Summary
Questo protocollo illustra un sistema di dimerizzazione proteica indotto chimicamente per creare condensati sulla cromatina. Viene dimostrata la formazione del corpo nucleare della leucemia promielocitica (PML) sui telomeri con dimerizzatori chimici. La crescita, la dissoluzione, la localizzazione e la composizione delle goccioline sono monitorate con imaging di cellule vive, immunofluorescenza (IF) e ibridazione fluorescente in situ (FISH).
Abstract
I condensati associati alla cromatina sono implicati in molti processi nucleari, ma i meccanismi sottostanti rimangono sfuggenti. Questo protocollo descrive un sistema di dimerizzazione proteica indotto chimicamente per creare condensati sui telomeri. Il dimerizzatore chimico è costituito da due ligandi collegati che possono legarsi ciascuno a una proteina: il ligando Halo all'enzima Halo e il trimetoprim (TMP) all'E. coli diidrofolato reduttasi (eDHFR), rispettivamente. La fusione dell'enzima Halo in una proteina telomerica ancora i dimerizzatori ai telomeri attraverso il legame covalente legante-enzima Halo. Il legame del TMP all'eDHFR recluta proteine di fase fuse con eDHFR in telomeri e induce la formazione di condensa. Poiché l'interazione TMP-eDHFR non è covalente, la condensazione può essere invertita utilizzando TMP libero in eccesso per competere con il dimerizzatore per il legame eDHFR. Viene mostrato un esempio di induzione della formazione del corpo nucleare della leucemia promielocitica (PML) sui telomeri e determinazione della crescita, della dissoluzione, della localizzazione e della composizione del condensato. Questo metodo può essere facilmente adattato per indurre condensati in altre posizioni genomiche fondendo Halo con una proteina che si lega direttamente alla cromatina locale o a dCas9 che è mirato al locus genomico con un RNA guida. Offrendo la risoluzione temporale richiesta per l'imaging live di singole cellule mantenendo la separazione di fase in una popolazione di cellule per saggi biochimici, questo metodo è adatto per sondare sia la formazione che la funzione dei condensati associati alla cromatina.
Introduction
Molte proteine e acidi nucleici subiscono la separazione di fase liquido-liquido (LLPS) e si auto-assemblano in condensati biomolecolari per organizzare la biochimica nelle cellule1,2. LLPS delle proteine leganti la cromatina porta alla formazione di condensati associati a specifici loci genomici e implicati in varie funzioni locali della cromatina3. Ad esempio, LLPS della proteina HP1 è alla base della formazione di domini eterocromatici per organizzare il genoma4,5, LLPS di fattori di trascrizione forma centri di trascrizione per regolare la trascrizione6, LLPS di mRNA nascenti e la proteina pettini multi-sesso genera corpi locus istoni per regolare la trascrizione e l'elaborazione degli mRNA istoni7. Tuttavia, nonostante siano stati scoperti molti esempi di condensati associati alla cromatina, i meccanismi alla base della formazione, della regolazione e della funzione del condensato rimangono poco compresi. In particolare, non tutti i condensati associati alla cromatina si formano attraverso LLPS e sono ancora necessarie attente valutazioni della formazione di condensa nelle cellule vive8,9. Ad esempio, la proteina HP1 nel topo ha dimostrato di avere solo una debole capacità di formare goccioline liquide nelle cellule vive e i focolai di eterocromatina si comportano come globuli polimerici collassati10. Pertanto, sono auspicabili strumenti per indurre condensati de novo sulla cromatina nelle cellule viventi, in particolare quelli che consentono l'uso di imaging dal vivo e saggi biochimici per monitorare la cinetica della formazione di condensa, le proprietà fisiche e chimiche dei condensati risultanti e le conseguenze cellulari della formazione di condensa.
Questo protocollo riporta un sistema di dimerizzazione chimica per indurre condensati proteici sulla cromatina11 (Figura 1A). Il dimerizzatore è costituito da due ligandi leganti che interagiscono con le proteine: trimetoprim (TMP) e ligando Halo e può dimerizzare proteine fuse ai recettori affini: Escherichia coli diidrofolato reduttasi (eDHFR) e un enzima alchilldehalogenasi batterico (enzima Halo), rispettivamente12. L'interazione tra il ligando Halo e l'enzima Halo è covalente, consentendo all'enzima Halo di essere utilizzato come ancoraggio fondendolo con una proteina legante la cromatina per reclutare una proteina che separa la fase fusa in eDHFR alla cromatina. Dopo il reclutamento iniziale, l'aumento della concentrazione locale della proteina che separa la fase passa la concentrazione critica necessaria per la separazione di fase e quindi nuclea un condensato all'ancora (Figura 1B). Fondendo proteine fluorescenti (ad es. mCherry ed eGFP) in eDHFR e Halo, la nucleazione e la crescita dei condensati possono essere visualizzate in tempo reale con la microscopia a fluorescenza. Poiché l'interazione tra eDHFR e TMP non è covalente, è possibile aggiungere TMP libero in eccesso per competere con il dimerizzatore per il legame eDHFR. Questo rilascerà quindi la proteina di separazione di fase dall'ancora e dissolverà il condensato associato alla cromatina.
Abbiamo usato questo strumento per indurre de novo la formazione di corpi nucleari da leucemia promielocitica (PML) sui telomeri nelle cellule tumorali negative alla telomerasi che utilizzano un allungamento alternativo dei telomeri (ALT) per il mantenimento dei telomeri13,14. I corpi nucleari PML sono compartimenti senza membrana coinvolti in molti processi nucleari15,16 e sono localizzati in modo univoco nei telomeri ALT per formare AFB, per i corpi PML associati ai telomeri ALT17,18. I telomeri si raggruppano all'interno delle AFB, presumibilmente per fornire modelli di riparazione per la sintesi del DNA telomerico diretto all'omologia in ALT19. Infatti, la sintesi del DNA dei telomeri è stata rilevata nelle AFB e le AFB svolgono un ruolo essenziale nell'arricchire i fattori di riparazione del DNA sui telomeri20,21. Tuttavia, i meccanismi alla base dell'assemblaggio APB e del clustering dei telomeri all'interno delle APB erano sconosciuti. Poiché le proteine dei telomeri nelle cellule ALT sono modificate in modo univoco da piccoli modificatori ubiquitina-simili (SUMO)22, molti componenti APB contengono siti di sumoilazione 22,23,24,25 e / o motivi interagendo SUMO (SIM) 26,27e interazioni SUMO-SIM guidano la separazione di fase28, abbiamo ipotizzato che la sumoilazione sui telomeri porti all'arricchimento di proteine contenenti SUMO / SIM e Le interazioni SUMO-SIM tra queste proteine portano alla separazione di fase. La proteina PML, che ha tre siti di sumoilazione e un sito SIM, può essere reclutata in telomeri sumoilati per formare AFB e la coalescenza delle AMB liquide porta al raggruppamento dei telomeri. Per testare questa ipotesi, abbiamo usato il sistema di dimerizzazione chimica per imitare la formazione di APB indotta dalla sumoilazione reclutando SIM nei telomeri (Figura 2A)11. La GFP viene fusa con Haloenzima per la visualizzazione e con la proteina legante i telomeri TRF1 per ancorare il dimerizzatore ai telomeri. SIM è fusa a eDHFR e mCherry. La cinetica della formazione di condensa e il clustering dei telomeri indotti dalla fusione di goccioline sono seguiti dall'imaging di cellule vive. La separazione di fase viene invertita aggiungendo TMP libero in eccesso per competere con il legame eDHFR. L'immunofluorescenza (IF) e l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) vengono utilizzate per determinare la composizione della condensa e l'associazione telomerica. Il reclutamento di SIM arricchisce SUMO sui telomeri e i condensati indotti contengono PML e quindi sono AFB. Il reclutamento di un mutante SIM che non può interagire con SUMO non arricchisce SUMO sui telomeri o induce la separazione di fase, indicando che la forza motrice fondamentale per la condensazione APB è l'interazione SUMO-SIM. Concordando con questa osservazione, i polimeri polySUMO-polySIM che si sono fusi a un fattore di legame TRF2 RAP1 possono anche indurre la formazione di APB29. Rispetto al sistema di fusione polySUMO-polySIM in cui la separazione di fase avviene finché vengono prodotte abbastanza proteine, l'approccio di dimerizzazione chimica qui presentato induce la separazione di fase su richiesta e quindi offre una migliore risoluzione temporale per monitorare la cinetica della separazione di fase e del processo di clustering dei telomeri. Inoltre, questo sistema di dimerizzazione chimica consente il reclutamento di altre proteine per valutare la loro capacità di indurre la separazione di fase e il clustering dei telomeri. Ad esempio, una proteina disordinata reclutata nei telomeri può anche formare goccioline e telomeri a grappolo senza indurre la formazione di APB, suggerendo che il clustering dei telomeri è indipendente dalla chimica APB e si basa solo sulla proprietà liquida APB11.
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Protocol
1. Produzione di linee cellulari transitorie
- Cellule accettori U2OS di coltura su coperchi di vetro 22 x 22 mm (per imaging dal vivo) o coverslip circolari di 12 mm di diametro (per IF o FISH) rivestiti con poli-D-lisina in piastra a 6 pozzetti con mezzo di crescita (10% di siero bovino fetale e 1% di soluzione di penicillina-streptomicina in DMEM) fino a raggiungere il 60-70% di confluenza.
- Sostituire il mezzo di crescita con 1 mL di mezzo di trasfezione (terreno di crescita senza soluzione di penicillina-streptomicina) prima della trasfezione.
- Per ogni pozzo di trasfezione, aggiungere 4 μL di reagente di trasfezione a 150 μL di mezzi sierici ridotti, vortice per 10 secondi e quindi incubare per 5 minuti.
- Per ogni pozzo, aggiungere il plasmide di costruzione Halo (Halo-GFP-TRF1 o Halo-TRF1) e il plasmide di costruzione eDHFR (mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDHFR-SIM mutante) con un rapporto di massa 1:1 (0,5 μg plasmide costrutto Halo con plasmide costrutto eDHFR 0,5 μg) a 150 μL di mezzi sierici ridotti, dropwise, miscela mediante pipettaggio.
NOTA: I tag sono relativamente piccoli (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) e non è stato osservato alcun effetto sulla separazione di fase. Tuttavia, si consiglia di utilizzare mutanti come il mutante SIM utilizzato qui per assicurarsi che il comportamento di fase sia sensibile alle mutazioni non ai tag. SIM è da PIASx28,30. La sequenza SIM è AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Il mutante SIM è generato dalla mutazione degli amminoacidi SIM VIDL in VADA28e la sequenza è AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Abbiamo depositato i nostri plasmidi in addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mutante mCherry-eDHFR-SIM. - Aggiungere 150 μL di miscela di mezzi sierici ridotti al reagente di trasfezione a 150 μL di mezzi sierici ridotti con DNA, goccia, mescolare mediante pipettaggio, incubare per 5 minuti.
- Aggiungere i 300 μL di miscela reagente-DNA di trasfezione alle cellule, a goccia e quindi rimettere le cellule nell'incubatrice.
- Attendere 24-48 ore prima dell'imaging dal vivo, dell'immunofluorescenza (IF) o dell'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH).
2. Dimerizzazione sui telomeri
- Sciogliere i dimerizzatori in solfosossido di dimetile a 10 mM e conservare in tubi di microcentrifuga di plastica a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
NOTA: Invece di utilizzare il dimerizzatore con TMP direttamente collegato ad Halo (TMP-Halo, TH), dimerizzatore TMP-NVOC-Halo (TNH) che ha un linker fotosensibile, 6-nitroveratryl oxycarbonyl (NVOC), tra TMP e Haloligand viene utilizzato31. Questo perché ci vuole meno tempo per TNH (~ 5 minuti) per diffondersi nella cellula rispetto a TH (~ 20 minuti). I risultati mostrati qui possono anche essere ottenuti utilizzando TH. Quando si utilizza TNH, fare attenzione a non esporre il dimerizzatore alla luce per evitare la scissione NOVC. Maneggiare TNH in una stanza buia con una lampada a luci rosse soffuse, conservare il dimerizzatore in tubi di plastica ambrata e avvolgere il contenitore contenente TNH o cellule trattate con un foglio di alluminio. L'imaging TNH con DIC è sicuro. - Prelevare un'aliquota di 10 mM dimerizzatore da -80 °C e diluire nel mezzo di imaging a una concentrazione di stock di 10 μM e conservare a -20 °C.
- Quando sono pronti per l'uso, diluire i dimerizzatori da 10 μM in soluzione stock a una concentrazione finale di lavoro di 100 nM in terreno di crescita (per imaging fisso) o mezzo di imaging. Trattare le cellule con 100 dimerizzatori nM (concentrazione finale) sul palco per l'imaging dal vivo o incubare per 4-5 ore per l'immunofluorescenza (IF) e l'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH).
NOTA: La concentrazione di dimerizzatori utilizzati influisce sull'efficienza di dimerizzazione e quindi sulla separazione di fase. La concentrazione del dimerizzatore che consente la massima efficienza di dimerizzazione dipende dal tipo di cellula e dalla concentrazione di proteine di ancoraggio, quindi dovrà essere determinata per diversi esperimenti. Un modo semplice è quello di incubare le cellule che esprimono la proteina di ancoraggio e mCherry-eDHFR (senza fondersi con la proteina che separa la fase o fuse con un mutante che separa non di fase) e identificare la concentrazione di dimerizzatore alla quale si ottiene la massima intensità di mCherry all'ancora. Un approccio più sistematico consiste nell'incubare le cellule che esprimono l'ancora solo con diverse concentrazioni di dimerizzatori e quindi con un colorante legante Halo per aiutare a determinare la concentrazione del dimerizzatore alla quale l'intensità del colorante legante Halo inizia a stabilizzarsi (cioè, tutte le ancore Fuse halo sono occupate dal dimerizzatore e non più lasciate per il colorante legante Halo)32. - Per invertire la dimerizzazione, incubare le cellule con dimerizzatori per 2-5 ore (con o senza imaging dal vivo) o fino a raggiungere la dimensione desiderata delle goccioline e aggiungere alle cellule 100 μM di TMP libero (concentrazione finale) diluito in mezzo di imaging.
3. Immunofluorescenza (IF)
- Semina 105 celle su vetri di copertura circolare di 12 mm di diametro rivestiti con poli-D-lisina in piastra a 6 pozzetti. Quindi trasfettate i due plasmidi (Halo-GFP-TRF1 con mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDHFR-SIM mutant) e attendere 24-48 ore prima di procedere all'immunofluorescenza.
NOTA: Attendere più di un giorno dopo che la trasfezione può ottenere un'espressione più elevata. - Dimerizzatori diluiti con mezzo di crescita per raggiungere una concentrazione finale di 100 nM, aggiungere dimerizzatori diluiti alle cellule e incubare a 37 °C per 4-5 ore.
NOTA: la separazione di fase viene rapidamente indotta dopo l'aggiunta di dimerizzatori (< 30 minuti). L'incubazione più lunga aiuta le goccioline grossolane in dimensioni più grandi. La successiva crescita delle goccioline con l'imaging dal vivo può essere utilizzata per determinare il tempo necessario affinché le goccioline raggiungano lo stato desiderato. - Fissare le celle in soluzione PBS contenente il 4% di formaldeide e lo 0,1% di Triton X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare le cellule. Lavare le celle 3 volte con PBS.
NOTA: dopo questo passaggio, può essere messo in pausa e le celle possono essere conservate a 4 °C per un massimo di una settimana.
Attenzione: la formaldeide è dannosa per inalazione e, se ingerita, irrita anche gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle ed è un possibile rischio di cancro. È necessario indossare dispositivi di protezione individuale, utilizzare solo in una cappa chimica. Mettilo anche in un contenitore per i rifiuti dopo l'uso, non smaltirlo nel lavandino. - Lavare le coperture due volte con TBS-Tx da 50 μL e una volta con tampone di diluizione anticorpale da 50 μL (AbDil). TBS-Tx è stato prodotto da TBS, 0,1% Triton X-100 e 0,05% Na-azide. AbDil è stato prodotto da TBS-Tx, 2% BSA e 0,05% Na-azide.
- Incubare ogni coverslip con 50 μL primario anti-PML (diluizione 1:50 in AbDil) / anti-SUMO1 (diluizione 1:200 in AbDil) / anticorpo anti-SUMO2/3 (diluizione 1:200 in AbDil) a 4 °C in una camera umidificata durante la notte. L'anticorpo mCherry può anche essere utilizzato (diluizione 1:200 in AbDil) per aiutare a rilevare il segnale mCherry per FISH.
NOTA: FISH spegne il segnale fluorescente mCherry, il che rende difficile differenziare le cellule trasfettate con plasmidi mCherry da quelle non trasfettate negli esperimenti FISH. Si consiglia l'uso di anticorpi mCherry. In alternativa, si può creare una linea cellulare stabile che esprime proteine contenenti eDHFR. - Lavare le coverslip 3 volte con AbDil per rimuovere l'anticorpo primario non legato.
- Incubare cellule con anticorpo secondario [anticorpo secondario anti-topo IgG (H+L) coniugato con Alexa Fluor 647 per PML e SUMO, anticorpo secondario anti-coniglio IgG (H+L) coniugato con Alexa Fluor 555 per mCherry, entrambi a diluizione 1:1000 in AbDil] per 1 ora in dark box a temperatura ambiente.
- Lavare le coverslip 3 volte con TBS-Tx.
- Etichettare i vetrini, diluire IL DAPI nel supporto di montaggio per raggiungere la concentrazione finale daPI di 1 μg/mL. Quindi mettere 2 μL di DAPI diluito sul vetrino. Capovolgi i coverslip e posizionali sulla goccia DAPI, aspira a un fluido extra dal bordo del coverslip.
- Sigillare con lo smalto, lasciarlo asciugare e risciacquare dalla parte superiore del coperchio con acqua. Salva nel congelatore per l'imaging.
4. Ibridazione fluorescente in situ (FISH)
- Semina 105 celle su vetri di copertura circolare di 12 mm di diametro rivestiti con poli-D-lisina in piastra a 6 pozzetti. Trasfettate le cellule con plasmidi mutanti Halo-TRF1 e mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDHFR-SIM e attendere 24-48 ore prima di procedere alla FISH. La fase di dimerizzazione è la stessa descritta al punto 3.2.
NOTA: Qui TRF1 non è fuso con GFP, quindi il canale verde viene liberato per la sonda del DNA telomerico. - Fissare le celle con il 4% di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente e lavare 4 volte con PBS. Per IF-FISH, procedere al protocollo IF da qui e dopo aver lavato via l'anticorpo secondario in IF (3.8), rifissire le cellule con il 4% di formaldeide per 10 minuti a temperatura ambiente e lavare tre volte con PBS.
- Disidratare i coverslip in una serie di etanolo (70%, 80%, 90%, 2 minuti ciascuno).
- Incubare i coverslip con sonda PNA 488-telC (rapporto 1:2000) in soluzione di ibridazione da 5 μL a 75 °C per 5 minuti. La soluzione di ibridazione contiene il 70% di formammide deionizzata, 10 mM Tris (pH 7,4), reagente bloccante dello 0,5%. Quindi incubare durante la notte in una camera umidificata a temperatura ambiente.
- Lavare i coperchi con tampone di lavaggio (70% formammide, 10 mM Tris) 2 minuti per 3 volte a temperatura ambiente e montare con 1 μg/mL DAPI nel supporto di montaggio per l'imaging.
NOTA: Il protocollo FISH è un protocollo pubblicato33'34.
5. Imaging dal vivo
- Quando le cellule sono pronte per l'imaging, montare i coverslip in camere magnetiche con celle mantenute in un mezzo di imaging da 1 mL senza rosso fenolo su uno stadio riscaldato in una camera ambientale.
- Impostare il microscopio e l'apparato di controllo ambientale. Le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale a disco rotante con un obiettivo 100x 1,4 NA, un Piezo Z-Drive, una telecamera EMCCD (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) e un modulo di unione laser dotato di laser 455, 488, 561, 594 e 647 nm controllati da software di imaging. Le potenze di uscita per tutti i laser sono di 20 mW misurate all'estremità della fibra.
- Localizzare le cellule con segnale GFP luminoso sui telomeri e segnale mCherry localizzato diffusivamente nel nucleoplasma. Trova circa 20 celle, memorizza ogni posizione con informazioni x, y, z e imposta i parametri per l'imaging time lapse con spaziatura di 0,5 μm per un totale di 8 μm in Z e intervallo di tempo di 5 minuti per 2-4 ore per entrambi i canali GFP e mCherry. Utilizzare il 30% di 594 nm e il 50% di intensità di potenza di 488 nm, con tempi di esposizione di 200 ms e guadagno della fotocamera 300.
NOTA: la potenza di uscita delle unità laser è di 20 mW. I fuochi GFP luminosi indicano una dimensione di ancoraggio maggiore che può nucleane i condensati più facilmente. Trova le cellule con una vasta gamma di segnali mCherry perché la separazione di fase dipende dalla concentrazione di SIM nella cellula. Le cellule con segnale mCherry troppo fiomo o troppo luminoso potrebbero non separarsi di fase. Per evitare il fotosableching, non utilizzare troppa potenza laser o tempi di esposizione troppo lunghi. - Inizia l'imaging e prendi un ciclo una tantum come pre-dimerizzazione. Mettere in pausa l'imaging, aggiungere 0,5 mL di mezzo di imaging contenente 15 μL di dimerizzatore da 10 μM alla camera di imaging sullo stadio in modo che la concentrazione finale del dimerizzatore sia di 100 nM. Riprendere l'imaging.
- Quando si è pronti per invertire la dimerizzazione, mettere in pausa l'imaging, aggiungere 0,5 mL di mezzo di imaging contenente 2 μL di TMP stock da 100 mM alla camera di imaging sul palco per ottenere una concentrazione finale di TMP di 100 μM. Continuare a imaging delle cellule per 1-2 ore.
6. Imaging fisso
- Stesso microscopio impostato come live imaging, il riscaldamento del palcoscenico non è necessario. Utilizzare 488 nm per l'immagine dei telomeri FISH, 561 nm per mCherry IF e 647 nm per PML o SUMO IF.
NOTA: Se non si utilizza un anticorpo mCherry, è possibile utilizzare direttamente la proteina mCherry, ma il segnale potrebbe attenuarsi a causa della tempra in FISH. Utilizzare ancora il laser a 561 nm anziché a 594 nm per l'immagine mCherry per evitare il bleed-through del segnale da Cy5 a mCherry. - Individuare circa 30-50 celle con segnale rosso (mCherry o mCherry IF) da selezionare per le cellule trasfettate.
- Le immagini sono state scattate con una spaziatura di 0,3 μm per un totale di 8 μm in Z per raccogliere più segnali. Utilizzare l'80% di 647 nm, l'80% di 561 nm e il 70% di intensità di potenza di 488 nm, con tempi di esposizione di 600 ms e guadagno della fotocamera 300.
7. Elabora immagini time-lapse
- Definire binario per telomeri
Scegli una cella con tutte le informazioni temporali e z-stack, scegli solo il canale GFP e crea un livello binario definendo la soglia. Regola i valori inferiore e superiore della soglia e utilizza funzioni come "Liscia", "Pulisci" e "Riempi fori" per vedere quanto bene la soglia raccoglie gli oggetti desiderati attraverso tutti i punti temporali. - Sottrarre lo sfondo
Scegli tutti i canali, disegna il rettangolo regione di interesse (ROI) sullo sfondo (a parte la cella). Definisci questo ROI come sfondo e quindi sottrai l'intensità dello sfondo. - Collegare il binario dei telomeri all'intensità dei telomeri
Scegli il binario telomero e collegalo al canale GFP per calcolare l'intensità GFP negli oggetti binari come intensità dei telomeri. - Calcola il numero e l'intensità dei telomeri nel tempo
Specificare le informazioni da esportare, ad esempio l'ora, l'ID oggetto, l'intensità media, l'intensità della somma e i dati di esportazione. Utilizzare il software di plottaggio delle figure per leggere la tabella esportata e generare cifre del numero di telomeri e dell'intensità dei telomeri (riassumere l'intensità sul volume in ciascun telomero e quindi la media su tutti i telomeri in una cella) nel tempo.
8. Elabora immagini a celle fisse
- Definire binari per ADB
Scegli le celle trasfettate per l'analisi cercando il segnale nel canale 561nm. Seguendo la procedura di cui al punto 7.1, definire la soglia sia nel canale GFP (telomero DNA FISH) che in quello Cy5 (PML o SUMO IF) per generare binari per telomeri e corpi PML o SUMO, rispettivamente. Unisci gli strati binari GFP e Cy5 e crea un nuovo strato contenente particelle che hanno entrambi il segnale GFP e Cy5 per rappresentare la co-localizzazione del corpo PML sui telomeri, quindi A APK. - Calcola il numero e l'intensità APB/SUMO
Sottrarre lo sfondo dell'immagine dopo 7.2. Collegare lo strato binario APB/SUMO al canale Cy5 dopo la versione 7.3. Calcola il numero e l'intensità APB/SUMO. Esportare e tracciare i dati dopo il punto 7.4.
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Representative Results
Immagini rappresentative della localizzazione telomerica di SUMO identificate dal TELomero DNA FISH e dalla proteina SUMO IF sono mostrate in Figura 2. Le cellule con reclutamento SIM hanno arricchito SUMO1 e SUMO 2/3 sui telomeri rispetto alle cellule con reclutamento di mutanti SIM. Ciò indica che l'arricchimento SUMO indotto dalla dimerizzazione della SIM sui telomeri dipende dalle interazioni SUMO-SIM.
Un filmato time lapse rappresentativo di TRF1 e SIM dopo la dimerizzazione viene mostrato nel Video 1. Le istantanee in quattro punti temporali sono mostrate nella Figura 3A. La SIM è stata reclutata con successo nei telomeri e sia i focolai SIM che TRF1 sono diventati più grandi e più luminosi, come previsto per la formazione e la crescita di goccioline liquide (Figura 1B). Inoltre, è stata osservata la fusione dei focolai di TRF1 (Figura 3B), che ha portato al raggruppamento dei telomeri come mostrato nel ridotto numero di telomeri (Figura 3E) e all'aumento dell'intensità dei telomeri nel tempo (Figura 3D). Al contrario, il mutante SIM è stato reclutato nei telomeri dopo la dimerizzazione, ma non ha indotto alcuna formazione di goccioline o raggruppamento di telomeri, poiché l'intensità dei telomeri non è cresciuta e il numero di telomeri non si è ridotto (Figura 3C,D, E, Video 2). Ciò indica che la separazione di fase e quindi il clustering dei telomeri è guidato dalle interazioni SUMO-SIM.
L'inversione della separazione di fase e del clustering dei telomeri dopo l'aggiunta di TMP libero in eccesso è mostrata nel Video 3. Le istantanee in quattro punti temporali sono mostrate nella Figura 4A. Concordando con la prevista dissoluzione del condensato e il de-raggruppamento dei telomeri, il numero di telomeri è aumentato e l'intensità dei telomeri è diminuita nel tempo (Figura 4B, C).
Immagini rappresentative di AFB identificate dal DNA dei telomeri FISH e dalla proteina PML IF sono mostrate nella Figura 5. Le cellule con SIM reclutate hanno più ACB rispetto alle cellule con SIM mutante reclutato, suggerendo che i condensati indotti dalla dimerizzazione sono effettivamente ATB.
Le figure qui mostrano immagini rappresentative. Per l'analisi statistica con più celle, fare riferimento a Zhang et. al., 202011.
Figura 1: Dimerizzazione chimica per indurre condensati associati alla cromatina. (A) Schema di dimerizzazione: Il dimerizzatore è costituito da due ligandi collegati, TMP e Halo che interagiscono rispettivamente con eDHFR e Haloenzima. La proteina di separazione di fase viene fusa in mCherry ed eDHFR e la proteina di ancoraggio cromosomico viene fusa in Halo e GFP. (B) Prima di aggiungere il dimerizzatore (nucleo in alto a sinistra), la maggior parte delle proteine di ancoraggio cromosomico (quadrati verdi) sono localizzate sui cromosomi e una piccola quantità di proteine di ancoraggio sono localizzate diffusamente nel nucleoplasma. Le proteine che separano le fasi da reclutare (stelle viola) e i partner che separano le fasi (proteine che si condensano con la proteina che separa la fase, i triangoli rossi) sono diffusamente localizzati nel nucleoplasma. Dopo aver aggiunto i dimerizzatori (nucleo in alto a destra), le proteine che separano la fase vengono dimerizzate nella proteina di ancoraggio sui cromosomi e nel nucleoplasma. Potrebbe esserci qualche eccesso di proteine di separazione di fase nel nucleoplasma, a seconda della concentrazione relativa della proteina di ancoraggio, della proteina che separa la fase e del dimerizzatore utilizzato. Dopo la dimerizzazione (nucleo in basso a destra), l'aumento della concentrazione locale delle proteine di separazione di fase all'ancora porta alla separazione di fase e alla formazione di condensati associati alla cromatina. I partner di separazione di fase sono arricchiti all'ancora a causa della co-condensazione con la proteina di separazione di fase fusa con eDHFR. Le proteine di ancoraggio che non sono direttamente legate alla cromatina possono essere arricchite all'ancora a causa della dimerizzazione alla proteina di separazione di fase. Dopo aver aggiunto il TMP libero in eccesso per competere con il dimerizzatore per il legame eDHFR (nucleo in basso a sinistra), la proteina che separa la fase viene rilasciata dalla cromatina e il condensato viene sciolto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: SUMO è arricchito dopo aver reclutato SIM in telomeri con dimerizzatori. (A) Schema di dimerizzazione in questo esperimento: SIM (o SIM mutante) è fuso a mCherry ed eDHFR, e TRF1 è fuso ad Halo e GFP. (B) Una cellula rappresentativa per i telomeri DNA FISH e SUMO1 IF dopo il reclutamento di SIM. In basso c'è uno strato binario che identifica telomeri, SUMO1 e il numero di focolai di DNA SUMO1 e telomeri colocalizzati. Barre di scala: 5 μm. (C) Una cellula rappresentativa per il DNA telomero FISH e SUMO1 IF dopo il reclutamento di SIM mutanti. Nella parte inferiore c'è lo strato binario delle immagini utilizzate per identificare il numero di focolai di DNA SUMO1 e telomeri colocalizzati. Barre di scala: 5 μm. (D) Una cellula rappresentativa per i telomeri DNA FISH e SUMO2/3 IF dopo il reclutamento di SIM. Nella parte inferiore c'è lo strato binario che identifica i telomeri, SUMO2/3, e il numero di focolai di DNA SUMO2/3 e telomeri colocalizzati. Barre di scala: 5 μm. (E) Una cellula rappresentativa per il DNA dei telomeri FISH e SUMO2/3 IF dopo il reclutamento di SIM mutanti. Nella parte inferiore c'è lo strato binario delle immagini utilizzate per identificare il numero di focolai di DNA SUMO2/3 e telomeri colocalizzati. Barre della scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La separazione di fase indotta dalla dimerizzazione guida il clustering dei telomeri. (A) Istantanee di TRF1-GFP e SIM-mCherry prima e dopo l'aggiunta di dimerizzatore da 100 nM (concentrazione finale). Nella parte inferiore si trova lo strato binario dei telomeri identificato da TRF1-GFP. Barre di scala: 5 μm. (B) Un evento di fusione dopo il reclutamento di SIM in telomeri. Barre di scala: 2 μm. Intervallo di tempo: 5 min. (C) Istantanee di TRF1-GFP e SIM mutant-mCherry prima e dopo l'aggiunta di 100 nM dimerizzatore (concentrazione finale). Nella parte inferiore si trova lo strato binario dei telomeri identificato da TRF1-GFP. Barre di scala: 5 μm. (D) Intensità media dei telomeri (riassumere l'intensità sul volume in ciascun telomero e quindi media su tutti i telomeri in una cellula) nel tempo dopo aver reclutato SIM (verde, per cella in Figura 3A) e SIM mutante (blu, per cellula in Figura 3C). (E) Numero di telomeri nel tempo dopo il reclutamento di SIM (verde, per cella in Figura 3A) e SIM mutante (blu, per cella in Figura 3C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Inversione della condensazione e clustering dei telomeri. (A) Istantanee di TRF1-GFP e SIM-mCherry dopo aver aggiunto 100 μM TMP (concentrazione finale) a celle con condensati formati per 3 ore. Nella parte inferiore si trova lo strato binario dei telomeri identificato da TRF1-GFP. Barre della scala: 5 μm. (B) Intensità media dei telomeri (riassumere l'intensità sul volume in ciascun telomero e quindi media su tutti i telomeri in una cellula) nel tempo per la cellula nella Figura 4A. (C) Numero di telomeri nel tempo per la cella nella figura 4A. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: I condensati indotti dalla dimerizzazione sono AFB. (A) Una cellula rappresentativa per il DNA dei telomeri FISH e PML IF dopo il reclutamento di SIM. Nella parte inferiore c'è lo strato binario che identifica telomeri, corpi PML e il numero di focolai di DNA PML e telomerici colocalizzati, cioè il numero di AFB. Barre di scala: 5 μm. (B) Una cellula rappresentativa per il DNA telomero FISH e PML IF dopo il reclutamento di mutanti SIM. In basso c'è lo strato binario delle immagini utilizzate per identificare il numero di focolai di PML e TELomero DNA colocalizzati, cioè il numero di AFB. Barre della scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Il reclutamento di SIM con dimerizzatori ai telomeri guida la separazione di fase e il clustering dei telomeri. Imaging dal vivo di SIM-mCherry, TRF1-GFP e canali di unione prima e dopo l'aggiunta di dimerizzatore 100 nM (concentrazione finale). Barre di scala: 5 μm. Intervallo di tempo: 5 min. Tempo come mostrato. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Il reclutamento di mutanti SIM non può guidare la separazione di fase e il clustering dei telomeri. Imaging dal vivo di SIM mutant-mCherry, TRF1-GFP e canali di unione prima e dopo l'aggiunta di dimerizzatore 100 nM (concentrazione finale). Barre di scala: 5 μm. Intervallo di tempo: 5 min. Tempo come mostrato. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 3: Inversione della condensa e clustering dei telomeri. Imaging dal vivo di canali SIM-mCherry, TRF1-GFP e merge dopo aver aggiunto 100 μM TMP (concentrazione finale) a celle con condensati formati per 3 ore. Barre di scala: 5 μm. Intervallo di tempo: 5 min. Tempo come mostrato. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Questo protocollo ha dimostrato la formazione e la dissoluzione di condensati sui telomeri con un sistema di dimerizzazione chimica. La cinetica della separazione di fase e del clustering dei telomeri indotto dalla fusione di goccioline viene monitorata con immagini dal vivo. La localizzazione e la composizione della condensa sono determinate con DNA FISH e proteina IF.
Ci sono due passaggi critici in questo protocollo. Il primo è determinare la concentrazione di proteine e dimerizzatori. Il successo nell'indurre la separazione di fase locale in un locus genomico si basa sull'aumento della concentrazione locale della proteina che separa la fase al di sopra della concentrazione critica per la separazione di fase (Figura 1B). La concentrazione globale della proteina che separa la fase deve essere abbastanza alta in modo che ci siano abbastanza proteine da concentrare localmente. La concentrazione della proteina che separa la fase non può essere troppo elevata in modo che la separazione di fase globale si sia verificata o possa essere facilmente indotta. La lunghezza del DNA di ancoraggio (o dimensione della cromatina modificata a cui si lega la proteina di ancoraggio) e la concentrazione della proteina di ancoraggio fusa con Alone determinano la dimensione del centro di nucleazione alla massima efficienza di dimerizzazione. Più grande è la dimensione dell'ancora, più facile è nucleane i condensati. L'efficienza di dimerizzazione è influenzata dalla quantità di dimerizzatori rispetto alla quantità di proteine di ancoraggio. Troppo pochi dimerizzatori non possono occupare tutte le proteine di ancoraggio disponibili mentre troppi dimerizzatori provocano un legame non produttivo di eDHFR ai dimerizzatori in eccesso piuttosto che a quelli sulla proteina di ancoraggio. La concentrazione del dimerizzatore, insieme alla lunghezza del DNA di ancoraggio e alla concentrazione della proteina di ancoraggio fusa con Alone, può essere utilizzata per determinare la concentrazione critica richiesta per la separazione di fase locale nucleante. Un approccio sistematico per variare questi parametri (lunghezza del DNA di ancoraggio, concentrazione di proteina di ancoraggio, concentrazione di proteine a separazione di fase e concentrazione di dimerizzatore) può essere utilizzato per mappare un diagramma di fase multidimensionale. Tuttavia, se l'interesse non è nella mappatura del diagramma di fase ma nella formazione di condensati associati alla cromatina come dimostrato qui, è molto facile scegliere semplicemente celle con segnale Halo-GFP luminoso (dimensioni di ancoraggio maggiori) e celle con una vasta gamma di luminosità per mCherry-eDHFR (varie concentrazioni proteiche di separazione di fase) per l'immagine con la concentrazione del dimerizzatore per la massima dimerizzazione determinata nel Protocollo 2.3. Il secondo passo critico è evitare il fotosciviazione nell'imaging dal vivo. A differenza della separazione di fase globale in cui le goccioline (focolai luminosi di mCherry che etichettano la proteina che separa la fase) emergeranno dopo la separazione di fase, la condensazione locale nelle posizioni genomiche non può essere facilmente individuata giudicando la presenza di focolai di mCherry. Questo perché il reclutamento della proteina da sola, senza separazione di fase, nei loci genomici comporterà la formazione di focolai locali mCherry. La separazione di fase avviene dopo il reclutamento, quindi i fuochi di mCherry continuano a diventare più grandi e più luminosi dopo il reclutamento iniziale. L'arricchimento indotto dalla separazione di fase può avvenire anche nel canale GFP (la proteina di ancoraggio), a causa della dimerizzazione della proteina di ancoraggio alla proteina a separazione di fase. Pertanto, il cambiamento delle proprietà fisiche (dimensioni e intensità) dei fuochi nel tempo piuttosto che la presenza di fuochi dovrebbe essere usato per giudicare la separazione di fase. Mentre potrebbe essere difficile differenziare la dimerizzazione o l'arricchimento indotto dalla separazione di fase dei focolai di mCherry (proteina preda), l'arricchimento dei focolai GFP (proteina di ancoraggio) si verifica solo se vi è separazione di fase (Figura 3D). Pertanto, l'arricchimento della proteina di ancoraggio può essere utilizzato per giudicare facilmente la separazione di fase. Il fotosableching derivante da un'elevata potenza laser o da un lungo tempo di esposizione durante l'imaging rende più difficile giudicare la separazione di fase dall'imaging dal vivo e pertanto dovrebbe essere evitato il più possibile regolando le condizioni di imaging. Si noti che gli aumenti dell'intensità e delle dimensioni dei fuochi nel tempo sono caratteristiche di LLPS ma non possono essere utilizzati come unica prova per LLPS. Nel caso qui presentato, la fusione di goccioline è stata utilizzata come prova per la formazione di goccioline liquide, che potrebbero non verificarsi per un numero minore di ancore o meno ancore mobili. Senza fusione di goccioline, altri metodi come la diffusione dei componenti della condensa e la sensibilità alla perturbazione di piccole molecole possono essere utilizzati per confermare ulteriormente la formazione di condensa.8,9,11.
Sebbene questo sistema di dimerizzazione chimica renda necessaria la risoluzione temporale per il monitoraggio della separazione di fase nelle cellule vive, manca di risoluzione spaziale a livello cellulare e subcellulare. Grazie al design modulare dei dimerizzatori, è possibile realizzare dimerizzatori sensibili alla luce attaccando una fotocultura a TMP, rendendo il linker fotosensibile o entrambi12,32,35. Semplicemente commutando i dimerizzatori all'interno dello stesso sfondo cellulare ingegnerizzato per diverse applicazioni, è possibile ottenere un elevato controllo spaziale e temporale della dimerizzazione, dell'inversione della dimerizzazione o di entrambi con la luce. Prevediamo che con quei dimerizzatori sensibili alla luce, sarà in grado di controllare la separazione di fase con elevata precisione spaziale e temporale. Rispetto agli strumenti optogenetici disponibili per controllare la separazione di fase attraverso le proteine sensibili alla luce36,37,uno svantaggio del sistema di dimerizzazione chimica è che può invertire la separazione di fase solo una volta. Tuttavia, questo sistema può mantenere un reclutamento prolungato e quindi la separazione di fase senza luce, il che lo rende più adatto per applicazioni di imaging dal vivo a lungo termine come seguire la crescita delle goccioline o le conseguenze cellulari della separazione di fase. Inoltre, la capacità di trattare una popolazione di cellule senza luce lo rende conveniente per i saggi biochimici come quelli necessari per determinare la composizione del condensato o i cambiamenti nell'organizzazione del genoma.
Questo metodo può essere facilmente adattato per indurre condensati in altre posizioni del genoma. Si può semplicemente identificare una proteina che si lega alla posizione genomica di interesse e fonderla con Halo per usarla come ancoraggio (Figura 1B). In alternativa, si può combinare questo con CRISPR e fondere dCas9 in Halo e utilizzare RNA guida per ancorare Halo ai loci genomici di interesse38. Inoltre, si può ancorare Halo a un array di DNA ectopico (ad esempio LacO) integrato nel genoma fondendo Halo con la proteina bersaglio (ad esempio LacI). Si può quindi utilizzare un approccio bottom-up per valutare la capacità di una proteina di separarsi localmente in fase sulla cromatina, come la sua capacità di separazione di fase è influenzata da troncamenti proteici, mutazioni o modifiche post-traduzionali, o come il condensato influenza le funzioni locali come la modifica della cromatina, la replicazione o la trascrizione. Per riassumere, questo sistema di dimerizzazione chimica può essere utilizzato per indurre una vasta gamma di condensati su varie posizioni di cromatina ed è particolarmente adatto per studiare come le proprietà del materiale e la composizione chimica dei condensati associati alla cromatina contribuiscono alle funzioni della cromatina combinando l'imaging dal vivo a lungo termine con saggi biochimici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (1K22CA23763201 a H.Z., GM118510 a D.M.C.) e dalla fondazione Charles E. Kaufman a H.Z. Gli autori desiderano ringraziare Jason Tones per aver corretto il manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
References
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