Summary
Denne protokollen illustrerer et kjemisk indusert protein dimeriseringssystem for å skape kondensater på kromatin. Dannelsen av promyelocytisk leukemi (PML) kjernelegeme på telomerer med kjemiske dimerizere er demonstrert. Dråpevekst, oppløsning, lokalisering og sammensetning overvåkes med levende celleavbildning, immunfluorescens (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH).
Abstract
Kromatin-assosierte kondensater er involvert i mange kjernefysiske prosesser, men de underliggende mekanismene forblir unnvikende. Denne protokollen beskriver et kjemisk indusert protein dimeriseringssystem for å skape kondensater på telomerer. Den kjemiske dimmerizeren består av to koblede ligander som hver kan binde seg til et protein: Halo ligand til Halo-enzymet og trimetoprim (TMP) til henholdsvis E. coli dihydrofolate reduktase (eDHFR). Fusjon av Halo-enzymet til et telomerprotein forankrer dimerizers til telomerer gjennom kovalent Halo ligand-enzymbinding. Binding av TMP til eDHFR rekrutterer eDHFR-smeltet fase som skiller proteiner til telomerer og induserer kondensatdannelse. Fordi TMP-eDHFR-interaksjon ikke er kovalent, kan kondens reverseres ved å bruke overflødig fri TMP til å konkurrere med dimmerizeren for eDHFR-binding. Et eksempel på å indusere promyelocytisk leukemi (PML) kjernefysisk kroppsdannelse på telomerer og bestemme kondensatvekst, oppløsning, lokalisering og sammensetning er vist. Denne metoden kan enkelt tilpasses for å indusere kondensater på andre genomiske steder ved å fusjonere Halo til et protein som direkte binder seg til det lokale kromatinet eller til dCas9 som er rettet mot det genomiske locus med en guide RNA. Ved å tilby den tidsmessige oppløsningen som kreves for encellet levende avbildning samtidig som faseseparasjon opprettholdes i en populasjon av celler for biokjemiske analyser, er denne metoden egnet for å undersøke både dannelsen og funksjonen til kromatinrelaterte kondensater.
Introduction
Mange proteiner og nukleinsyrer gjennomgår væske-væske fase separasjon (LLPS) og selvmontering i biomolekylære kondensater for å organisere biokjemi i celle1,2. LLPS av kromatinbindende proteiner fører til dannelse av kondensater som er forbundet med spesifikk genomisk loci og er involvert i ulike lokale kromatinfunksjoner3. For eksempel ligger LLPS av HP1-protein til grunn for dannelsen av heterokromatindomener for å organisere genomet4,5, LLPS av transkripsjonsfaktorer danner transkripsjonssentre for å regulere transkripsjon6, LLPS av nascent mRNAer og multi-sex kammer protein genererer histone locus organer for å regulere transkripsjon og behandling av histone mRNAs7. Til tross for mange eksempler på kromatinrelaterte kondensater som oppdages, forblir de underliggende mekanismene for kondensatdannelse, regulering og funksjon dårlig forstått. Spesielt dannes ikke alle kromatinrelaterte kondensater gjennom LLPS, og nøye evalueringer av kondensatdannelse i levende celler er fortsatt nødvendig8,9. For eksempel er HP1-protein i mus vist å ha bare en svak kapasitet til å danne flytende dråper i levende celler og heterokromatinfoci oppfører seg som kollapset polymer globules10. Derfor er verktøy for å indusere de novokondensater på kromatin i levende celler ønskelige, spesielt de som tillater bruk av levende avbildning og biokjemiske analyser for å overvåke kinetikken til kondensatdannelse, de fysiske og kjemiske egenskapene til de resulterende kondensatene og de cellulære konsekvensene av kondensatdannelse.
Denne protokollen rapporterer et kjemisk dimeriseringssystem for å indusere proteinkondensater på kromatin11 (figur 1A). Dimerizer består av to koblede proteininteragerende ligander: trimetoprim (TMP) og Halo ligand og kan dimerisere proteiner smeltet til konjakkreseptorene: Escherichia coli dihydrofolate reduktase (eDHFR) og et bakterielt alkyldehalogenase enzym (Halo enzyme), henholdsvis12. Samspillet mellom Halo ligand og Halo-enzymet er kovalent, slik at Halo-enzymet kan brukes som anker ved å smelte det sammen til et kromatinbindende protein for å rekruttere et faseseparerende protein smeltet til eDHFR til kromatin. Etter den første rekrutteringen passerer økt lokal konsentrasjon av faseseparasjonsproteinet den kritiske konsentrasjonen som trengs for faseseparasjon og nukleerer dermed et kondensat ved ankeret (figur 1B). Ved å fusjonere fluorescerende proteiner (f.eks. mCherry og eGFP) til eDHFR og Halo, kan kjernedannelse og vekst av kondensater visualiseres i sanntid med fluorescensmikroskopi. Fordi samspillet mellom eDHFR og TMP ikke er kovalent, kan overflødig fri TMP legges til for å konkurrere med dimmerizeren for eDHFR-binding. Dette vil deretter frigjøre faseseparasjonsproteinet fra ankeret og oppløse det kromatin-assosierte kondensatet.
Vi brukte dette verktøyet til å indusere de novo promyelocytic leukemi (PML) kjernefysisk kroppsdannelse på telomerer i telomerase-negative kreftceller som bruker en alternativ forlengelse av telomerer (ALT) bane for telomervedlikehold13,14. PML kjernefysiske organer er membranløse rom involvert i mange kjernefysiske prosesser15,16 og er unikt lokalisert til ALT telomerer for å danne APB-er, for ALT telomer-tilknyttede PML-organer17,18. Telomeres-klynge i APBer, antagelig for å gi reparasjonsmaler for homologistyrt telomer DNA-syntese i ALT19. Faktisk har telomere DNA-syntese blitt oppdaget i APBer og APBer spiller viktige roller i å berike DNA-reparasjonsfaktorer på telomerer20,21. Mekanismene som lå til grunn for APB-montering og telomerklynger i APBer var imidlertid ukjente. Siden telomerproteiner i ALT-celler er unikt modifisert av små allestedsnærværende modifikator (SUMOer)22, inneholder mange APB-komponenter sumoyleringssteder 22,23,24,25 og / eller SUMO-interagerende motiver (SIMer)26,27 og SUMO-SIM interaksjoner driver faseseparasjon28, vi antok at summering på telomerer fører til berikelse av SUMO / SIM som inneholder proteiner og SUMO-SIM-interaksjoner mellom disse proteinene fører til faseseparasjon. PML-protein, som har tre sumoyleringssteder og ett SIM-nettsted, kan rekrutteres til å summere telomerer for å danne APBer og koalescens av flytende APBer fører til telomererklynge. For å teste denne hypotesen brukte vi det kjemiske dimeriseringssystemet til å etterligne sumoyleringsindusert APB-dannelse ved å rekruttere SIM til telomerer (figur 2A)11. GFP smeltes sammen til Haloenzyme for visualisering og til telomerbindende protein TRF1 for å forankre dimmerizeren til telomerer. SIM-kortet er smeltet sammen til eDHFR og mCherry. Kinetikk i kondensatdannelse og dråpefusjonsindusert telomerklynge følges med levende celleavbildning. Faseseparasjon reverseres ved å legge til overflødig fri TMP for å konkurrere med eDHFR-binding. Immunfluorescens (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH) brukes til å bestemme kondensatsammensetning og telomerisk assosiasjon. Rekruttering av SIM beriker SUMO på telomerer og de induserte kondensatene inneholder PML og er derfor APBer. Rekruttering av en SIM-mutant som ikke kan samhandle med SUMO, beriker ikke SUMO på telomerer eller induserer faseseparasjon, noe som indikerer at den grunnleggende drivkraften for APB-kondensering er SUMO-SIM-interaksjon. Enig med denne observasjonen, polySUMO-polySIM polymerer som smeltet til en TRF2 bindingsfaktor RAP1 kan også indusere APB formasjon29. Sammenlignet med polySUMO-polySIM fusjonssystemet der faseseparasjon oppstår så lenge nok proteiner produseres, induserer den kjemiske dimeriseringsmetoden som presenteres her faseseparasjon på forespørsel og gir dermed bedre tidsoppløsning for å overvåke kinetikken til faseseparasjon og telomerklyngeprosess. I tillegg tillater dette kjemiske dimeriseringssystemet rekruttering av andre proteiner for å vurdere deres evne til å indusere faseseparasjon og telomerklynge. For eksempel kan et forstyrret protein rekruttert til telomerer også danne dråper og klynge telomerer uten å indusere APB-dannelse, noe som tyder på at telomerklynge er uavhengig av APB-kjemi og bare er avhengig av APB flytende egenskap11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produksjon av forbigående cellelinjer
- Kultur U2OS akseptorceller på 22 x 22 mm glassdeksler (for levende bildebehandling) eller 12 mm diameter sirkulære deksler (for IF eller FISH) belagt med poly-D-lysin i 6-brønns plate med vekstmedium (10% foster bovint serum og 1% Penicillin-Streptomycin løsning i DMEM) til de når 60-70% konfluency.
- Bytt ut vekstmedium med 1 ml transfeksjonsmedium (vekstmedium uten Penicillin-Streptomycin-løsning) før transfeksjon.
- For hver transfeksjonsbrønn legger du til 4 μL transfeksjonsreagens til 150 μL redusert serummedie, virvel i 10 sekunder og deretter inkuberer i 5 minutter.
- For hver brønn legger du til Halo-konstruksjonsplasmid (Halo-GFP-TRF1 eller Halo-TRF1) og eDHFR-konstruksjonsplasmid (mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDHFR-SIM mutant) ved et 1:1 masseforhold (0,5 μg Halo konstruksjon plasmid med 0,5 μg eDHFR konstruksjon plasmid) til 150 μL redusert serummedier, dråpevis, blandes ved pipettering.
MERK: Kodene er relativt små (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) og ingen effekt på faseseparasjon ble observert. Bruk av mutanter som SIM-mutant som brukes her for å sikre at faseatferden er følsom for mutasjonene, anbefales imidlertid ikke taggene. SIM-kortet er fra PIASx28,30. SIM-sekvensen er AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCAGGCTAAACGT. SIM mutant genereres ved å mutere SIM aminosyrer VIDL til VADA28, og sekvensen er AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Vi deponerte våre plasmider til addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mCherry-eDHFR-SIM mutant. - Tilsett 150 μL transfeksjonsreagens -redusert serummedieblanding til 150 μL redusert serummedie med DNA, dropwise, bland ved pipettering, inkuber i 5 minutter.
- Tilsett 300 μL transfeksjonsreagens-DNA-blanding i celler, dropwise og plasser deretter celler tilbake til inkubator.
- Vent 24-48 timer før levende avbildning, immunfluorescens (IF) eller fluorescens in situ hybridisering (FISH).
2. Dimerisering på telomerer
- Løs opp dimerizere i dimetylsulfid ved 10 mM og oppbevar dem i mikrosenterrør i plast ved −80 °C for langtidslagring.
MERK: I stedet for å bruke dimmerizeren med TMP direkte koblet til Halo (TMP-Halo, TH), dimmerizer TMP-NVOC-Halo (TNH) som har en lysfølsom linker, 6-nitroveratryloksykarbonyl (NVOC), mellom TMP og Haloligand brukes31. Dette er fordi det tar mindre tid for TNH (~ 5 minutter) å spre seg inn i cellen enn TH (~ 20 minutter). Resultatene vist her kan også oppnås ved hjelp av TH. Når du bruker TNH, må du passe på å ikke utsette dimmerizeren for lys for å unngå NOVC-spalting. Håndter TNH i et mørkt rom med en svak rødlyslampe, oppbevar dimmerizeren i gule plastrør og pakk beholderen som inneholder TNH eller behandlede celler med aluminiumsfolie. Imaging TNH med DIC er trygt. - Ta en aliquot på 10 mM dimmerizer fra −80 °C og fortynn i bildemediet til en lagerkonsentrasjon på 10 μM og oppbevar ved −20 °C.
- Når du er klar til bruk, fortynn dimmerizere fra 10 μM lagerløsning til en endelig arbeidskonsentrasjon på 100 nM i vekstmedium (for fast bildebehandling) eller bildebehandlingsmedium. Behandle celler med 100 nM dimmerisatorer (sluttkonsentrasjon) på scenen for levende avbildning eller inkubering i 4-5 timer for immunfluorescens (IF) og fluorescens in situ hybridisering (FISH).
MERK: Konsentrasjonen av dimmerizere som brukes påvirker dimeriseringseffektiviteten og dermed faseseparasjonen. Dimerizerkonsentrasjonen som tillater maksimal dimeriseringseffektivitet avhenger av celletype og ankerproteinkonsentrasjon, så det må bestemmes for forskjellige eksperimenter. En enkel måte er å inkubere celler som uttrykker ankerproteinet og mCherry-eDHFR (uten å fusjonere til fasen som skiller protein eller smeltes til et ikke-faset separerende mutant) og identifisere dimerizerkonsentrasjonen der den høyeste mCherry-intensiteten ved ankeret oppnås. En mer systematisk tilnærming er å inkubere celler som uttrykker ankeret bare med forskjellige konsentrasjoner av dimerizere og deretter med et Halo-bindende fargestoff for å bidra til å bestemme dimerizerkonsentrasjonen der Halo-bindingsfargeintensiteten begynner å platå (dvs. alle Halo-smeltede ankre er okkupert av dimmerizeren og ikke mer igjen for Halo-bindingsfargen)32. - For å reversere dimerisering, inkubere celler med dimmerizere i 2-5 timer (med eller uten levende bildebehandling) eller til ønsket dråpestørrelse oppnås og tilsett 100 μM fri TMP (sluttkonsentrasjon) fortynnet i bildebehandlingsmedium til celler.
3. Immunfluorescence (IF)
- Frø 105 celler på 12 mm diameter sirkulære dekselglass belagt med poly-D-lysin i 6-brønns plate. Deretter transfekterer de to plasmidene (Halo-GFP-TRF1 med mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDHFR-SIM mutant) og venter i 24-48 timer før du fortsetter til immunfluorescence.
MERK: Vent mer enn én dag etter at transfeksjonen kan oppnå høyere uttrykk. - Fortynn dimerizere med vekstmedium for å nå en endelig konsentrasjon på 100 nM, tilsett fortynnede dimerizere til celler og inkuber ved 37 °C i 4-5 timer.
MERK: Faseseparasjon induseres raskt etter tilsetning av dimmerizere (< 30 minutter). Lengre inkubasjon hjelper dråper grovere i større størrelser. Etter dråpevekst med levende bildebehandling kan brukes til å bestemme tiden det tar for dråper å nå en ønsket tilstand. - Fest celler i PBS-oppløsning som inneholder 4% formaldehyd og 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved romtemperatur for å permeabilisere celler. Vask celler 3 ganger med PBS.
MERK: Etter dette trinnet kan det settes på pause og celler kan lagres ved 4 °C i opptil en uke.
Forsiktig: Formaldehyd er skadelig ved innånding, og hvis det svelges, irriterer det også øyne, åndedrettssystem og hud og er en mulig kreftfare. Trenger å bruke personlig verneutstyr, bruk bare i en kjemisk avtrekkshette. Legg den også i en avfallsbeholder etter bruk, ikke kast den i vasken. - Vask deksler to ganger med 50 μL TBS-Tx og en gang med 50 μL antistofffortynningsbuffer (AbDil). TBS-Tx ble laget av TBS, 0,1% Triton X-100 og 0,05% Na-azide. AbDil ble laget av TBS-Tx, 2% BSA og 0,05% Na-azide.
- Inkuber hver dekslelip med 50 μL primær anti-PML (1:50 fortynning i AbDil) / anti-SUMO1 (1:200 fortynning i AbDil) / anti-SUMO2/3 antistoff (1:200 fortynning i AbDil) ved 4 °C i et fuktet kammer over natten. mCherry antistoff kan også brukes (1:200 fortynning i AbDil) for å bidra til å oppdage mCherry signal for FISK.
MERK: FISK slukker mCherry fluorescerende signal, noe som gjør det vanskelig å skille celler transfektert med mCherry plasmider fra de som ikke er transfektert i FISH eksperimenter. Bruk av mCherry antistoff anbefales. Alternativt kan man lage en stabil cellelinje som uttrykker eDHFR som inneholder protein. - Vask deksler 3 ganger med AbDil for å fjerne ubundet primært antistoff.
- Inkuber celler med sekundært antistoff [antimus IgG (H +L) sekundært antistoff konjugert med Alexa Fluor 647 for PML og SUMO, anti-kanin IgG (H +L) sekundært antistoff konjugert med Alexa Fluor 555 for mCherry, begge ved 1:1000 fortynning i AbDil] i 1 time i mørk boks ved romtemperatur.
- Vask deksler 3 ganger med TBS-Tx.
- Merk lysbilder, fortynn DAPI i monteringsmedier for å nå DAPI-sluttkonsentrasjonen på 1 μg/ml. Sett deretter 2 μL fortynnet DAPI på lysbildet. Snu dekslene og plasser dem på DAPI-slipp, aspirer ekstra væske fra kanten av dekslene.
- Tetning med neglelakk, la den tørke og skyll fra toppen av dekslene med vann. Spar i fryseren for avbildning.
4. Fluorescens in situ hybridisering (FISH)
- Frø 105 celler på 12 mm diameter sirkulære dekselglass belagt med poly-D-lysin i 6-brønns plate. Transfektceller med Halo-TRF1 og mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDHFR-SIM mutantplasmider og vent i 24-48 timer før du fortsetter til FISH. Dimeriseringstrinnet er det samme som beskrevet i 3.2.
MERK: Her er TRF1 ikke smeltet sammen med GFP, så den grønne kanalen frigjøres for telomer DNA-sonde. - Fest celler med 4% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur og vask 4 ganger med PBS. For IF-FISH, fortsett til IF-protokollen herfra og etter å ha vasket av sekundært antistoff i IF (3,8), refiks celler med 4% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur og vask tre ganger med PBS.
- Dehydrere dekslerlips i en etanol serie (70%, 80%, 90%, 2 minutter hver).
- Inkubere deksler med 488-telC PNA-sonde (1:2000-forhold) i 5 μL hybridiseringsløsning ved 75 °C i 5 minutter. Hybridiseringsløsningen inneholder 70% deionisert formamid, 10 mM Tris (pH 7,4), 0,5% blokkerende reagens. Deretter inkuberes over natten i et fuktet kammer ved romtemperatur.
- Vask deksler med vaskebuffer (70% formamid, 10 mM Tris) 2 minutter i 3 ganger ved romtemperatur og monter med 1 μg/ml DAPI i monteringsmedier for avbildning.
MERK: FISH-protokollen er en publisert protokoll33'34.
5. Levende bildebehandling
- Når cellene er klare for avbildning, monteres deksler i magnetiske kamre med celler opprettholdt i 1 ml bildebehandlingsmedium uten fenolrød på et oppvarmet stadium i et miljøkammer.
- Sett opp mikroskop og miljøkontrollapparat. Bilder ble anskaffet med et spinnende diskkonfokalt mikroskop med et 100x 1.4 NA-mål, en Piezo Z-Drive, et elektron multipliserende ladekoblet enhet (EMCCD) kamera, og en laserfusjonsmodul utstyrt med 455, 488, 561, 594 og 647 nm lasere kontrollert av bildebehandlingsprogramvare. Utgangseffektene for alle lasere er 20 mW målt ved fiberenden.
- Finn celler med sterkt GFP-signal på telomerer og diffust lokalisert mCherry-signal i nukleoplasma. Finn rundt 20 celler, husk hver posisjon med x, y, z informasjon og sett opp parametere for tidsforløpavbildning med 0,5 μm avstand for totalt 8 μm i Z og 5-minutters tidsintervall i 2-4 timer for både GFP- og mCherry-kanaler. Bruk 30 % av 594 nm og 50 % av effektintensiteten på 488 nm, med eksponeringstider på 200 ms og kameraforsterkning på 300.
MERK: Utgangseffekten til laserenheter er 20 mW. Lyse GFP-foci indikerer større ankerstørrelse som lettere kan kjernekondensere. Finn celler med et bredt spekter av mCherry-signal fordi faseseparasjon avhenger av SIM-konsentrasjonen i cellen. Celler med for svakt eller for sterkt mCherry-signal kan ikke fases atskilt. For å unngå fotobleking må du ikke bruke for mye laserkraft eller for lang eksponeringstid. - Start avbildningen og ta engangsløkke som forhåndsdempning. Pause bildebehandling, tilsett 0,5 ml bildebehandlingsmedier som inneholder 15 μL 10 μM dimmerizer til bildekammeret på scenen, slik at den endelige dimmerizerkonsentrasjonen er 100 nM. Fortsett avbildningen.
- Når du er klar til å reversere dimerisering, pause bildebehandling, legge til 0,5 ml bildebehandlingsmedier som inneholder 2 μL 100 mM lager TMP til bildekammeret på scenen for å få 100 μM TMP endelig konsentrasjon. Fortsett å bildeceller i 1-2 timer.
6. Fast bildebehandling
- Samme mikroskop satt opp som levende bildebehandling, sceneoppvarming er ikke nødvendig. Bruk 488 nm til å bilde telomere FISH, 561 nm for mCherry IF, og 647 nm for PML eller SUMO IF.
MERK: Hvis du ikke bruker et mCherry antistoff, bare direkte bilde mCherry protein, men signal kanskje dim på grunn av slukking i FISH. Bruk fortsatt 561 nm i stedet for 594 nm laser til bilde mCherry for å unngå signalblødning av Cy5 til mCherry. - Finn rundt 30-50 celler med rødt signal (mCherry eller mCherry IF) for å velge for transfekterte celler.
- Bilder ble tatt med 0,3 μm avstand for totalt 8 μm i Z for å samle flere signaler. Bruk 80 % av 647 nm, 80 % av 561 nm og 70 % av 488 nm effektintensitet, med eksponeringstider på 600 ms og kameraforsterkning på 300.
7. Behandle tidsforløpbilder
- Definere binær for telomerer
Velg én celle med all tids- og z-stakkinformasjon, velg bare GFP-kanalen og opprett et binært lag ved å definere terskelverdi. Juster de nedre og øvre verdiene i terskelen og bruk funksjoner som "Glatt", "Rengjør" og "Fyll hull" for å se hvor godt terskelen plukker opp de ønskede objektene gjennom alle tidspunkter. - Trekk fra bakgrunn
Velg alle kanaler, tegn rektangelet Region of Interest (ROI) på bakgrunnen (bortsett fra cellen). Definer denne avkastningen som bakgrunn, og trekk deretter fra bakgrunnsintensiteten. - Koble telomer binær til telomerintensitet
Velg telomer binær og koble den til GFP-kanal for beregning av GFP-intensitet i binære objekter som telomerintensitet. - Beregn telomernummer og -intensitet over tid
Angi hvilken informasjon som skal eksporteres, for eksempel klokkeslett, objekt-ID, gjennomsnittsintensitet, sumintensitet og eksportdata. Bruk figurtegningsprogramvare til å lese den eksporterte tabellen og generere tall for telomernummer og telomerintensitet (oppsummer intensitet over volumet i hver telomer og deretter gjennomsnitt over alle telomerer i en celle) over tid.
8. Behandle bilder med faste celler
- Definere binær for APBer
Velg transfiserte celler for analyse ved å se etter signal i 561nm kanal. Etter prosedyren i 7.1 definerer du terskelen i henholdsvis GFP-kanalen (telomere DNA FISH) og Cy5-kanalen (PML eller SUMO IF) for å generere binær for telomerer og PML-organer eller SUMO. Slå sammen GFP- og Cy5-binære lag og opprett et nytt lag som inneholder partikler som begge har GFP- og Cy5-signal for å representere samlokalisering av PML-kroppen på telomerer, og dermed APB-er. - Beregn APB/SUMO-tall og -intensitet
Trekk fra bildebakgrunnen etter 7.2. Koble APB/SUMO binært lag til Cy5-kanal etter 7.3. Beregn APB/SUMO-tall og -intensitet. Eksporter og tegn inn data etter 7.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative bilder av telomerisk lokalisering av SUMO identifisert av telomer DNA FISH og SUMO protein IF er vist i figur 2. Celler med SIM-rekruttering beriket SUMO1 og SUMO 2/3 på telomerer sammenlignet med celler med SIM-mutantrekruttering. Dette indikerer at SIM-dimeriseringsindusert SUMO-berikelse på telomerer avhenger av SUMO-SIM-interaksjoner.
En representativ intervallfilm av TRF1 og SIM etter dimerisering vises i Video 1. Øyeblikksbilder på fire tidspunkt vises i Figur 3A. SIM ble vellykket rekruttert til telomerer, og både SIM- og TRF1-foci ble større og lysere, som spådd for væskedråpedannelse og vekst (Figur 1B). I tillegg ble det observert fusjon av TRF1 foci (Figur 3B), som førte til telomerklynge som vist i det reduserte telomertallet (figur 3E) og økt telomerintensitet over tid (Figur 3D). Derimot ble SIM-mutant rekruttert til telomerer etter dimerisering, men induserte ingen dråpedannelse eller telomerklynge, da telomerintensiteten ikke vokste og telomertallet ikke ble redusert (Figur 3C, D, E, Video 2). Dette indikerer at faseseparasjon og dermed telomerklynger er drevet av SUMO-SIM-interaksjoner.
Tilbakeføringen av faseseparasjon og telomerklynge etter at overflødig fri TMP er lagt til, vises i Video 3. Øyeblikksbilder på fire tidspunkt vises i Figur 4A. Enig med den forventede kondensatoppløsningen og avklyngingen av telomerer, økte telomertallet og telomerintensiteten gikk ned over tid (Figur 4B, C).
Representative bilder av APBer identifisert av telomer DNA FISH og PML protein IF er vist i figur 5. Celler med SIM rekruttert har flere AGB-er enn celler med SIM-mutant rekruttert, noe som tyder på at dimeriseringsinduserte kondensater faktisk er APBer.
Tallene her viser representative bilder. For statistisk analyse med flere celler, se Zhang et. al., 202011.
Figur 1: Kjemisk dimmerisering for å indusere kromatinrelaterte kondensater. (A) Dimeriseringsskjematisk: Dimerizeren består av to koblede ligander, TMP og Halo som samhandler med henholdsvis eDHFR og Haloenzyme. Faseseparasjonsproteinet smeltes sammen til mCherry og eDHFR, og kromosomankerproteinet smeltes sammen til Halo og GFP. (B) Før du tilsetter dimerizer (øverst til venstre kjerne), lokaliseres flertallet av kromosomankerproteiner (grønne firkanter) til kromosomene, og en liten mengde ankerproteiner lokaliseres diffust i nukleoplasmaet. Faseseparerende proteiner som skal rekrutteres (lilla stjerner) og faseseparasjonspartnere (proteiner som vil kondensere med faseseparerende protein, røde trekanter) er diffust lokalisert i nukleoplasma. Etter å ha tilsatt dimerizers (øverst til høyre kjerne), blir faseseparerende proteiner dimerisert til ankerproteinet på kromosomene og i nukleoplasma. Det kan være noen overflødige faseseparere proteiner i nukleoplasma, avhengig av den relative konsentrasjonen av ankerproteinet, faseseparering av protein og dimmerizeren som brukes. Etter dimerisering (nederst til høyre kjerne), økte lokal konsentrasjon av fasen separere proteiner på ankeret fører til fase separasjon og dannelse av kromatin-assosierte kondensater. Faseseparasjonspartnere berikes ved ankeret på grunn av kokondensasjon med eDHFR-smeltet faseseparasjonsprotein. Ankerproteiner som ikke er direkte bundet til kromatinet, kan berikes ved ankeret på grunn av dimerisering til faseseparasjonsproteinet. Etter å ha tilsagt overflødig fri TMP for å konkurrere med dimmerizeren for eDHFR-binding (nederst til venstre kjerne), frigjøres faseseparasjonsproteinet fra kromatinet og kondensatet oppløses. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: SUMO er beriket etter å ha rekruttert SIM til telomerer med dimerizere. (A) Dimeriseringsskjematisk i dette eksperimentet: SIM (eller SIM-mutant) er smeltet sammen til mCherry og eDHFR, og TRF1 er smeltet sammen til Halo og GFP. (B) En representativ celle for telomer DNA FISH og SUMO1 IF etter rekruttering av SIM. Bunn er binært lag som identifiserer telomerer, SUMO1 og antall colokaliserte SUMO1- og telomer-DNA-foci. Skalastenger: 5 μm. (C) En representativ celle for telomer DNA FISH og SUMO1 IF etter rekruttering av SIM-mutant. Nederst er det binære laget av bildene som brukes til å identifisere antall colokaliserte SUMO1 og telomere DNA-fokus. Skalastenger: 5 μm. (D) En representativ celle for telomer DNA FISH og SUMO2/3 IF etter rekruttering av SIM. Nederst er det binære laget som identifiserer telomerer, SUMO2/3, og antall colokaliserte SUMO2/3 og telomer DNA-fokus. Skalastenger: 5 μm. (E) En representativ celle for telomer DNA FISH og SUMO2/3 IF etter rekruttering av SIM-mutant. Nederst er det binære laget av bildene som brukes til å identifisere antall colokaliserte SUMO2/3 og telomere DNA-fokus. Skalastenger: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dimeriseringsindusert faseseparasjon driver telomergruppering. (A) Øyeblikksbilder av TRF1-GFP og SIM-mCherry før og etter tilsetning av 100 nM dimmerizer (endelig konsentrasjon). Nederst er telomer binært lag identifisert fra TRF1-GFP. Skalastenger: 5 μm. (B) En fusjonshendelse etter å ha rekruttert SIM til telomerer. Skalastenger: 2 μm. Tidsintervall: 5 min. (C) Øyeblikksbilder av TRF1-GFP og SIM mutant-mCherry før og etter tilsetning 100 nM dimmerizer (endelig konsentrasjon). Nederst er telomer binært lag identifisert fra TRF1-GFP. Skalastolper: 5 μm. (D) Gjennomsnittlig telomerintensitet (summer intensitet over volumet i hver telomer og deretter gjennomsnitt over alle telomerer i en celle) over tid etter rekruttering av SIM-kort (grønn, for celle i figur 3A) og SIM-mutant (blå, for celle i figur 3C). (E) Telomertall over tid etter rekruttering av SIM-kort (grønn, for celle i figur 3A) og SIM-mutant (blå, for celle i figur 3C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Reversering av kondens og telomerklynger. (A) Øyeblikksbilder av TRF1-GFP og SIM-mCherry etter å ha lagt 100 μM TMP (endelig konsentrasjon) til celler med kondensater dannet i 3 timer. Nederst er telomer binært lag identifisert fra TRF1-GFP. Skalastolper: 5 μm. (B) Gjennomsnittlig telomerintensitet (oppsummer intensitet over volumet i hver telomer og deretter gjennomsnitt over alle telomerer i en celle) over tid for celle i figur 4A. (C) Telomertall over tid for cellen i figur 4A. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Dimeriseringsinduserte kondensater er APBer. (A) En representativ celle for telomer DNA FISH og PML IF etter rekruttering av SIM. Nederst er det binære laget som identifiserer telomerer, PML-kropper og antall colokaliserte PML- og telomer-DNA-fokus, det vil si antall APBer. Skalastenger: 5 μm. (B) En representativ celle for telomer DNA FISH og PML IF etter rekruttering av SIM-mutant. Nederst er det binære laget av bildene som brukes til å identifisere antall colokaliserte PML- og telomer-DNA-fokus, det vil si antall APBer. Skalastenger: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Rekruttere SIM-kort med dimmere til telomerer driver faseseparasjon og telomerklynge. Live bildebehandling av SIM-mCherry, TRF1-GFP, og slå sammen kanaler før og etter tilsetning av 100 nM dimmerizer (endelig konsentrasjon). Skalastenger: 5 μm. Tidsintervall: 5 min. Tid som vist. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Rekruttering av SIM-mutant kan ikke drive faseseparasjon og telomerklynge. Live bilde av SIM mutant-mCherry, TRF1-GFP og slå sammen kanaler før og etter å ha lagt til 100 nM dimmerizer (endelig konsentrasjon). Skalastenger: 5 μm. Tidsintervall: 5 min. Tid som vist. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: Reversering av kondens og telomerklynger. Live bildebehandling av SIM-mCherry, TRF1-GFP og slå sammen kanaler etter å ha lagt 100 μM TMP (endelig konsentrasjon) til celler med kondensater dannet i 3 timer. Skalastenger: 5 μm. Tidsintervall: 5 min. Tid som vist. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen demonstrerte dannelse og oppløsning av kondensater på telomerer med et kjemisk dimeriseringssystem. Kinetikk av faseseparasjon og dråpefusjonsindusert telomerklynge overvåkes med levende avbildning. Lokalisering og sammensetning av kondensat bestemmes med DNA FISH og protein IF.
Det er to kritiske trinn i denne protokollen. Den første er å bestemme protein- og dimerizerkonsentrasjon. Suksessen med å indusere lokal faseseparasjon ved et genomisk locus er avhengig av økningen i lokal konsentrasjon av faseseparasjonsproteinet over den kritiske konsentrasjonen for faseseparasjon (Figur 1B). Den globale konsentrasjonen av faseseparerende protein må være høy nok til at det er nok proteiner til å konsentreres lokalt. Konsentrasjonen av faseseparasjonsproteinet kan ikke være for høy, slik at global faseseparasjon har oppstått eller lett kan induseres. Anker-DNA-lengden (eller størrelsen på det modifiserte kromatinet som ankerproteinet binder seg til) og konsentrasjonen av Halo-smeltet ankerprotein bestemmer størrelsen på kjernesenteret ved maksimal dimeriseringseffektivitet. Jo større ankerstørrelsen er, jo lett er det å kjernekondensere. Dimeriseringseffektiviteten påvirkes av mengden dimerizere i forhold til mengden ankerproteiner. For få dimerizers kan ikke okkupere alle tilgjengelige ankerproteiner, mens for mange dimmerizere resulterer i ikke-produktiv binding av eDHFR til overflødige dimmere i stedet for til de på ankerproteinet. Dimerizerkonsentrasjon, sammen med anker-DNA-lengden og konsentrasjonen av Halo-smeltet ankerprotein, kan brukes til å bestemme den kritiske konsentrasjonen som kreves for nukleerende lokal faseseparasjon. En systematisk tilnærming for å variere disse parametrene (anker-DNA-lengde, ankerproteinkonsentrasjon, faseseparasjonsproteinkonsentrasjon og dimerizerkonsentrasjon) kan brukes til å kartlegge et flerdimensjonalt fasediagram. Men hvis interessen ikke er i kartleggingsfasediagram, men danner kromatin assosierte kondensater som demonstrert her, er det veldig enkelt å bare plukke celler med lyse Halo-GFP-signal (større ankerstørrelse) og celler med et bredt spekter av lysstyrke for mCherry-eDHFR (ulike faseseparerende proteinkonsentrasjon) for å bilde med dimmerizerkonsentrasjonen for maksimal dimmesetting bestemt i protokoll 2.3. Det andre kritiske trinnet er å unngå fotobleaching i live bildebehandling. Forskjellig fra global faseseparasjon der dråper (lyse mCherry foci merking av fase separasjon protein) vil dukke opp etter fase separasjon, lokal kondens på genomiske steder kan ikke lett oppdages ved å bedømme tilstedeværelsen av mCherry foci. Dette skyldes at rekruttering av proteinet alene, uten faseseparasjon, til genomisk loci vil resultere i dannelse av mCherry lokale foci. Faseseparasjon skjer etter rekruttering, så mCherry foci fortsetter å bli større og lysere etter første rekruttering. Faseseparasjonsindusert berikelse kan også forekomme i GFP-kanal (ankerproteinet), på grunn av dimerisering av ankerproteinet til faseseparasjonsproteinet. Derfor bør endring av fysiske egenskaper (størrelse og intensitet) av foci over tid i stedet for tilstedeværelsen av foci brukes til å bedømme faseseparasjon. Selv om det kan være vanskelig å skille mellom dimerisering eller faseseparasjonsindusert berikelse av mCherry (prey protein) foci, oppstår berikelse av GFP (ankerprotein) foci bare hvis det er faseseparasjon (Figur 3D). Derfor kan berikelsen av ankerprotein brukes til enkelt å bedømme faseseparasjon. Fotobleaching som følge av høy lasereffekt eller lang eksponeringstid under avbildning gjør det vanskeligere å bedømme faseseparasjon fra levende bildebehandling og bør derfor unngås så mye som mulig ved å justere bildeforholdene. Vær oppmerksom på at økningen i foci-intensitet og størrelse over tid er egenskaper ved LLPS, men kan ikke brukes som eneste bevis for LLPS. I saken som presenteres her, ble dråpefusjon brukt som bevis for dannelse av flytende dråper, som kanskje ikke forekommer for mindre antall ankre eller færre mobile ankre. Uten dråpefusjon kan andre metoder som diffusjon av kondensatkomponenter og følsomhet for små molekylperturbasjon brukes til å bekrefte kondensatdannelse ytterligere.8,9,11.
Selv om dette kjemiske dimeriseringssystemet gjengir tidsoppløsning som kreves for å overvåke faseseparasjon i levende celler, mangler det romlig oppløsning på cellulært og subcellulært nivå. Takket være den modulære utformingen av dimmerizerne er det mulig å lage lysfølsomme dimmerizere ved å feste et fotoseanse til TMP, noe som gjør linkeren lysfølsom eller begge12,32,35. Ved ganske enkelt å bytte dimmerizere innenfor samme konstruerte cellebakgrunn for forskjellige applikasjoner, kan høy romlig og tidsmessig kontroll av dimeriseringen, reversering av dimerisering eller begge deler med lys oppnås. Vi ser for oss med de lysfølsomme dimmerizerne, det vil kunne kontrollere faseseparasjon med høy romlig og tidsmessig presisjon. Sammenlignet med de tilgjengelige optogenetiske verktøyene for å kontrollere faseseparasjon gjennom lysfølsomme proteiner36,37, er en ulempe ved det kjemiske dimeriseringssystemet at det bare kan reversere faseseparasjon en gang. Dette systemet kan imidlertid opprettholde vedvarende rekruttering og dermed faseseparasjon uten lys, noe som gjør det mer egnet for langsiktige live bildebehandlingsapplikasjoner som å følge dråpevekst eller cellulære konsekvenser av faseseparasjon. I tillegg gjør evnen til å behandle en populasjon av celler uten lys det praktisk for biokjemiske analyser som de som trengs for å bestemme kondensatsammensetning eller endringer i genomorganisasjon.
Denne metoden kan enkelt tilpasses for å indusere kondensater andre steder på genomet. Man kan ganske enkelt identifisere et protein som binder seg til den genomiske plasseringen av interesse og smelter det til Halo for å bruke det som anker (Figur 1B). Alternativt kan man kombinere dette med CRISPR og smelte sammen dCas9 til Halo og bruke guide RNAer til å forankre Halo til den genomiske loci av interesse38. I tillegg kan man forankre Halo til en ektopisk DNA-matrise (f.eks. LacO) integrert i genomet ved å fusjonere Halo til målproteinet (f.eks. Man kan deretter bruke en nedenfra-og-opp-tilnærming for å vurdere et proteins evne til å fase separat lokalt på kromatin, hvordan faseseparasjonsevnen påvirkes av proteinavkortinger, mutasjoner eller postoversettelsesendringer, eller hvordan kondensatet påvirker lokale funksjoner som kromatinmodifisering, replikering eller transkripsjon. For å oppsummere kan dette kjemiske dimeriseringssystemet brukes til å indusere et bredt spekter av kondensater på ulike kromatinsteder og er spesielt egnet for å undersøke hvordan materialegenskapene og kjemisk sammensetning av kromatinrelaterte kondensater bidrar til kromatinfunksjoner ved å kombinere langsiktig levende avbildning med biokjemiske analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av US National Institutes of Health (1K22CA23763201 til H.Z., GM118510 til D.M.C.) og Charles E. Kaufman foundation til H.Z. Forfatterne vil takke Jason Tones for korrekturlesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
References
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A.
- Strom, A. R., et al.
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
- McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
- Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
- Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
- Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
- Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
- Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
- Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
- Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
- Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
- Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
- Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
- Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).
- Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
- Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
- Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
- Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
- Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
- Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
- Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
- Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
- Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
- Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
- Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
- Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
- Zhang, H., et al.
- Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
- Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
- Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
- Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).
