Summary
该协议说明了化学诱导的蛋白质变暗系统，在染色质上产生凝结物。 用化学调光剂在端粒上形成前列腺白血病（PML）核体。滴生长、溶解、定位和组成通过活细胞成像、免疫荧光 （IF） 和荧光就地杂交 （FISH） 进行监测。
Abstract
与铬素相关的冷凝水与许多核过程有关，但其基本机制仍然难以捉摸。该协议描述了一个化学诱导的蛋白质变暗系统，在端粒上产生凝结物。化学分光器由两个连结的配体组成，每个配体可以与蛋白质结合：光环配体与光环酶和三叶虫（TMP）到 大肠杆 菌二氢脱氢还原酶（eDHFR）。光环酶与端粒蛋白的融合通过共价光环配体酶结合将调光剂锚定到端粒。TMP 与 eDHFR 结合，将 eDHFR 融合相分离蛋白到端粒，并诱导凝结物形成。由于 TMP-eDHFR 相互作用是非共价的，因此可以通过使用多余的免费 TMP 与变音器竞争 eDHFR 绑定来逆转冷凝。显示了在端粒上诱导产卵性白血病 （PML） 核体形成并确定凝结水生长、溶解、定位和成分的示例。这种方法可以很容易地适应诱导冷凝水在其他基因组位置通过融合光环到蛋白质，直接结合到当地的色素或dCas9，这是针对基因组位置与引导RNA。通过提供单细胞活成像所需的时间分辨率，同时保持生化测定细胞群的相分离，该方法适用于探索染色素相关凝结物的形成和功能。
Introduction
许多蛋白质和核酸经过液态相分离（LLPS），并自行组装成生物分子凝结物，在细胞1、2中组织生物化学。铬素结合蛋白的LLPS导致凝结物的形成，与特定的基因组位点相关，并涉及各种局部染色质功能3。例如，HP1蛋白的LLPS是异色素域形成的基础，组织基因组4、5，转录因子的LLPS形成转录中心来调节转录6，新生的mRNA和多性别梳蛋白的LLPS产生希石细胞体来调节histonemRNAS7的转录和处理。 然而，尽管发现了许多与染色素相关的冷凝水的例子，但冷凝水形成、调节和功能的基本机制仍然鲜为人知。特别是，并非所有的染色质相关冷凝水都是通过LLPS形成的，还需要仔细评估活细胞中的凝结物形成。例如，小鼠体内的HP1蛋白在活细胞中形成液滴的能力较弱，异色素foci表现为坍塌的聚合物球10。因此，在活细胞中诱导染色素的脱凝析剂的工具是可取的，特别是那些允许使用活成像和生化检测来监测凝结物形成的动能、产生的凝结水的物理和化学特性以及凝结水形成的细胞后果的工具。
该协议报告了一种化学变质系统，在染色质11（图1A）上诱导蛋白质凝结物。分光器由两个链接的蛋白质相互作用的配体组成：三叶草（TMP）和光环配体，可以调低融合到认知受体的蛋白质：大肠杆菌二氢磷酸还原酶（eDHFR）和细菌烷基卤酶酶（哈洛酶），分别12。光环配体和光环酶之间的相互作用是共价的，允许光环酶通过将其与染色质结合蛋白融合来吸收融合到eDHFR到染色质的相分离蛋白来用作锚。在初始招募后，相分离蛋白的局部浓度增加，超过了相分离所需的临界浓度，从而在锚点核聚水（图1B）。通过将荧光蛋白（例如 mCherry 和 eGFP）与 eDHFR 和光环融合在一起，冷凝水的核和生长可以通过荧光显微镜实时可视化。由于 eDHFR 和 TMP 之间的相互作用是非共价的，因此可以添加多余的免费 TMP，以与变色器竞争 eDHFR 绑定。然后，这将释放锚的相分离蛋白，并溶解与染色素相关的冷凝水。
我们用这个工具诱导端粒酶阴性癌细胞端粒上的非核细胞白血病（PML）核体形成，使用端粒（ALT）通路的替代加长端粒维持13，14。 PML核体是涉及许多核过程的无膜隔间15，16，并具有独特的本地化ALT端粒形成APB，为ALT端粒相关的PML体17，18。端粒聚集在APB内，大概是为了提供修复模板的同源定向端粒DNA合成在ALT19。事实上，端粒DNA合成已经在APB中被发现，APB在丰富端粒20、21的DNA修复因子方面起着至关重要的作用。然而，APB 组装和端粒聚类在 APB 内的基础机制尚不得而知。由于ALT细胞中的端粒蛋白由小的全非基蛋白样修饰剂（SUMOs）22独特地修饰，许多APB组件包含相扑位点22、23、24、25和/或 相扑相互作用主题（SIM）26，27和 SUMO-SIM 相互作用驱动相分离28，我们假设端粒上的相扑导致富集 SUMO/SIM 包含蛋白质和这些蛋白质之间的 SUMO-SIM 相互作用导致相位分离。 PML蛋白，它有三个相扑位点和一个SIM网站，可以招募到相扑端粒形成APB和液体APB的聚合导致端粒聚类。为了验证这一假设，我们使用化学调光系统模仿相扑诱发的APB形成，通过招募SIM到端粒（图2A）11。GFP 融合到光环酶中用于可视化，并融合到端粒结合蛋白 TRF1 上，将调光器固定到端粒上。SIM 融合到 eDHFR 和 mcherry。凝结物形成和液滴融合诱导端粒聚类的动力学与活细胞成像相跟随。 阶段分离通过添加多余的免费 TMP 来与 eDHFR 绑定竞争来逆转。免疫荧光 （IF） 和荧光原位杂交 （FISH） 用于确定凝结水成分和端粒关联。招聘 SIM 丰富端粒上的 SUMO，诱导的冷凝水含有 PML，因此是 ABB。招募不能与 SUMO 交互的 SIM 突变体不会丰富端粒上的 SUMO 或诱导相分离，表明 APB 凝结的根本驱动力是 SUMO-SIM 交互。同意这一观察，聚SUMO-聚氨酯聚合物融合到TRF2结合因子RAP1也可以诱导APB形成29。与聚SUMO-聚氨酯聚变系统相比，只要产生足够的蛋白质，相分离就会发生，这里提出的化学调光方法可按需诱导相分离，从而提供更好的时间分辨率来监测相分离和端粒聚类过程的动能。此外，这种化学分化系统允许招募其他蛋白质来评估它们诱导相分离和端粒聚类的能力。例如，在端粒中招募的无序蛋白质也可以形成液滴和聚类端粒，而不会诱导APB的形成，这表明端粒聚类独立于APB化学，仅依赖于APB液体特性11。
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Protocol
1. 生产瞬态细胞系
- 培养 U2OS 接受细胞在 22 x 22 毫米玻璃盖片 （用于实时成像） 或 12 mm 直径圆形覆盖脂 （IF 或 FISH） 涂有多 D-赖氨酸在 6 井板与生长介质（10%胎儿牛血清和1%青霉素-链霉素溶液在DMEM），直到他们达到60-70%的汇合。
- 转染前用1 mL转染介质（无青霉素-链霉素溶液的生长介质）代替生长介质。
- 对于每个转染井，将 4 μL 转染试剂添加到 150 μL 减少血清介质，漩涡 10 秒，然后孵育 5 分钟。
- 对于每口井，添加光环构造质粒（哈洛-GFP-TRF1 或光环-TRF1）和 eDHFR 构建质粒（mCherry-eDHFR-SIM 或 mCherry-eDHFR-SIM） 突变）在1：1质量比（0.5 μg光环构建质粒与0.5 μg eDHFR构建质粒）到150微升减少血清介质， 滴， 通过管道混合。
注：标签相对较小（哈洛33千伏、eDHFR 28 kD、mCherry 30 kD、eGFP 27 kD），未观察到对相位分离的影响。但是，使用此处使用的 SIM 突变体（如 SIM 突变体）来确保相位行为对突变敏感，而不是建议标记。SIM是从皮亚西克斯28，30。SIM 序列是阿格特加特加特加特SIM突变是由将 SIM 氨基酸 VIDL 变异为 VADA28生成的，序列为 AAGTCGATGCGCCCGACCGACCGACGCGAGGAGAGAGAGAGAGACCCCACGGGGGT。我们沉积我们的质粒添加基因： #164644 3XHalo-GFP-TRF1;#164646米切里 - 埃赫弗 - 西姆;#164649米切里 - 埃赫弗 - 西姆突变体。 - 加入150微升的转染试剂-减少血清介质混合物到150微升减少血清介质与DNA，滴，通过管道混合，孵育5分钟。
- 将300微升的转染试剂-DNA混合物加入细胞，滴入细胞，然后将细胞放回孵化器。
- 等待24-48小时，然后进行现场成像、免疫荧光（IF）或荧光就地杂交（FISH）。
2. 端粒上的分化
- 在 10 mM 下溶解二甲基硫化物中的二甲醚，并储存在塑料微中心管中，在 +80 °C 下进行长期存储。
注：与其使用与 TMP 直接链接到光环 （TMP-Halo， TH） 的调光器，不如使用 TMP 和 Haloligand 之间的6硝基微丙烯酸酯 （NVOC） 的调光剂 TMP-NVOC-Halo （TNH） 。这是因为 TNH（+5 分钟）扩散到细胞所需的时间比 TH（+20 分钟）少。此处显示的结果也可以使用 TH 获得。使用 TNH 时，小心不要将调味机暴露在光线下，以避免 NOVC 裂口。用昏暗的红灯在黑暗的房间里处理 TNH，将调光器存放在琥珀色塑料管中，然后用铝箔包裹装有 TNH 或经过处理的细胞的容器。使用 DIC 成像 TNH 是安全的。 - 将 10 mM 的二氧化一微基从 +80 °C 中取出，在成像介质中稀释到库存浓度为 10 μM，存储在 +20 °C。
- 当准备使用时，将稀释变味器从 10 μM 库存溶液稀释到生长介质（用于固定成像）或成像介质中最终工作浓度为 100 nM。在舞台上用100纳米调光器（最终浓度）治疗细胞，进行活成像或孵育4-5小时，进行免疫荧光（IF）和荧光就地杂交（FISH）。
注：使用的调光剂的浓度会影响变暗效率，从而影响相位分离。使最大变暗效率的变音器浓度取决于细胞类型和锚蛋白浓度，因此需要为不同的实验确定。一个简单的方法是孵化表达锚蛋白和mCherry-eDHFR的细胞（不与分离蛋白质的相位融合或融合到非相分离突变体），并识别在锚地达到最高mCherry强度的变色器浓度。更系统的方法是孵化细胞表达锚只与不同浓度的调光剂，然后用光环结合染料，以帮助确定调光器浓度，其中光环结合染料强度开始稳定（即，所有的光环融合锚被二聚变器占用，不再留给光环结合染料）32。 - 要逆转变暗，用调光剂孵育细胞2-5小时（有或没有活成像），或直到达到所需的液滴大小，并在成像介质中加入100微米自由TMP（最终浓度）稀释到细胞。
3. 免疫荧光 （IF）
- 种子 105 细胞在 12 毫米直径的圆形盖眼镜涂层多 D-赖氨酸在 6 井板.然后转染两个质粒（哈洛-GFP-TRF1与mCherry-eDHFR-SIM或mCherry-eDHFR-SIM突变体），等待24-48小时，然后继续免疫荧光。
注：等待一天以上后，转染可以获得更高的表达。 - 稀释具有生长介质的稀释剂，最终浓度达到 100 nM，将稀释的稀释剂添加到细胞中，并在 37 °C 下孵育 4-5 小时。
注：添加调光剂（<30分钟）后，会迅速诱导相分离。更长的孵化有助于将小滴粗糙成更大的尺寸。通过实时成像跟踪液滴生长，可用于确定液滴达到所需状态所需的时间。 - 在室温下将含有 4% 甲醛和 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液中的细胞固定 10 分钟，使细胞渗透。用 PBS 清洗细胞 3 次。
注：在此步骤之后，可以暂停，并且电池可以在 4 °C 下存储长达一周。
注意：甲醛因吸入而有害，如果吞咽，也会刺激眼睛、呼吸系统和皮肤，并可能带来癌症危害。需要佩戴个人防护装备，仅在化学烟气罩中使用。使用后也把它放进垃圾容器里，不要把它放在水槽里。 - 用 50 μL TBS-Tx 清洗盖片两次，用 50 μL 抗体稀释缓冲器 （AbDil） 清洗一次。TBS-Tx 是由 TBS 制造的， 0.1% 特里顿 X - 100 和 0.05% 纳齐德。Abdil 是由 Tbs - tx， 2% Bsa 和 0.05% 纳齐德制造的。
- 在潮湿的腔室中以 4 °C 的 4 °C 将每个盖片与 50 μL 原质抗 PML（AbDil 中的 1：50 稀释）/抗 SUMO1（AbDil 中的 1：200 稀释）/防 SUMO1（AbDil 中的 1：200 稀释）孵育每个盖片。mcherry 抗体也可用于（AbDil 中的 1：200 稀释），以帮助检测鱼的 mCherry 信号。
注：鱼淬火的mCherry荧光信号，这使得很难区分细胞转染与麦切里质粒从那些没有在FISH实验中转染。建议使用 mcherry 抗体。或者，一个人可以使一个稳定的细胞线表达eDHFR含有蛋白质。 - 用 AbDil 洗 3 次盖片，以去除未绑定的主要抗体。
- 用继发抗体[抗鼠标IgG（H+L）二级抗体结合亚历克萨氟647PML和SUO，抗兔IgG（H+L）二级抗体结合亚历克萨氟555为mCherry，均在1：1000稀释在AbDil]在室温下在暗盒中1小时。
- 用 TBS-Tx 洗 3 次封面。
- 标签幻灯片，稀释安装介质中的 DAPI，以达到 1 μg/mL 的 DAPI 最终浓度。然后将 2 μL 稀释的 DAPI 放在幻灯片上。翻转盖唇，并把它们放在DAPI下降，渴望从盖唇的边缘额外的液体。
- 用指甲油密封，让它干燥，用水从盖唇顶部冲洗。保存在冰柜中用于成像。
4. 原位杂交荧光（鱼）
- 种子 105 细胞在 12 毫米直径的圆形盖眼镜涂层多 D-赖氨酸在 6 井板.与光环 -TRF1 和 mCherry-eDHFR-SIM 或 mCherry-eDHFR-SIM 突变质粒的转化细胞，等待 24-48 小时，然后再前往鱼。变暗步骤与 3.2 中描述的相同。
注意：这里TRF1不与GFP融合，所以绿色通道被释放端粒DNA探针。 - 在室温下用 4% 甲醛修复细胞 10 分钟，用 PBS 洗 4 次。对于 IF-FISH，从这里开始执行 IF 协议，在 IF （3.8） 中洗掉二级抗体后，在室温下用 4% 甲醛修复细胞 10 分钟，然后用 PBS 洗涤三次。
- 乙醇系列中的脱水盖片（70%、80%、90%、2分钟）。
- 在 5 μL 杂交溶液中以 75 °C 孵育覆盖唇，使用 488-telC PNA 探头（1：2000 比率），5 分钟。杂交溶液含有 70% 去离子化表酰胺、10 mM Tris（pH 7.4）、0.5% 阻塞试剂。然后在室温下在潮湿的室内孵育过夜。
- 在室温下用洗涤缓冲器（70% 形式酰胺，10 mM Tris）清洗盖片 2 分钟，3 次，并在安装介质中安装 1 μg/mL DAPI 进行成像。
注：鱼协议是已发布的协议33'34。
5. 实时成像
- 当细胞准备好成像时，在磁室中安装覆盖唇，将细胞保持在 1 mL 成像介质中，在环境室的加热阶段不产生酚红色。
- 设置显微镜和环境控制装置。图像是使用旋转盘共聚焦显微镜获得的，该显微镜具有 100 倍 1.4 NA 目标、Piezo Z-Drive、电子乘法电荷耦合装置 （EMCCD） 摄像机以及配备 455、488、561、594 和 647 nm 激光的激光合并模块，由成像软件控制。所有激光器的输出能力在光纤末端测量为 20 mW。
- 在端粒上定位具有明亮 GFP 信号的细胞，并在核质中分散定位 mCherry 信号。查找大约 20 个单元格，使用 x、y、z 信息记住每个位置，并设置时间差成像参数，间隔为 0.5 μm，Z 间距为 8 μm，GFP 和 mCherry 通道间隔为 5 分钟，间隔为 2-4 小时。使用 594 nm 的 30% 和 488 nm 功率强度的 50%，曝光时间为 200 ms，相机增益 300。
注：激光装置的输出功率为20mW。明亮的 GFP foci 表示锚尺寸较大，可以更容易地核聚变冷凝。查找具有广泛 mCherry 信号的细胞，因为相位分离取决于细胞中的 SIM 浓度。信号太暗或太亮的细胞可能不会相位分离。为了避免光出血，请不要使用过多的激光功率或过长的曝光时间。 - 开始成像，并采取一次性循环作为预变色。暂停成像，在舞台上的成像室中加入含有 15 μL 10 μM 调光器的 0.5 mL 成像介质，使最终变音器浓度为 100 nM。恢复成像。
- 当准备反向变暗时，暂停成像，将包含 2 μL 100 mM 库存 TMP 的 0.5 mL 成像介质添加到舞台上的成像室，以获得 100 μM TMP 最终浓度。继续成像细胞1-2小时。
6. 固定成像
- 与现场成像设置相同的显微镜，不需要舞台加热。使用 488 nm 来成像端粒鱼， 561 nm 用于 mcherry IF， 647 nm 用于 PML 或 SUMO IF。
注意： 如果不使用 mcherry 抗体， 只需直接成像 mcherry 蛋白质， 但信号可能暗淡， 因为鱼淬火。 仍然使用 561 nm 而不是 594 nm 激光来成像 mcherry， 以避免 Cy5 到 mcherry 的信号出血。 - 找到大约30-50个带有红色信号的细胞（mCherry或mCherryIF），以选择转染细胞。
- 图像的间距为 0.3 μm，Z 中总共为 8 μm，用于收集更多信号。使用 647 nm 的 80%、561 nm 的 80% 和 488 nm 功率强度的 70%，曝光时间为 600 ms，相机增益 300。
7. 处理延时图像
- 定义端粒的二进制
选择一个具有所有时间和 z 堆栈信息的单元格，仅选择 GFP 通道并通过定义阈值创建二进制层。调整阈值的下值和上值，并使用"平滑"、"清洁"和"填充孔"等功能，查看阈值通过所有时间点拾取所需对象的程度。 - 减去背景
选择所有通道，在背景（单元格之外）绘制矩形兴趣区 （ROI）。将此投资回报率定义为背景，然后减去背景强度。 - 将端粒二进制链接到端粒强度
选择端粒二进制，并将其链接到 GFP 通道，用于计算二进制对象中的 GFP 强度作为端粒强度。 - 计算端粒数量和强度随着时间的推移
指定要导出哪些信息，如时间、对象 ID、平均强度、总和强度和出口数据。使用图形绘图软件读取输出的表，并生成端粒数和端粒强度（在每个端粒的体积上总结强度，然后在细胞中的所有端粒上平均）。
8. 处理固定单元格图像
- 为 APB 定义二进制
通过在 561nm 通道中查找信号来选择转染的细胞进行分析。按照 7.1 中的程序，定义 GFP（端粒 DNA FISH）和 Cy5（PML 或 SUMO IF）通道的阈值，分别生成端粒和 PML 身体或 SUMO 的二进制。合并 GFP 和 Cy5 二进制层，创建包含包含粒子的新层，这些粒子都有 GFP 和 Cy5 信号，可表示端粒上 PML 体的共定位，因此 APB。 - 计算 APB/SUMO 数量和强度
减去 7.2 之后的图像背景。在 7.3 之后将 APB/SUMO 二进制层链接到 Cy5 通道。计算 APB/SUMO 数量和强度。7.4 之后的导出和绘图数据。
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Representative Results
图2显示端粒DNA鱼和相扑蛋白IF识别的SUMO端粒定位代表性图像。与 SIM 突变招募的细胞相比，具有 SIM 征用的细胞在端粒上丰富了 SUMO1 和 SUMO 2/3。这表明 SIM 变小化诱导端粒上的 SUMO 浓缩取决于 SUMO-SIM 交互。
在视频1 中显示 TRF1 和二元化后 SIM 的代表性时间推移电影。图 3A中显示了四个时间点的快照。SIM成功被招募到端粒，SIM和TRF1 foci变得越来越大，更亮，如液体液滴形成和生长预测（图1B）。此外，还观察到TRF1 foci的融合（图3B），这导致端粒聚类，如端粒数（图3E）的减少和端粒强度随时间的增加（图3D）。相比之下，SIM突变体在变暗后被招募到端粒，但没有诱导任何滴状或端粒聚集，因为端粒强度没有增加，端粒数量没有减少（图3C，D，E，视频2）。这表明相分离，因此端粒聚类是由 SUMO-SIM 交互驱动的。
添加多余的免费 TMP 后相分离和端粒聚类的逆转显示在视频 3中。图4A显示四个时间点的快照。同意端粒的冷凝水溶解和去聚类预测，端粒数量增加，端粒强度随着时间的推移而降低（图4B，C）。
端粒DNA鱼和PML蛋白IF识别的APB代表图像显示在 图5中。与 SIM 变异的细胞相比，使用 SIM 招募的细胞具有更多的 ABB，这表明二元化诱导的冷凝水确实是 ABB。
这里的数字显示了具有代表性的图像。有关更多单元格的统计分析，请参阅张等人。al.， 202011.
图1：化学变质诱导染色素相关凝结物。 （A） 分光器示意图：调光器由两个相互关联的配体组成，TMP和光环分别与eDHFR和卤素酶相互作用。分离蛋白的相位融合到麦哲里和eDHFR，染色体锚蛋白融合到光环和GFP。（B） 在添加调光剂（左上角）之前，大多数染色体锚蛋白（绿色方块）被定位到染色体上，少量的锚蛋白在核质中扩散定位。要招募的相分离蛋白（紫星）和相分离伙伴（与相分离蛋白、红三角形相凝结的蛋白质）在核质中扩散定位。加入调光剂（右上核）后，相分离蛋白在染色体和核质的锚蛋白上变暗。根据锚蛋白的相对浓度、相分离蛋白和使用的调光剂，核质中可能会有一些多余的分离蛋白的阶段。在变暗（右下角）后，锚点分离蛋白的局部浓度增加，导致相分离和染色素相关凝结物的形成。由于与 eDHFR 融合相分离蛋白共同凝结，锚点的相分离伙伴富集。锚蛋白不直接绑定到染色质可以丰富在锚，因为变暗到相分离蛋白。加入多余的免费TMP，与二聚变器竞争eDHFR结合（左下角）后，分离蛋白的相位从染色质中释放出来，冷凝水溶解。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：在用调光器将SIM器招募到端粒后，SUMO被丰富。 （A） 这个实验中的分化示意图：SIM（或SIM突变体）融合到mCherry和eDHFR，TRF1融合到光环和GFP。（B） 招募 SIM 后端粒 DNA 鱼和相扑 1 的代表细胞。底部是二元层，可识别端粒、SUMO1 和共位相扑 1 和端粒 DNA foci 的数量。比例栏： 5μm.（C） 端粒 DNA 鱼和相扑 1 的代表细胞， 如果招募 SIM 突变体后。底部是用于识别共位相扑1和端粒DNAfoci数量的图像的二元层。比例条：5μm.（D） 端粒DNA鱼和相扑2/3如果招募SIM后的代表细胞。底部是识别端粒、SUMO2/3 的二元层，以及共定位的 SUMO2/3 和端粒 DNA foci 的数量。比例条： 5μm.（E） 端粒 DNA 鱼和相扑 2/3 如果招募 SIM 突变体后的代表细胞。底部是用于识别共位 SUMO2/3 和端粒 DNA foci 数量的图像的二元层。刻度条：5 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：分化诱导相分离驱动端粒聚类。（A ） 添加100 nM调光器（最终浓度）前后TRF1-GFP和SIM-mCherry快照。底部是从 TRF1-GFP 中识别的端粒二进制层。比例栏：5μm.（B） 招募 SIM 到端粒后的融合事件。秤杆：2μm。时间间隔：5分钟（C）TRF1-GFP和SIM突变-mCherry的快照前后添加100 nM调光器（最终浓度）。底部是从 TRF1-GFP 中识别的端粒二进制层。刻度条：5 μm.（D） 招募 SIM （绿色，图 3A中的细胞） 和 SIM 突变体 （蓝色， 图3C中的细胞） 后， 平均端粒强度 （在每个端粒的体积上总结强度， 然后平均超过细胞中的所有端粒） 。（E） 在招募 SIM 卡 （绿色，图 3A中的单元格） 和 SIM 形突变体 （蓝色， 图3C中的细胞） 后， 端粒号码。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：凝结和端粒聚类的逆转。（A） 在将 100 μM TMP（最终浓度）添加到凝结水形成 3 小时的细胞后，TRF1-GFP 和 SIM-mCherry 的快照。底部是从 TRF1-GFP 中识别的端粒二进制层。比例杆：5μm.（B）平均端粒强度（总结强度超过每个端粒的体积，然后平均超过细胞中的所有端粒）随着时间的推移，细胞在 图4A。（C） 图4A中细胞的端粒数。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：分化诱发的凝结物是APB。（A）端粒DNA鱼和PML如果招募SIM后的代表细胞。底部是识别端粒、PML 体的二元层，以及共定位 PML 和端粒 DNA foci 的数量，即 ABB 数。比例栏： 5 μm.（B） 端粒 DNA 鱼和 Pml 如果招募 SIM 突变体后的代表细胞。底部是用于识别共位 PML 和端粒 DNA foci（即 ABB 数量）的图像的二进制层。刻度条：5 μm。请单击此处查看此图的较大版本。
视频 1： 用调光器招募 SIM 卡到端粒可驱动相位分离和端粒聚类。 SIM-mCherry、TRF1-GFP 的实时成像，并在添加 100 nM 调光器（最终浓度）之前和之后合并通道。秤杆：5μm。时间间隔：5分钟。时间如前所示。请点击这里下载此视频。
视频 2： 招募 SIM 突变体不能驱动相位分离和端粒聚类。 SIM 突变-mCherry、TRF1-GFP 的实时成像，并在添加 100 nM 调光器（最终浓度）之前和之后合并通道。秤杆：5μm。时间间隔：5分钟。时间如前所示。请点击这里下载此视频。
视频 3：冷凝和端粒聚类的逆转。 SIM-mCherry、TRF1-GFP 的实时成像，并在将 100 μM TMP（最终浓度）添加到凝结水形成 3 小时的细胞后合并通道。秤杆：5μm。时间间隔：5分钟。时间如前所示。请点击这里下载此视频。
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Discussion
该协议演示了端粒上凝结水的形成和溶解与化学变暗系统。通过实时成像监测相位分离和液滴融合诱导端粒聚类的动力学。凝结物的本地化和成分由DNA鱼和蛋白质IF确定。
此协议中有两个关键步骤。首先是确定蛋白质和调光剂的浓度。在基因组位点诱导局部相分离的成功取决于相分离蛋白的局部浓度高于相分离的关键浓度（图 1B).分离蛋白的全球浓度需要足够高，以便有足够的蛋白质在当地集中。相分离蛋白的浓度不能过高，因此全球相分离已经发生或容易诱发。 锚DNA长度（或锚蛋白与之结合的改性染色质的大小）和光环融合锚蛋白的浓度决定了核中心在最大调光效率下的大小。锚的大小越大，核凝结物就容易了。与锚蛋白量相比，变暗效率受变音器量的影响。太少的调光剂不能占据所有可用的锚蛋白，而太多的调光剂导致eDHFR与多余的调光剂，而不是锚蛋白上的低沉剂的非生产性结合。分光器浓度，以及锚DNA长度和光环融合锚蛋白的浓度，可用于确定核化局部相分离所需的关键浓度。可使用系统的方法来改变这些参数（锚DNA长度、锚蛋白浓度、相分离蛋白浓度和调光剂浓度），以绘制多维相图。但是，如果兴趣不是映射相图，而是形成色度素相关凝结物，如这里所示，则很容易简单地选择具有明亮光环-GFP信号（较大锚大小）的细胞和具有广泛亮度的细胞，用于 mCherry-eDHFR（各种相分离蛋白浓度），以图像与变音器浓度进行成像，以达到第 2.3 号议定书确定的最大变暗度。第二个关键步骤是避免实时成像中的光出血。与全球相分离不同，液滴（亮的mCherry foci标记相分离蛋白）将在相分离后出现，在基因组位置的局部凝结不能轻易地通过判断mCherry foci的存在来发现。这是因为单独招募蛋白质，没有相分离，到基因组叶将导致形成麦切里局部卵石。阶段分离发生在招聘之后，因此在首次招聘后，MCherry foci 继续变得越来越大，越来越亮。由于锚蛋白对相分离蛋白的变小化，GFP通道（锚蛋白）中也可能发生相分离诱导浓缩。因此，应使用 foci 的物理属性（大小和强度）随着时间推移而变化，而不是使用 foci 的存在来判断相位分离。虽然可能难以区分mCherry（猎物蛋白）foci的分化或相分离诱导浓缩，但GFP（锚蛋白）foci的浓缩只有在相分离时才会发生（图 3D).因此，锚蛋白的富集可以用来轻松判断相分离。高激光功率或成像期间长时间曝光导致的光出血使得判断相位与实时成像分离更加困难，因此应通过调整成像条件尽可能避免。请注意，随着时间的推移，foci 强度和尺寸的增加是 LLPS 的特征，但不能用作 LLPS 的唯一证据。在此处介绍的案例中，液滴融合被用作形成液滴的证据，对于数量较少的锚或更少的移动锚，液滴可能不会发生。在没有液滴聚变的情况下，其他方法，如冷凝水成分的扩散和对小分子扰动的敏感性，可以用来进一步确认冷凝水的形成8,9,11.
虽然这种化学变暗系统为活细胞的监测相分离提供所需的时间分辨率，但它在细胞和亚细胞水平上缺乏空间分辨率。由于调光器的模块化设计，可以通过将光衣附着在TMP上，使连接器感光或同时具有12、32、35。只需在同一工程单元格内切换调光器以用于不同的应用，就可以实现对变暗的高空间和时间控制、变暗的逆转或两者兼有光。我们设想，有了这些光敏的调光器，它将能够控制具有高空间和时间精度的相位分离。与现有的光遗传工具相比，通过光敏蛋白36、37控制相分离，化学分化系统的缺点是只能逆相分离一次。然而，该系统可以保持持续的招募，从而阶段分离没有光，这使得它更适合长期现场成像应用，如跟随滴生长或细胞后果的相位分离。此外，在没有光的情况下治疗细胞群的能力使得生化测定变得方便，例如确定凝结物组成或基因组组织变化所需的测定。
这种方法可以很容易地适应在基因组的其他位置诱导冷凝水。人们只需识别出一种与感兴趣的基因组位置结合的蛋白质，并将其融合到光环中，将其用作锚（图1B）。或者，一个人可以结合这与CRISPR和引信dCas9到光环，并使用指南RNA锚定光环到基因组地段的兴趣38。此外，人们可以通过将光环与靶向蛋白（例如Lacii）融合到基因组中，将光环锚定在外位DNA阵列（例如Lao）上。然后，人们可以使用自下而上的方法来评估蛋白质在染色质上局部相分离的能力，其相位分离能力如何受到蛋白质截断、突变或转化后修饰的影响，或者凝结物如何影响局部功能，如染色质修饰、复制或转录。总之，这种化学变质系统可用于在各种染色质位置诱导各种凝结剂，特别适合通过将长期活成像与生化测定相结合，研究染色质相关凝结物的物质特性和化学成分如何促进染色质功能。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家卫生研究院（1K22CA23763201至H.Z.，GM118510至D.M.C）和查尔斯·考夫曼基金会对H.Z.的支持。作者要感谢杰森·托恩斯对手稿的校对。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
References
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