Stima del contenuto di Lignina da biomassa vegetale mediante acido tioglicolico (TGA)

La lignina è uno dei componenti portanti vitali delle pareti cellulari delle piante e il secondo polimero più abbondante sulla Terra¹. Chimicamente, la lignina è un eteropolimero reticolato costituito da composti fenolici complessi ad alto peso molecolare che formano una fonte rinnovabile naturale di polimeri aromatici e sintesi di biomateriali^2,3. Questo polimero naturale svolge ruoli significativi nella crescita delle piante, nello sviluppo, nella sopravvivenza, nel supporto meccanico, nella rigidità delle pareti cellulari, nel trasporto dell'acqua, nel trasporto di minerali, nella resistenza all'alloggio, nello sviluppo di tessuti e organi, nella deposizione di energia e nella protezione da stress biotici e^{abiotici 4,5,6,7}. La lignina è composta principalmente da tre diversi monoligoli: coniferile, sinapil e alcoli p-coumarili derivati dalla via fenil propanoide^8,9. La quantità di lignina e la composizione dei monomeri variano in base alle specie vegetali, al tipo di tessuto / organo e alle diverse fasi dello sviluppo delle piante¹⁰. La lignina è ampiamente classificata in legno tenero, legno duro e lignina d'erba basata sulla composizione della sorgente e del monolignolo. Il legno tenero è composto principalmente dal 95% di alcol di coniferile con il 4% di p-coumaryl e l'1% di alcoli sinapilici. Il legno duro ha alcoli di coniferile e sinapil in proporzioni uguali, mentre la lignina erba è composta da varie proporzioni di alcoli di coniferile, sinapile e p-coumaryl^11,12. La composizione dei monomeri è critica in quanto determina la forza della lignina, la decomposizione e la degradazione della parete cellulare, nonché determina la struttura molecolare, la ramificazione e il collegamento incrociato con altri polisaccaridi^13,14.

La ricerca sulla lignina sta acquisendo importanza nel foraggiamento, nell'industria tessile, nell'industria della carta e per il bioetanolo, i biocarburanti e i bio-prodotti a causa del suo basso costo^{e dell'elevata abbondanza 15,16}. Vari metodi chimici (ad esempio, bromuro di acetile, detergenti acidi, ossidazione di Klason e permanganato) insieme a metodi strumentali (ad esempio, spettroscopia del vicino infrarosso (NIR), spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettrofotometria ultravioletta (UV) sono stati utilizzati per la quantificazione della lignina^9,17. I metodi di analisi della lignina sono generalmente classificati in base alla radiazione elettromagnetica, alla gravimetria e alla solubilità. Il principio alla base della stima della lignina mediante radiazione elettromagnetica era basato sulla proprietà chimica della lignina con cui assorbe la luce a lunghezze d'onda specifiche. Questi risultati sono stati stimati in base al principio che la lignina ha una maggiore assorbanza UV rispetto ai carboidrati. Nel 1962, Bolker e Somerville usavano pellet di cloruro di potassio per stimare il contenuto di lignina nel legno¹⁸. Tuttavia, questo metodo presenta inconvenienti nella stima del contenuto di lignina provenienti da campioni erbacei a causa della presenza di composti fenolici non lignina e dell'assenza di un adeguato coefficiente di estinzione. Nel 1970, Fergus e Goring scoprirono che i massimi di assorbimento del composto guaiacyl e siringile erano a 280 nm e 270 nm, il che corresse la questione del coefficiente di estinzione del metodo¹⁹di Bolker e Somerville. Successivamente, la spettroscopia infrarossa, una tecnica altamente sensibile per caratterizzare i fenolici, è stata utilizzata anche per la stima della lignina con una piccola quantità di campioni di biomassa vegetale. Un esempio di tale tecnologia era la spettrofotometria di trasformazione di Fourier a riflessione diffusa. Questo metodo, tuttavia, manca di uno standard adeguato simile al metodo UV²⁰. Successivamente, il contenuto di lignina è stato stimato da NIRS (spettroscopia vicino all'infrarosso) e NMR (spettroscopia di risonanza magnetica nucleare). Tuttavia, ci sono svantaggi in questi metodi, non alterano la struttura chimica della lignina, mantenendo la sua purezza²⁰.

Il metodo gravimetrico klason è un metodo analitico diretto e più affidabile per la stima della lignina degli steli legnosi. La base per la stima gravimetrica della lignina è l'idrolisi/solubilizzazione di composti non lignina e la raccolta di lignina insolubile per la gravimetria²¹. In questo metodo, i carboidrati vengono rimossi per idrolisi della biomassa con H₂SO_{4 concentrato per estrarre} il residuo di lignina^20,22. Il contenuto di lignina stimato con questo metodo è noto come lignina acida insolubile o lignina di Klason. L'applicazione del metodo Klason dipende dalle specie vegetali, dal tipo di tessuto e dal tipo di parete cellulare. La presenza di quantità variabili di componenti non lignina come tannini, polisaccaridi e proteine, si traduce in differenze proporzionali nella stima del contenuto di lignina acida insolubile/solubile. Pertanto, il metodo Klason è raccomandato solo per la stima della lignina della biomassa ad alto contenuto di lignina come gli steli legnosi^17,23. I metodi di solubilità come il bromuro di acetile (AcBr), la lignina insolubile con acido e l'acido tioglicolico (TGA) sono metodi più comunemente usati per stimare il contenuto di lignina da varie fonti di biomassa vegetale. Kim et al. Il primo metodo estrae la lignina come residuo insolubile solubilizzando la cellulosa e l'emicellulosa, mentre il secondo metodo separa la lignina nella frazione solubile, lasciando la cellulosa e l'emicellulosa come residuo insolubile²⁴.

Metodi analoghi utilizzati nella stima della lignina in base alla solubilità sono i metodi dell'acido tioglicolico (TGA) e del bromuro di acetile (AcBr)²⁵. Sia il TGA che il bromuro di acetile stimano il contenuto di lignina misurando l'assorbanza della lignina solubilizzata a 280 nm; Tuttavia, il metodo AcBr degrada gli xilulici durante il processo di solubilizzazione della lignina e mostra un falso aumento del contenuto di lignina²⁶. Il metodo tioglicolato (TGA) è il metodo più affidabile, in quanto dipende da un legame specifico con i gruppi tioether di gruppi di alcole benzile di lignina con TGA. La lignina legata al TGA viene precipitata in condizioni acide utilizzando HCl e il contenuto di lignina è stimato utilizzando la sua assorbanza a 280 nm²⁷. Il metodo TGA presenta ulteriori vantaggi di meno modifiche strutturali, una forma solubile di stima della lignina, meno interferenze da componenti non di lignina e una stima precisa della lignina dovuta a un legame specifico con la TGA.

Questo metodo TGA viene modificato in base al tipo di campione di biomassa vegetale utilizzato per la stima del contenuto di lignina. Qui, abbiamo modificato e adattato il metodo TGA rapido delle cannucce di riso²⁷ ai tessuti di cotone per stimare il contenuto di lignina. In breve, i campioni di piante in polvere essiccati sono stati sottoposti a tampone di solubilizzazione proteica ed estrazione di metanolo per rimuovere le proteine e la frazione solubile in alcool. Il residuo insolubile di alcol è stato trattato con TGA e lignina precipitata in condizioni acide. Una curva standard di lignina è stata generata usando lignina di bambù commerciale ed è stata ottenuta una linea di regressione (y = mx+c). Il valore "x" utilizza valori medi di assorbanza della lignina a 280 nm, mentre i valori "m" e "c" sono stati inseriti dalla linea di regressione per calcolare la concentrazione sconosciuta di lignina in campioni di biomassa delle piante di cotone. Questo metodo è diviso in cinque fasi: 1) preparazione di campioni vegetali; 2) lavare i campioni con acqua e metanolo; 3) trattamento del pellet con TGA e acido per far precipitare la lignina; 4) precipitazione della lignina; 5) la preparazione standard della curva e la stima del contenuto di lignina del campione. Le prime due fasi si concentrano principalmente sulla preparazione del materiale vegetale seguita da acqua, PSB (tampone di solubilizzazione proteica) ed estrazioni di metanolo per ottenere il materiale insolubile alcool. Quindi, è stato trattato con TGA (acido tioglicolico) e HCl per formare un complesso con lignina nella terza fase. Alla fine, l'HCl è stato utilizzato per precipitare la lignina, che è stata sciolta in idrossido di sodio per misurarne l'assorbanza a 280 nm²⁸.

1. Preparazione di campioni vegetali

1. Raccogliere piante di cotone di due mesi dalla serra(figura 1A).
2. Capovolgere delicatamente vasi vegetali per separare terreno e radici con radici laterale intatte allentando il terreno intorno alla pianta(Figura 1B).
3. Lavare accuratamente le piante raccolte in vassoi riempiti d'acqua per rimuovere tutto lo sporco (per campioni di radici)(Figura 1C).
4. Utilizzare gli asciugamani di carta per asciugare i tessuti separati di radice, stelo e foglia ed etichettarli (Figura 1D). Asciugare all'aria per 2 giorni a temperatura ambiente per prevenire qualsiasi contaminazione fungina (Figura 1E).
5. Trasferire i tessuti campione in contenitori etichettati/fogli di alluminio e incubare in un incubatore a temperatura controllata a 49 °C per 7-10 giorni(figura 1F).
   NOTA: Temperature più elevate possono alterare la struttura della lignina. In alternativa, un essiccatore a congelatore può essere utilizzato per asciugare campioni per 1 o 2 giorni senza causare cambiamenti chimici alla biomassa vegetale.
6. Utilizzare una lama per tagliare il tessuto essiccato dell'incubatore in pezzi di dimensioni 5 mm o in alternativa utilizzare una smerigliatrice a biomassa per macinare i tessuti vegetali(Figura 1G, Figura 1H).
   NOTA: La smerigliatrice/lama a biomassa deve essere pulita dopo che ogni campione è stato tagliato/macinato.
7. Trasferire il materiale vegetale macinato a tessuto/biomassa tagliato in flaconcini di macinazione e macinare in polvere fine di dimensioni di 1 mm utilizzando un mulino congelatore o una smerigliatrice criogenica con liquido N₂.
8. Macinare campioni per tre cicli alla velocità di 10 CPS (ciascuna campata di ciclo di 2 min) in una polvere uniforme(Figura 1I, 1J, 1K).
   NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa a questo punto e i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente in contenitori ermetici per lo stoccaggio a lungo termine.

2. Lavare i campioni con acqua, PSB e metanolo

1. Misurare e registrare il peso di tutti i tubi vuoti di microfugo da 2 ml utilizzati per la stima del contenuto di lignina nel quaderno da laboratorio.
2. Trasferire 20 mg della polvere del campione macinato nel tubo pre pesato. Pesare il tubo con tessuto e tessuto in polvere e registrare questi pesi nel quaderno da laboratorio.
3. Incubare tutti i 2 tubi di microfugo da 2 ml (con coperchi aperti) con 20 mg di polvere di tessuto in un blocco termico o in un forno a 60 °C per 1 ora.
4. Dopo l'incubazione, raffreddare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
5. Aggiungere 1,8 ml di acqua a ciascun tubo di microfugo e mescolare con vortici. Quindi, centrifuga a 25.200 x g (15.000 giri/min) per 10 minuti a RT e scarta il supernatante(Figura 2).
6. Aggiungere 1,8 mL di tampone di solubilizzazione proteica (PSB)(tabella 1)a ciascun pellet trattenuto e mescolare mediante vortice. Centrifuga a 25.200 x g (15.000 giri/min) per 10 minuti a RT e scarta il supernatante.
7. Ripetere nuovamente il passaggio 2.6 per ogni campione.
8. Aggiungere 1,8 mL di acqua a ogni pellet, mescolare con vortice e centrifugare a 25.200 x g (15.000 giri/min) per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, salvare il pellet e scartare il supernatante.
9. Al pellet trattenuto, aggiungere 1,8 mL di metanolo e incubare in un blocco termico di 60 °C per 20 minuti. Quindi, centrifuga a 25.200 x g (15.000 giri/min) per 10 minuti a RT. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e conservare il pellet (Figura 2).
10. Ripetere nuovamente il passaggio 2.9 per ogni campione.
11. Asciugare ad aria il pellet a RT o procedere immediatamente mediante essiccazione sottovuoto. Aspirare a secco utilizzando essiccatore sottovuoto a 30 °C per 2-3 ore o fino a quando il pellet non è completamente asciutto.
    NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa a questo punto mediante essiccazione ad aria durante la notte o continuare mediante essiccazione sottovuoto.
12. Dopo l'asciugatura, pesare i tubi campione con il pellet essiccato e registrare il peso accanto al rispettivo peso del tubo vuoto nel notebook da laboratorio. Stimare il peso del pellet sottraendo i due valori. Questi pesi saranno utilizzati per la stima della lignina al termine del processo di estrazione della lignina.
13. A questo punto di estrazione della lignina, includere la lignina di bambù commerciale per la generazione della curva standard di lignina. Misurare la lignina di bambù commerciale in tubi separati che vanno da 0,5 mg a 5 mg in incrementi di 0,5 mg (0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 3 mg, 3,5 mg, 4 mg, 4,5 mg e 5,0 mg). Misurare ogni concentrazione tre volte per tre repliche tecniche.
    NOTA: D'ora in su, gli standard misurati nella fase precedente sono stati elaborati allo stesso modo dei campioni essiccati.

3. Trattamento del pellet con TGA e acido per precipitare la lignina

1. Prelevare campioni trattati dalla fase precedente, insieme agli standard misurati, al trattamento TGA (acido tioglicolico).
2. Aggiungere 1 mL di 3 N HCl(tabella 1)e 100 μL di TGA a ciascun pellet.
3. Vortice e incubare in un blocco termico preriscaldato a 80 °C per 3 ore in una cappa aspirante(figura 2).
   NOTA: La fase di riscaldamento a 80 °C deve essere monitorata. L'accumulo ad alta pressione può aprire i coperchi e può portare a fuoriuscite di sostanze chimiche. Si consigliano tubi a cappuccio a vite, ma i tubi da 2 ml possono essere vagai durante questo passaggio come alternativa per prevenire tali fuoriuscite.
4. Dopo l'incubazione, tubi freddi a RT per 10-15 minuti e centrifuga a 25.200 x g (15.000 giri/min) per 10 minuti a RT.
   NOTA: I rifiuti generati da solventi acidi e organici devono essere separati e conservati in contenitori di vetro con tappi ventilati. Utilizzare contenitori di vetro separati per la raccolta di rifiuti di acido TGA e rifiuti acidi.
5. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e conservare il pellet. Aggiungere 1 mL di acqua, mescolare con vortice e centrifuga a 25.200 x g (15.000 giri/min) per 10 minuti a RT.
6. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e mescolare il pellet in 1 N NaOH per 24 ore a 37 °C shaker/miscelatore termico a bassa velocità(Figura 2).
   NOTA: Questo tempo di incubazione può essere ridotto a 1 ora⁷.
7. Dopo l'incubazione, centrifugare i tubi di microfugo da 2 ml a 25.200 x g (15.000 giri/min) per 10 min a RT. Mantenere il supernatante per il passaggio successivo.
   NOTA: La procedura prevede l'uso di acidi forti e altre sostanze chimiche corrosive in natura. Pertanto, l'uso di DPI adeguati è raccomandato durante tutto il processo di stima della lignina. TGA ha un forte odore sgradevole ed è corrosivo in natura. Pertanto, si consiglia di utilizzare solo nella cappa dei fumi.

4. Precipitazione della lignina

1. Trasferire il supernatante in un tubo di microfugo fresco da 2 ml e aggiungere 200 μL di HCl. Concentrato Incubare a 4 °C per 4 ore o durante la notte(figura 2).
   NOTA: Il processo di estrazione può essere messo in pausa a questo punto estendendo la fase di refrigerazione a durante la notte.
2. Centrifugare a 25.200 x g (15.000 giri/min) per 10 minuti a RT e sciogliere il pellet in 1 mL di 1 N NaOH.
3. Incubare nello shaker a RT per 10 minuti per sospendere completamente il pellet in NaOH.
4. Infine, misurare l'assorbanza dei campioni a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro e confrontarla con la curva standard della lignina.
5. Misurare la concentrazione sconosciuta di lignina utilizzando i valori della linea di regressione della curva di calibrazione e le assorbanze dei campioni estratti a 280 nm.

5. Preparazione standard della curva e stima della lignina nel campione

1. Elaborare gli standard di lignina allo stesso modo dei campioni sperimentali provenienti dal trattamento TGA.
2. Misurare gli standard commerciali di lignina di bambù in incrementi di 0,5 mg a partire da 0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 3,5 mg, 4,0 mg, 4,5 mg e 5 mg. Quindi, il processo di TGA, HCl, si dissolve in 1 N NaOH seguito da una misurazione dell'assorbanza a 280 nm(Figura 3A).
3. Utilizzare valori di concentrazione di lignina e letture di assorbanza per generare un grafico sparso della curva standard della lignina (Figura 3B).
4. Utilizzare la linea di regressione, y = mx+c generata nel grafico sparso, per la stima del contenuto di lignina sconosciuta dei campioni preparati utilizzando valori "x" da assorbanze medie di campioni estratti a 280 nm e valori "m" e "c" dalla linea di regressione della curva standard di lignina.
5. Dividere il contenuto di lignina nel valore y risultante per peso totale del campione di biomassa vegetale essiccata sottovuoto/aria dopo l'estrazione del metanolo in mg (circa 15 mg) per ottenere concentrazione di lignina per mg. Quindi, moltiplicare questo valore per 100 per calcolare la percentuale di lignina per mg.

Due diverse linee sperimentali di cotone sono state confrontate per differenze nel loro contenuto di lignina in tessuti diversi. Il contenuto di lignina estratta di ciascun campione è stato misurato a 280 nm e ha registrato i rispettivi valori di assorbanza. I valori medi di assorbanza di ciascuna replica biologica sono stati confrontati con la linea di regressione della curva standard di lignina(tabella 2, figura 3C). La linea di regressione, y = mx + c, viene utilizzata per calcolare il contenuto sconosciuto di lignina delle linee sperimentali estratte, il campione 1 e il campione 2. I risultati dei valori medi di OD sono stati sostituiti in "x" mentre i valori "m" e "c" sono stati collegati dalla linea di regressione della curva standard di lignina per ottenere la concentrazione di lignina "y" in mg(tabella 3, figura 3B). Nella fase successiva, per calcolare per 1 mg di contenuto di lignina, dividere il valore "y" per il peso del campione (15 mg) dopo l'estrazione del metanolo. Nel passaggio seguente, per calcolare per grammo (= 1.000 mg) il valore y/15 è stato moltiplicato per 1.000. Per ottenere % di lignina dividiamo il valore y/15 per 1.000 e moltiplichiamo per 100. La media della lignina % per tre repliche biologiche (di ciascuna linea, campione 1 e campione 2) è stata confrontata tra le due linee sperimentali campione 1 (11,7%) e campione 2 (10,3%). I valori di lignina erano coerenti tra le repliche biologiche suggerendo che il metodo TGA è un metodo affidabile e altamente specifico per misurare il contenuto di lignina. Sono stati inoltre effettuati studi comparativi tra diversi tipi di tessuto (radice, gambo e foglie) di due linee sperimentali di cotone ed entrambe le linee hanno mostrato un contenuto relativamente inferiore di lignina nelle foglie (3,4%) rispetto agli steli (dal 9,4% al 9,9%) radici (dal 9,4% al 9,2%) (Tabella 4, Figura 4).

Figura 1: Preparazione del campione di biomassa vegetale.  (A) Materiale vegetale di cotone raccolto dalla casa verde. (B) Vasi delicatamente capovolti per separare le radici. (C)Accuratamente lavato in acqua per rimuovere tutto lo sporco. (D) Tessuti separati di radici, steli e foglie. (E) Tessuto essiccato all'aria per 2 giorni dopo la separazione del tessuto. (F) Il tessuto essiccato all'aria viene trasferito nell'incubatrice a 49 °C per 10 giorni. ( G )Lasmerigliatrice a biomassa è stata utilizzata per macinare campioni di biomassa vegetale. (H) Campioni di biomassa vegetale macinata di radici, steli e foglie. (I) I campioni macinati vengono caricati nei flaconcini di rettifica, collocati nella camera del frantoio, messi a terra nel congelatore ad una velocità di 10 CPS per 3 cicli. (J) Flaconcini macinati che mostrano polvere di tessuto finemente macinata dopo la macinazione nel frantoio. (K) Polvere di tessuto finemente macinata di radice, gambo e foglia dopo l'utilizzo del frantoio per la macinazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Fasi critiche dell'estrazione mediata di lignina mediata da TGA. Diagramma di flusso delle fasi critiche dell'estrazione della lignina dalla biomassa vegetale alla stima del contenuto di lignina con metodo TGA: 1. Preparazione di campioni di piante mediante essiccazione e macinazione sufficienti in polvere fine mediante congelatore; 2. 20 mg di polvere di tessuto sono stati sottoposti a lavaggi psb, metanolo e acqua, materiale insolubile alcool essiccato ed estratto; 3. Utilizzando TGA e acido, la lignina è stata precipitata; 4. Preparazione della curva standard di lignina utilizzando lignina di bambù commerciale; 5. Stima del contenuto di lignina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Preparazione standard della curva e stima della lignina nel campione. (A) Tabella che mostra diverse concentrazioni di lignina di bambù commerciale utilizzata per generare la curva standard di lignina dalle letture di assorbanza a 280 nm. (B) Grafico sparso generato con il programma Excel utilizzando i valori dei grafici a barre della tabella A. (C) che rappresentano il contenuto stimato di lignina del tessuto radicale del campione 1 e del campione 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Preparazione delle soluzioni utilizzate nel protocollo. Tabella che mostra la preparazione di diverse soluzioni utilizzate nel protocollo.

Tabella 2: Curva standard di Lignin preparata da 0,5 mg a 3,5 mg di lignina di bambù industriale. Grafico sparso con linea di regressione che mostra i valori m e c. Clicca qui per scaricare questa Tabella.

Tabella 3: Modello di Lignin utilizzato per il calcolo del contenuto di lignina sconosciuta utilizzando letture di assorbanza di campioni a 280 nm (come x) e valori standard della linea di regressione della curva 'm' e 'c' dalla curva standard. Clicca qui per scaricare questa Tabella.

Tabella 4: Contenuto di lignina provenienti da diversi tessuti (radici, steli e foglie) di pianta di cotone in fase di post fioritura. Clicca qui per scaricare questa Tabella.

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.