprækursor til en brønd af en 2-brønds kammerrutschebane eller en 6-brønds plade.
- Pipette 10 μL PBS på hver side af hver flowcelle.
- Brug et barberblad eller fine-punkt pincet til at fordele PBS langs hele længden af flowcellen, og løft derefter forsigtigt siderne af flowcellen, så PBS suser under hydrogelen.
BEMÆRK: Dette vil "flyde" hydrogelen over diaset, hvilket giver mulighed for overførsel uden forvrængning eller rive. - Brug et barberblad til forsigtigt at flytte flowcellen til kanten af glasrutschebanen.
- Vend rutsjebanen. Med barberbladet skubbes flowcellen af diaset, så den lander oven på barberbladet.
- Pluk flowcellen af barberbladet ved hjælp af buede sammentrulninger. Inverter flowcellen, så cellerne er på bunden, og placer derefter oven på dråben af hydrogelprækursoropløsning.
- Gentag trin 7.4.1 - 7.4.6 for hver flowcelle.
- Inkuber i mindst 30 minutter, så hydrogelen, der indeholder de mønstrede celler, kan binde sig til hydrogelunderlaget, hvilket resulterer i fuld indlejring af de mønstrede celler.
- Fjern PDMS-flowcellen.
- Tilføj nok medier til at nedsænke PDMS-flowcellen.
BEMÆRK: Tilstrømningen af medier vil løsne vedhæftningen mellem hydrogel og PDMS flow celle. - Brug buede sammentrulninger, der er orienteret langs flowcellens lange akse, til forsigtigt at skubbe flowcellen, indtil den springer af og flyder ind i medierne. Saml flowcellen med sammentypninger og kassér.
BEMÆRK: For at opnå optimale resultater skal du sprede de buede sammenkypninger og lægge et forsigtigt tryk på væggene i PDMS-flowcellen. Anvend kraft i retning af den lange akse i flowcellen.
- Tilføj nok medier til at nedsænke PDMS-flowcellen.
8. Bekræft vellykket mærkning af celler med cmo (valgfrit, til fejlfinding)
- Bestil en fluorescerende modificeret (FAM eller AF647) oligonukleotid, der supplerer overflade vedhæftning sekvens af adapteren streng, der anvendes i forsøget.
- Mærk celler med CMO DNA og udvask overskydende DNA som beskrevet i trin 5. Resuspend i 200 μL iskold PBS.
- Der fremstilles en 4 μM-opløsning af det fluorescerende mærkede komplementære oligonukleotid i PBS. Der tilsættes 200 μL af denne opløsning til celleaffjedringen. Inkuber på is i 5 minutter.
- Tilsæt 1 mL iskold PBS. Bland Centrifuge cellerne for at pille dem. Fjern supernatant. Gentag denne proces to gange mere for at vaske ethvert DNA, der ikke er hybridiseret.
- Udfør analytisk flowcytometri for at kvantificere tilstedeværelsen af DNA på celleoverfladen.
- På et flowcytometer analyseres kontrolceller, der ikke er mærket med DNA. Opret porte baseret på denne befolkning.
- Analyser CMO-mærkede celler, der er blevet behandlet med et fluorescerende mærket komplementært oligonukleotid.
- Beregn den gennemsnitlige fluorescensintensitet.
Representative Results
Denne protokol gør det muligt at mønstre celler i 2D og 3D med høj præcision og uden brug af brugerdefinerede reagenser eller dyrt renrumsudstyr. Figur 1 viser en oversigt over protokollen. For det første oprettes DNA-funktionaliserede dias gennem fotolitografi. Derefter er celler mærket med CMOs. Cellerne flyder derefter over diaset, hvor de kun fastgøres til diasets DNA-funktionaliserede områder. Efter overskydende celler er vasket væk, afsløres det ønskede mønster af celler. Disse celler kan dyrkes på diaset eller indlejres i en hydrogel, der indeholder DNase og overføres fra diaset til 3D-cellekultur.
Mærkning af celler med CMOs giver mulighed for deres tilknytning til dna-mønstret dias (Figur 2). For det første er den kolesterol-modificerede Universal Anchor Strand pre-hybridiseret med Adapter Streng. Derefter blandes Universal Anchor + Adapter-opløsningen 1:1 med celleaffjedringen. Kolesterolet på Universal Anchor + Adapter komplekse indsætter i cellemembranen. Tilsætning af den kolesterol-modificerede Universal Co-Anchor Strand, som hybridiseres med Universal Anchor Strand, forbedrer stabiliteten af CMO-komplekset i cellemembranen ved at øge nettohydrfobicityen af komplekset26. Efter at have vasket det overskydende DNA ud af celleaffjedringen, flyder cellerne over diaset. Hybridisering mellem adapterstrengen og Surface DNA-strengen resulterer i fastgørelse af celler til diasets DNA-mønstrede områder.
Mønsteret af cellerne er skabt ved hjælp af fotolitografi til at begrænse fastgørelsen af amin-modificerede DNA oligos til bestemte regioner i en aldehyd-modificeret glas slide29 (Figur 3A). Positiv fotoresist er spin-belagt på en aldehyd-funktionaliseret dias. Derefter placeres en gennemsigtighedsfotomaske oven på diaset, og diaset udsættes for UV-lys. Efter udvikling er de områder af diaset, der blev udsat for UV-lys, ikke længere belagt med fotoresisten og har således udsat aldehydgrupper. En 20 μM opløsning af amin-modificerede DNA oligos derefter tabes på diaset og spredes til at dække de mønstrede regioner. Bagning efterfulgt af reduktiv amination resulterer i en kovalent binding mellem det amin-modificerede DNA og diaset. Bemærkelsesværdigt, denne proces kan gentages til mønster flere oligos uden tab af funktionalitet af de tidligere mønstrede oligos (Figur 3B). Der bør dog udvises forsigtighed for at undgå overlappende mønstre, hvilket resulterer i tilstedeværelsen af begge oligoer ved en reduceret koncentration (supplerende figur 3). Flere cellepopulationer kan mønstres sekventielt ved hjælp af adapterstrenge, der adskiller sig i deres modulære domæne (de 20 baser tættest på 3' ende).
Selv om denne fotopatterning protokol blev udviklet af Scheideler et al. i forbindelse med et rent rum, har vi vist, at det er muligt at opnå lignende resultater med en billig, "home-brew" fotolitografi setup, der passer nemt inden for en kemisk røghætte. Opsætningen omfatter en $ 400 spin coater lavet af en DC motor, digital controller, og CD kage boks, samt en UV-lampe, der blev samlet fra de enkelte komponenter og til huse i en repurposed skarpe beholder (Supplerende figur 1). Den største fordel ved hjemmet-bryg photolithography setup er, at det er meget overkommeligt (< $ 1000 for alt udstyr), mens du stadig er i stand til at skabe enkeltcellede funktioner. Brugen af billigt udstyr har dog sine begrænsninger - for eksempel er det mere udfordrende at præcist tilpasse fiducial markører til mønster flere DNA oligos uden brug af en maske aligner. Vi anbefaler denne billige fotolitografi opsætning til laboratorier, der ikke har bekvem adgang til et rent rum, eller som ønsker at prøve denne metode uden en stor investering.
For at identificere optimale betingelser for DNA-programmeret celle vedhæftning varierede vi systematisk dna-strengenes koncentrationer på celleoverflader og målte effektiviteten af celle vedhæftning til DNA-modificerede glasoverflader. Koncentrationen af Universal Anchor + Adapter Streng og Universal Co-Anchor i mærkningsløsninger blev varieret på tværs af flere størrelsesordener (Figur 4A,B), hvilket resulterede i 104 - 106 DNA-komplekser pr. celle (supplerende figur 4). Celle vedhæftning var dosisafhængig, med minimal vedhæftning af DNA-mønsteret, når celler blev mærket med CMOs i en koncentration på 0,05 μM eller mindre, og høj belægning i en koncentration på 2,5 μM og højere. Vi brugte derfor en 2 μM opløsning af Universal Anchor + Adapter Strand og 2 μM opløsning af Universal Co-Anchor i de fleste eksperimenter. Celle vedhæftning forventes også at falde, hvis mængden af DNA, der anvendes på glasoverfladen faldt29, eller hvis uoverensstemmelser mellem adapteren strand og overfladestrengen steg. Yderligere oplysninger om Adapter Strand-sekvensdesign findes i supplerende fil 2. CMO-mærkning ved hjælp af adapterstrenge uden CpG-gentagelser stimulerede ikke TLR9 i HEK-celler, der udtrykker musen TLR9 ( supplerende figur5).
Vi giver flere demonstrationer, at den reviderede protokol giver reproducerbar og effektiv DNA-programmeret celle vedhæftning. For eksempel, human navlestreng endotelceller (HUVECs) mærket med CMOs overholdt DNA-mønstre med høj effektivitet. HUVECs med cmo-mærket klæbede såvel som LMO-mærkede HUVECs (Figur 5A). Celler mønstret ved hjælp af CMO-DPAC bevaret deres levedygtighed og funktionalitet. Celler mærket med cmos blev plettet af calcein AM og ethidium homodimer at vurdere levedygtigheden (supplerende figur 6). Forskellene i levedygtighed sammenlignet med umærkede kontrolceller var små (94 % vs. 97 %). Enkelt MDCKs mønstret via CMO-DPAC og overført til Matrigel var i stand til at formere sig og polarisere korrekt efter 5 dages kultur (Figur 5B). DPAC giver også et middel til at udarbejde mønstre af celler i den tredje dimension (Figur 5C). For eksempel kan flerlags, flercellede aggregater oprettes ved skiftende lag af celler mærket med komplementære CMOs (Figur 5C). Disse eksperimenter viser, at protokollen er reproducerbar, påvirker ikke celle levedygtighed eller funktionalitet negativt, og giver cellulære mønstre, der med succes kan dyrkes inden for en enkelt billedbehandling plan i en 3D ECM.
Ved at give ortogonale DNA-sekvenser til direkte celle vedhæftning, DPAC giver et middel til at mønstre flere celletyper på en enkelt overflade. For at implementere denne funktion i DPAC skal DNA-mønstre, der genereres ved fotolitografi, justeres i forhold til hinanden. Metal betroede markører deponeret på diaset tilladt for tilpasning af flere fotomasker og dermed mønstre af flere celletyper på én gang. MCF10As farves med forskellige unikke farvestoffer blev mærket med ortogonale CMOs og mønstret for at skabe en visualisering af UC Berkeley og UCSF logoer (Figur 6). Dette eksperiment viser, at flere unikke cellepopulationer kan mønstres sammen med høj præcision og uden krydskontaminering.
Vellykket mønstre af celler ved hjælp af CMO-DPAC kræver fotolitografi af høj kvalitet, tilstrækkelig koncentration af oligo på celleoverfladen, en høj densitet af celler over mønsteret og tilstrækkelig vask. Hvis et af disse trin mislykkes, påvirker det endelige resultat. Supplerende figur 2 indeholder eksempelbilleder af korrekt og forkert fotolitografi (supplerende figur 2A), den ønskede celletæthed over mønsteret for at skabe fuldt besatte mønstre (supplerende figur 2B), tab af mønstrede celler som følge af alt for kraftig pipettering under efterfølgende trin i DPAC (supplerende figur 2C) og uønsket klumpning af celler (supplerende figur 2D). Tabel 1 indeholder en liste over almindelige fejlpunkter og den foreslåede fejlfinding. Brugen af fluorescerende komplementære oligoer anbefales som et værktøj til fejlfinding for at bekræfte tilstedeværelsen af mønstret DNA på diaset og tilstedeværelsen af CMOs på celleoverfladen ved flowcytometri (se trin 8 i protokollen).
Figur 1: Oversigt over CMO-DPAC-protokollen. For det første er en DNA-mønstret dias skabt ved belægning af en aldehyd-funktionaliseret glasrutschebane med en positiv fotoresist, der dækker den med en gennemsigtighedsmaske i det ønskede mønster og udsætter det for UV-lys. Den UV-eksponerede fotoresisten vaskes væk med udvikleren, hvilket efterlader udsatte områder af aldehyd-diaset og tillader binding af amine-funktionaliseret DNA til overfladen. Celler mærkes derefter med CMOs og flyder over overfladen. DNA'et på cellemembranen hybridiserer dna'et på overfladen, hvilket resulterer i vedhæftning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Celler er mærket med CMOs i en trinvis proces. For det første er den kolesterol-modificerede Universal Anchor Strand pre-hybridiseret med Adapter Streng. Derefter blandes Universal Anchor + Adapter-løsningen med celleaffjedringen. Kolesterolet på Universal Anchor + Adapter komplekse indsætter i cellemembranen. Efter inkubation tilsættes den kolesterol-modificerede Universal Co-Anchor Strand til celleaffjedringen, hvor den hybridiseres med Universal Anchor Strand og indsætter i cellemembranen. Tilsætning af det andet kolesterolmolekyle øger DNA-kompleksets nettohydrfobicity og stabiliserer det i membranen26. Efter vask af overskydende DNA, cellerne er koncentreret og føjet til en PDMS flow celle på toppen af den mønstrede overflade. 3' enden af Adapter Strand hybridiseres med Surface DNA-strengen på glasrutschebanen, hvilket resulterer i vedhæftning til diaset specifikt i områder, der er funktionaliseret med komplementært DNA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fotolitografi bruges til at skabe de DNA-mønstrede dias, der i sidste ende vil diktere placeringen af celler. (A) Oversigt over fotolitografi proces. En aldehyd-funktionaliseret dias er spin-belagt med en positiv fotoresist. UV-lys skinner på diaset gennem en gennemsigtighed fotomaske, der er gennemsigtig, hvor celle vedhæftning ønskes. Efter rutsjebanen er udviklet, har de regioner, der tidligere var udsat for UV-lys, nu udsat aldehydgrupper. En 20 μM opløsning af en amine-funktionaliseret DNA oligo derefter tabes på diaset og spredes over de mønstrede regioner. Diaset bages derefter for at fremkalde dannelsen af Schiff-bindinger (C =N) mellem amine- og aldehydgrupperne, en vendbar kovalent binding29. Efterfølgende reduktiv amination med 0,25% natriumborohydrid i PBS konverterer Schiff-basen til en sekundær amination ved reduktiv amination, hvilket resulterer i en irreversibel binding mellem DNA og diaset. Den resterende fotoresist kan derefter fjernes ved skylning med acetone. (B) Denne proces kan gentages for at skabe multi-komponent DNA-mønstre og derfor udføre eksperimenter med flere cellepopulationer. (i) Efter at den første oligo er mønstret, er diaset igen belagt med fotoresisten, og protokollen fortsætter som før. Justering af fotomasker ved hjælp af tillidsmarkører er nødvendig for at mønstre flere DNA-strenge. (ii) Hver celletype, der mønstres, adskiller sig i adapterstrengens modulære domæne med 20 baser. Ved at bruge ortogonale sæt komplementære oligoer, flere celletyper kan mønstres uden cross-vedhæftning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Vedhæftning af CMO-mærkede celler til DNA-mønstre øges som en funktion af CMO-koncentrationen under mærkningen. I dette eksperiment blev Universal Anchor + Adapter Strand (pre-hybridiseret) og Universal Co-Anchor brugt ved lige koncentrationer. Koncentration refererer til koncentrationen af cmo i celleaffjedringen under cmo-mærkning af celler. (A) Kvantificering af den procentdel af DNA-pletter med en diameter på 15 μm, der var optaget af MCF10A-celler med cmo-mærket som funktion af cmo-koncentrationen under cellemærkning. Data repræsenteret som middel ± standardafvigelse fra tre eksperimenter. (B) Repræsentative billeder af DNA-mønstrene (magenta) og klæbede MCF10As (cyan) i forskellige koncentrationer af cmo. Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: CMO-DPAC kan bruges til at skabe todimensionelle cellemønstre, der efterfølgende kan indlejres i en tredimensionel hydrogel til kultur og/eller lagdelt for at skabe flerlagsstrukturer. (A) Direkte sammenligning mellem CMO-mærkede humane navlestrengsveen endotelceller (HUVECs) og LMO-mærket HUVECs overholdt en lineær DNA-mønster. Begge metoder til cellemærkning resulterer i næsten 100% belægning af DNA-mønsteret. (B) Enkelt Madin-Darby Canine Kidneyceller (MDCKs) udtrykker H2B-RFP blev mønstret på 15 μm diameter pletter fordelt 200 μm fra hinanden og efterfølgende indlejret i Matrigel. Efter 120 timers kultur blev de resulterende epitelcyster faste og farvede til E-cadherin, actin og kollagen IV. Spheroid i hvid boks er vist i detaljer. Skalalinje = 50 μm. (C) Flerlags cellulære strukturer kan oprettes ved at mærke separate cellepopulationer med komplementære adapterstrenge og mønstre sekventielt, så hver ny tilsætning af celler klæber til cellelaget før det. (i) Et skema over fortløbende mønstre af cellepopulationer til at skabe flerlagsstrukturer. (ii) Trelagscelleaggregater af MCF10As (visualiseret ved hjælp af farvestoffer) blev oprettet ved hjælp af denne proces. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Flere celletyper kan mønstres uden krydskontaminering eller tab af vedhæftning. Flere amin-modificerede DNA oligos blev mønstret sekventielt på en aldehyd dias og justeret ved hjælp af metal betroede markører. Tre populationer af MCF10As (cyan, magenta, gul) blev farvet med unikke farvestoffer mærket med komplementære CMOs, og mønstret på diaset, hvilket resulterer i et billede af UC Berkeley og UCSF logoer. Skalalinje 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Eksempel billeder af bænken photolithography setup. (A) Skub på spin coater, dækket med positiv fotoresist, før spin belægning. (B) Billede af gennemsigtighed fotomaske. (C) Under eksponeringen er fotomasken klemt inde mellem den fotoresistbelagte rutsjebane, og en glasskive. (D) Huset til UV-lampe er lavet af en re-purposed sharps container. (E) Slide nedsænket i udvikler løsning. (F) Udviklet dias. (G) Amin-modificeret DNA-opløsning spredes på mønstrede områder af diaset. (H) PDMS-flowceller placeret oven på mønstrede områder af diaset. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Nogle eksempler på almindelige fejl i denne protokol. (A) (i) Underbagning før UV-eksponering eller overudviklingsfunktioner efter eksponering kan resultere i funktioner, der har takkede kanter og kan være uregelmæssige i størrelse. (ii) Et eksempel på en korrekt fotopatterned dias, der har rene kanter omkring funktioner, ensartet funktion størrelse, og ingen indlysende revner i mønsteret. Skalastang = 50 μm. (B) Celletæthed er afgørende for mønstreeffektiviteten. Når man observerer cellerne oven på mønsteret under et mikroskop, bør der kun være få mellemrum mellem cellerne, som det fremgår af eksempelbilledet til venstre. Skalastang = 50 μm. (C) Mønstrede celler kan være følsomme over for væskekræfter, der opstår som følge af alt for kraftig pipettering, hvilket kan beskadige og løsne de mønstrede celler. Flerlagscelleaggregater er særligt sårbare, da en celle nederst understøtter en struktur af flere celler. (i) En matrix af celleaggregater med succes integreret i Matrigel. (ii) Et gitter af celleaggregater, der løsnede sig som følge af pipetter tyktflydende Matrigel for kraftigt. (D) Klumpning af celler kan forekomme, især med epitelceller. Disse klumper er normalt homotypic, men kan være heterotypic (celler, der klæber til allerede mønstrede celler af en anden type), hvis cellerne er særligt klæbrige. Billedet viser, at tre forskellige populationer af MCF10As blev mønstret på et array bestående af tre forskellige enkeltcellede DNA-spots (15 μm). De fleste DNA-spots har 2-4 celler vedhæftet. Klumpning kan løses ved EDTA-behandling eller ved at filtrere klumperne ud, før de mønstrer. Skalalinje = 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Overlappende fotopatterns resulterer i tilstedeværelse af begge oligoer ved reduceret koncentration. To ortogonale amin-modificerede oligoer blev fotopatterned sekventielt, først en lodret linje (Streng 1), efterfulgt af en vandret linje, der overlappede det (Streng 2). Oligoerne blev derefter visualiseret ved hybridisering med fluorescerende komplementære oligoer. (A) Fluorescensbillede af streng 1. (B) Kvantificering af fluorescensprofilen for streng 1 over en 100 μm lodret linje, der strækker sig over overlapningen. (C) Fluorescensbillede af streng 2. (D) Kvantificering af fluorescensprofilen for streng 2 over en vandret linje på 100 μm, der strækker sig over overlapningen. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: Kvantificering af DNA-komplekser på celleoverfladen som funktion af cmo-mærkningskoncentrationen. HUVECs blev mærket med forskellige koncentrationer af CMO-opløsning, vasket og derefter inkuberet med en fluorescerende komplementær streng. En MESF (Molekyler af tilsvarende opløselige fluorokrom) mikrosfære kit blev brugt til at gøre kvantitative flow cytometri og anslå antallet af DNA-komplekser på celleoverfladen som en funktion af CMO koncentration under mærkning. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 5: CMO-mærkning stimulerer ikke TLR9-respons. Der blev udført et forsøg for at se, om cmo-mærkning ville udløse TLR9's DNA-detektionsmekanisme, og om dette ville blive påvirket af cpg'er i Adapter Strand-sekvensen. HEK-celler, der udtrykker mus TLR9, blev inkuberet natten over med 0,2 μM af enten ODN 1826 (en CpG-holdige TLR9-agonist), CMO Universal Anchor + Universal Co-Anchor + Adapter Strand, der indeholder samme sekvens som ODN 1826 (CMO-CpG) eller CMO Universal Anchor + Universal Co-Anchor + Adapter Streng, der indeholder en lignende sekvens, men med udskiftning af cpg'erne med gpcs (CMO-GpC). TLR9 stimulation ville resultere i produktion af SEAP (udskilles embryonale alkaliske fosfatase). SEAP sekretion blev kvantificeret ved en colorimetric assay (absorbans). Behandlingsbetingelserne blev sammenlignet med hvileceller, der kun blev behandlet med PBS. Inkubation med CMO-GPC stimulerede ikke TLR9-udtrykket. Inkubation med CMO-CpG var lidt højere end hvileceller, men meget lavere end ODN-1826. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 6: Cellers levedygtighed efter cmo-mærkningsprocessen. For at vurdere, hvordan protokollen påvirker levedygtigheden, blev HUVECs opdelt i fire populationer: en forblev på is i 1 time, en blev mock-mærket med PBS, men ellers taget gennem alle centrifuge og vasketrin, en blev mærket med CMOs, og en blev mærket med CMOs og filtreret gennem et 40 μm filter for at fjerne klumper. Cellerne blev derefter plettet med calcein AM og ethidium homodimer at vurdere antallet af levende og døde celler. Alle behandlinger resulterede i signifikant nedsat levedygtighed end iskontrollen (envejs ANOVA med Tukey post-hoc-analyse), men median levedygtigheden for CMO-mærkning (med eller uden filtrering) var omkring 94%. Data indsamlet fra tre uafhængige eksperimenter. * = p < 0,05. = p < 0,0001 Klik her for at downloade denne fil.
| Resultat | Mulige årsager | Foreslåede rettelser |
| Photolithography – funktioner er revnet | Inkonsekvent eller utilstrækkelig soft-bake | Forøg tiden af soft-bake op til 3 minutter; kontrollere den faktiske temperatur af kogeplade og øge temperaturen efter behov |
| Photolithography – funktioner er ikke skarpe eller har fotoresist tilbage i dem | Underudvikling | Forøg den tid, diaset bruger på udviklerløsning. indarbejde blid agitation |
| Photolithography – funktioner inkonsekvent på tværs af dias | UV-lys er muligvis ikke centreret eller ikke fokuseret korrekt | Juster UV-lysopsætningen for at sikre kollimeret lys af ensartet intensitet |
| Celler klæber ikke til mønstrede pletter med høj effektivitet | Ikke nok DNA på overfladen | Bekræft, at DNA er til stede på overfladen ved at hybridisere diaset med fluorescerende komplementære oligoer og derefter billeddannelse under mikroskop |
| Cellerne er utilstrækkeligt mærket med cmo | Tilføj fluorescerende komplementære oligoer til celleaffjedring og bekræft fluorescens via flowcytometri | |
| Ikke nok celler over mønster | Saml celler ved at skylle ud fra PDMS flow celle, centrifuge, og re-suspendere i lavere volumen for at koncentrere cellerne | |
| For meget tilbageværende CMO i celleaffjedring, hybridisering med DNA på dias | Tilføj endnu et vasketrin. Sørg for at fjerne så meget supernatant som muligt med hver vask. | |
| For meget internalisering af cmo på grund af tid og temperatur | Arbejd hurtigt efter mærkning af cellerne med cmo; holde celler og glide på is og bruge iskolde reagenser | |
| Celler klump | Cellerne blev ikke tilstrækkeligt adskilt under trypsinisering | Brug PBS + 0,04% EDTA under cellevask; gennem 35 μm filter før den endelige vask |
| Celler klæber ikke specifikt | Hvis i et bestemt område – kan skyldes ridser på dias, forskydning af PDMS flow celler, eller spild af DNA uden for mønsterområdet | Undgå ridser, vær omhyggelig med at justere PDMS-flowcellerne til mønsterområdet |
| Hvis cellerne klæber overalt – utilstrækkelig blokering eller vask | Tilføj i flere vasker efter mønstre cellerne; mere kraftigt under vask; blok med 1% BSA i længere tid, før du starter cellemønstre; silanize slide (valgfri trin 3) eller bekræfte silanisering lykkedes ved at måle kontakt vinkel af vanddråbe | |
| Bobler form i flow celle | Pipetteringsfejl, ujævn hydrofil overflade skabt under plasmaoxidation | Hvis boblerne er små, skal du tilføje PBS til indløbet af flowcellen, og de kan vaskes ud. Hvis boblerne er større, skal du lægge et forsigtigt tryk på PDMS-flowcellen og skubbe boblerne mod indløbet eller stikkontakten. |
| Celler i første omgang klæber til mønster, men fjernes under vask, mønstre af andre celletyper, eller tilføje hydrogel forløber | Forskydningskræfterne fra at pipetter for kraftigt kan få cellerne til at løsne sig fra overfladen | Pipet mere forsigtigt under efterfølgende vasker, runder af celle mønstre, eller tilføje hydrogel prækursorer. Fordi hydrogel prækursorer er tyktflydende, de er mere tilbøjelige til at forårsage mønsteret til at løsne sig, så vær ekstra forsigtig. Flerlagskonstruktioner har tendens til at være toptunge og er mere modtagelige for at blive løsnet. |
| Væv deformeres under 3D-overførsel | Hydrogel holder sig til at glide | Bekræft hydrofobicity af dias ved hjælp af kontaktvinkelmålinger |
| Brug barberbladet til at løfte PDMS helt på begge kanter, så PBS kan flyde under vævet | ||
| Dette kan ske med rene kollagen hydrogels – overveje at justere proteinkoncentrationen eller sammensætningen af hydrogel | ||
| Celler overføres ikke med hydrogelen og forbliver på diaset | Forøg Turbo DNAse koncentration eller øge inkubationstiden | |
| Hydrogel er ikke solid nok | Forøg inkubationstiden og/eller geleringsmekanismen for den pågældende hydrogel (f.eks. for kollagen skal du sørge for, at pH er korrekt) | |
| Hydrogel tårer ved fjernelse af PDMS | Gør PDMS flowceller hydrofile ved hjælp af plasmaoxidation, før du begynder at eksperimentere, så de let løsnes ved tilføjelse af medier. Brug sammenkøjninger meget forsigtigt til at løsne PDMS. |
Tabel 1: En fejlfindingsvejledning til at identificere og løse potentielle fejl, der kan opstå som følge af denne protokol. Især kan dårlig vedhæftning af celler til mønsteret have mange grundlæggende årsager, og denne vejledning bør hjælpe med identifikation og løsning af disse problemer.
Supplerende fil 1. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
I denne artikel præsenterer vi en detaljeret protokol til højopløsningsmønster af celler i 2D og 3D til in vitro-cellekultureksperimenter. I modsætning til tidligere offentliggjorte versioner af denne metode fokuserer den protokol, der præsenteres her, på brugervenlighed: Det kræver ikke højt specialiseret udstyr, og alle reagenser kan købes hos leverandører i stedet for at kræve brugerdefineret syntese. I modsætning til andre cellemikropatterningsmetoder er denne metode hurtig og celleformet agnostiker: Det kræver ikke specifik vedhæftning til ekstracellulære matrixproteiner15. Celler mønstret af CMO-DPAC kan indlejres i en ekstracellulær matrix som Matrigel eller kollagen, hvilket resulterer i 3D-kulturer med meget højere rumlig opløsning end det i øjeblikket er muligt med ekstruderingstrykbaserede metoder22. CMO-DPAC kan bruges til at skabe hundredvis til tusindvis af mikroskopiske funktioner pr dias, giver mulighed for mange replikaer, der skal udføres på samme tid.
En af de vigtigste parametre i denne protokols succes er tætheden af celler, der føjes til flowcellerne oven på det mønstrede dias. Ideelt set bør tætheden være mindst 25 millioner celler / mL. Når den indlæses i flowcellerne, resulterer denne celletæthed i et næsten tætpakket monolag af celler over mønsteret (supplerende figur 2B). Disse høje celletætheder maksimerer sandsynligheden for, at en celle vil bosætte sig direkte oven på et DNA-sted og klæbe. Reduktion af celletætheden vil reducere den samlede mønstereffektivitet. Et andet vigtigt skridt i denne protokol er grundigt at suspendere cellerne i PBS eller serumfri medier, før du tilføjer CMO-løsningen. CMOs partition meget hurtigt i cellemembraner og tilføje CMO opløsning direkte til en celle pellet vil resultere i heterogen mærkning af celler. Efter at have tilføjet CMO-opløsningen til celleaffjedringen er det vigtigt at blande grundigt ved pipettering, så cellerne er ensartet mærket med CMOs. Efter inkubationerne er det nødvendigt at vaske de overskydende CMOs grundigt gennem flere centrifugerings- og vasketrin. Overskydende fri CMO til stede i celle suspension vil binde sig til mønstrede amine-modificeret DNA på glas dias, blokering hybridisering og vedhæftning af CMO-modificerede celler i suspension. Tid er også en vigtig overvejelse for denne protokol. Det er vigtigt at arbejde så hurtigt som muligt, når du bruger CMOs og at holde cellerne på is for at minimere internalisering af CMOs og maksimere celle levedygtighed. Flow cytometri forsøg har vist, at CMOs ikke fortsætter så længe på celleoverfladen som LMOs, med 25% tab af CMO komplekser over to timers inkubation på is36. Desuden vil cellernes levedygtighed falde, efterhånden som cellehåndteringstiden øges. Levedygtighed kan maksimeres ved at arbejde hurtigt, holde celler på is, ved hjælp af iskolde reagenser og bruge serumfrie medier til at give nogle næringsstoffer.
Selvom CMO-DPAC kan være en kraftfuld måde at studere cellebiologi ved at mønstre celler med høj præcision, har den sine begrænsninger. CMO-DPAC-eksperimenter kan være udfordrende, især da den eksperimentelle kompleksitet tilføjes med flere celletyper, lag eller 3D-cellekultur (Supplerende fil 1). Eksperimentelle fejl kan være almindelige, når du starter denne protokol, som beskrevet i tabel 1. Derfor anbefaler vi, at brugerne indfører kvalitetskontrol (bekræfter, at DNA er til stede på diaset, bekræfter, at celler er tilstrækkeligt mærket med DNA (trin 8), hvilket bekræfter, at overskydende celler er blevet grundigt vasket væk osv.) for at sikre, at eksperimentet lykkes, og for at identificere trin, der kan kræve yderligere optimering. Vi håber, at oplysningerne i dette manuskript og dets supplerende filer vil bidrage til at lette enhver nødvendig fejlfinding.
Kolesterol er et bioaktivt molekyle, hvis internalisering kan påvirke cellemetabolisme, genekspression ogmembranvæske 37,38. En tidligere undersøgelse sammenlignede virkningerne på genekspression af CMO- og LMO-mærkede celler ved hjælp af enkeltcellet RNA-sekventering. CMO-mærkede HEK-celler havde ændret genekspression sammenlignet med umærkede og LMO-mærkede celler36. Mærkning af celler med CMOs resulterede i forskellen (> 1,5 gange) af otte gener i forhold til umærkede kontroller, herunder AP2B1, som har været forbundet med kolesterol og sphingolipid transport (GeneCards), og MALAT1, en lang ikke-kodende RNA, der regulerer kolesterol ophobning39. Mens mindre, disse transskriptionelle svar kan ikke desto mindre være af bekymring, hvis det pågældende eksperiment studerer stofskifte, membran dynamik, eller andre kolesterol-associerede veje i celler.
Denne protokol er fleksibel og kan justeres, så den opfylder behovene i hvert eksperiment. Fordi CMO indsætter sig selv i lipidmembranen i stedet for at bruge en bestemt receptor, er metoden celletype agnostiker (HUVECs, MCF10As, HEKs og MDCKs blevet påvist her). Selvom kolesterol er et andet hydrofobisk anker end vores tidligere offentliggjorte LMOs, har vi hidtil fundet dem til at opføre sig på samme måde. Således ville vi forvente, at CMOs til at arbejde med nogen af de mange forskellige celletyper, som vi tidligere har offentliggjort med LMOs, herunder men ikke begrænset til neurale stamceller, fibroblaster, perifere blod mononukleare celler, tumorceller, og primære bryst epitelceller6,23,27,29,36 . CMO mærkning stimulerer ikke TLR9, hvilket tyder på, at protokollen er kompatibel med immunceller. Membraninkorporering af cmo'en er en funktion af den samlede cellestørrelse og graden af negativ ladning i cellen glycocalyx35. Således har vi inkluderet en protokol (Trin 8) til test af omfanget af membran inkorporering, der er modtagelig for hurtig optimering. De specifikke træk ved hvert cellemønster vil uundgåeligt variere baseret på det eksperimentelle design (se supplerende fil 1 for mere vejledning). Selvom fotopatterningsprotokollen, der er beskrevet ovenfor til at mønstre DNA'et, anbefales, bør enhver metode til rumligt begrænse dråber af amin-DNA-opløsning fungere, såsom brug af dråbeprintere med høj opløsning. Mønsteropløsningen og mindstefunktionsafstanden varierer afhængigt af den anvendte metode. Det er også teoretisk muligt at kombinere DNA-fotopatterning dele af denne protokol med andre metoder, der er blevet brugt til at mærke celler med DNA, såsom med DNA hybridiseret til membran-udtrykte zink fingre40, ved hjælp af NHS-konjugeret DNA41, og reagerer azido sialsyre rester på celleoverfladen med fosphin-konjugeret DNA42 . CMO-DPAC kan anvendes på en række eksperimenter, der kræver stram kontrol over cellecelleafstand, herunder undersøgelser af samspillet mellem par celler, co-kultur eksperimenter ser på overførsel af signaler fra "afsender" celler til "modtager" celler, og undersøgelser af effekten af nærliggende ekstracellulære signaler på stamcelledifferentiering6,29 . Metoden kan også bruges til at oprette mikrotisssu'er, der kan bruges til at studere cellemigration i tre dimensioner, selvorganisering af celler i væv23,27og det dynamiske samspil mellem celler og ECM27. Vi håber, at denne protokol vil give forskerne en tilgængelig platform til at udforske nye anvendelser af HØJ OPLØSNING DNA-baserede celle mønstre i deres egne laboratorier.
Disclosures
Z.J.G. er rådgiver og kapitalejer i Provenance Biosciences.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Jeremy Garcia for at teste denne protokol og Bhushan Kharbikar for at give uddannelse på udstyret på UCSF Biomedical Micro and Nanotechnology Core. Denne forskning blev delvist støttet af tilskud fra Department of Defense Breast Cancer Research Program (W81XWH-10-1-1023 og W81XWH-13-1-0221), NIH (U01CA199315, DP2 HD080351-01, 1R01CA190843-01, 1R21EB019181-01A, og 1R21CA182375-01A1), NSF (MCB1330864), og UCSF Center for Cellular Construction (DBI-1548297), en NSF Science and Technology Center. O.J.S blev finansieret af et NSF Graduate Research Fellowship, et Siebel stipendium og et P.E.O. Scholarship. Z.J.G og A.R.A. er Chan-Zuckerberg BioHub Efterforskere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155379 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Adapter with External SM1 Threads and Internal SM3 Thread | ThorLabs | SM3A1 | |
| Aldehyde Functionalized Slides | Schott | Nexterion Slide AL | Store under dry conditions after opening. |
| All Plastic Syringes, 1 mL | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Amine-Modified DNA Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
| Aspheric Condenser Lens | ThorLabs | ACL7560 | |
| Borosilicate Disc, 6in Diameter X 1/2in Thick | Chemglass | CG-1906-23 | |
| Cell Culture Dishes 60x15 mm style | Corning | 353002 | |
| Cholesterol-Modified Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
| Diamond Scribe | Excelta | 475B | |
| DNA Oligonucleotide | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
| Isopropyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| Methylene Chloride (Stabilized/Certified ACS) | Fisher Scientific | D37-4 | |
| MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
| Microposit S1813 Positive Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
| Ø3" Adjustable Lens Tube, 0.81" Travel | ThorLabs | SM3V10 | |
| Oven | Thermo Scientific | 51-028-112H | |
| PE-50 Compact Benchtop Plasma Cleaning System | Plasma Etch | PE-50 | |
| Photomask (custom) | CAD/Art Services | n/a | Minimum feature size guaranteed by CAD/Art Services is 10 microns. |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RCT Basic Hot Plate | IKA | 3810001 | |
| Silicon Wafer (100 mm) | University Wafer | 590 | |
| Sodium Borohydride, 98%, granules | Acros Organics | 419471000 | |
| Spin Coater Kit | Instras | SCK-200 | This is a low cost option, but any spin coater that can maintain a speed of 3000 rpm will suffice. |
| SU-8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 2646340 | |
| Syringe Needles | Sigma-Aldrich | Z192341 | |
| T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | ThorLabs | LEDD1B | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane | Gelest | SIT8170.0 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 90335 | |
| Turbo DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Tweezers Style N7 | VWR | 100488-324 | The curved shape of these tweezers is essential for delicately picking up the PDMS flow cells containing patterned tissues. |
| UV LED (365 nm, 190 mW (Min) Mounted LED, 700 mA) | ThorLabs | M365L2 | |
| Wafer Tweezers | Agar Scientific | T5063 | |
| WHEATON Dry-Seal vacuum desiccator | Millipore Sigma | W365885 |
References
- Kreeger, P. K., Strong, L. E., Masters, K. S. Engineering approaches to study cellular decision-making. Annual Review of Biomedical Engineering. , 49-72 (2018).
- Goubko, C. a, Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Materials Science and Engineering C. 29 (6), 1855 (2009).
- Sun, W., et al.
- Liu, W. F., Chen, C. S. Cellular and multicellular form and function. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (13), 1319-1328 (2007).
- Duffy, R. M., Sun, Y., Feinberg, A. W. Understanding the role of ECM protein composition and geometric micropatterning for engineering human skeletal muscle. Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2076-2089 (2016).
- Chen, S., et al. Interrogating cellular fate decisions with high-throughput arrays of multiplexed cellular communities. Nature Communications. 7, 10309 (2016).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Rao, N., et al. A co-culture device with a tunable stiffness to understand combinatorial cell-cell and cell-matrix interactions. Integrative Biology. 5 (11), 1344 (2013).
- Sriraghavan, V., Desai, R. A., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. S. Micropatterned dynamically adhesive substrates for cell migration. Langmuir. 26 (22), 17733-17738 (2010).
- Wong, L., Pegan, J. D., Gabela-Zuniga, B., Khine, M., McCloskey, K. E. Leaf-inspired microcontact printing vascular patterns. Biofabrication. 9 (2), 021001 (2017).
- Chen, T. H., et al. Directing tissue morphogenesis via self-assembly of vascular mesenchymal cells. Biomaterials. 33 (35), 9019-9026 (2012).
- Laurent, J., et al. Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939-956 (2017).
- Lin, C., Khetani, S. R. Micropatterned co-cultures of human hepatocytes and stromal cells for the assessment of drug clearance and drug-drug interactions. Current Protocols in Toxicology. 2017, 1-23 (2017).
- Hui, E. E., Bhatia, S. N.
- D'Arcangelo, E., McGuigan, A. P. Micropatterning strategies to engineer controlled cell and tissue architecture in vitro. BioTechniques. 58 (1), 13-23 (2015).
- Martinez-Rivas, A., González-Quijano, G. K., Proa-Coronado, S., Séverac, C., Dague, E. Methods of micropatterning and manipulation of cells for biomedical applications. Micromachines. 8 (12), (2017).
- Lee, S., et al. Simple lithography-free single cell micropatterning using laser-cut stencils. Journal of Visualized Experiments. (158), e60888 (2020).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein printing by light-induced molecular adsorption. Advanced Materials. 28 (10), 2024-2029 (2016).
- Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the primo system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
- Reid, J. A., Mollica, P. M., Bruno, R. D., Sachs, P. C. Consistent and reproducible cultures of large-scale 3D mammary epithelial structures using an accessible bioprinting platform. Breast Cancer Research. , 1-13 (2018).
- Wang, Z., Lee, S. J., Cheng, H. -J., Yoo, J. J., Atala, A. 3D bioprinted functional and contractile cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 70, 48-56 (2018).
- Miri, A. K., et al. Effective bioprinting resolution in tissue model fabrication. Lab on a Chip. 19 (11), 2019-2037 (2019).
- Todhunter, M. E., et al.
- Todhunter, M. E., Weber, R. J., Farlow, J., Jee, N. Y., Gartner, Z. J. Fabrication of 3D microtissue arrays by DNA programmed assembly of cells. Current Protocols in Chemical Biology. 8 (3), 147-178 (2016).
- Csizmar, C. M., Petersburg, J. R., Wagner, C. R. Programming cell-cell interactions through non-genetic membrane engineering. Cell Chemical Biology. 25 (8), 931-940 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- Hughes, A. J., et al. Engineered tissue folding by mechanical compaction of the mesenchyme. Developmental Cell. 44 (2), 165-178 (2018).
- Weber, R. J., et al. Rapid organoid reconstitution by chemical micromolding. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 1851-1855 (2016).
- Scheideler, O. J., et al. Recapitulating complex biological signaling environments using a multiplexed, DNA-patterning approach. Science Advances. 6 (12), (2020).
- Viola, J. M., et al. Guiding cell network assembly using shape-morphing hydrogels. Advanced materials (Deerfield Beach, Fla.). , 2002195 (2020).
- Mohammad, A., Davis, M., Aprelev, A., Ferrone, F. A. Note: Professional grade microfluidics fabricated simply. Review of Scientific Instruments. 87 (10), 1-4 (2016).
- Lee, O. J., Chuah, H. S., Umar, R., Chen, S. K., Yusra, A. F. I. Construction of cost effective homebuilt spin coater for coating amylose-amylopectin thin films. Journal of Fundamental and Applied Sciences. 9 (2), 279 (2018).
- Webb, K., Hlady, V., Tresco, P. A. Relative importance of surface wettability and charged functional groups on NIH 3T3 fibroblast attachment, spreading, and cytoskeletal organization. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (3), 422-430 (1998).
- Processing Guidelines for: SU-8 2025, SU-8 2035, SU-8 2050, SU-8 2075. Microchem SU-8 2000 Permanent Expoxy Negative Photoresist. , Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/SU-82000DataSheet2025thru2075Ver4.pdf 1-5 (2019).
- Palte, M. J., Raines, R. T. Interaction of nucleic acids with the glycocalyx. Journal of the American Chemical Society. 134 (14), 6218-6223 (2012).
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16 (7), 619-626 (2019).
- Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 422-429 (2010).
- Luo, J., Yang, H., Song, B. L. Mechanisms and regulation of cholesterol homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (4), 225-245 (2020).
- Liu, L., Tan, L., Yao, J., Yang, L. Long non-coding RNA MALAT1 regulates cholesterol accumulation in ox-LDL-induced macrophages via the microRNA-17-5p/ABCA1 axis. Molecular Medicine Reports. 21 (4), 1761-1770 (2020).
- Mali, P., Aach, J., Lee, J. H., Levner, D., Nip, L., Church, G. M. Barcoding cells using cell-surface programmable DNA-binding domains. Nature Methods. 10 (5), 403-406 (2013).
- Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25 (12), 6985-6991 (2009).
- Gartner, Z. J., Bertozzi, C. R. Programmed assembly of 3-dimensional microtissues with defined cellular conductivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. (17), 1-5 (2009).
