Summary
Este protocolo ilustra um sistema de dimerização de proteínas quimicamente induzido para criar condensados na cromatina. Demonstra-se a formação de corpo nuclear de leucemia promielolítica (PML) em telômeros com dimerizadores químicos. O crescimento, a dissolução, a localização e a composição são monitoradas com imagem de células vivas, imunofluorescência (IF) e fluorescência na hibridização situ (FISH).
Abstract
Os condensados associados à cromatina estão implicados em muitos processos nucleares, mas os mecanismos subjacentes permanecem evasivos. Este protocolo descreve um sistema de dimerização de proteínas quimicamente induzido para criar condensados em telômeros. O dimerizer químico consiste em dois ligantes ligados que cada um pode se ligar a uma proteína: ligante halo à enzima halo e trimetoprim (TMP) a E. coli dihidrofolate reductase (eDHFR), respectivamente. Fusão da enzima Halo a uma proteína de telômero ancora dimerizers aos telômeros através da ligação entre ligand ligand-enzima halo covalente. A vinculação do TMP ao eDHFR recruta a fase fundida pelo eDHFR que separa proteínas aos telômeros e induz a formação de condensados. Como a interação TMP-eDHFR não é covalente, a condensação pode ser revertida usando TMP livre em excesso para competir com o dimerizer para a ligação eDHFR. Um exemplo de indução da formação nuclear da leucemia promicocítica (PML) nos telômeros e na determinação do crescimento, dissolução, localização e composição da condensação. Este método pode ser facilmente adaptado para induzir condensados em outros locais genômicos, fundindo halo a uma proteína que se liga diretamente à cromatina local ou ao dCas9 que é direcionado ao lócus genômico com um RNA guia. Ao oferecer a resolução temporal necessária para imagens vivas de células únicas, mantendo a separação de fase em uma população de células para ensaios bioquímicos, este método é adequado para sondar tanto a formação quanto a função de condensados associados à cromatina.
Introduction
Muitas proteínas e ácidos nucleicos sofrem separação de fase líquido-líquido (LLPS) e se auto-montam em condensados biomoleculares para organizar a bioquímica nas células1,2. LLPS de proteínas de ligação de cromatina leva à formação de condensados que estão associados a loci genômicos específicos e estão implicados em várias funções locais de cromatina3. Por exemplo, LLPS de proteína HP1 está por trás da formação de domínios heterocromatinas para organizar o genoma4,5, LLPS de fatores de transcrição forma centros de transcrição para regular transcrição6, LLPS de mRNAs nascentes e proteína de combs multi-sexo gera corpos histonas locus para regular a transcrição e processamento de histone mRNAs7. No entanto, apesar de muitos exemplos de condensados associados à cromatina serem descobertos, os mecanismos subjacentes de formação, regulação e função de condensado permanecem mal compreendidos. Em particular, nem todos os condensados associados à cromatina são formados através de LLPS e avaliações cuidadosas da formação de condensados em células vivas ainda são necessárias8,9. Por exemplo, a proteína HP1 no camundongo é mostrada ter apenas uma capacidade fraca de formar gotículas líquidas em células vivas e os focos de heterocromatina se comportam como glóbulos polímeros colados10. Portanto, são desejáveis ferramentas para induzir novos condensados na cromatina em células vivas, particularmente aquelas que permitem o uso de imagens vivas e ensaios bioquímicos para monitorar a cinética da formação de condensados, as propriedades físicas e químicas dos condensados resultantes e as consequências celulares da formação de condensados.
Este protocolo relata um sistema de dimerização química para induzir condensados proteicos na cromatina11 (Figura 1A). O dimerizer consiste em dois ligantes interligadores de proteínas ligados: trimetoprim (TMP) e ligante halo e pode escurecer proteínas fundidas aos receptores cognatos: Escherichia coli dihidrofolate reductase (eDHFR) e uma enzima de alkyldehalogenase bacteriana (enzima halo),respectivamente 12. A interação entre ligante halo e enzima halo é covalente, permitindo que a enzima Halo seja usada como uma âncora, fundindo-a a uma proteína de ligação de cromatina para recrutar uma proteína de separação de fase fundida ao eDHFR à cromatina. Após o recrutamento inicial, o aumento da concentração local da fase de separação da proteína passa pela concentração crítica necessária para a separação de fases e, assim, nuclea um condensado na âncora(Figura 1B). Ao fundir proteínas fluorescentes (por exemplo, mCherry e eGFP) para eDHFR e Halo, a nucleação e o crescimento de condensados podem ser visualizados em tempo real com microscopia de fluorescência. Como a interação entre eDHFR e TMP não é covalente, o TMP livre em excesso pode ser adicionado para competir com o dimerizer para a vinculação eDHFR. Isso liberará então a proteína de separação de fase da âncora e dissolverá o condensado associado à cromatina.
Utilizamos esta ferramenta para induzir a formação nuclear de leucemia promyelocítica (PML) em telômeros em células cancerígenas telomerase-negativas que utilizam um alongamento alternativo de telômeros (ALT) caminho para manutenção de telômeros13,14. Os corpos nucleares pml são compartimentos sem membrana envolvidos em muitos processos nucleares15,16 e são exclusivamente localizados aos telômeros ALT para formar APBs, para os corpos PML associados ao telômero ALT17,18. Os telômeros agrupam-se dentro dos APBs, presumivelmente para fornecer modelos de reparo para síntese de DNA de telômero direcionada à ímologia em ALT19. De fato, a síntese de DNA de telômero foi detectada em APBs e APBs desempenham papéis essenciais no enriquecimento de fatores de reparação de DNA nos telômeros20,21. No entanto, os mecanismos subjacentes à montagem de APB e ao agrupamento de telômeros dentro das APBs eram desconhecidos. Uma vez que as proteínas de telômero em células ALT são modificadas exclusivamente por pequenos modificadores semelhantes à ubiquitina (SUMOs)22,muitos componentes APB contêm sítios de sumô 22,23,24,25 e/ou25 Os motivos que interagem pelo SUMSUMO (SIMs)26,27 e as interações SUMO-SIM impulsionam a separação de fase28,hipótesemos que o sumô em telômeros leva ao enriquecimento do SUMO/SIM contendo proteínas e As interações SUM-SIM entre essas proteínas levam à separação de fases. A proteína PML, que tem três locais de sumô e um site sim, pode ser recrutada para telômeros sumôs para formar APBs e coalescência de APBs líquidos leva ao agrupamento de telômeros. Para testar essa hipótese, utilizamos o sistema de dimerização química para imitar a formação de APB induzida por sumô, recrutando SIM para telômeros(Figura 2A)11. O GFP é fundido à Haloenzyme para visualização e à proteína de ligação de telômeros TRF1 para ancorar o dimerizer aos telômeros. O SIM é fundido para eDHFR e mCherry. Cinéticas da formação de condensado e agrupamento de telômeros induzidos por fusão de gotículas são seguidos com imagens de células vivas. A separação de fase é revertida adicionando TMP livre de excesso para competir com a vinculação eDHFR. A imunofluorescência (IF) e a fluorescência na hibridização situ (FISH) são utilizadas para determinar a composição do condensado e a associação telômérica. O recrutamento do SIM enriquece o SUM nos telômeros e os condensados induzidos contêm PML e, portanto, são APBs. Recrutar um mutante SIM que não pode interagir com o SUMH não enriquece o SUMô em telômeros ou induz a separação de fases, indicando que a força motriz fundamental para a condensação de APB é a interação SUMO-SIM. Concordando com essa observação, polímeros poliSUMO-polySIM que fundiram-se a um fator de ligação TRF2 RAP1 também podem induzir a formação de APB29. Em comparação com o sistema de fusão polySUMO-polySIM, onde a separação de fase ocorre enquanto proteínas suficientes forem produzidas, a abordagem de dimerização química aqui apresentada induz a separação de fases sob demanda e, portanto, oferece melhor resolução temporal para monitorar a cinética da separação de fases e do processo de agrupamento de telômeros. Além disso, este sistema de dimerização química permite o recrutamento de outras proteínas para avaliar sua capacidade em induzir a separação de fases e agrupamento de telômeros. Por exemplo, uma proteína desordenada recrutada para telômeros também pode formar gotículas e telômeros sem induzir a formação de APB, sugerindo que o agrupamento de telômeros é independente da química apb e depende apenas da propriedade líquida APB11.
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Protocol
1. Produção de linhas celulares transitórias
- Cultura U2OS células aceitadoras em tampas de vidro de 22 x 22 mm (para imagem ao vivo) ou tampas circulares de 12 mm de diâmetro (para IF ou FISH) revestidas com poli-D-lisina em 1 Placa de 6 poços com meio de crescimento (10% soro bovino fetal e 1% solução de penicilina-estreptomicina no DMEM) até atingirem 60-70% de confluência.
- Substitua o meio de crescimento por meio de transfecção de 1 mL (meio de crescimento sem solução penicilina-estreptomicina) antes da transfecção.
- Para cada poço de transfecção, adicione 4 reagentes de transfecção μL a 150 μL de mídia súmada reduzida, vórtice por 10 segundos e, em seguida, incubar por 5 minutos.
- Para cada poço, adicione halo construto plasmídeo (Halo-GFP-TRF1 ou Halo-TRF1) e eDHFR construa plasmídeo (mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDHFR-SIM mutante) a uma proporção de massa de 1:1 (0,5 μg Halo constrói plasmídeo com 0,5 μg eDHFR construção plasmid) para 150 μL mídia de soro reduzido, dropwise, mistura por pipetação.
NOTA: As tags são relativamente pequenas (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) e nenhum efeito na separação de fase foi observado. No entanto, o uso de mutantes como o mutante SIM usado aqui para garantir que o comportamento de fase seja sensível às mutações e não às tags é aconselhado. SIM é de PIASx28,30. Sequência sim é AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGACGAATCTAGCAGCGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Sim mutante é gerado por aminoácidos SIM mutantes VIDL para VADA28, e a sequência é AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGACGACGACTAGCAGAGAGAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Depositamos nossos plasmídeos para addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mCherry-eDHFR-SIM mutante. - Adicione 150 μL de reagente de transfecção -mistura de mídia sérico reduzida a 150 μL de mídia sérico reduzida com DNA, dropwise, misture por pipetação, incubar por 5 minutos.
- Adicione os 300 μL de mistura reagente-DNA de transfecção às células, dropwise e, em seguida, coloque as células de volta à incubadora.
- Aguarde 24-48 horas antes da imagem ao vivo, imunofluorescência (IF) ou fluorescência na hibridização situ (FISH).
2. Dimerização em telômeros
- Dissolva os dimerizadores em sulfoxida de dimetila a 10 mM e armazene em tubos de microcentrifusagem de plástico a −80 °C para armazenamento a longo prazo.
NOTA: Em vez de usar o dimerizer com TMP diretamente ligado ao Halo (TMP-Halo, TH), o dimerizer TMP-NVOC-Halo (TNH) que tem um linker fotossensível, 6-nitroveratryl oxycarbonyl (NVOC), entre TMP e Haloligand é usado31. Isso porque leva menos tempo para o TNH (~5 minutos) se difundir na célula do que o TH (~20 minutos). Os resultados aqui mostrados também podem ser obtidos usando TH. Ao usar tnh, tenha cuidado para não expor o dimerizer à luz para evitar o decote NOVC. Manuseie o TNH em uma sala escura com uma lâmpada de luz vermelha fraca, armazene o dimerizer em tubos de plástico âmbar e enrole o recipiente contendo TNH ou células tratadas com papel alumínio. A imagem TNH com DIC é segura. - Pegue uma alíquota de dimerizer de 10 mM de −80 °C e dilue em meio de imagem para uma concentração de estoque de 10 μM e armazene a −20 °C.
- Quando estiver pronto para usar, diluir os dimerizers da solução de estoque de 10 μM para uma concentração final de trabalho de 100 nM em meio de crescimento (para imagem fixa) ou meio de imagem. Trate as células com dimerizers de 100 nM (concentração final) no palco para imagens ao vivo ou incubar por 4-5 horas para imunofluorescência (IF) e fluorescência na hibridização situ (FISH).
NOTA: A concentração de dimerizadores utilizados afeta a eficiência da dimerização e, portanto, a separação de fases. A concentração de dimerizer que permite a máxima eficiência de dimerização depende do tipo celular e da concentração de proteína âncora, por isso precisará ser determinada para diferentes experimentos. Uma maneira simples é incubar células expressando a proteína âncora e mCherry-eDHFR (sem fundir a fase que separa proteínas ou fundida a um mutante de separação não-fase) e identificar a concentração de dimerizer na qual a maior intensidade mCherry na âncora é alcançada. Uma abordagem mais sistemática é incubar células expressando a âncora apenas com diferentes concentrações de dimerizadores e, em seguida, com um corante de ligação halo para ajudar a determinar a concentração de dimerizador em que a intensidade de corante de ligação halo começa a planar (ou seja, todas as âncoras com halo-fundido são ocupadas pelo dimerizador e não restam mais para o corante de ligação halo)32. - Para reverter a dimerização, incubar células com dimerizers por 2-5 horas (com ou sem imagem viva) ou até que o tamanho da gotícula desejada seja alcançado e adicione 100 μM livre de TMP (concentração final) diluído em imagens médias para células.
3. Imunofluorescência (IF)
- Semente 105 células em óculos de cobertura circular de 12 mm de diâmetro revestidos com poli-D-lysine em placa de 6 poços. Em seguida, transfeme os dois plasmídeos (Halo-GFP-TRF1 com mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDHFR-SIM mutante) e espere 24-48 horas antes de prosseguir para a imunofluorescência.
NOTA: Aguarde mais de um dia após a transfecção obter maior expressão. - Dimerizers diluídos com meio de crescimento para atingir uma concentração final de 100 nM, adicione dimerizers diluídos às células e incubar a 37 °C por 4-5 horas.
NOTA: A separação de fase é rapidamente induzida após a adição de dimerizers (< 30 minutos). A incubação mais longa ajuda gotículas grosseiras em tamanhos maiores. Seguir o crescimento de gotículas com imagens vivas pode ser usado para determinar o tempo que as gotículas levam para atingir um estado desejado. - Fixar células em solução PBS contendo 4% de formaldeído e 0,1% Triton X-100 por 10 minutos à temperatura ambiente para células permeabilizes. Lave as células 3 vezes com PBS.
NOTA: Após esta etapa, pode ser pausada e as células podem ser armazenadas a 4 °C por até uma semana.
Atenção: O formaldeído é prejudicial pela inalação e, se engolido, também irrita os olhos, o sistema respiratório e a pele e é um possível risco de câncer. Precisa usar equipamento de proteção individual, usar apenas em um capuz de fumaça química. Coloque-o também em um recipiente de resíduos após o uso, não o descarte na pia. - A lavagem cobre deslizamentos duas vezes com 50 μL TBS-Tx e uma vez com tampão de diluição de anticorpos de 50 μL (AbDil). TBS-Tx foi feito pela TBS, 0,1% Triton X-100 e 0,05% Na-azide. A AbDil foi feita pela TBS-Tx, 2% BSA e 0,05% Na-azide.
- Incubar cada deslizamento com 50 μL anti-PML primário (diluição 1:50 em AbDil) / anti-SUMO1 (diluição de 1:200 em AbDil) / anticorpo anti-SUMO2/3 (diluição 1:200 em AbDil) a 4 °C em uma câmara umidificada durante a noite. Anticorpo mCherry também pode ser usado (diluição de 1:200 em AbDil) para ajudar a detectar o sinal mCherry para FISH.
NOTA: O PEIXE sacia o sinal fluorescente mCherry, o que dificulta a diferenciação de células transfeinadas com plasmídeos mCherry daqueles que não são transfectados em experimentos de PEIXE. O uso de anticorpos mCherry é aconselhável. Alternativamente, pode-se fazer uma linha celular estável expressando eDHFR contendo proteína. - Lavar tampas 3 vezes com AbDil para remover anticorpo primário desvinculado.
- Incubar células com anticorpo secundário [anticorpo secundário IgG (H+L) de anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor 647 para PML e SUMO, anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) conjugado com Alexa Fluor 555 para mCherry, ambos a 1:1000 diluição em AbDil] por 1 hora em caixa escura à temperatura ambiente.
- As tampas de lavagem são 3 vezes com TBS-Tx.
- Slides de etiqueta, diluir DAPI na mídia de montagem para alcançar a concentração final da DAPI de 1 μg/mL. Em seguida, coloque 2 DAPI diluídos de 2 μL no slide. Vire as tampas e coloque-as na gota DAPI, aspirar fluido extra da borda do deslizamento de tampas.
- Sele com esmalte, deixe secar e enxágue do topo da tampa com água. Guarde no congelador para imagens.
4. Fluorescência na hibridização situ (FISH)
- Semente 105 células em óculos de cobertura circular de 12 mm de diâmetro revestidos com poli-D-lysine em placa de 6 poços. Células transfectas com Halo-TRF1 e mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDHFR-SIM plasmídeos mutantes e esperam por 24-48 h antes de prosseguir para FISH. O passo de dimerização é o mesmo descrito em 3.2.
NOTA: Aqui o TRF1 não é fundido com o GFP para que o canal verde seja liberado para a sonda de DNA de telômero. - Fixar células com 4% de formaldeído por 10 minutos à temperatura ambiente e lavar 4 vezes com PBS. Para IF-FISH, proceda ao protocolo IF daqui e depois de lavar anticorpos secundários em IF (3.8), refixar células com 4% de formaldeído por 10 minutos à temperatura ambiente e lavar três vezes com PBS.
- A desidratação cobre deslizamentos em uma série de etanol (70%, 80%, 90%, 2 minutos cada).
- Incubar tampas com sonda PNA de 488 telC (proporção 1:2000) em solução de hibridização de 5 μL a 75 °C por 5 minutos. A solução de hibridização contém 70% de formamida deionizada, 10 mM Tris (pH 7,4), reagente de bloqueio de 0,5%. Em seguida, incubar durante a noite em uma câmara umidificada à temperatura ambiente.
- Lavar tampas com tampão de lavagem (70% formamida, 10 mM Tris) 2 minutos por 3 vezes à temperatura ambiente e montar com 1 μg/mL DAPI em mídia de montagem para imagem.
NOTA: O protocolo FISH é um protocolo publicado33'34.
5. Imagem ao vivo
- Quando as células estão prontas para a imagem, as tampas de montagem em câmaras magnéticas com células mantidas em meio de imagem de 1 mL sem fenol vermelho em um estágio aquecido em uma câmara ambiental.
- Configure microscópio e aparato de controle ambiental. As imagens foram adquiridas com um microscópio confocal de disco giratório com um objetivo 100x 1.4 NA, um Piezo Z-Drive, uma câmera de dispositivo acoplado a carga (EMCCD) de elétrons e um módulo de fusão a laser equipado com lasers 455, 488, 561, 594 e 647 nm controlados por software de imagem. Os poderes de saída para todos os lasers são medidos em 20 mW na extremidade da fibra.
- Localize células com sinal GFP brilhante nos telômeros e sinal mCherry localizado difusivamente no nucleoplasma. Encontre cerca de 20 células, memorize cada posição com informações x, y, z e configure parâmetros para imagens de lapso de tempo com espaçamento de 0,5 μm para um total de 8 μm em Z e intervalo de tempo de 5 minutos para 2-4 horas para ambos os canais GFP e mCherry. Use 30% de 594 nm e 50% de intensidade de potência de 488 nm, com tempos de exposição de 200 ms e ganho de câmera de 300.
NOTA: A potência de saída das unidades laser é de 20 mW. Os focos GFP brilhantes indicam tamanho de âncora maior que pode nuclear condensados mais facilmente. Encontre células com uma ampla gama de sinal mCherry porque a separação de fase depende da concentração de SIM na célula. Células com sinal mCherry muito escuro ou muito brilhante podem não se separar de fase. Para evitar fotobleaching, não use muita potência laser ou muito tempo de exposição. - Inicie a imagem e faça um loop único como pré-dimerização. Pausar a imagem, adicionar 0,5 mL de mídia de imagem contendo 15 μL de dimerizer de 10 μM à câmara de imagem no palco de modo que a concentração final de dimerizer seja de 100 nM. Retomar a imagem.
- Quando estiver pronto para reverter a dimerização, pause a imagem, adicione 0,5 mL de mídia de imagem contendo 2 μL de 100 mM de estoque TMP à câmara de imagem no palco para obter 100 μM TMP concentração final. Continuem as células de imagem por 1-2 horas.
6. Imagem fixa
- Mesmo microscópio configurado como imagens ao vivo, o aquecimento do palco não é necessário. Use 488 nm para imagem de telômero FISH, 561 nm para mCherry IF e 647 nm para PML ou SUMO IF.
NOTA: Se não estiver usando um anticorpo mCherry, basta imaginar diretamente a proteína mCherry, mas sinal talvez fraca por causa da sacieciação em PEIXES. Ainda use 561 nm em vez de laser de 594 nm para imaginar mCherry para evitar o sinal de sangramento de Cy5 para mCherry. - Localize cerca de 30-50 células com sinal vermelho (mCherry ou mCherry IF) para selecionar para células transfeinadas.
- As imagens foram tiradas com espaçamento de 0,3 μm para um total de 8 μm em Z para coleta de mais sinais. Use 80% de 647 nm, 80% de 561 nm, e 70% de intensidade de potência de 488 nm, com tempos de exposição de 600 ms e ganho de câmera de 300.
7. Processar imagens de lapso de tempo
- Definir binário para telômeros
Escolha uma célula com informações de sempre e z-stack, escolha apenas o canal GFP e crie uma camada binária definindo o limiar. Ajuste os valores inferiores e superiores do limiar e use funções como "Liso", "Limpar" e "Preencher buracos" para ver o quão bem o limiar capta os objetos desejados em todos os pontos de tempo. - Subtrair fundo
Escolha todos os canais, desenhe o retângulo Região de Interesse (ROI) em segundo plano (além da célula). Defina este ROI como plano de fundo e, em seguida, subtraia a intensidade de fundo. - Link telomere binário à intensidade do telômero
Escolha o binário do telômero e vincule-o ao canal GFP para calcular a intensidade do GFP nos objetos binários como intensidade de telômero. - Calcular número de telômero e intensidade ao longo do tempo
Especifique quais informações devem ser exportadas, como tempo, ID do objeto, intensidade média, intensidade da soma e dados de exportação. Use o software de plotagem de figuras para ler a tabela exportada e gerar figuras do número de telômero e intensidade do telômero (resumir a intensidade sobre o volume em cada telômero e, em seguida, a média sobre todos os telômeros em uma célula) ao longo do tempo.
8. Processar imagens de células fixas
- Definir binário para APBs
Escolha células transfeinadas para análise procurando sinal no canal de 561nm. Após o procedimento em 7.1, defina limiar tanto no canal GFP (Telomere DNA FISH) quanto no Cy5 (PML ou SUMO IF) para gerar binário para telômeros e corpos pml ou SUMô, respectivamente. Mesclar camadas binárias GFP e Cy5 e criar uma nova camada contendo partículas que tenham sinal GFP e Cy5 para representar a co-localização do corpo PML nos telômeros, assim APBs. - Calcular o número e intensidade do APB/SUM
Subtraia o fundo de imagem após 7.2. Link apb/sumo camada binária para canal Cy5 após 7.3. Calcular o número e a intensidade DO APB/SUM. Dados de exportação e parcela após 7.4.
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Representative Results
Imagens representativas da localização telômica do SUMM identificado pelo DNA de telômero FISH e pela proteína SUME são mostradas na Figura 2. Células com recrutamento de SIM enriqueceram o SUMO1 e o SUMÔ 2/3 nos telômeros em comparação com células com recrutamento mutante SIM. Isso indica que o enriquecimento de SUM induzido por dimerização do SIM nos telômeros depende das interações SUMO-SIM.
Um filme de lapso de tempo representativo do TRF1 e DO SIM após a dimerização é mostrado no Vídeo 1. Instantâneos em quatro pontos de tempo são mostrados na Figura 3A. O SIM foi recrutado com sucesso para telômeros e tanto os focos SIM quanto o TRF1 se tornaram maiores e mais brilhantes, como previsto para a formação e crescimento de gotículas líquidas(Figura 1B). Além disso, observou-se fusão de focos TRF1(Figura 3B),o que levou ao agrupamento de telômero, como mostrado no número reduzido do telômero(Figura 3E)e aumento da intensidade do telômero ao longo do tempo(Figura 3D). Em contraste, o mutante SIM foi recrutado para telômeros após a dimerização, mas não induziu nenhuma formação de gotícula ou agrupamento de telômeros, pois a intensidade do telômero não cresceu e o número de telômeros não reduziu (Figura 3C, D,E, Vídeo 2). Isso indica que a separação de fases e, portanto, o agrupamento de telômeros são impulsionados por interações SUMO-SIM.
A inversão da separação de fase e agrupamento de telômero após a adição de TMP livre de excesso é mostrada no Vídeo 3. Instantâneos em quatro pontos de tempo são mostrados na Figura 4A. Concordando com a dissolução e desarquivamento previsto de telômeros, o número de telômeros aumentou e a intensidade do telômero diminuiu ao longo do tempo(Figura 4B, C).
Imagens representativas de APBs identificadas por peixe de DNA de telômero e proteína PML IF são mostradas na Figura 5. Células com SIM recrutados têm mais APBs do que células com mutantes SIM recrutados, sugerindo que condensados induzidos por dimerização são de fato APBs.
Os números aqui mostram imagens representativas. Para análise estatística com mais células, consulte Zhang et. al., 202011.
Figura 1: Dimerização química para induzir condensados associados à cromatina. (A) Esquema de dimerização: O dimerizer consiste em dois ligantes ligados, TMP e Halo que interagem com eDHFR e Haloenzyme, respectivamente. A proteína de separação de fase é fundida ao mCherry e eDHFR, e a proteína âncora do cromossomo é fundida ao Halo e ao GFP. (B) Antes de adicionar dimerizer (núcleo superior esquerdo), a maioria das proteínas âncoras cromossômicas (quadrados verdes) são localizadas nos cromossomos e uma pequena quantidade de proteínas âncoras são difusamente localizadas no nucleoplasma. A fase de separação de proteínas a serem recrutadas (estrelas roxas) e parceiros de separação de fase (proteínas que se condensarão com a fase que separa proteínas, triângulos vermelhos) são difusamente localizadas no nucleoplasma. Após a adição de dimerizadores (núcleo superior direito), as proteínas de separação de fase são dimerizadas à proteína âncora nos cromossomos e no nucleoplasma. Pode haver alguma fase em excesso separando proteínas no nucleoplasma, dependendo da concentração relativa da proteína âncora, da proteína de separação de fase e do dimerizador utilizado. Após a dimerização (núcleo inferior-direito), o aumento da concentração local da fase que separa proteínas na âncora leva à separação de fases e à formação de condensados associados à cromatina. Os parceiros de separação de fase são enriquecidos na âncora por causa da co-condensação com a proteína de separação de fase fundida pelo eDHFR. Proteínas âncoras que não estão diretamente ligadas à cromatina podem ser enriquecidas na âncora por causa da dimerização da fase que separa a proteína. Depois de adicionar TMP livre em excesso para competir com o dimerizer para ligação eDHFR (núcleo inferior esquerdo), a proteína de separação de fase é liberada da cromatina e o condensado é dissolvido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O SUMô é enriquecido após o recrutamento de SIM para telômeros com dimerizers. (A) Esquema de dimerização neste experimento: SIM (ou MUTANTE SIM) é fundido a mCherry e eDHFR, e TRF1 é fundido ao Halo e GFP. (B) Uma célula representativa para o DNA de telômero FISH e SUMO1 IF após o recrutamento do SIM. O fundo é a camada binária que identifica telômeros, SUMO1 e número de focos de DNA de SUMO1 e telômero. Barras de escala: 5 μm. (C) Uma célula representativa para o Telomere DNA FISH e SUMO1 IF após o recrutamento de SIM mutante. Na parte inferior está a camada binária das imagens usadas para identificar o número de focos de DNA de SUMO1 e telômero. Barras de escala: 5 μm. (D) Uma célula representativa para o Telomere DNA FISH e SUMO2/3 IF após o recrutamento de SIM. Na parte inferior está a camada binária que identifica telômeros, SUMO2/3, e o número de focos de DNA SUMO2/3 e telômero. Barras de escala: 5 μm. (E) Uma célula representativa para o Telomere DNA FISH e SUMO2/3 IF após o recrutamento de mutante SIM. Na parte inferior está a camada binária das imagens usadas para identificar o número de focos de DNA de SUMO2/3 e telômero. Barras de escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A separação de fase induzida por dimerização impulsiona o agrupamento do telômero. (A) Instantâneos de TRF1-GFP e SIM-mCherry antes e depois de adicionar dimerizer de 100 nM (concentração final). Na parte inferior está a camada binária de telômero identificada pelo TRF1-GFP. Barras de escala: 5 μm. (B) Um evento de fusão após o recrutamento de SIM para telômeros. Barras de escala: 2 μm. Intervalo de tempo: 5 min. (C) Instantâneos de TRF1-GFP e SIM mutante-mCherry antes e depois de adicionar dimerizer de 100 nM (concentração final). Na parte inferior está a camada binária de telômero identificada pelo TRF1-GFP. Barras de escala: 5 μm. (D) Intensidade média do telômero (resumir intensidade sobre o volume em cada telômero e, em seguida, média sobre todos os telômeros em uma célula) ao longo do tempo após o recrutamento de SIM (verde, para célula na Figura 3A) e mutante SIM (azul, para célula na Figura 3C). (E) Número de telômero ao longo do tempo após o recrutamento de SIM (verde, para célula na Figura 3A) e mutante SIM (azul, para célula na Figura 3C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Reversão da condensação e agrupamento de telômero. (A) Instantâneos de TRF1-GFP e SIM-mCherry após a adição de 100 μM TMP (concentração final) a células com condensados formados por 3h. Na parte inferior está a camada binária de telômero identificada pelo TRF1-GFP. Barras de escala: 5 μm. (B) Intensidade média do telômero (resumir intensidade sobre o volume em cada telômero e, em seguida, média sobre todos os telômeros em uma célula) ao longo do tempo para célula na Figura 4A. (C) Número de telômero ao longo do tempo para célula na Figura 4A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Condensados induzidos por dimerização são APBs. (A) Uma célula representativa para o Mielô DE DNA FISH e PML IF após o recrutamento de SIM. Na parte inferior está a camada binária que identifica telômeros, corpos pml e o número de pml e focos de DNA de telômeros, ou seja, número de APBs. Barras de escala: 5 μm. (B) Uma célula representativa para o peixe de DNA de telômero e PML IF após o recrutamento de mutantes SIM. Na parte inferior está a camada binária das imagens utilizadas para identificar o número de pml e focos de DNA de telômeros, ou seja, número de APBs. Barras de escala: 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Recrutar SIM com dimerizers para telômeros impulsiona a separação de fases e agrupamento de telômeros. Imagem ao vivo de SIM-mCherry, TRF1-GFP e canais de fusão antes e depois de adicionar dimerizer de 100 nM (concentração final). Barras de escala: 5 μm. Intervalo de tempo: 5 min. Tempo como mostrado. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 2: Recrutar mutante SIM não pode conduzir separação de fase e agrupamento de telômero. Imagem ao vivo de SIM mutante-mCherry, TRF1-GFP e canais de fusão antes e depois de adicionar dimerizer de 100 nM (concentração final). Barras de escala: 5 μm. Intervalo de tempo: 5 min. Tempo como mostrado. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo 3: Reversão da condensação e agrupamento de telômero. Imagem ao vivo de SIM-mCherry, TRF1-GFP e canais de fusão após a adição de 100 μM TMP (concentração final) a células com condensados formados por 3h. Barras de escala: 5 μm. Intervalo de tempo: 5 min. Tempo como mostrado. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Este protocolo demonstrou a formação e dissolução de condensados em telômeros com um sistema de dimerização química. Cinéticas de separação de fase e agrupamento de telômeros induzidos por gotículas são monitorados com imagens ao vivo. A localização e a composição do condensado são determinadas com DNA FISH e proteína IF.
Há dois passos críticos neste protocolo. A primeira é determinar a concentração de proteínas e dimerizer. O sucesso em induzir a separação de fase local em um lócus genômico depende do aumento da concentração local da fase que separa a proteína acima da concentração crítica para separação de fases (Figura 1B). A concentração global da fase que separa a proteína precisa ser alta o suficiente para que haja proteínas suficientes para se concentrar localmente. A concentração da proteína de separação de fase não pode ser muito alta para que a separação de fase global tenha ocorrido ou possa ser facilmente induzida. O comprimento do DNA da âncora (ou tamanho da cromatina modificada a que a proteína âncora se liga) e a concentração de proteína âncora fundida por Halo determinam o tamanho do centro de nucleação com eficiência máxima de dimerização. Quanto maior o tamanho da âncora, mais fácil é nuclear condensados. A eficiência de dimerização é afetada pela quantidade de dimerizadores em relação à quantidade de proteínas âncoras. Poucos dimerizers não podem ocupar todas as proteínas âncoras disponíveis, enquanto muitos dimerizers resultam em ligação não produtiva de eDHFR ao excesso de dimerizers em vez dos da proteína âncora. A concentração de dimerizer, juntamente com o comprimento do DNA da âncora e a concentração da proteína de âncora fundida por Halo, podem ser usadas para determinar a concentração crítica necessária para a separação de fases locais de nucleação. Uma abordagem sistemática para variar esses parâmetros (comprimento de DNA âncora, concentração de proteína âncora, concentração de proteína de separação de fase e concentração de dimerizer) pode ser usada para mapear um diagrama de fase multidimensional. No entanto, se o interesse não está no mapeamento do diagrama de fase, mas na formação de condensados associados à cromatina como demonstrado aqui, é muito fácil simplesmente escolher células com sinal halo-GFP brilhante (tamanho de âncora maior) e células com uma ampla gama de brilho para mCherry-eDHFR (várias fases que separam a concentração de proteína) à imagem com a concentração de dimerizador para dimerização máxima determinada no Protocolo 2.3. O segundo passo crítico é evitar fotobleaching em imagens ao vivo. Diferente da separação de fase global, onde gotículas (focos de mCherry brilhante rotulando a proteína de separação de fase) surgirão após a separação de fase, a condensação local em locais genômicos não pode ser facilmente detectada julgando a presença de focos mCherry. Isso porque o recrutamento da proteína sozinho, sem separação de fases, para loci genômico resultará na formação de focos locais mCherry. A separação de fases ocorre após o recrutamento, então os focos mCherry continuam a se tornar maiores e mais brilhantes após o recrutamento inicial. O enriquecimento induzido pela separação de fase pode ocorrer também no canal GFP (a proteína âncora), devido à dimerização da proteína âncora à proteína de separação de fase. Portanto, a mudança de propriedades físicas (tamanho e intensidade) dos focos ao longo do tempo, em vez da presença de focos, deve ser usada para julgar a separação de fases. Embora possa ser difícil diferenciar dimerização ou enriquecimento induzido por separação de fase de mCherry (proteína de presa), o enriquecimento de focos de GFP (proteína âncora) só ocorre se houver separação de fase (Figura 3D). Portanto, o enriquecimento da proteína âncora pode ser usado para julgar facilmente a separação de fases. Fotobleaching resultante de alto poder laser ou longo tempo de exposição durante a imagem torna mais difícil julgar a separação de fases de imagens ao vivo e, portanto, deve ser evitado o máximo possível ajustando as condições de imagem. Observe que os aumentos na intensidade e tamanho dos focos ao longo do tempo são características de LLPS, mas não podem ser usados como a única evidência para LLPS. No caso aqui apresentado, a fusão de gotículas foi utilizada como evidência para a formação de gotículas líquidas, o que pode não ocorrer para menor número de âncoras ou menos âncoras móveis. Sem a fusão de gotículas, outros métodos como a difusão de componentes condensados e a sensibilidade à perturbação de pequenas moléculas podem ser usados para confirmar ainda mais a formação de condensados8,9,11.
Embora este sistema de dimerização química torne a resolução temporal necessária para monitorar a separação de fases em células vivas, ele carece de resolução espacial no nível celular e subcelular. Graças ao design modular dos dimerizers, é possível fazer dimerizers sensíveis à luz anexando uma fotocagem ao TMP, tornando o fotosensível ou ambos12,32,35. Simplesmente alternando dimerizers dentro do mesmo fundo celular projetado para diferentes aplicações, alto controle espacial e temporal da dimerização, reversão da dimerização, ou ambos com luz podem ser alcançados. Imaginamos que com esses dimerizers sensíveis à luz, ele será capaz de controlar a separação de fases com alta precisão espacial e temporal. Em comparação com as ferramentas optogenéticas disponíveis para controlar a separação de fases através de proteínas sensíveis à luz36,37, uma desvantagem do sistema de dimerização química é que ele só pode reverter a separação de fase uma vez. No entanto, esse sistema pode manter o recrutamento sustentado e, portanto, a separação sem luz, o que o torna mais adequado para aplicações de imagem ao vivo de longo prazo, como acompanhar o crescimento de gotículas ou consequências celulares da separação de fases. Além disso, a capacidade de tratar uma população de células sem luz torna conveniente para ensaios bioquímicos como os necessários para determinar a composição do condensado ou mudanças na organização do genoma.
Este método pode ser facilmente adaptado para induzir condensados em outros locais do genoma. Pode-se simplesmente identificar uma proteína que se liga à localização genômica de interesse e fundi-la ao Halo para usá-la como âncora(Figura 1B). Alternativamente, pode-se combinar isso com CRISPR e fundir dCas9 ao Halo e usar o guia RNAs para ancorar halo ao loci genômico de interesse38. Além disso, pode-se ancorar halo a uma matriz de DNA ectópica (por exemplo, LacO) integrada ao genoma, fundindo halo à proteína de alvo (por exemplo, LacI). Pode-se então usar uma abordagem de baixo para cima para avaliar a capacidade de uma proteína de separar-se localmente na cromatina, como sua capacidade de separação de fase é afetada por truncações proteicas, mutações ou modificações pós-translacionais, ou como o condensado afeta funções locais como modificação da cromatina, replicação ou transcrição. Para resumir, este sistema de dimerização química pode ser usado para induzir uma ampla gama de condensados em vários locais de cromatina e é particularmente adequado para investigar como as propriedades materiais e a composição química de condensados associados à cromatina contribuem para as funções de cromatina, combinando imagens ao vivo de longo prazo com ensaios bioquímicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (1K22CA23763201 a H.Z., GM118510 a D.M.C.) e fundação Charles E. Kaufman para h.Z. Os autores gostariam de agradecer jason Tones por revisar o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
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