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Biology

Condensados de proteínas inducidas por dimerización química en telómeros

Published: April 12, 2021 doi: 10.3791/62173
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

Summary

Este protocolo ilustra un sistema de dimerización de proteínas inducido químicamente para crear condensados en la cromatina.  Se demuestra la formación del cuerpo nuclear de la leucemia promielocítica (LMP) en telómeros con dimerizadores químicos. El crecimiento, la disolución, la localización y la composición de las gotas se controlan con imágenes de células vivas, inmunofluorescencia (IF) e hibridación fluorescente in situ (FISH).

Abstract

Los condensados asociados a la cromatina están implicados en muchos procesos nucleares, pero los mecanismos subyacentes siguen siendo difíciles de alcanzar. Este protocolo describe un sistema de dimerización de proteínas inducido químicamente para crear condensados en los telómeros. El dimerizador químico consiste en dos ligandos unidos que pueden unirse a una proteína: Halo ligando a Halo-enzima y trimetoprima (TMP) a E. coli dihidrofolato reductasa (eDHFR), respectivamente. La fusión de la enzima Halo a una proteína telómero ancla los dimerizantes a los telómeros a través de la unión covalente ligando-enzima de Halo. La unión de TMP a eDHFR recluta proteínas de separación de fase fusionadas con eDHFR a telómeros e induce la formación de condensado. Debido a que la interacción TMP-eDHFR no es covalente, la condensación se puede revertir mediante el uso de exceso de TMP libre para competir con el dimerizador para la unión de eDHFR. Se muestra un ejemplo de inducción de la formación de cuerpos nucleares de leucemia promielocítica (LMP) en los telómeros y determinación del crecimiento, disolución, localización y composición del condensado. Este método se puede adaptar fácilmente para inducir condensados en otras ubicaciones genómicas fusionando Halo a una proteína que se une directamente a la cromatina local o a dCas9 que está dirigida al locus genómico con un ARN guía. Al ofrecer la resolución temporal requerida para la obtención de imágenes en vivo de una sola célula mientras se mantiene la separación de fases en una población de células para ensayos bioquímicos, este método es adecuado para sondear tanto la formación como la función de los condensados asociados a la cromatina.

Introduction

Muchas proteínas y ácidos nucleicos se someten a separación de fase líquido-líquido (LLPS) y se autoensamblan en condensados biomoleculares para organizar la bioquímica en las células1,2. LLPS de proteínas de unión a cromatina conduce a la formación de condensados que están asociados con loci genómicos específicos y están implicados en varias funciones locales de cromatina3. Por ejemplo, LLPS de la proteína HP1 subyace a la formación de dominios de heterocromatina para organizar el genoma4,5,LLPS de factores de transcripción forma centros de transcripción para regular la transcripción6,LLPS de mRNAs nacientes y peines multi-sexo la proteína genera cuerpos de locus histonas para regular la transcripción y procesamiento de mRNAs de histonas7.  Sin embargo, a pesar de que se han descubierto muchos ejemplos de condensados asociados a la cromatina, los mecanismos subyacentes de formación, regulación y función del condensado siguen siendo poco conocidos. En particular, no todos los condensados asociados a la cromatina se forman a través de LLPS y aún se necesitan evaluaciones cuidadosas de la formación de condensado en células vivas8,9. Por ejemplo, se ha demostrado que la proteína HP1 en ratones tiene solo una capacidad débil para formar gotas líquidas en células vivas y los focos de heterocromatina se comportan como glóbulos de polímero colapsado10. Por lo tanto, las herramientas para inducir condensados de novo en la cromatina en las células vivas son deseables, particularmente aquellas que permiten el uso de imágenes en vivo y ensayos bioquímicos para monitorear la cinética de la formación de condensados, las propiedades físicas y químicas de los condensados resultantes y las consecuencias celulares de la formación de condensados.

Este protocolo reporta un sistema de dimerización química para inducir condensados de proteínas en la cromatina11 (Figura 1A). El dimerizador consiste en dos ligandos vinculados que interactúan con proteínas: trimetoprima (TMP) y ligando Halo y puede dimerizar proteínas fusionadas a los receptores cognados: Escherichia coli dihidrofolato reductasa (eDHFR) y una enzima alquilldehalogenasa bacteriana (enzima Halo), respectivamente12. La interacción entre el ligando Halo y la enzima Halo es covalente, lo que permite que la enzima Halo se use como ancla fusionándola con una proteína de unión a la cromatina para reclutar una proteína de separación de fase fusionada con eDHFR a cromatina. Después del reclutamiento inicial, el aumento de la concentración local de la proteína que separa la fase pasa la concentración crítica necesaria para la separación de fases y, por lo tanto, nuclea un condensado en el anclaje (Figura 1B). Al fusionar proteínas fluorescentes (por ejemplo, mCherry y eGFP) a eDHFR y Halo, la nucleación y el crecimiento de condensados se pueden visualizar en tiempo real con microscopía de fluorescencia. Debido a que la interacción entre eDHFR y TMP no es covalente, se puede agregar un exceso de TMP libre para competir con el dimerizador por la unión de eDHFR. Esto liberará la proteína de separación de fase del anclaje y disolverá el condensado asociado a la cromatina.

Utilizamos esta herramienta para inducir la formación de cuerpo nuclear de leucemia promielocítica (LMP) de novo en telómeros en células cancerosas negativas para telomerasa que utilizan una vía alternativa de alargamiento de telómeros (ALT) para el mantenimiento de los telómeros13,14.  Los cuerpos nucleares PML son compartimentos sin membrana involucrados en muchos procesos nucleares15,16 y se localizan de manera única en los telómeros ALT para formar AB, para los cuerpos PML asociados a los telómeros ALT17,18. Los telómeros se agrupan dentro de los AB, presumiblemente para proporcionar plantillas de reparación para la síntesis de ADN de telómeros dirigidos por homología en ALT19. De hecho, se ha detectado la síntesis de ADN de telómeros en AB y los AB juegan un papel esencial en el enriquecimiento de los factores de reparación del ADN en los telómeros20,21. Sin embargo, se desconocieron los mecanismos subyacentes al ensamblaje de APB y la agrupación de telómeros dentro de los AB. Dado que las proteínas de los telómeros en las células ALT se modifican de forma única mediante un pequeño modificador similar a la ubiquitina (SUMO)22,muchos componentes de APB contienen sitios de sumoilación 22,23, 24,25 y / o motivos que interactúan con SUMO (SIM)26,27 y las interacciones SUMO-SIM impulsan la separación de fases28, planteamos la hipótesis de que la sumoilación en los telómeros conduce al enriquecimiento de proteínas que contienen SUMO / SIM y Las interacciones SUMO-SIM entre esas proteínas conducen a la separación de fases.  La proteína PML, que tiene tres sitios de sumoilación y un sitio SIM, se puede reclutar a telómeros sumoilados para formar AB y la coalescencia de AB líquidos conduce a la agrupación de telómeros. Para probar esta hipótesis, utilizamos el sistema de dimerización química para imitar la formación de APB inducida por la sumoilación mediante el reclutamiento de SIM a telómeros (Figura 2A)11. GFP se fusiona con Haloenzyme para visualización y con la proteína de unión a telómeros TRF1 para anclar el dimerizador a los telómeros. SIM se fusiona con eDHFR y mCherry. La cinética de la formación de condensados y la agrupación de telómeros inducida por la fusión de gotas se siguen con imágenes de células vivas.  La separación de fases se invierte añadiendo un exceso de TMP libre para competir con la unión eDHFR. La inmunofluorescencia (IF) y la hibridación fluorescente in situ (FISH) se utilizan para determinar la composición del condensado y la asociación telomérica. Recruiting SIM enriquece suMO en telómeros y los condensados inducidos contienen PML y por lo tanto son APBs. El reclutamiento de un mutante SIM que no puede interactuar con SUMO no enriquece SUMO en telómeros ni induce la separación de fases, lo que indica que la fuerza impulsora fundamental para la condensación de APB es la interacción SUMO-SIM. De acuerdo con esta observación, los polímeros poliSUMO-polySIM que se fusionan a un factor de unión TRF2 RAP1 también pueden inducir la formación de APB29. En comparación con el sistema de fusión polySUMO-polySIM donde la separación de fases ocurre siempre que se produzcan suficientes proteínas, el enfoque de dimerización química presentado aquí induce la separación de fases bajo demanda y, por lo tanto, ofrece una mejor resolución temporal para monitorear la cinética de la separación de fases y el proceso de agrupamiento de telómeros. Además, este sistema de dimerización química permite el reclutamiento de otras proteínas para evaluar su capacidad para inducir la separación de fases y la agrupación de telómeros. Por ejemplo, una proteína desordenada reclutada a los telómeros también puede formar gotas y telómeros de racimo sin inducir la formación de APB, lo que sugiere que la agrupación de telómeros es independiente de la química de APB y solo se basa en la propiedad líquida de APB11.

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Protocol

1. Producción de líneas celulares transitorias

  1. Cultite células aceptoras U2OS en fundas de vidrio de 22 x 22 mm (para imágenes vivas) o cubiertas circulares de 12 mm de diámetro (para IF o FISH) recubiertas con poli-D-lisina en placa de 6 pozos con medio de crecimiento (10% de suero bovino fetal y solución de penicilina-estreptomicina al 1% en DMEM) hasta que alcancen una confluencia del 60-70%.
  2. Reemplace el medio de crecimiento con 1 ml de medio de transfección (medio de crecimiento sin solución de penicilina-estreptomicina) antes de la transfección.
  3. Para cada pozo de transfección, agregue 4 μL de reactivo de transfección a 150 μL de medios séricos reducidos, vórtice durante 10 segundos y luego incube durante 5 minutos.
  4. Para cada pomo, agregue el plásmido de construcción halo (Halo-GFP-TRF1 o Halo-TRF1) y el plásmido de construcción eDHFR (mCherry-eDHFR-SIM o mutante mCherry-eDHFR-SIM) a una relación de masa de 1:1 (plásmido de construcción Halo 0.5 μg con plásmido de construcción eDHFR 0.5 μg) a medios séricos reducidos 150 μL, en forma gota, mezclados por pipeteo.
    NOTA: Las etiquetas son relativamente pequeñas (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) y no se observó ningún efecto sobre la separación de fases. Sin embargo, se recomienda el uso de mutantes como el mutante SIM utilizado aquí para asegurarse de que el comportamiento de fase sea sensible a las mutaciones, no a las etiquetas. SIM es de PIASx28,30. La secuencia SIM es AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. El mutante SIM se genera mutando los aminoácidos SIM VIDL a VADA28,y la secuencia es AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Depositamos nuestros plásmidos a addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mutante mCherry-eDHFR-SIM.
  5. Agregue 150 μL de mezcla de medios séricos reducidos con reactivo de transfección a medios séricos reducidos de 150 μL con ADN, en sentido de gota, mezcle mediante pipeteo, incube durante 5 minutos.
  6. Agregue los 300 μL de mezcla de reactivo de transfección y ADN a las células, gota a gota y luego coloque las células de nuevo en la incubadora.
  7. Espere de 24 a 48 horas antes de la obtención de imágenes en vivo, la inmunofluorescencia (IF) o la hibridación fluorescente in situ (FISH).

2. Dimerización en telómeros

  1. Disolver los dimerizadores en sulfuro de dimetilo a 10 mM y almacenar en tubos de microcentrífuga de plástico a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: En lugar de utilizar el dimerizador con TMP directamente vinculado a Halo (TMP-Halo, TH), se utiliza el dimerizador TMP-NVOC-Halo (TNH) que tiene un enlazador fotosensible, 6-nitroveratrilo oxicarbonilo (NVOC), entre TMP y Haloligand31. Esto se debe a que el TNH (~5 minutos) tarda menos tiempo en difundirse en la célula que el TH (~20 minutos). Los resultados que se muestran aquí también se pueden obtener utilizando TH. Cuando use TNH, tenga cuidado de no exponer el dimerizador a la luz para evitar la escisión de NOVC. Manipule TNH en una habitación oscura con una lámpara de luz roja tenue, guarde el dimerizador en tubos de plástico ámbar y envuelva el recipiente que contiene TNH o células tratadas con papel de aluminio. La obtención de imágenes de TNH con DIC es segura.
  2. Tomar una alícuota de dimerizador de 10 mM desde -80 °C y diluir en medio de imagen hasta una concentración de stock de 10 μM y almacenar a -20 °C.
  3. Cuando esté listo para usar, diluya los diluyeres de una solución de stock de 10 μM a una concentración de trabajo final de 100 nM en medio de crecimiento (para imágenes fijas) o medio de imagen. Tratar las células con dimerizadores de 100 nM (concentración final) en el escenario para imágenes en vivo o incubar durante 4-5 horas para inmunofluorescencia (IF) e hibridación fluorescente in situ (FISH).
    NOTA: La concentración de dimerizadores utilizados afecta la eficiencia de la dimerización y, por lo tanto, la separación de fases. La concentración del dimerizador que permite la máxima eficiencia de dimerización depende del tipo de célula y la concentración de proteína de anclaje, por lo que deberá determinarse para diferentes experimentos. Una forma sencilla es incubar células que expresan la proteína de anclaje y mCherry-eDHFR (sin fusionarse a la proteína separador de fase o fusionada a un mutante separador no fase) e identificar la concentración de dimerizador a la que se alcanza la mayor intensidad de mCherry en el anclaje. Un enfoque más sistemático es incubar células que expresan el anclaje solo con diferentes concentraciones de dimerizadores y luego con un tinte de unión a Halo para ayudar a determinar la concentración del dimerizador a la que la intensidad del tinte de unión a Halo comienza a estabilizarse (es decir, todos los anclajes fusionados con Halo están ocupados por el dimerizador y no quedan más para el tinte de unión Halo)32.
  4. Para revertir la dimerización, incube las células con dimerizadores durante 2-5 horas (con o sin imágenes vivas) o hasta que se logre el tamaño de gota deseado y agregue 100 μM de TMP libre (concentración final) diluido en medio de imágenes a las células.

3. Inmunofluorescencia (IF)

  1. Semilla 105 celdas en vidrios de cubierta circular de 12 mm de diámetro recubiertos con poli-D-lisina en placa de 6 pozos. Luego transfecta los dos plásmidos (Halo-GFP-TRF1 con mCherry-eDHFR-SIM o mutante mCherry-eDHFR-SIM) y espere 24-48 horas antes de proceder a la inmunofluorescencia.
    NOTA: Esperar más de un día después de la transfección puede obtener una mayor expresión.
  2. Diluir los diluyers con medio de crecimiento para alcanzar una concentración final de 100 nM, añadir dimerizers diluidos a las células e incubar a 37 °C durante 4-5 horas.
    NOTA: La separación de fases se induce rápidamente después de agregar dimerizadores (< 30 minutos). Una incubación más larga ayuda a que las gotas se ensaquen en tamaños más grandes. Después del crecimiento de las gotas con imágenes en vivo se puede utilizar para determinar el tiempo que tardan las gotas en alcanzar el estado deseado.
  3. Fije las células en una solución de PBS que contenga 4% de formaldehído y 0,1% de Tritón X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar las células. Lave las células 3 veces con PBS.
    NOTA: Después de este paso, se puede pausar y las celdas se pueden almacenar a 4 ° C durante un hasta una semana.
    Precaución: El formaldehído es dañino por inhalación y si se ingiere, también irrita los ojos, el sistema respiratorio y la piel y es un posible peligro de cáncer. Necesidad de usar equipo de protección personal, use solo en una campana de humos químicos. También colóqueles en un contenedor de residuos después de su uso, no lo deseche en el fregadero.
  4. Lave las fundas dos veces con 50 μL TBS-Tx y una vez con 50 μL Antibody Dilution Buffer (AbDil). TBS-Tx fue fabricado por TBS, 0.1% Triton X-100 y 0.05% Na-azide. AbDil fue fabricado por TBS-Tx, 2% BSA y 0.05% Na-azide.
  5. Incubar cada funda con 50 μL primario anti-PML (dilución 1:50 en AbDil) / anti-SUMO1 (dilución 1:200 en AbDil) / anticuerpo anti-SUMO2/3 (dilución 1:200 en AbDil) a 4 °C en una cámara humidificada durante la noche. El anticuerpo mCherry también se puede usar (dilución 1:200 en AbDil) para ayudar a detectar la señal mCherry para FISH.
    NOTA: FISH apaga la señal fluorescente mCherry, lo que dificulta la diferenciación de las células transfectadas con plásmidos mCherry de las no transfectadas en los experimentos FISH. Se recomienda el uso de anticuerpos mCherry. Alternativamente, se puede hacer una línea celular estable que exprese eDHFR que contenga proteínas.
  6. Lave las fundas 3 veces con AbDil para eliminar el anticuerpo primario no unido.
  7. Incubar células con anticuerpo secundario [anticuerpo secundario anti-ratón IgG (H+L) conjugado con Alexa Fluor 647 para PML y SUMO, anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) conjugado con Alexa Fluor 555 para mCherry, ambos con dilución 1:1000 en AbDil] durante 1 hora en caja oscura a temperatura ambiente.
  8. Lave los cubrecubres 3 veces con TBS-Tx.
  9. Portaobjetos de etiquetas, diluya DAPI en medios de montaje para alcanzar la concentración final de DAPI de 1 μg/mL. Luego coloque 2 μL DAPI diluido en la diapositiva. Voltee los cubrecufolios y colóquelos en la gota DAPI, aspire líquido adicional desde el borde del cubrecos.
  10. Sellar con esmalte de uñas, dejar secar y enjuagar desde la parte superior de la funda con agua. Guardar en el congelador para la obtención de imágenes.

4. Hibridación fluorescente in situ (FISH)

  1. Semilla 105 celdas en vidrios de cubierta circular de 12 mm de diámetro recubiertos con poli-D-lisina en placa de 6 pozos. Transfectar células con plásmidos mutantes Halo-TRF1 y mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDHFR-SIM y esperar 24-48 h antes de proceder a FISH. El paso de dimerización es el mismo que se describe en 3.2.
    NOTA: Aquí TRF1 no está fusionado con GFP, por lo que el canal verde se libera para la sonda de ADN de los telómeros.
  2. Fije las células con formaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente y lave 4 veces con PBS. Para IF-FISH, proceda al protocolo IF desde aquí y después de lavar el anticuerpo secundario en IF (3.8), vuelva a fijar las células con formaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente y lave tres veces con PBS.
  3. Deshidrate los cubrecundos en una serie de etanol (70%, 80%, 90%, 2 minutos cada uno).
  4. Incubar la cubiertas con sonda PNA de 488 telC (relación 1:2000) en solución de hibridación de 5 μL a 75 °C durante 5 minutos. La solución de hibridación contiene 70% de formamida desionizada, 10 mM Tris (pH 7.4), 0.5% de reactivo de bloqueo. Luego incubar durante la noche en una cámara humidificada a temperatura ambiente.
  5. Lave las fundas con tampón de lavado (70% formamida, 10 mM Tris) 2 minutos durante 3 veces a temperatura ambiente y monte con 1 μg/mL DAPI en medios de montaje para imágenes.
    NOTA: El protocolo FISH es un protocolo publicado33'34.

5. Imágenes en vivo

  1. Cuando las células estén listas para la obtención de imágenes, monte cubiertas en cámaras magnéticas con células mantenidas en un medio de imágenes de 1 ml sin rojo fenol en una etapa calentada en una cámara ambiental.
  2. Instalar microscopio y aparato de control ambiental. Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal de disco giratorio con un objetivo de 100x 1.4 NA, un Piezo Z-Drive, una cámara de dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones (EMCCD) y un módulo de fusión láser equipado con láseres de 455, 488, 561, 594 y 647 nm controlados por software de imágenes. Las potencias de salida para todos los láseres son de 20 mW medidos en el extremo de la fibra.
  3. Localice las células con señal GFP brillante en los telómeros y señal mCherry difusivamente localizada en el nucleoplasma. Encuentre alrededor de 20 celdas, memorice cada posición con información x, y, z y configure parámetros para imágenes de lapso de tiempo con espaciado de 0,5 μm para un total de 8 μm en Z e intervalo de tiempo de 5 minutos durante 2-4 horas para los canales GFP y mCherry. Utilice el 30% de la intensidad de potencia de 594 nm y el 50% de 488 nm, con tiempos de exposición de 200 ms y ganancia de cámara de 300.
    NOTA: La potencia de salida de las unidades láser es de 20 mW. Los focos brillantes de GFP indican un tamaño de anclaje más grande que puede nuclear los condensados más fácilmente. Encuentre células con un amplio rango de señal mCherry porque la separación de fases depende de la concentración de SIM en la célula. Es posible que las células con una señal mCherry demasiado tenue o demasiado brillante no se separen en fase. Para evitar el fotobleaching, no use demasiada potencia láser ni un tiempo de exposición demasiado largo.
  4. Comience a tomar imágenes y tome un bucle de una sola vez como predmerización. Pausar las imágenes, agregar medios de imagen de 0,5 ml que contengan 15 μL de dimerizador de 10 μM a la cámara de imágenes en el escenario para que la concentración final del dimerizador sea de 100 nM. Reanudar la obtención de imágenes.
  5. Cuando esté listo para la dimerización inversa, detenga las imágenes, agregue medios de imagen de 0,5 ml que contengan 2 μL de TMP de stock de 100 mM a la cámara de imágenes en el escenario para obtener una concentración final de TMP de 100 μM. Continúe con las imágenes de las células durante 1-2 horas.

6. Imágenes fijas

  1. Mismo microscopio configurado como imágenes en vivo, no se necesita calentamiento de etapa. Utilice 488 nm para obtener imágenes de los telómeros FISH, 561 nm para mCherry IF y 647 nm para PML o SUMO IF.
    NOTA: Si no usa un anticuerpo mCherry, simplemente imagine directamente la proteína mCherry, pero la señal puede atenuarse debido al enfriamiento en FISH.  Siga utilizando el láser de 561 nm en lugar de 594 nm para obtener imágenes de mCherry para evitar el sangrado de la señal de Cy5 a mCherry.
  2. Localice alrededor de 30-50 células con señal roja (mCherry o mCherry IF) para seleccionar las células transfectadas.
  3. Las imágenes se tomaron con un espaciado de 0,3 μm para un total de 8 μm en Z para recoger más señales. Utilice el 80% de la intensidad de potencia de 647 nm, el 80% de 561 nm y el 70% de 488 nm, con tiempos de exposición de 600 ms y ganancia de cámara de 300.

7. Procesar imágenes de lapso de tiempo

  1. Definir binario para telómeros
    Elija una celda con toda la información de tiempo y z-stack, elija solo el canal GFP y cree una capa binaria definiendo el umbral. Ajuste los valores inferior y superior del umbral y utilice funciones como "Suavizar", "Limpiar" y "Rellenar agujeros" para ver qué tan bien el umbral recoge los objetos deseados a través de todos los puntos de tiempo.
  2. Restar fondo
    Elija todos los canales, dibuje el rectángulo Región de interés (ROI) en el fondo (aparte de la celda). Defina este ROI como fondo y luego reste la intensidad del fondo.
  3. Vincular binario de telómeros a intensidad de telómeros
    Elija binario de telómeros y conéctelo al canal GFP para calcular la intensidad de GFP en los objetos binarios como intensidad de telómeros.
  4. Calcular el número de telómeros y la intensidad a lo largo del tiempo
    Especifique la información que se va a exportar, como la hora, el ID del objeto, la intensidad media, la intensidad de la suma y los datos de exportación. Utilice el software de trazado de figuras para leer la tabla exportada y generar cifras de número de telómeros e intensidad de telómeros (resuma la intensidad sobre el volumen en cada telómero y luego promedie todos los telómeros en una celda) a lo largo del tiempo.

8. Procesar imágenes de celda fija

  1. Definir binario para ABs
    Elija células transfectadas para el análisis buscando señal en el canal de 561 nm. Siguiendo el procedimiento de 7.1, definir umbral tanto en el canal GFP (TELOMERE DNA FISH) como en el Cy5 (PML o SUMO IF) para generar binarios para telómeros y cuerpos PML o SUMO, respectivamente. Fusione las capas binarias GFP y Cy5 y cree una nueva capa que contenga partículas que tengan señal GFP y Cy5 para representar la colocalización del cuerpo de PML en los telómeros, por lo tanto, APU.
  2. Calcular el número y la intensidad de APB/SUMO
    Reste el fondo de la imagen después de 7.2. Vincule la capa binaria APB/SUMO al canal Cy5 después de 7.3. Calcule el número y la intensidad de APB/SUMO. Exportar y trazar datos siguiendo 7.4.

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Representative Results

En la Figura 2se muestran imágenes representativas de localización telomérica de SUMO identificadas por ADN telómero FISH y PROTEÍNA SUMO IF. Las células con reclutamiento de SIM enriquecieron SUMO1 y SUMO 2/3 en telómeros en comparación con las células con reclutamiento de mutantes SIM. Esto indica que el enriquecimiento de SUMO inducido por la dimerización de SIM en telómeros depende de las interacciones SUMO-SIM.

Una película representativa de lapso de tiempo de TRF1 y SIM después de la dimerización se muestra en el Video 1. Las instantáneas en cuatro puntos de tiempo se muestran en la Figura 3A. SIM se reclutó con éxito para telómeros y los focos SIM y TRF1 se hicieron más grandes y brillantes, como se predijo para la formación y el crecimiento de gotas líquidas(Figura 1B). Además, se observó fusión de focos de TRF1(Figura 3B),lo que condujo a la agrupación de telómeros como se muestra en el número reducido de telómeros(Figura 3E)y aumentó la intensidad de los telómeros a lo largo del tiempo(Figura 3D). En contraste, el mutante SIM fue reclutado a telómeros después de la dimerización, pero no indujo ninguna formación de gotas o agrupamiento de telómeros, ya que la intensidad de los telómeros no creció y el número de telómeros no se redujo(Figura 3C,D, E, Video 2). Esto indica que la separación de fases y, por lo tanto, la agrupación de telómeros está impulsada por las interacciones SUMO-SIM.

La inversión de la separación de fases y la agrupación de telómeros después de agregar un exceso de TMP libre se muestra en el Video 3. Las instantáneas en cuatro puntos de tiempo se muestran en la Figura 4A. De acuerdo con la disolución de condensado predicha y el desagrublamiento de telómeros, el número de telómeros aumentó y la intensidad de los telómeros disminuyó con el tiempo(Figura 4B,C).

En la Figura 5se muestran imágenes representativas de apBs identificados por los telómeros DNA FISH y la proteína PML IF. Las células con SIM reclutadas tienen más AB que las células con mutante SIM reclutado, lo que sugiere que los condensados inducidos por la dimerización son de hecho AB.

Las cifras aquí muestran imágenes representativas. Para el análisis estadístico con más células, consulte Zhang et. al., 202011.

Figure 1
Figura 1: Dimerización química para inducir condensados asociados a la cromatina. (A) Esquema de dimerización: El dimerizador consiste en dos ligandos unidos, TMP y Halo que interactúan con eDHFR y Haloenzyme, respectivamente. La proteína de separación de fase se fusiona con mCherry y eDHFR, y la proteína de anclaje cromosómico se fusiona con Halo y GFP. (B) Antes de agregar dimerizador (núcleo superior izquierdo), la mayoría de las proteínas de anclaje cromosómico (cuadrados verdes) se localizan en los cromosomas y una pequeña cantidad de proteínas de anclaje se localizan difusamente en el nucleoplasma. Las proteínas de separación de fase a reclutar (estrellas púrpuras) y las parejas de separación de fase (proteínas que se condensarán con la proteína de separación de fase, triángulos rojos) se localizan difusamente en el nucleoplasma. Después de agregar dimerizadores (núcleo superior derecho), las proteínas de separación de fase se dimerizan a la proteína de anclaje en los cromosomas y en el nucleoplasma. Podría haber algún exceso de proteínas de separación de fase en el nucleoplasma, dependiendo de la concentración relativa de la proteína de anclaje, la proteína de separación de fase y el dimerizador utilizado. Después de la dimerización (núcleo inferior derecho), el aumento de la concentración local de las proteínas de separación de fase en el anclaje conduce a la separación de fases y la formación de condensados asociados a la cromatina. Los socios de separación de fase se enriquecen en el ancla debido a la cocondensación con la proteína de separación de fase fusionada con eDHFR. Las proteínas de anclaje que no están directamente unidas a la cromatina pueden enriquecerse en el ancla debido a la dimerización a la proteína de separación de fase. Después de agregar el exceso de TMP libre para competir con el dimerizador para la unión a eDHFR (núcleo inferior izquierdo), la proteína de separación de fase se libera de la cromatina y el condensado se disuelve. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: SUMO se enriquece después de reclutar SIM a telómeros con dimerizadores. (A) Esquema de dimerización en este experimento: SIM (o mutante SIM) se fusiona con mCherry y eDHFR, y TRF1 se fusiona con Halo y GFP. (B) Una célula representativa para el ADN de los telómeros FISH y SUMO1 IF después de reclutar SIM. En la parte inferior se encuentra la capa binaria que identifica los telómeros, SUMO1 y el número de focos de SUMO1 y ADN de telómeros colocalizados. Barras de escala: 5 μm. (C) Una célula representativa para el ADN de los telómeros FISH y SUMO1 IF después de reclutar mutante SIM. En la parte inferior se encuentra la capa binaria de las imágenes utilizadas para identificar el número de focos de SUMO1 y ADN de telómeros colocalizados. Barras de escala: 5 μm. (D) Una célula representativa para el ADN de los telómeros FISH y SUMO2/3 IF después de reclutar SIM. En la parte inferior se encuentra la capa binaria que identifica los telómeros, SUMO2/3, y el número de focos de SUMO2/3 y ADN de telómeros colocalizados. Barras de escala: 5 μm. (E) Una célula representativa para el ADN de los telómeros FISH y SUMO2/3 IF después de reclutar mutante SIM. En la parte inferior se encuentra la capa binaria de las imágenes utilizadas para identificar el número de focos de ADN de los telómeros y SUMO2/3 colocalizados. Barras de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La separación de fase inducida por dimerización impulsa la agrupación de telómeros. (A) Instantáneas de TRF1-GFP y SIM-mCherry antes y después de agregar un dimerizador de 100 nM (concentración final). En la parte inferior se encuentra la capa binaria de telómeros identificada a partir de TRF1-GFP. Barras de escala: 5 μm. (B) Un evento de fusión después de reclutar SIM a telómeros. Barras de escala: 2 μm. Intervalo de tiempo: 5 min. (C) Instantáneas de TRF1-GFP y SIM mutant-mCherry antes y después de agregar dimerizador de 100 nM (concentración final). En la parte inferior se encuentra la capa binaria de telómeros identificada a partir de TRF1-GFP. Barras de escala: 5 μm. (D) Intensidad media de los telómeros (resumir la intensidad sobre el volumen en cada telómero y luego promediar sobre todos los telómeros en una célula) a lo largo del tiempo después de reclutar SIM (verde, para la célula en la Figura 3A)y SIM mutante (azul, para la célula en la Figura 3C). (E) Número de telómeros a lo largo del tiempo después de reclutar SIM (verde, para la célula en la Figura 3A)y SIM mutante (azul, para la célula en la Figura 3C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Inversión de la condensación y agrupamiento de telómeros. (A) Instantáneas de TRF1-GFP y SIM-mCherry después de agregar 100 μM TMP (concentración final) a células con condensados formados durante 3 h. En la parte inferior se encuentra la capa binaria de telómeros identificada a partir de TRF1-GFP. Barras de escala: 5 μm. (B) Intensidad media de los telómeros (resumir la intensidad sobre el volumen en cada telómero y luego promediar sobre todos los telómeros en una célula) a lo largo del tiempo para la célula en la Figura 4A. (C) Número de telómeros a lo largo del tiempo para la célula en la Figura 4A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Los condensados inducidos por la dimerización son AB. (A) Una célula representativa para el ADN de los telómeros FISH y PML IF después de reclutar SIM. En la parte inferior se encuentra la capa binaria que identifica los telómeros, los cuerpos de PML y el número de focos de PML y ADN de telómeros colocalizados, es decir, el número de APU. Barras de escala: 5 μm. (B) Una célula representativa para el ADN de los telómeros FISH y PML IF después de reclutar mutante SIM. En la parte inferior se encuentra la capa binaria de las imágenes utilizadas para identificar el número de focos de PML y ADN de telómeros colocalizados, es decir, el número de APU. Barras de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: El reclutamiento de SIM con dimerizadores para telómeros impulsa la separación de fases y la agrupación de telómeros. Imágenes en vivo de SIM-mCherry, TRF1-GFP y canales de fusión antes y después de agregar un dimerizador de 100 nM (concentración final). Barras de escala: 5 μm. Intervalo de tiempo: 5 min. Tiempo como se muestra. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: El reclutamiento de mutantes SIM no puede impulsar la separación de fases y la agrupación de telómeros. Imágenes en vivo de SIM mutant-mCherry, TRF1-GFP y canales de fusión antes y después de agregar dimerizador de 100 nM (concentración final). Barras de escala: 5 μm. Intervalo de tiempo: 5 min. Tiempo como se muestra. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 3: Inversión de la condensación y agrupamiento de telómeros. Imágenes en vivo de sim-mCherry, TRF1-GFP y canales de fusión después de agregar 100 μM TMP (concentración final) a células con condensados formados durante 3 h. Barras de escala: 5 μm. Intervalo de tiempo: 5 min. Tiempo como se muestra. Haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

Este protocolo demostró la formación y disolución de condensados en telómeros con un sistema de dimerización química. La cinética de la separación de fases y la agrupación de telómeros inducida por la fusión de gotas se monitorean con imágenes en vivo. La localización y composición del condensado se determinan con ADN FISH y proteína IF.

Hay dos pasos críticos en este protocolo. El primero es determinar la concentración de proteínas y dimerizantes. El éxito en la inducción de la separación de fase local en un locus genómico se basa en el aumento de la concentración local de la proteína de separación de fase por encima de la concentración crítica para la separación de fases (Figura 1B). La concentración global de la proteína de separación de fase debe ser lo suficientemente alta como para que haya suficientes proteínas para concentrarse localmente. La concentración de la proteína de separación de fases no puede ser demasiado alta, por lo que la separación de fase global se ha producido o puede ser inducida fácilmente.  La longitud del ADN de anclaje (o el tamaño de la cromatina modificada a la que se une la proteína de anclaje) y la concentración de la proteína de anclaje fusionada con Halo determinan el tamaño del centro de nucleación con la máxima eficiencia de dimerización. Cuanto mayor sea el tamaño del anclaje, más fácil será nuclear los condensados. La eficiencia de dimerización se ve afectada por la cantidad de dimerizadores en relación con la cantidad de proteínas de anclaje. Muy pocos dimerizadores no pueden ocupar todas las proteínas de anclaje disponibles, mientras que demasiados dimerizadores dan como resultado la unión no productiva de eDHFR a los dimerizadores en exceso en lugar de a los de la proteína de anclaje. La concentración del dimerizador, junto con la longitud del ADN de anclaje y la concentración de la proteína de anclaje fusionada con Halo, se puede utilizar para determinar la concentración crítica requerida para la separación de la fase local de nucleación. Se puede utilizar un enfoque sistemático para variar esos parámetros (longitud de ADN de anclaje, concentración de proteína de anclaje, concentración de proteína de separación de fase y concentración de dimerizador) para mapear un diagrama de fases multidimensional. Sin embargo, si el interés no está en mapear el diagrama de fases sino en formar condensados asociados a la cromatina como se demuestra aquí, es muy fácil simplemente elegir células con señal Halo-GFP brillante (mayor tamaño de anclaje) y celdas con un amplio rango de brillo para mCherry-eDHFR (concentración de proteínas de separación de varias fases) para obtener imágenes con la concentración del dimerizador para la máxima dimerización determinada en el Protocolo 2.3. El segundo paso crítico es evitar el fotobleaching en imágenes en vivo. A diferencia de la separación de fase global donde las gotas (focos mCherry brillantes que etiquetan la proteína de separación de fase) emergerán después de la separación de fase, la condensación local en ubicaciones genómicas no se puede detectar fácilmente juzgando la presencia de focos mCherry. Esto se debe a que el reclutamiento de la proteína sola, sin separación de fases, a loci genómicos dará lugar a la formación de focos locales de mCherry. La separación de fases ocurre después del reclutamiento, por lo que los focos de mCherry continúan creciendo y brillando después del reclutamiento inicial. El enriquecimiento inducido por separación de fases también puede ocurrir en el canal GFP (la proteína de anclaje), debido a la dimerización de la proteína de anclaje a la proteína de separación de fase. Por lo tanto, el cambio de las propiedades físicas (tamaño e intensidad) de los focos a lo largo del tiempo en lugar de la presencia de focos debe utilizarse para juzgar la separación de fases. Si bien puede ser difícil diferenciar la dimerización o el enriquecimiento inducido por la separación de fases de los focos mCherry (proteína de presa), el enriquecimiento de los focos GFP (proteína de anclaje) solo ocurre si hay separación de fases (Figura 3D). Por lo tanto, el enriquecimiento de la proteína de anclaje se puede utilizar para juzgar fácilmente la separación de fases. El fotobleaching resultante de la alta potencia del láser o el largo tiempo de exposición durante la obtención de imágenes hace que sea más difícil juzgar la separación de fase de las imágenes en vivo y, por lo tanto, debe evitarse tanto como sea posible ajustando las condiciones de imagen. Tenga en cuenta que los aumentos en la intensidad y el tamaño de los focos a lo largo del tiempo son características de LLPS, pero no se pueden usar como la única evidencia para LLPS. En el caso aquí presentado, se utilizó la fusión de gotas como evidencia de la formación de gotas líquidas, lo que puede no ocurrir para un menor número de anclajes o menos anclajes móviles. Sin fusión de gotas, se pueden utilizar otros métodos como la difusión de componentes de condensado y la sensibilidad a la perturbación de moléculas pequeñas para confirmar aún más la formación de condensado.8,9,11.

Aunque este sistema de dimerización química representa la resolución temporal requerida para monitorear la separación de fases en células vivas, carece de resolución espacial a nivel celular y subcelular. Gracias al diseño modular de los dimerizadores, es posible hacer dimerizadores sensibles a la luz adjuntando una fototeca a TMP, haciendo que el enlazador sea fotosensible o ambos12,32,35. Simplemente cambiando los dimerizadores dentro del mismo fondo de células diseñadas para diferentes aplicaciones, se puede lograr un alto control espacial y temporal de la dimerización, la inversión de la dimerización o ambos con luz. Imaginamos que con esos dimerizadores sensibles a la luz, podrá controlar la separación de fases con alta precisión espacial y temporal. En comparación con las herramientas optogenéticas disponibles para controlar la separación de fases a través de proteínas sensibles a la luz36,37, una desventaja del sistema de dimerización química es que solo puede revertir la separación de fase una vez. Sin embargo, este sistema puede mantener el reclutamiento sostenido y, por lo tanto, la separación de fases sin luz, lo que lo hace más adecuado para aplicaciones de imágenes en vivo a largo plazo, como para seguir el crecimiento de gotas o las consecuencias celulares de la separación de fases. Además, la capacidad de tratar una población de células sin luz lo hace conveniente para ensayos bioquímicos como los necesarios para determinar la composición del condensado o los cambios en la organización del genoma.

Este método se puede adaptar fácilmente para inducir condensados en otros lugares del genoma. Simplemente se puede identificar una proteína que se une a la ubicación genómica de interés y fusionarla con Halo para usarla como ancla(Figura 1B). Alternativamente, se puede combinar esto con CRISPR y fusionar dCas9 a Halo y usar ARN guía para anclar Halo a los loci genómicos de interés38. Además, se puede anclar Halo a una matriz de ADN ectópico (por ejemplo, LacO) integrada en el genoma fusionando Halo con la proteína objetivo (por ejemplo, LacI). Luego se puede usar un enfoque de abajo hacia arriba para evaluar la capacidad de una proteína para separar localmente la fase en la cromatina, cómo su capacidad de separación de fase se ve afectada por truncamientos de proteínas, mutaciones o modificaciones post-traslacionales, o cómo el condensado afecta las funciones locales como la modificación de la cromatina, la replicación o la transcripción. En resumen, este sistema de dimerización química se puede utilizar para inducir una amplia gama de condensados en varias ubicaciones de cromatina y es particularmente adecuado para investigar cómo las propiedades del material y la composición química de los condensados asociados a la cromatina contribuyen a las funciones de la cromatina mediante la combinación de imágenes en vivo a largo plazo con ensayos bioquímicos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (1K22CA23763201 a H.Z., GM118510 a D.M.C.) y la fundación Charles E. Kaufman a H.Z. Los autores desean agradecer a Jason Tones por revisar el manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning MT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Scientific 28906 Prepare 1% in 1x PBS
6 Well Culture Plate VWR 10861-554
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-101
Anti-mCherry antibody Abcam Ab183628
Anti-PML antibody Santa Cruz sc966
Anti-SUMO1 antibody Abcam Ab32058
Anti-SUMO2/3 antibody Cytoskeleton Asm23
Blocking Reagent Roche 11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP9706100
BTX Tube micro 1.5ML  VWR 89511-258
Circle Cover Slips Thermo Scientific 3350
Confocal microscope  Nikon MQS31000
DAPI Fisher Scientific D1306
Dimethyl Sulphoxide  Sigma-Aldrich 472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10017CV
EMCCD Camera iXon Life  897
Ethanol Fisher Scientific 4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Gibco A4766801
Formamide, Deionized MilliporeSigma 46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
Laser merge module  Nikon NIIMHF47180
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 21083027
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668027
Figure plotting software, MATLAB The MathWorks
Microscope Slide Box Fisher Scientific 34487
Nail Polish Fisher Scientific 50-949-071
Imaging software, NIS-Elements  Nikon
Opti-MEM Reduced Serum Media Gibco 51985091
Parafilm Bemis 13-374-12
PBS 10x, pH 7.4 Fisher Scientific 70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100X Gibco 15140122
Piezo Z-Drive  Physik Instrumente (PI) 91985
Pipet Tips VWR 10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides Fisher Scientific 22-037-246
Poly-D-Lysine solution Sigma-Aldrich A-003-E
Sodium Azide Fisher Scientific BP922I-500
Spinning disk Yokogawa CSU-X1
Square Cover Slips Thermo Scientific 3305
TBS 10x solution Fisher Scientific BP2471500
TelC-Alexa488 PNA Bio F1004
TMP Synthesized by Chenoweth lab Available upon request
TNH Synthesized by Chenoweth lab Available upon request
Tris Solution Fisher Scientific 92-901-00ML
Triton X-100 10% Solution MilliporeSigma 64-846-350ML Prepare 0.5% in 1x PBS
U2Os cell line From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories NC9524612

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Zhao, R., Chenoweth, D. M., Zhang, H. Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres. J. Vis. Exp. (170), e62173, doi:10.3791/62173 (2021).

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