Megakaryocyt Kultur i 3D Methylcellulose-baserede Hydrogel at forbedre cellemodning og studere virkningen af stivhed og indespærring

Summary

Det er nu anerkendt, at de tre-dimensionelle miljø af celler kan spille en vigtig rolle i deres adfærd, modning og / eller differentiering. Denne protokol beskriver en tredimensionel cellekulturmodel designet til at studere virkningen af fysisk indeslutning og mekaniske begrænsninger på megakaryocytter.

Abstract

3D-miljøet, der fører til både indespærring og mekaniske begrænsninger, anerkendes i stigende grad som en vigtig faktor for celleadfærd. 3D-kulturen er således blevet udviklet for bedre at kunne nærme sig in vivo-situationen. Megakaryocytter skelner fra hæmatoopoietiske stamceller og stamfaderceller (HSPCs) i knoglemarven (BM). BM er en af de blødeste væv i kroppen, indespærret inde i knoglen. Knoglen er dårligt udvides på celleskalaen, megakaryocytter er samtidig udsat for en svag stivhed og høj indespærring. Denne protokol præsenterer en metode til inddrivelse af museperage negative (Lin-) HSPCs ved immunmagnetisk sortering og deres differentiering i modne megakaryocytter i et 3D-medium bestående af methylcellulose. Methylcellulose er ikke reaktivt over for megakaryocytter, og dens stivhed kan justeres til den normale knoglemarv eller øges for at efterligne en patologisk fibrotisk marv. Processen med at gendanne megakaryocytterne til yderligere celleanalyser er også beskrevet i protokollen. Selvom proplateletforlængelse forhindres i 3D-miljøet, er det beskrevet nedenfor, hvordan man genanvender megakaryocytterne i flydende medium og kvantificerer deres evne til at udvide proplatelets. Megakaryocytter dyrket i 3D hydrogel har en højere kapacitet til at danne proplatelets sammenlignet med dem, der dyrkes i et flydende miljø. Denne 3D-kultur gør det muligt i) at differentiere forfædre mod megakaryocytter nå en højere modning tilstand, ii) at generobre fænotyper, der kan observeres in vivo, men gå ubemærket hen i klassiske flydende kulturer, og iii) at studere transduktion veje induceret af de mekaniske signaler, som en 3D-miljø.

Introduction

Celler i kroppen oplever et komplekst 3D-mikromiljø og udsættes for samspillet mellem kemiske og mekanofysiske signaler, herunder stivhed fra væv og indespærring på grund af tilstødende celler og omgivende matrix ^1,2,3. Betydningen af stivhed og indespærring for celle adfærd er kun blevet anerkendt i de sidste årtier. I 2006 fremhævede det skelsættende værk fra Engler et al. ⁴ betydningen af det mekaniske miljø for celledifferentiering. Forfatterne viste, at variation i cellesubstrat stivhed resulterede i orientering af stamceller mod forskellige differentiering slægter. Siden da er virkningen af mekaniske signaler på celle skæbne og adfærd blevet mere og mere anerkendt og studeret. På trods af at det er et af organismens blødeste væv, har knoglemarven en 3D strukturel organisation, der er indespærret inde i knoglen. Marv stivhed, selv om teknisk vanskeligt at måle præcist, skønnes at ligge mellem 15 og 300 Pa ^5,6. Inden for stroma, celler er tæt begrænset til hinanden. Derudover migrerer de fleste af dem mod bihulekarrene for at komme ind i blodcirkulationen. Disse betingelser skaber yderligere mekaniske begrænsninger på tilstødende celler, som skal tilpasse sig disse kræfter. Mekaniske signaler repræsenterer et vigtigt parameter, hvis konsekvenser for megakaryocyt differentiering og proplatelet dannelse er for nylig blevet undersøgt. Selvom megakaryocytter kan differentiere in vitro i traditionel flydende kultur, når de ikke den grad af modning observeret in vivo, til dels på grund af fraværet af de mekaniske signaler fra 3D-miljøet ⁷. Voksende forfædre indlejret i hydrogel bringer 3D mekaniske signaler, der mangler i flydende miljø.

Hydrogels har været meget udbredt i flere årtier i det hæmatologiske område, især at dyrke celler i koloni danner assays at kvantificere hæmatopoietic forfædre. Sådanne hydrogeler er imidlertid sjældent blevet brugt til at udforske de biologiske virkninger af det 3D mekaniske miljø på modning og differentiering af hæmatoopoietiske celler. I løbet af de sidste par år har vores laboratorium udviklet en 3D-kulturmodel ved hjælp af en methylcellulosebaseret hydrogel ^8. Denne ikke-aktive fysiske gel er et nyttigt værktøj til at efterligne de fysiske begrænsninger i det indfødte megakaryocytmiljø. Den er afledt af cellulose ved udskiftning af hydroxylrester (-OH) med methoxidgrupper (-OCH₃). Både graden af methylsubstitution og methylcellulosekoncentrationen bestemmer hydrogelstivheden, når den har jellified. Under udviklingsfasen af denne teknik blev det påvist, at en Youngs modulus i intervallet 30 til 60 Pa er den optimale gelstivhed til megakaryocytvækst ⁹.

Følgende protokol beskriver en metode til at dyrke mus megakaryocytiske forfædre i en 3D methylcellulose hydrogel. Det har tidligere vist sig, at sammenlignet med standard flydende kultur øger denne hydrogelkultur graden af megakaryocyt polyploidisering, forbedrer modningen og intracellulær organisation og øger megakaryocytternes kapacitet til at udvide proplatelets, når de er suspenderet igen i et flydende medium ⁹. Dette manuskript beskriver i detaljer protokollen for isolering af musebenmarv Lin- celler og deres indlejring i en methylcellulose hydrogel til 3D-kultur samt kvantificeringen af deres evne til at producere proplatelets og inddrivelse af cellerne til yderligere analyser.

Protocol

Alle forsøg bør udføres i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle protokoller, der vises i videoen, blev gennemført i nøje overensstemmelse med EU-retten og anbefalingerne fra Etablissement Français du Sangs 'Review Board). En første version af denne protokol blev oprindeligt offentliggjort i 2018 i Metoder i Molekylærbiologi ⁸.

BEMÆRK: Figur 1 giver et skematisk billede af hele processen. Denne proces omfatter 1) knogle dissektion, marv hentning, og mekanisk isolering af marvceller, 2) magnetisk sortering af afstamning negative (Lin-) celler, 3) såning i flydende eller methylcellulose hydrogel, og 4) resuspension af megakaryocytter dyrket i 3D gel til undersøgelse af proplatelet dannelse i flydende medium.

1. Knoglesamling fra voksne mus

BEMÆRK: I dette afsnit er det vigtigt at minimere mikrobiel forurening.

1. Forbered et 15 mL rør til knogleopsamling med Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), der indeholder 1% af det samlede volumen af penicillin-streptomycin-glutamin (PSG) antibiotikum mix (penicillin 10000 U / mL, streptomycin 100000 μg / mL og L-glutamin 29,2 mg / mL).
   BEMÆRK: Hvis alle de anvendte mus har samme genotype, skal du samle alle knogler i det samme rør, der indeholder 1 mL DMEM - PSG 1% pr. Antal mus. Antibiotika er vigtige for at forhindre mulig bakteriespredning i løbet af knogleprøvetagningen.
2. Fyld et 50 mL rør med ethanol 70% for knogledesinfektion og en anden til skylning af instrumenter under proceduren. Brug steriliserede dissektionsinstrumenter.
3. Bedøve musene ved hjælp af isoflurane indånding (4%) og hurtigt gå videre til cervikal dislokation at aflive musene. Sænk hurtigt kroppen i 70% ethanol for at desinficere og undgå mikrobiel forurening.
4. Dissekerer hurtigt skinnebenet og lårbenene.
5. Brug en skalpel, skære væk epifyser af anklen side ende for skinnebenet og hoften side ende for lårbenet.
6. Fordyb knoglerne i et sekund i 70% ethanol, før nedsænke dem i DMEM medium indeholder 1% PSG.

2. Marv dissociation og Lin-celler isolation

BEMÆRK: Denne del af protokollen udføres under en laminar flow hætte. For en kultur er alle brøndene en del af det samme eksperiment og kan ikke betragtes som uafhængige biologiske replikerer. Cellerne fra alle mus er samlet for at sikre homogeniteten af alle brøndene og for at kunne sammenligne dem med hinanden og samtidig eliminere mulig inter-individuel variation. For uafhængige biologiske replikerer skal kulturen gentages.

1. Placer knoglerne i en petriskål og opstigning dem to gange i steril Dulbeccos fosfatbuffered saltvand (DPBS) for at fjerne potentielle forurenende stoffer.
2. Forbered DMEM - 1% PSG i et 50 mL rør.
   BEMÆRK: Giv 2 mL DMEM - 1% PSG pr. mus, der anvendes til forsøget.
3. Fyld en 5 mL sprøjte udstyret med en 21-gauge nål med DMEM - 1% PSG.
4. Hold knoglen med sammenkrump, før kun facet af nålen i knæsiden ende.
   BEMÆRK: Knæsidens epifyse skal forblive intakt fra dissektionen, hvilket efterlader et lille hulrum i midten, hvorigennem nålen skal indsættes. Den resterende epifysis vil opretholde knoglen fastgjort til nålen under skylning. Pas på ikke at indføre mere end facet i knoglen, da det kan squash og beskadige marven.
5. Tryk hurtigt på sprøjtestemplet for at skylle marven ud i et 50 mL-rør.
   BEMÆRK: For at undgå stænk og lette marv flush og befrielse placere den frie ende af knoglen på rørvæggen, nedsænket i DMEM - 1% PSG. I praksis er et volumen mellem 500 μL og 1 mL generelt tilstrækkeligt til at udstøde marven fra knoglen. Når marven er blevet totalt udstødt, er knoglen blevet hvid. I tilfælde af at marven ikke er blevet helt bortvist fra diafysen som bedømt af nogle resterende røde farve, er det muligt at gentage flush med frisk medium.
6. Gentag trin 2.4. og 2.5. for alle knogler, genopfyldning af 5 mL sprøjten med DMEM - 1% PSG hvis det er nødvendigt.
7. Brug den samme 5 ML sprøjte med 21-gauge nålen til at overføre den samlede mængde medium, der indeholder skyllet marv i runde bund 10 mL rør.
   BEMÆRK: Det er ikke absolut nødvendigt at skifte til et rundt bundet 10 mL rør, men det gør det lettere at gå videre til følgende dissociationstrin. Tøv ikke med at skifte sprøjte og/eller nål, hvis der er mistanke om smittefare.
8. Fortsæt til celle dissociation ved at aspirere og udvise medium og marv celler successivt to gange gennem en 21-gauge nål, tre gange gennem en 23-gauge og en gang gennem en 25-gauge nål.
   BEMÆRK: Undgå luftbobler, da det kan være skadeligt for cellerne.
9. Affjedringen overføres til 15 ML-rør.
10. Mål cellenummer og kontroller levedygtigheden ved hjælp af en automatiseret celletæller eller et cellekammer til manuel optælling i nærværelse af trypanblå for at udelukke døde celler.
11. Centrifugere de 15 ML rør i 7 min ved 300 x g. Brug en 1 mL overførsel pipette, forsigtigt pipette ud og kassere supernatant.
12. Isoler stamceller og stamfaderceller ved negativ immunmagnetisk sortering ved hjælp af et musehæmatopoietisk celleisolation kit.
    BEMÆRK: Formålet med denne cellesortering er at hente de celler, der er negative for alle udvælgelsesantistoffer (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) og dermed eliminere de celler, der allerede er involveret i en anden differentieringslinje end den megakarycytiske.
13. Efter sættets anvisninger skal cellulerede pellet i frisklavet M medium (PBS med 2% af det endelige volumen af fosterkvægsserum (FBS), EDTA 1 mM) i en koncentration på 1 × 10⁸ celler/mL og fordele suspensionen i runde bundede 5 mL polystyrenrør til et maksimalt volumen på 2 mL.
14. Tilsættes polystyrenrørene: normalt rotteserum i en koncentration på 50 μL/mL samt den biotinylerede antistofblanding (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) i en koncentration på 50 μL blanding pr. mL og homogeniseres ved forsigtigt at svirpe rørene.
    BEMÆRK: Disse antistoffer vil binde sig til celler, der allerede er engageret i en differentieringsvej undtagen den megakarycytiske vej.
15. Inkuber rørene på is i 15 minutter.
16. Tilsæt strøptavidin-belagt magnetiske perler i en koncentration på 75 μL/mL og homogenisere ved forsigtigt at svirpe rørene.
17. Inkuber igen på is i 10 minutter.
18. Om nødvendigt justeres til et endeligt volumen på 2,5 mL pr. rør med M medium.
19. Homogeniser affjedringen ved forsigtigt at svirpe røret lige før du placerer dem, uden deres hætter, inde i en magnet og vent i tre minutter.
    BEMÆRK: De celler, der allerede er engageret i en differentieringsvej og belagt med magnetiske perler, vil blive bevaret på rørets væg inde i magneten.
20. Inverter magnet og rør for at overføre rørindholdet til et nyt rundbundet 5 mL polystyrenrør.
    BEMÆRK: Tag ikke røret ud af magneten til overførslen; det gøres ved at vende magneten med røret stadig i. Brug en stabil bevægelse og ryst ikke røret.
21. Kassér det indledende rør, der indeholder uønskede magnetiske mærkede celler, og placer den nye uden hætte i magneten i yderligere tre minutter.
22. Hvis du fortsætter som i trin 2.20, overføres de isolerede Lin- celler til et nyt 15 mL rør.
    BEMÆRK: Hvis der er anvendt flere 5 ML polystyrenrør til de foregående trin, skal du samle alle cellerne i det samme 15 ML rør. De celler, der er genvundet efter cellesortering, er hæmatoopoietiske stamceller og forfædre. Tilstedeværelsen af thrombopoietin (TPO), den største fysiologiske regulator af megakaryopoiesis ¹⁰, vil lede celledifferentiering mod megakaryocytisk cellelinje.
23. Mål Lin- cellenummeret og levedygtigheden som i trin 2.10.
24. Beregn den krævede mængde celle suspension til centrifuge for at have 1 x 10⁶ levedygtige celler x Well Number, Well Number er antallet af brønde til frø per betingelse.
25. Forbered et rør pr. tilstand med den passende mængde celleaffjedring og centrifuge ved 300 x g i 7 min.
26. For flydende kulturer skal supernatanten kasseres og genbruge cellepillen i komplet kulturmedium (DMEM, PSG 1% af det endelige volumen, FBS 10% af det endelige volumen, hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL) for at opnå den endelige koncentration på 2 ×^{10 6} levedygtige celler/mL (svarende til 1 ×^{10 6} celler pr. 500 μL godt). Inkuberes cellerne ved 37 °C under 5% CO2. (= kulturdag 0)
    BEMÆRK: Se næste afsnit for methylcellulosekulturer For eksempel at forberede komplet kulturmedium til én brønd skal du bruge 435 μL DMEM, 50 μL på 100% FBS til 10% endelig, 5 μL på 100% PSG til 1% endelig, 5 μL på 10 000 U/mL for 100 U/mL-finale og 5 μL på 5 μg/mL TPO til 50 ng/mL endelig. 4-brønd eller 24-brønd kultur plader er typisk anvendes som deres brønd diameter er en god pasform til 500 μL behov pr godt.

3. Celleindlejring i methylcellulose hydrogel

BEMÆRK: Bemærk, at følgende protokol beskriver metoden til at opnå en enkelt brønd af hydrogel cellekultur, tilpasse sig antallet af brønde, der er nødvendige.

1. Optø 1 mL aliquots af 3% methylcellulose lageropløsning ved stuetemperatur. Forbered en separat ekstra aliquot af methylcellulose til sprøjtebelægning.
   BEMÆRK: Ved en koncentration på 3% forbliver methylcellulose flydende ved stuetemperatur (20-25 °C).
2. Coat en 1 mL Luer lås sprøjte udstyret med en 18-gauge nål med methylcellulose ved at trække 1 mL methylcellulose fra den ekstra aliquot. Helt udvise methylcellulose.
   BEMÆRK: Dette belægningstrin sikrer, at mængden af methylcellulose, der opsamles i trin 3.3, er nøjagtig.
3. Med den samme sprøjte og nål, men ved hjælp af en ny methylcellulose aliquot, tegne den passende mængde methylcellulose (Figur 2A).
   BEMÆRK: For at opnå en endelig koncentration på 2% methylcellulose i et sidste volumen på 500 μL pr. brønd kræves der 333 μL på 3% methylcellulose.
4. Forsigtigt fjerne nålen. Skru et Luer-låsestik på enden af sprøjtenvedhjælp af steriliserede sammenkrammer.
5. Fastgør en anden, ikke-belagt, 1 mL Luer låsesprøjte til Luer-låsestikket for at forbinde de to sprøjter sammen (Figur 2D).
   BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at belægge denne anden sprøjte.
6. Methylcellulosevolumenet fordeles ligeledes mellem de to sprøjter (figur 2E) og lægges til side indtil trin 3.11.
7. Det koncentrerede DMEM-kulturmedium forberedes således, at der i det endelige methylcellulosevolumen (trin 3.11) opnås en koncentration, der er identisk med den, der er identisk med det flydende kulturmedium for hver forbindelse (PSG 1% af det endelige volumen, FBS 10% af det endelige volumen, hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
   1. Der fremstilles 167 μL koncentreret kulturmedium pr. sidste brønd på 1 × 10⁶ celler. Denne mængde medium beregnes således, at der opnås en endelig methylcellulosekoncentration på 2%. Det samlede volumen i brønden vil være 500 μL (167 μL celleaffjedring i koncentreret kulturmedium + 333 μL methylcellulose), og alle komponenter vil have en koncentration, der er identisk med den i flydende brønde.
   2. For at forberede komplet kulturmedium til én brønd skal du f.eks. bruge 102 μL DMEM, 50 μL på 100% FBS til 10 % endelig, 5 μL på 100 % PSG til 1 % endelig, 5 μL på 10 000 U/mL til 100 U/mL-finale og 5 μL på 5 μg/mL TPO til 50 ng/mL-finale. Det giver et volumen på 167 μL, der anvendes til at genbruge cellerne, og ved tilsætning af 333 μL methylcellulose vil det endelige volumen være 500 μL.
8. Efter at have afsluttet centrifugeringstrin 2.26 skal supernatanten kasseres og genbruge cellepillen i det koncentrerede kulturmedium i et forhold på 1 × 10⁶ celler pr. 167 μL.
9. Tag sprøjterne tilbage, og afbryd en af dem fra stikket.
10. Pipette 167 μL af celleaffjedringen.
11. Tilsættes celleaffjedringen direkte i sprøjtestikket (Figur 2F), og sørg for ikke at indføre luftbobler.
    BEMÆRK: Når celleaffjedringen tilføjes, skal sprøjtestemplet langsomt tegnes samtidigt for at frigøre plads til celleaffjedringen.
12. Tilslut forsigtigt de to sprøjter (Figur 2G) uden at miste affjedring i skruetråden.
    BEMÆRK: Før gentilslutningen skal stemplet tegnes for at lade stikket være halvt tomt og give plads nok til, at den anden sprøjte kan tilsluttes, uden at affjedringen flyder over.
13. Homogeniser langsomt methylcellulosemediet med celleaffjedringen med ti frem og tilbage-stempelbevægelser mellem de to sprøjter (Figur 2H).
14. Træk det samlede volumen i en sprøjte, og frakobles de to sprøjter, så stikket er tomt.
15. Tøm indholdet af sprøjten i en brønd af en 4-brønds plade (Figur 2I).
16. Inkuber cellerne ved 37 °C under 5% CO₂ (= kulturdag 0).
    BEMÆRK: Det er muligt at tilberede to methylcellulose brønde med et par sprøjter. Forøg med to volumen af methylcellulose og mængden af celle suspension til at have 2 x10⁶ celler. Efter at have afsluttet trin 3.13. volumen fordeles ens mellem de to sprøjter, så den har 500 μL i hver af dem. Afbryd dem og tøm den uden stikket i en kultur godt. Tilslut sprøjterne igen for at overføre lydstyrken fra den, der holdt stikket til det andet. Frakoble sprøjterne, den ene med 500 μL bør ikke have stikket fastgjort, og frø cellerne i en anden kultur godt. De 3% methylcellulose købes som en lageropløsning i Iscoves Modified Dulbecco's Medium (IMDM), mens koncentrerede celler suspenderes i DMEM. Der er oprindeligt foretaget sammenlignende test for at sikre, at dette blandede medium ikke havde nogen indvirkning på eksperimentets udfald, især sammenlignet med den flydende kultur i 100% DMEM.

4. Cell Resuspension for Proplatelet Analyse

BEMÆRK: Analyse af evnen til at danne proplatelets skal udføres under sammenlignelige forhold mellem flydende og methylcellulose dyrkede megakaryocytter. De fysiske begrænsninger, der udøves af methylcellulose hydrogel hæmme proplatelet udvidelse. Derfor suspenderes methylcellulosedyrkede celler i frisk flydende medium på kulturdag 3 for at give dem mulighed for at udvide proplatelets. Methylcellulose hydrogel er en fysisk hydrogel, der let fortyndes ved flydende medium tilsætning. Det er vigtigt, at for at undgå artefakter fra resuspension og centrifugering skal celler i kontrolvæskemedietilstand behandles samtidigt på samme måde som methylcellulosedyrkede celler. Se eksperimentets skematiske repræsentation (figur 1).

1. Forbered 10 mL DMEM - 1% PSG forvarmet ved 37 °C i et 15 mL rør for hver brønd til resuspend.
2. Forsigtigt genbruge cellerne fra hver brønd i 10 mL af DMEM - 1% PSG.
   BEMÆRK: Gør forsigtigt flere op-og-ned bevægelser for at fortynde methylcellulose helt. For de flydende brønde sørg for at samle alle de celler deponeret i bunden af brønden.
3. Centrifuge rørene 5 min ved 300 × g.
4. I mellemtiden forberede komplet kultur medium (DMEM, PSG 1% af det endelige volumen, FBS 10% af det endelige volumen, hirudin 100 U / mL, TPO 50 ng / mL).
   BEMÆRK: På dette trin hver brønd er hentet til at blive fortyndet til det halve, derfor forberede 1 mL af komplet kultur medium pr godt.
5. Kassér supernatanten og genbrug cellepillen i 1 mL kulturmedium for hvert rør.
6. Reseed 500 μL celle suspension per brønd i en 4 eller 24-brønd plade og inkuberes ved 37 °C under 5% CO₂.
   BEMÆRK: Fra en indledende brønd, opnå 2 brønde til proplatelet visualisering i duplikat. Bemærk, at da disse dubletter stammer fra den samme prøve, kan de ikke betragtes som uafhængige replikeringer.
7. 24 timer efter reseeding, på dag 4 af kultur, tilfældigt erhverve 10 billeder pr godt ved hjælp af lyse feltmikroskopi og 20× mål.
   BEMÆRK: Cellerne har en tendens til at gruppere i midten af brønden, sørg for ikke at have for mange celler på marken, da det kan gøre proplatelet visualisering og kvantificering vanskelig. Sørg for at fange mindst 5 megakaryocytter pr. Felt.
8. Tæl det samlede antal megakaryocytter og megakaryocytter, der udvider proplatelets i hvert billede, og beregn andelen af megakaryocytter, der udvider proplatelets.
   BEMÆRK: Kvantificeringen er ikke automatiseret. udføre celletælling manuelt. Optælling kan lettes ved brug af celletæller plugin af ImageJ til at klikke på cellerne for at markere dem, som de tælles. 10 felter erhvervet pr brønd og brønde i duplikat repræsenterer ca 150-300 megakaryocytter per betingelse.

5. Cellefiksering og hentning til fremtidige analyser

ADVARSEL: Denne protokol bruger fikseringsmidler, som skal håndteres under en røghætte, iført beskyttelsesudstyr.

BEMÆRK: Målet er at bevare intakt gel begrænsninger anvendes på cellerne, indtil de er fuldt fast. Derfor, og uanset det anvendte fiksativ, skal det tilsættes i brønden oven på methylcellulose uden at forstyrre gelen. Den samme protokol anvendes på flydende kulturer.

1. Tilsæt et volumen af fiksativ opløsning svarende til den seedede volumen (500 μL i denne protokol), oven på methylcellulose uden at forstyrre gelen. Vent på det rette tidspunkt i henhold til det anvendte fiksativ (mindst 10 min).
   BEMÆRK: Den fiksative diffusion i hele gelen skal være meget hurtig som afsløret af en hurtig ændring i gelfarven (fra pink til en gul-orange skygge). Paraformaldehyd (8% i DPBS, 500 μL pr. Brønd) anvendes normalt til immunmærkning, mens glutaraldhehyd (5% i cacodylate buffer, 500 μL pr. Brønd) anvendes til elektronmikroskopianalyse.
2. Ved hjælp af en P1000 pipette forsigtigt gøre flere op-og-ned pipetter med fiksativ og gel for at homogent fortynde methylcellulose.
3. Brug den samme pipette og spids til at overføre al volumen fra brønden til et 15 ML rør, der indeholder 10 mL DPBS og homogeniseres.
4. Centrifugere blandingen ved 300 × g i 7 min.
   BEMÆRK: Et andet vasketrin kan være nødvendigt for at fjerne al methylcellulose
5. Kassér supernatanten og genbrug megakaryocyt pellet i det relevante medium i henhold til den ønskede analyse (immunmærkning, flowcytometri⁹, elektronmikroskopi ...) (for elektronmikroskopi se også papirmetoden "In situ udforskning af de vigtigste trin i megakaryopoiesis ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi" i dette JoVE-nummer).

Representative Results

Data, der er opnået ved hjælp af denne protokol, blev oprindeligt offentliggjort i Blood i 2016⁹.

Ifølge protokollen blev cellerne sået i enten flydende eller methylcellulose hydrogel medium. Celler i flydende medium har alle sedimenteret i bunden af brønden, i kontakt med den stive plastoverflade og engang med andre celler. I modsætning hertil fordeles celler indlejret i methylcellulose hydrogel homogent i gelen og isoleres fra naboceller (Figur 3A). Methylcellulosegel i en endelig koncentration på 2 % øger den gennemsnitlige megakaryocytdiameter en smule i forhold til den flydende kultur (figur 3B) i overensstemmelse med den højere rapporterede ploidy⁹. Derimod forringer en forøgelse af methylcellulosekoncentrationen med 0,5 % megakaryocytdifferentiering som vist ved en mindre middeldiameter (figur 3B).

En mærkbar forskel i megakaryocyt ultrastruktur observeres mellem megakaryocytter differentieret i flydende kultur og dem differentieret in vivo inden for knoglemarven. Et karakteristisk træk ved modne megakaryocytter er et komplekst intracytoplasmisk membrannetværk, DMS (Afgrænsning Membrane System), der tjener som reservoir for membranen af de fremtidige blodplader. I modne megakaryocytter DMS organiserer sig til at danne sammenflettede membranplader, der optager det meste af cytoplasmaet. Ved transmission elektronmikroskopi (TEM) synes de at være tæt apposed og afgrænse cytoplasmaiske territorier (Figur 3C øverste panel) (for TEM-proceduren, se papirmetoden "In situ udforskning af de vigtigste trin i megakaryopoiesis ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi" i samme JOVE Issue). I flydende kultur har DMS-membraner for det meste udseendet af små runde, ovale eller aflange vesikler uden afgrænsning af cytoplasmaiske territorier(Figur 3C-mellempanelet). I modsætning hertil fremmer 2% methylcellulosekultur tilrettelæggelsen af DMS i de fleste megakaryocytter, med membraner tæt apposed og afgrænser cytoplasmaiske territorier, der ligner den in situ (Figur 3C lavere panel). Dette resultat indikerer, at 2% methylcellulose hydrogel kultur giver mulighed for bedre megakaryocyt differentiering på grund af de mekaniske begrænsninger af miljømediet.

Efter celleoverførsel til flydende medium på dag 3 begynder megakaryocytter at udvide proplatelets efter 4 timer ⁹. Figur 4 viser kvantificeringen af andelen af megakaryocytter, der har forlænget proplatelets 24 timer efter resuspension i flydende miljøer. Ti billeder blev tilfældigt erhvervet pr brønd, ved hjælp af lyse feltmikroskopi og 20× mål (Figur 4A). Kvantificeringen blev udført blindt og manuelt ved hjælp af celletæller-plugin på Fiji (ImageJ) (Figur 4B). Fordi disse er primære cellekulturer, er der en variation mellem eksperimenter, men protokollen forbliver robust og tilbyder en god reproducerbarhed. I flydende prækulturtilstand bør proplatelet-andelen være mellem 10% og 20%, mens denne andel fordobles for hydrogel-prækulturen.

Figur 1. Skematisk repræsentation af hele processen. Knogler dissekeres ud, marv skylles ud og celler adskilles mekanisk. Stamceller og stamfaderceller af interesse (Lin- celler) isoleres ved en immunmagnetisk negativ sorteringsprocedure og sået i enten flydende eller hydrogel medium (dag 0). På kulturdag 3 (som i alt repræsenterer en varighed på 4 dage) suspenderes begge betingelser i separate friske flydende kulturmiljø. Dette andet dyrkningstrin udføres fra dag 3 til dag 4 af kultur. Andelen af MKs, der udvider proplatelets, måles på kultur dag 4. For visuel klarhed er en celle skematiseret pr. Brønd. Den blå cirkel skildrer en enkelt celle med sin kerne i lilla. I det sidste trin er begge MKs repræsenteret med proplatelet. Andelen af MKs danner proplatelets varierer afhængigt af flydende eller methylcellulose pre-kultur. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Celleindlejring i methylcellulose hydrogel. Efter forbelægning af sprøjtevæggen, (A) tegne den passende mængde methylcellulose; (B, C) frakoble nålen og skrue et stik på sprøjten; (D) skub methylcellulose halvvejs gennem stikket og fastgør en anden sprøjte (E) fordele methylcellulose ligeligt mellem de to sprøjter og afbryde dem (F) tilsættes celleaffjedringen til sprøjten, der bærer stikket (G) tilslut de to sprøjter igen (H) homogenisere ved at skubbe hele volumen fra den ene sprøjte til den anden et par gange; (I) så cellerne ved at udstøde hele volumen i en kulturskål. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Megakaryocyt egenskaber i henhold til kulturtilstand. (A) Repræsentative billeder af megakaryocytter på dag 3 af kultur i væske (venstre panel) eller 2% methylcellulose hydrogel medium (højre panel). Skalastang = 50 μm (B) Middeldiameter af megakaryocytter dyrket i flydende medium eller i 2% eller 2,5% methylcellulose hydrogel. Resultaterne udtrykkes som den gennemsnitlige ± SD i 3 uafhængige kulturer, med i alt mindst 100 megakaryocytter undersøgt. *, P<0,05, ***P < 0,0001, ved hjælp af 1-vejs analyse af varians (ANOVA) med Bonferroni's multiple sammenligning test. (graf tilpasset fra Aguilar et al. 2016) (C) Skematisk visning (venstre) og repræsentative elektroniske mikroskopibilleder (i midten) af murine megakaryocytter; højre paneler, tæt på udsigt fra de hvide firkanter (skalastang = 5 μm for de midterste elektroniske mikroskopibilleder og 2 μm for nærbilleder). Øvre paneler er in situ megakaryocytter, midten repræsenterer megakaryocytter dyrket in vitro i flydende kultur og lavere paneler er megakaryocytter dyrket i 3D methylcellulose hydrogel. Disse data blev oprindeligt offentliggjort i Blood Journal, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_9⁵. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Repræsentative resultater af proplatelet kvantificering. (A) repræsentative billeder af megakaryocytter på dag 4 af kultur. Cellerne blev inkuberet tre dage i væske (venstre) eller 2% methylcellulose hydrogel medium (højre) efterfulgt af en dags resuspension i flydende medium. Sorte pile angiver megakaryocytter, der udvider proplatelets. (Skalalinje = 50 μm). (B) Repræsentative kvantificeringsdata for proplateletdannelse. Proplatelet dannelse kvantificeret på dag 4 for megakaryocytter tidligere præ-dyrkede fra dag 0 til dag 3 i flydende eller 2% methylcellulose hydrogel medium. Resultaterne udtrykkes som % af megakaryocytter, der udvider proplatelets (gennemsnit ± SD) og er fra 3 uafhængige eksperimenter, med et samlet antal megakaryocytter undersøgt pr. tilstand >750 (t-test, p = 0,0023). Den gennemsnitlige andel af megakaryocytter, der strækker proplatelets, er 16% i flydende tilstand og 39% for methylcellulose hydrogel pre-culture. Dette resultat svarer til den tidligere påviste og offentliggjorte effekt af hydrogel pre-culture, der øger proplatelet dannelse i forhold til flydende tilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I det foregående årti har mekanobiologi rejst mere og mere interesse for mange områder af biologi. Det er nu almindeligt anerkendt, at det mekaniske miljø omkring cellerne spiller en rolle i deres adfærd, understreger vigtigheden af at studere, hvordan megakaryocytter forstand og reagere på ekstracellulære mekaniske signaler. Det er udfordrende præcist at måle stivheden af knoglemarvsvævet in situ¹¹, især hvis vi betragter den hæmatopoietiske røde marv, da den er placeret inde i trabekulære knogler hos store pattedyr, mens den lettere tilgængelige marv fra diafysen hovedsagelig består af adipocytter (gul marv)¹². I tilfælde af en isoleret marv fra mus, hvor diafyse i det væsentlige indeholder rød marv, er et andet problem, at når det er ekstraheret fra knoglen, forbliver vævet ikke sammenhængende. Shin og samarbejdspartnere formåede imidlertid at måle mus diaphysis marv stivhed ved hjælp af atomprøven mikroskopi og fundet en værdi af E_marv = 0,3 ± 0,1 kPa, som placerer marven blandt de blødeste væv⁶.

Interessen for den procedure, der er beskrevet her, er at sammenligne megakaryocyt adfærd i flydende medium til den i hydrogel. I flydende miljø har cellerne alle sedimenteret i bunden af brønden, i kontakt med den stive plastoverflade og engang med andre celler. I modsætning hertil fordeles celler indlejret i methylcellulosehydroxidgel homogent i gelen og er fuldt isoleret fra de andre celler (Figur 3A). De underkastes derfor hovedsagelig mekaniske signaler fra indespærringen, bortset fra sammenstillingskommunikation. Parakrine stimulation kan ikke helt udelukkes. Ikke desto mindre er cellerne indlejret i methylcellulose hydrogel fjernt fra hinanden i modsætning til situationen i knoglemarven, og vi kan således antage, at hvis udskillede stoffer når naboceller, kan de blive meget fortyndet.

Metoden er nem at sætte op og kræver ikke specifikke færdigheder. Methylcellulose er en fysisk gel, hvis polymerkæder danner ikke-kovalente krydsforbindelser. At være flydende ved lav temperatur, det gelalfies, når du øger temperaturen (se artiklen fra Aguilar et al. 2016⁹ for mere information om karakteriseringen af gelens mekaniske egenskaber). Denne geltilstand kan let vendes efter fortynding i vandig opløsning, hvilket muliggør en nem genopretning af cellerne, uanset om den er fastgjort i gel eller som levende celler.

En kritisk faktor her er stivheden af hydrogel. Den passende methylcellulosevolumen bør meget præcist udleveres, da selv en lille ændring i hydrogelkoncentrationen kan have en vigtig indvirkning på miljøets stivhed og dermed på megakaryocytmodning. For eksempel blev det tidligere vist, at stigende methylcellulosekoncentration fra 2 til 2,5% øgede gelstivheden (Youngs modulus) med 10 gange. En mulig faldgrube er, at der ikke er nogen nem kvalitetskontrol til at kontrollere præcise rheologiske egenskaber af methylcellulose i hver eksperimentel brønd, når den er blevet sået med celler. Ikke desto mindre er et væsentligt kriterium, der vil berolige om en korrekt gelkoncentration, den korrekte modning af megakaryocytterne i hydrogelen, hvilket afspejles af deres store størrelse stort set ligner den i flydende medium. Et fald i deres gennemsnitlige diameter kan afspejle en defekt differentiering svarende til, hvad der sker, når stivheden øges med 2,5 % methylcellulose (figur 3B).

En anden begrænsning af metoden er, at cellegendannelse fra hydrogel tager længere tid end i den klassiske kultur, da det er nødvendigt først at fortynde gelen før centrifugering. Hvis methylcellulose skal fjernes fuldstændigt, for eksempel for at opnå cellelysat til yderligere vestlig blot eller RNA-isolationsprocedure, kan der være behov for et ekstra vasketrin, i hvilken periode der kan forekomme ændringer i proteiner eller RNA (proteindephorylation, RNA-nedbrydning ...).

Et kritisk punkt at overveje i proceduren er det celleantal, der skal være ens under hvert forhold. Dette er ikke så trivielt, da celler i væskekulturen har tendens til at sediment i bunden af brønden, og nogle af dem klæber på plastoverfladen, hvilket ikke er tilfældet for celler i suspension i hydrogel. En faldgrube er en ufuldstændig samling af cellerne i flydende tilstand, hvilket resulterer i et andet celleindhold mellem "flydende" og "hydrogel" tilstand efter suspension i flydende medium på dag 3. En sådan forskel kan føre til uoverensstemmelser i de endelige data. Som et kontrolpunkt kan en celle numeration gøres på dette stadium, før reseeding cellerne. Det er at foretrække at gøre det manuelt ved hjælp af en Nageotte hæmocytometer, da det er især velegnet til større celler såsom megakaryocytter.

Hvad angår enhver primær cellekultur, er der en mulig risiko for forurening. Forurening er den mest sandsynlige forklaring på en usædvanlig lav proplatelet andel i methylcellulose prækultur tilstand, som en lille forurening synes vanskeligere at opdage end i flydende medium. Derfor kan det gå ubemærket hen, indtil proplatelet kvantificering, hvilket fører til vildledende resultater. God laboratoriepraksis skal overholdes nøje, især under indkapsling af methylcelluloseceller, der kræver talrige og præcise manipulationer af sprøjter og stik. Megakaryocyt levedygtighed bør også kontrolleres med Trypan blå ved hjælp af en Nageotte celle kammer til manuel optælling før reseeding på dag 3.

Samlet set beskriver protokollen her en in vitro-model til sammenligning mellem klassisk flydende kultur og en 3D-kultur ved hjælp af methylcellulose hydrogel. Bemærk at denne kulturprotokol er beskrevet for mus primary Lin^- celler og er endnu ikke blevet tilpasset menneskelige celler. Denne 3D-model er et nyttigt værktøj til at undersøge virkningen af det mekaniske miljø på megakaryocyt adfærd og modning⁹. Det er også muligt at tilføje forbindelser i kulturen (selv på gelen) for at studere påvirkningen af lægemidler på megakaryocyt adfærd / modning og proplatelet dannelse. Endelig, ved at reproducere de mekaniske begrænsninger, som celler kan støde på i knoglemarven, giver dette kultursystem mulighed for undersøgelse af unormale fænotyper, der ikke kunne observeres i klassiske flydende kulturer, som tidligere viste for Myh9 knockout megakaryocytter^9,13,14.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge needles	Sigma-Aldrich	1001735825
21-gauge needles	BD Microlance	301155
23-gauge needles	Terumo	AN*2332R1
25-gauge neeldes	BD Microlance	300400
4-well culture dishes	Thermo Scientific	144444
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
Cytoclips	Microm Microtech	F/CLIPSH
Cytofunnels equiped with filter cards	Microm Microtech	F/JC304
Cytospin centrifuge	Thermo Scientific		Cytospin 4
Dakopen	Dako
DMEM 1x	Gibco, Life Technologies	41 966-029
DPBS	Life Technologies	14190-094	Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline
EasySep magnets	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit	Stem Cell Technologies	19856A	biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads
EDTA	Invitrogen	15575-020
Fetal Bovine Serum	Healthcare Life Science	SH30071.01
Luer lock 1 mL syringes	Sigma-Aldrich	Z551546-100EA	or 309628 syringes from BD MEDICAL
Luer lock syringes connectors	Fisher Scientific	11891120
MC 3%	R&D systems	HSC001
Polylysin coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Rat serum	Stem Cell Technologies	13551
Recombinant hirudin	Transgène	rHV2-Lys47
Recombinant human trombopoietin (rhTPO)	Stem Cell Technologies	2822	10,000 units/mL
Round bottomed 10 mL plastique tubes	Falcon	352054
Round bottomed 5 mL polystyrene tubes