Summary
अब यह स्वीकार किया गया है कि कोशिकाओं का त्रि-आयामी वातावरण उनके व्यवहार, परिपक्वता और/या भेदभाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है । यह प्रोटोकॉल मेगाकारियोसाइट्स पर भौतिक रोकथाम और यांत्रिक बाधाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किए गए एक त्रि-आयामी सेल संस्कृति मॉडल का वर्णन करता है।
Abstract
कारावास और यांत्रिक बाधाओं दोनों के लिए अग्रणी 3 डी वातावरण तेजी से सेल व्यवहार के एक महत्वपूर्ण निर्धारक के रूप में पहचाना जाता है । इस प्रकार वीवो की स्थिति में बेहतर दृष्टिकोण के लिए 3 डी संस्कृति विकसित की गई है । मेगाकारियोसाइट्स बोन मैरो (बीएम) में हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) से अंतर करते हैं। बीएम शरीर के सबसे नरम ऊतकों में से एक है, जो हड्डी के अंदर सीमित है। कोशिका पैमाने पर हड्डी खराब उत्तेजित हो रही है, मेगाकारियोसाइट्स एक कमजोर कठोरता और उच्च कारावास के अधीन हैं। यह प्रोटोकॉल इम्यूनो-मैग्नेटिक सॉर्टिंग द्वारा माउस वंश नकारात्मक (लिन-) एचएसपीसीएस की वसूली के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है और मिथाइलसेल्यूलोस से बने 3 डी माध्यम में परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स में उनका भेदभाव करता है। मिथाइलसेल्यूलोस मेगाकैरियोसाइट्स के प्रति अट्रैक्टिव है और इसकी कठोरता को सामान्य अस्थि मज्जा में समायोजित किया जा सकता है या पैथोलॉजिकल फाइब्रोटिक मैरो की नकल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। आगे सेल विश्लेषण के लिए मेगाकारियोसाइट्स को ठीक करने की प्रक्रिया भी प्रोटोकॉल में विस्तृत है। यद्यपि प्रोपलेटर एक्सटेंशन को 3 डी परिवेश के भीतर रोका जाता है, लेकिन इसे नीचे वर्णित किया गया है कि तरल माध्यम में मेगाकरियोसाइट्स को फिर से कैसे रीसस्लपेंड किया जाए और प्रोपलेटलेट्स का विस्तार करने की उनकी क्षमता की मात्रा निर्धारित की जाए। 3 डी हाइड्रोगेल में उगाए जाने वाले मेगाकारियोसाइट्स में तरल परिवेश में उगाए गए लोगों की तुलना में प्रोपलेटलेट बनाने की क्षमता अधिक होती है। यह 3 डी संस्कृति आई) को एक उच्च परिपक्वता राज्य तक पहुंचने वाले मेगाकार्योसाइट्स की ओर जनकों में अंतर करने की अनुमति देती है, द्वितीय) जो वीवो में मनाया जा सकता है, लेकिन शास्त्रीय तरल संस्कृतियों में किसी का ध्यान नहीं जाता है, और iii) एक 3 डी पर्यावरण द्वारा प्रदान किए गए यांत्रिक संकेतों द्वारा प्रेरित ट्रांसडक्शन रास्ते का अध्ययन करने के लिए।
Introduction
शरीर की कोशिकाएं एक जटिल 3 डी माइक्रोएनवायरमेंट का अनुभव करती हैं और उन्हें रासायनिक और मशीनोभिक संकेतों के बीच परस्पर क्रिया के अधीन किया जाता है जिसमें ऊतक से कठोरता और पड़ोसी कोशिकाओं और आसपास के मैट्रिक्स 1, 2,3के कारण कारावास शामिल है । कठोरता और सेल व्यवहार के लिए कारावास के महत्व को केवल पिछले दशकों में मांयता प्राप्त किया गया है । 2006 में, एंगलर एट अल 4 से मौलिक कार्य ने सेल भेदभाव के लिए यांत्रिक वातावरण के महत्व पर प्रकाश डाला। लेखकों ने दिखा दिया कि सेल सब्सट्रेट कठोरता में भिन्नता के परिणामस्वरूप विभिन्न भेदभाव वंशों की ओर स्टेम कोशिकाओं का अभिविन्यास हुआ। तब से, सेल भाग्य और व्यवहार पर यांत्रिक संकेतों का प्रभाव तेजी से पहचाना और अध्ययन किया गयाहै। बावजूद इसके जीव के नरम ऊतकों में से एक होने के बावजूद, बोन मैरो में एक 3 डी संरचनात्मक संगठन है जो हड्डी के अंदर सीमित है। मैरो कठोरता, हालांकि तकनीकी रूप से ठीक मापने के लिए मुश्किल है, 15 और 300 पीए 5,6केबीच झूठ होने का अनुमान है। स्ट्रोमा के भीतर कोशिकाएं कसकर एक-दूसरे तक सीमित हो जाती हैं। इसके अलावा, उनमें से अधिकांश रक्त परिसंचरण में प्रवेश करने के लिए साइनसॉयड वाहिकाओं की ओर पलायन कर रहे हैं। ये स्थितियां आसन्न कोशिकाओं पर अतिरिक्त यांत्रिक बाधाएं पैदा करती हैं, जिन्हें इन ताकतों के अनुकूल होना पड़ता है । यांत्रिक संकेत एक महत्वपूर्ण पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनके मेगाकार्योसाइट भेदभाव और प्रोपलेटलेट गठन पर परिणाम अभी हाल ही में खोजे गए हैं। यद्यपि मेगाकारियोसाइट्स पारंपरिक तरल संस्कृति में विट्रो में अंतर कर सकते हैं, वे 3 डी पर्यावरण 7से यांत्रिक संकेतों की अनुपस्थिति के कारण वीवो मेंदेखी गई परिपक्वता की डिग्री तक नहीं पहुंचते हैं। हाइड्रोगेल में एम्बेडेड बढ़ते जनक 3डी मैकेनिकल संकेत लाते हैं जिनमें तरल परिवेश की कमी होती है।
हेमेटोपोइटिक प्रोजेनिटर की मात्रा निर्धारित करने के लिए कॉलोनी में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए, विशेष रूप से हेमेटोपोइटिक जनकों को निर्धारित करने के लिए कॉलोनी में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए हाइड्रोगेल का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। हालांकि, इस तरह के हाइड्रोगेल का उपयोग शायद ही कभी 3 डी यांत्रिक वातावरण के परिपक्वता और हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं के भेदभाव पर जैविक प्रभाव का पता लगाने के लिए किया गया हो। पिछले कुछ वर्षों में हमारी प्रयोगशाला ने मिथाइलसेल्यूलोस आधारित हाइड्रोजेल 8 का उपयोग करके एक 3डी संस्कृति मॉडल विकसित किया है। यह अट्रैक्टिव फिजिकल जेल देशी मेगाकैरियोसाइट पर्यावरण की शारीरिक बाधाओं की नकल करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। यह मेथोक्साइड समूहों (-ओएच3)द्वारा हाइड्रोक्सिल अवशेषों (-ओह) के प्रतिस्थापन द्वारा सेल्यूलोज से लिया गया है। मिथाइल प्रतिस्थापन और मिथाइलसेलुलोस एकाग्रता की डिग्री दोनों ही एक बार जेलीफाइड होने के बाद हाइड्रोगेल कठोरता निर्धारित करते हैं। इस तकनीक के विकास चरण के दौरान, यह प्रदर्शित किया गया था कि 30 से 60 पीए की सीमा में एक युवा का मॉड्यूलस मेगाकरियोसाइट विकास 9के लिए इष्टतम जेल कठोरता है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल 3 डी मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोगेल में माउस मेगाकारियोसाइटिक प्रोजेनिटर विकसित करने की विधि का वर्णन करता है। यह पहले से दिखाया गया है कि मानक तरल संस्कृति की तुलना में, यह हाइड्रोगेल संस्कृति मेगाकार्योसाइट पॉलीप्लाइडाइजेशन की डिग्री बढ़ाती है, परिपक्वता और इंट्रासेलुलर संगठन में सुधार करती है, और एक बार तरल माध्यम 9में पुनर्निर्प्स करने के लिए मेगाकारियोसाइट्स की क्षमता को बढ़ाती है। इस पांडुलिपि में माउस बोन मैरो लिन − कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल और 3 डी संस्कृति के लिए मिथाइलसेल्यूलोस हाइड्रोगेल में उनके एम्बेडिंग के साथ-साथ प्रोपलेट्स का उत्पादन करने की उनकी क्षमता का मात्राकरण और आगे के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं की वसूली का विस्तार से वर्णन किया गया है।
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Protocol
प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुपालन में सभी प्रयोग किए जाने चाहिए । वीडियो में प्रदर्शित सभी प्रोटोकॉल यूरोपीय कानून और Etablissement फ्रांस्वा डु गाया (EFS) की समीक्षा बोर्ड की सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार किया गया । इस प्रोटोकॉल का पहला संस्करण मूल रूप से आणविक जीव विज्ञान 8में विधिओं में 2018 में प्रकाशित किया गया था।
नोट: चित्रा 1 पूरी प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध दृश्य प्रस्तुत करता है । इस प्रक्रिया में 1) अस्थि विच्छेदन, मज्जा पुनर्प्राप्ति, और मज्जा कोशिकाओं का यांत्रिक अलगाव, 2) वंश नकारात्मक (लिन-) कोशिकाओं की चुंबकीय छंटाई, 3) तरल या मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोगेल में सीडिंग, और 4) तरल माध्यम में प्रॉलेट गठन की जांच के लिए 3 डी जेल में उगाए गए मेगाकारियोसाइट्स का पुन: निलंबन शामिल है।
1. वयस्क चूहों से हड्डी संग्रह
नोट: इस खंड में, माइक्रोबियल संदूषण को कम करना महत्वपूर्ण है।
- दुलबेक्को के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) के साथ हड्डी संग्रह के लिए 15 एमएल ट्यूब तैयार करें जिसमें पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामिन (पीएसजी) एंटीबायोटिक मिक्स (पेनिसिलिन 10000 यू/एमएल, की कुल मात्रा का 1% होता है, स्ट्रेप्टोमाइसिन 100000 μg/mL और एल-ग्लूटामिन 29.2 मिलीग्राम/एमएल) ।
नोट: यदि उपयोग किए गए सभी चूहों में एक ही जीनोटाइप है, तो डीएमईएम के 1 मिलीएल युक्त एक ही ट्यूब में सभी हड्डियों को पूल करें - पीएसजी 1% चूहों की संख्या प्रति। एंटीबायोटिक्स हड्डी के नमूने के समय के दौरान संभावित बैक्टीरिया प्रसार को रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैं। - हड्डी कीटाणुशोधन के लिए इथेनॉल 70% के साथ एक 50 एमएल ट्यूब भरें और प्रक्रिया के दौरान उपकरणों को कुल्ला करने के लिए एक और। निष्फल विच्छेदन उपकरणों का उपयोग करें।
- आइसोफ्लुनेलिएंस साँस लेना (4%) का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें और चूहों को इच्छामृत्यु देने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के लिए तेजी से आगे बढ़ें। तेजी से कीटाणुरहित और माइक्रोबियल संदूषण से बचने के लिए 70% इथेनॉल में शरीर विसर्जित करें।
- तेजी से टिबिया और फीमर को काटना।
- एक स्केलपेल का उपयोग करके, टिबिया के लिए टखने की ओर के अंत के एपिफिसिस को काट दें और फीमर के लिए कूल्हे की ओर अंत करें।
- 1% पीएसजी वाले डीएमईएम माध्यम में विसर्जित करने से पहले 70% इथेनॉल में एक सेकंड के लिए हड्डियों को विसर्जित करें।
2. मज्जा वियोजन और लिन कोशिकाओं अलगाव
नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा एक लैमिनार प्रवाह हुड के तहत किया जाता है। एक संस्कृति के लिए, सभी कुएं एक ही प्रयोग का हिस्सा हैं और स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति के रूप में नहीं माना जा सकता है। सभी चूहों से कोशिकाओं को एक साथ जमा करने के लिए सभी कुओं की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए और संभव अंतर व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता को नष्ट करते हुए एक दूसरे से तुलना करने में सक्षम होने के लिए कर रहे हैं । स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति के लिए, संस्कृति को दोहराया जाना चाहिए।
- हड्डियों को पेट्री डिश में रखें और संभावित संदूषकों को हटाने के लिए बाँझ डल्बेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डीपीबीएस) में उन्हें दो बार उठें।
- डीएमईएम तैयार करें - 50 एमएल ट्यूब में 1% पीएसजी।
नोट: प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों में डीएमईएम - 1% पीएसजी प्रदान करें। - डीएमईएम - 1% पीएसजी के साथ 21 गेज सुई से लैस 5 एमएल सिरिंज भरें।
- संदंश के साथ हड्डी को पकड़ें, घुटने के किनारे के अंत में सुई के केवल बेवेल का परिचय दें।
नोट: घुटने की ओर एपिफिसिस विच्छेदन से बरकरार रहना चाहिए, इसके केंद्र में एक छोटी सी गुहा छोड़ने के माध्यम से जो सुई डालने के लिए । शेष एपिफिसिस फ्लशिंग के दौरान सुई से जुड़ी हड्डी को बनाए रखेगा। सावधान रहें कि हड्डी में बेवेल से अधिक परिचय न दें क्योंकि यह स्क्वैश और मैरो को नुकसान पहुंचा सकता है। - जल्दी से सिरिंज प्लंजर प्रेस करने के लिए एक ५० एमएल ट्यूब में बाहर मैरो फ्लश ।
नोट: बौछार से बचने और मज्जा फ्लश और मुक्ति की सुविधा के लिए ट्यूब की दीवार पर हड्डी के मुक्त अंत जगह, DMEM में डूबे -1% PSG । व्यवहार में, 500 माइक्रोन और 1 मिलील के बीच की मात्रा आम तौर पर हड्डी से मज्जा को निष्कासित करने के लिए पर्याप्त है। जब मज्जा पूरी तरह से निष्कासित कर दिया गया है, तो हड्डी सफेद हो गई है। यदि मैरो को डायफिसिस से पूरी तरह से निष्कासित नहीं किया गया है जैसा कि कुछ शेष लाल रंग द्वारा आंका गया है, तो ताजा माध्यम के साथ फ्लश दोहराना संभव है। - चरण 2.4 दोहराएं। और 2.5. सभी हड्डियों के लिए, डीएमईएम के साथ 5 एमएल सिरिंज को फिर से भरना - यदि आवश्यक हो तो 1% पीएसजी।
- गोल तली 10 एमएल ट्यूबों में फ्लश मैरो युक्त मध्यम की कुल मात्रा को स्थानांतरित करने के लिए 21 गेज सुई के साथ एक ही 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करें।
नोट: एक गोल तली 10 एमएल ट्यूब पर स्विच करना बिल्कुल आवश्यक नहीं है लेकिन यह निम्नलिखित वियोजन चरणों में आगे बढ़ना आसान बनाता है। यदि संदूषण का खतरा होने की आशंका है तो सिरिंज और/या सुई बदलने में संकोच न करें । - एक 21 गेज सुई के माध्यम से लगातार दो बार मध्यम और मज्जा कोशिकाओं को निष्कासित करके कोशिका विच्छेदन के लिए आगे बढ़ें, एक 23 गेज के माध्यम से तीन बार और एक बार एक 25 गेज सुई के माध्यम से ।
नोट: हवा के बुलबुले से बचें क्योंकि यह कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकता है। - निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- सेल नंबर को मापें और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए ट्राइपैन ब्लू की उपस्थिति में मैनुअल गिनती के लिए स्वचालित सेल काउंटर या सेल चैंबर का उपयोग करके व्यवहार्यता की जांच करें।
- 300 x ग्रामपर 7 मिनट के लिए 15 एमएल ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। 1 एमएल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके, सावधानी से बाहर निकालें और सुपरनैट को त्यागें।
- माउस हेमेटोपोइटिक सेल आइसोलेशन किट का उपयोग करके नकारात्मक इम्यूनोमैग्नेटिक छंटाई द्वारा स्टेम और जनक कोशिकाओं को अलग करें।
नोट: इस सेल छंटाई का उद्देश्य उन कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करना है जो सभी चयन एंटीबॉडी (सीडी 5, सीडी11बी, सीडी 19, सीडी 45आर/बी220, Ly6G/C (जीआर-1), TER119, 7-4) के लिए नकारात्मक हैं और इसलिए उन कोशिकाओं को खत्म करना है जो पहले से ही मेगाकार्योटिक के अलावा अन्य भेदभाव वंश में लगे हुए हैं। - किट निर्देशों के बाद, ताजा तैयार एम माध्यम में सेलुलर गोली को फिर से खर्च करें (भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), EDTA 1 mM) की अंतिम मात्रा के 2% के साथ 1 × 108 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के साथ सेलुलर गोली को फिर से खर्च करें और राउंड बॉटमेड 5 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूब्स में निलंबन को 2 एमएल की अधिकतम मात्रा में वितरित करें ।
- पॉलीस्टीरिन ट्यूब में जोड़ें: 50 μL/एमएल की एकाग्रता पर सामान्य चूहा सीरम के साथ-साथ बायोटिनाइलेटेड एंटीबॉडी मिक्स (सीडी 5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C (Gr-1), TER119, 7-4) मिश्रण के ५० माइक्रोन की एकाग्रता पर प्रति mL और धीरे से ट्यूबों flicking द्वारा समरूप ।
नोट: ये एंटीबॉडी मेगाकारियोसाइटिक मार्ग को छोड़कर पहले से ही भेदभाव मार्ग में लगी कोशिकाओं को बांध देंगे। - 15 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
- 75 माइक्रोन/एमएल की एकाग्रता पर स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोती जोड़ें और धीरे से ट्यूबों को फ्लिकिंग करके समरूप करें।
- 10 मिनट के लिए बर्फ पर फिर से इनक्यूबेट ।
- यदि आवश्यक हो, तो एम माध्यम के साथ प्रति ट्यूब 2.5 एमएल की अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
- उन्हें रखने से पहले धीरे से ट्यूब को फ्लिकिंग करके निलंबन को समरूप करें, उनकी टोपियां के बिना, एक चुंबक के अंदर और तीन मिनट तक प्रतीक्षा करें।
नोट: पहले से ही एक भेदभाव मार्ग में लगे कोशिकाओं और चुंबकीय मोतियों के साथ लेपित चुंबक के अंदर ट्यूब की दीवार पर बनाए रखा जाएगा । - उलटा चुंबक और ट्यूब एक नया गोल तली 5 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूब में ट्यूब सामग्री हस्तांतरण करने के लिए।
नोट: स्थानांतरण के लिए चुंबक से बाहर ट्यूब मत लो; यह अभी भी ट्यूब के साथ चुंबक उलटा द्वारा किया जाता है। एक स्थिर आंदोलन का प्रयोग करें और ट्यूब हिला नहीं है। - अवांछित चुंबकीय लेबल कोशिकाओं युक्त प्रारंभिक ट्यूब को त्यागें और नई एक जगह, अपनी टोपी के बिना, चुंबक में तीन मिनट के लिए ।
- चरण 2.20 में आगे बढ़ते हुए, अलग-थलग लिन− कोशिकाओं को एक नई 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
नोट: यदि पिछले चरणों के लिए कई 5 एमएल पॉलीस्टीरिन ट्यूब का उपयोग किया गया है, तो सभी कोशिकाओं को एक ही 15 एमएल ट्यूब में पूल करें। सेल छंटाई के बाद बरामद कोशिकाओं हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल और जनक हैं। मेगाकारियोपोइसिस 10के प्रमुख शारीरिक नियामक थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ) की उपस्थिति मेगाकारियोसाइटिक सेल लाइन की ओर सेल भेदभाव को निर्देशित करेगी। - चरण 2.10 में लिन− सेल संख्या और व्यवहार्यता को मापें।
- 1 x 10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं एक्स वेल नंबर है करने के लिए अपकेंद्रित्र करने के लिए सेल निलंबन की आवश्यक मात्रा की गणना करें, अच्छीतरह से संख्या प्रति शर्त बीज के लिए कुओं की संख्या जा रहा है ।
- 7 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेल निलंबन और अपकेंद्रित्र की उचित मात्रा के साथ प्रति स्थिति एक ट्यूब तैयार करें।
- तरल संस्कृतियों के लिए, सुपरनैंट को त्यागें और सेल पेलेट को पूर्ण संस्कृति माध्यम में फिर से खर्च करें (डीएमईएम, पीएसजी अंतिम मात्रा का 1%, अंतिम मात्रा का एफबीएस 10%, हिरुडिन 100 यू/एमएल, टीपीओ 50 एनजी/एमएल) 2 × 106 व्यवहार्य कोशिकाओं/एमसीएल (1 × 106 कोशिकाओं प्रति 500 μL अच्छी तरह से) की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। 5% CO2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। (संस्कृति के = दिन 0)
नोट: एक अच्छी तरह से के लिए पूर्ण संस्कृति माध्यम तैयार करने के लिए, एक उदाहरण के रूप में मिथाइलसेलुलोस संस्कृतियों के लिए अगले पैराग्राफ देखें, डीएमईएम के 435 माइक्रोन, 10% फाइनल के लिए 100% एफबीएस के 50 माइक्रोन, 1% फाइनल के लिए 100% पीएसजी के 5 माइक्रोन, 100 यू/एमएल फाइनल के लिए 10 000 यू/एमएल के 5 माइक्रोन और 5 10 एनजी/एमएसएल फाइनल के लिए 5 μl पोरल का उपयोग करें। 4-अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों आम तौर पर उनके अच्छी तरह से व्यास के रूप में उपयोग किया जाता है ५०० μL प्रति अच्छी तरह से जरूरत के लिए एक अच्छा फिट है ।
3. मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोजेल में सेल एम्बेडिंग
नोट: कृपया ध्यान दें कि निम्नलिखित प्रोटोकॉल हाइड्रोजेल सेल संस्कृति का एक भी कुआं प्राप्त करने की विधि का वर्णन करता है, आवश्यक कुओं की संख्या के अनुकूल होता है।
- कमरे के तापमान पर 3% मिथाइलसेलुलोस स्टॉक समाधान के 1 एमएल एलिकोट्स गल। सिरिंज कोटिंग के लिए मिथाइलसेलुलोस का एक अलग अतिरिक्त एलिकोट तैयार करें।
नोट: 3% की एकाग्रता पर, मिथाइलसेलुलोस कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर तरल रहता है। - कोट एक 1 एमएल लूयर लॉक सिरिंज जो एक्सट्रा एलिकोट से मिथाइलसेलुलोस के 1 एमएल ड्राइंग करके मिथाइलसेलुलोस के साथ 18 गेज सुई से लैस है। पूरी तरह से मिथाइलसेल्यूलोज को निष्कासित करें।
नोट: यह कोटिंग चरण यह सुनिश्चित करता है कि चरण 3.3 में एकत्र मिथाइलसेल्यूलोस की मात्रा सटीक है। - एक ही सिरिंज और सुई के साथ, लेकिन एक नए मिथाइलसेलुलोस एलिकोट का उपयोग करके, मिथाइलसेल्यूलोस(चित्रा 2 ए)की उचित मात्रा खींचें।
नोट: 500 माइक्रोन प्रति अच्छी तरह से अंतिम मात्रा में 2% मिथाइलसेल्यूलोस की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, 3% मिथाइलसेलुलोस के 333 माइक्रोन की आवश्यकता होती है। - सावधानी से सुई निकालें। निष्फल संदंश का उपयोग करके, सिरिंज के अंत में एक लूयर लॉक कनेक्टर स्क्रू(चित्रा 2B-C)।
- दो सिरिंज को एक साथ जोड़ने के लिए एक दूसरे, गैर-लेपित, 1 एमएल लूयर लॉक सिरिंज को लूयर लॉक कनेक्टर से अटैच करें(चित्रा 2डी)।
नोट: इस दूसरी सिरिंज कोट करने की कोई जरूरत नहीं है । - दोनों सीरिंज(चित्रा 2E)के बीच मिथाइलसेल्यूलोज वॉल्यूम को समान रूप से वितरित करें और उन्हें चरण 3.11 तक अलग रखें।
- केंद्रित डीएमईएम संस्कृति माध्यम तैयार करें ताकि अंतिम मिथाइलसेल्यूलोस वॉल्यूम (चरण 3.11) में प्राप्त किया जा सके प्रत्येक यौगिक के लिए तरल संस्कृति माध्यम में से एक के समान एकाग्रता (पीएसजी अंतिम मात्रा का 1%, अंतिम मात्रा का एफबीएस 10%, हिरुडिन 100 यू/एमएल, टीपीओ 50 एनजी/एमएलएएल)।
- 1 × 10 6 कोशिकाओं के अंतिम कुएं के प्रति केंद्रित संस्कृति माध्यम के167 माइक्रोन तैयार करें। माध्यम की इस मात्रा की गणना की जाती है ताकि 2% की अंतिम मिथाइलसेल्यूलोस एकाग्रता प्राप्त की जा सके। कुएं में कुल मात्रा 500 माइक्रोल (केंद्रित संस्कृति माध्यम में सेल निलंबन की 167 माइक्रोन + 333 मेथिलेल्यूलोस की माइक्रोन) होगी और सभी घटकों में तरल कुओं में एक समान एकाग्रता होगी।
- एक उदाहरण के रूप में, एक अच्छी तरह से के लिए पूर्ण संस्कृति माध्यम तैयार करने के लिए, डीएमईएम के 102 माइक्रोन, 10% फाइनल के लिए 100% एफबीएस के 50 माइक्रोन, 1% फाइनल के लिए 100% पीएसजी के 5 माइक्रोन, 100 यू/एमएल फाइनल के लिए 10 000 यू/एमएल के 5 माइक्रोन और 5 10 एनजी/एमएल फाइनल के लिए 5 μl PO के μL का उपयोग करें। यह कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए उपयोग किए जाने वाले 167 माइक्रोन की मात्रा देता है और मिथाइलसेल्यूलोस के 333 माइक्रोन के अतिरिक्त के साथ अंतिम मात्रा 500 माइक्रोन होगी।
- अपकेंद्रित्र चरण 2.26 को पूरा करने के बाद, सुपरनैंट को त्यागें और केंद्रित संस्कृति माध्यम में सेल पेलेट को 1 × 106 कोशिकाओं प्रति 167 माइक्रोन के अनुपात में फिर से खर्च करें।
- सीरिंज वापस ले लो और कनेक्टर से उनमें से एक डिस्कनेक्ट।
- पिपेट 167 सेल निलंबन का माइक्रोल।
- सेल सस्पेंशन को सीधे सिरिंज कनेक्टर(चित्रा 2F)में जोड़ें, जिससे हवा के बुलबुले पेश न हो।
नोट: सेल निलंबन को जोड़ते समय, सेल निलंबन के लिए कुछ जगह मुक्त करने के लिए एक साथ सिरिंज प्लंजर खींचें। - ध्यान से पेंच धागे में किसी भी निलंबन खोने के बिना दो सीरिंज(चित्रा 2G)को फिर से कनेक्ट करें।
नोट: पुनर्संबंध से पहले, कनेक्टर को आधा खाली छोड़ने के लिए प्लंजर खींचें और निलंबन के बिना कनेक्ट करने के लिए दूसरी सिरिंज के लिए पर्याप्त जगह दें। - धीरे-धीरे दो सिरिंज(चित्रा 2H)के बीच दस बैक-एंड-आगे प्लंजर आंदोलनों के साथ सेल निलंबन के साथ मिथाइलसेलुलोस माध्यम को समरूप बनाएं।
- कुल वॉल्यूम को एक सिरिंज में ड्रा करें और दो सिरिंज को डिस्कनेक्ट करें, जिससे कनेक्टर खाली हो जाए।
- सिरिंज की सामग्री को 4-अच्छी प्लेट(चित्रा 2I)के कुएं में खाली करें।
- 5% सीओ2 (संस्कृति के = दिन 0) के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
नोट: एक जोड़ी सीरिंज के साथ दो मिथाइलसेलुलोस कुओं को तैयार करना संभव है। मिथाइलसेल्यूलोस की मात्रा दो से बढ़ाएं और सेल सस्पेंशन की मात्रा में 2 x106 कोशिकाएं हों। चरण 3.13 पूरा करने के बाद। उनमें से प्रत्येक में 500 माइक्रोन करने के लिए दो सीरिंज के बीच समान रूप से मात्रा वितरित करें। उन्हें डिस्कनेक्ट करें और संस्कृति में कनेक्टर के बिना एक को अच्छी तरह से खाली करें। सीरिंज को फिर से कनेक्ट करने के लिए एक है कि दूसरे को कनेक्टर रखा से मात्रा हस्तांतरण । सीरिंज डिस्कनेक्ट करें, 500 माइक्रोन के साथ एक कनेक्टर संलग्न नहीं होना चाहिए, और एक दूसरी संस्कृति में अच्छी तरह से कोशिकाओं बीज। 3% मिथाइलसेलुलोस को इस्कोव के संशोधित डल्बेको के माध्यम (आईएमडीएम) में स्टॉक समाधान के रूप में खरीदा जाता है जबकि डीएमईएम में केंद्रित कोशिकाओं को निलंबित कर दिया जाता है। तुलनात्मक परीक्षण शुरू में यह सुनिश्चित करने के लिए किए गए हैं कि इस मिश्रित माध्यम का प्रयोग के परिणाम पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, विशेष रूप से 100% डीएमईएम में तरल संस्कृति की तुलना में।
4. प्रोपलेट विश्लेषण के लिए सेल पुनर्पेंशन
नोट: प्रोपलेट बनाने की क्षमता का विश्लेषण तरल और मिथाइलसेल्यूलोस उगाए गए मेगाकारियोसाइट्स के बीच तुलनीय परिस्थितियों में किया जाना चाहिए। मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोगेल द्वारा लगाए गए शारीरिक बाधाएं प्रोलेटलेट विस्तार को रोकती हैं। इसलिए, मिथाइलसेल्यूलोस-विकसित कोशिकाओं को संस्कृति के तीसरे दिन ताजा तरल माध्यम में फिर से निलंबित कर दिया जाता है ताकि उन्हें प्रोपलेटलेट्स का विस्तार करने की अनुमति मिल सके। मिथाइलसेल्यूलोस हाइड्रोगेल एक भौतिक हाइड्रोजेल है जो तरल मध्यम जोड़ पर आसानी से पतला हो जाता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि पुनर्प्रापणन और अपकेंद्रित्र से कलाकृतियों से बचने के लिए, नियंत्रण तरल मध्यम स्थिति में कोशिकाओं को एक साथ उसी तरह से इलाज करना होगा जैसे मिथाइलसेल्यूलोज-विकसित कोशिकाएं। प्रयोग के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व(चित्रा 1)को देखें।
- डीएमईएम के 10 एमएल तैयार करें - 1% पीएसजी प्रत्येक कुएं को फिर से खर्च करने के लिए 15 एमएल ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम किया जाता है।
- डीएमईएम के 10 एमएल में प्रत्येक कुएं से कोशिकाओं को सावधानी से पुनर्सुखें - 1% पीएसजी।
नोट: मिथाइलसेलुलोस को पूरी तरह से पतला करने के लिए धीरे-धीरे कई अप-एंड-डाउन आंदोलन करें। तरल कुओं के लिए अच्छी तरह से नीचे जमा सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए सुनिश्चित करें । - 300 × जीपर ट्यूब 5 मिनट सेंट्रलाइज करें।
- इस बीच पूर्ण संस्कृति माध्यम (DMEM, पीएसजी अंतिम मात्रा का 1%, अंतिम मात्रा के FBS 10%, hirudin १०० U/mL, टीपीओ ५० एनजी/एमएल) तैयार करते हैं ।
नोट: इस चरण में प्रत्येक कुएं को आधे से पतला किया जाता है, इसलिए प्रति अच्छी तरह से पूर्ण संस्कृति माध्यम का 1 एमएल तैयार करें। - सुपरनेट को त्यागें और प्रत्येक ट्यूब के लिए संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
- 4 या 24-वेल प्लेट में प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के 500 माइक्रोन को फिर से प्राप्त करें और 5% सीओ2के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: एक प्रारंभिक कुएं से, डुप्लिकेट में प्रोपलेट विज़ुअलाइज़ेशन के लिए 2 कुओं को प्राप्त करें। कृपया ध्यान दें कि चूंकि ये डुप्लिकेट उसी नमूने से उत्पन्न होते हैं, इसलिए उन्हें स्वतंत्र प्रतिकृति के रूप में नहीं माना जा सकता है। - 24 घंटे reseeding के बाद, संस्कृति के दिन 4 पर, बेतरतीब ढंग से उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी और 20 × उद्देश्य का उपयोग कर प्रति अच्छी तरह से 10 छवियों को प्राप्त करते हैं ।
नोट: कोशिकाओं को अच्छी तरह से के केंद्र में समूह के लिए करते हैं, सुनिश्चित करें कि क्षेत्र पर भी कई कोशिकाओं के रूप में यह प्रोपलेट दृश्य और मात्रा मुश्किल प्रदान कर सकते है नहीं है । प्रति क्षेत्र कम से कम 5 मेगाकारियोसाइट्स पर कब्जा करना सुनिश्चित करें। - प्रत्येक छवि में प्रोपलेटलेट्स का विस्तार करने वाले मेगाकार्योसाइट्स और मेगाकारियोसाइट्स की कुल संख्या की गणना करें और प्रोपलेटलेट्स का विस्तार करने वाले मेगाकारियोसाइट्स के अनुपात की गणना करें।
नोट: मात्रा स्वचालित नहीं है; मैन्युअल रूप से सेल गिनती प्रदर्शन करते हैं। गिनती इमेजजे के सेल काउंटर प्लगइन के उपयोग से कोशिकाओं पर क्लिक करने के लिए उन्हें चिह्नित करने के लिए सुविधा प्रदान की जा सकती है क्योंकि उनकी गिनती की जाती है। डुप्लीकेट में प्रति अच्छी तरह से और कुओं का अधिग्रहण किए गए 10 क्षेत्र प्रति स्थिति लगभग 150-300 मेगाकारियोसाइट्स का प्रतिनिधित्व करते हैं।
5. भविष्य के विश्लेषण के लिए सेल निर्धारण और पुनर्प्राप्ति
सावधानी: यह प्रोटोकॉल फिक्सेटिव का उपयोग करता है जिसे एक धुएं के हुड के नीचे संभाला जाना चाहिए, सुरक्षात्मक उपकरण पहने हुए।
नोट: उद्देश्य कोशिकाओं पर लागू जेल की बाधाओं को बरकरार रखना है जब तक कि वे पूरी तरह से तय न हो जाएं। इसलिए, और इस्तेमाल किए गए सुधारक की परवाह किए बिना, इसे जेल को परेशान किए बिना, मिथाइलसेल्यूलोस के शीर्ष पर अच्छी तरह से जोड़ा जाना चाहिए। एक ही प्रोटोकॉल तरल संस्कृतियों पर लागू होता है।
- जेल को बाधित किए बिना मिथाइलसेलुलोस के शीर्ष पर वरीयता प्राप्त मात्रा (इस प्रोटोकॉल में 500 माइक्रोन) के बराबर फिक्सेटिव समाधान की मात्रा जोड़ें। उपयोग किए गए फिक्सेटिव (कम से कम 10 मिनट) के अनुसार उचित समय की प्रतीक्षा करें।
नोट: जेल भर में सुधारात्मक प्रसार बहुत तेजी से होना चाहिए जैसा कि जेल के रंग में तेजी से परिवर्तन (गुलाबी से पीले-नारंगी छाया तक) से पता चला है। पैराफॉर्मलडिहाइड (डीपीबीएस में 8%, 500 माइक्रोल प्रति कुएं) का उपयोग आमतौर पर इम्यूनोलाबेलिंग के लिए किया जाता है, जबकि ग्लूटारलधिहाइड (कैकोडिलेट बफर में 5%, 500 माइक्रोल प्रति कुएं) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है। - P1000 पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे फिक्सेटिव और जेल के साथ कई अप-एंड-डाउन पिपिंग करते हैं ताकि मेथिलसेल्यूलोज को सजातीय रूप से पतला किया जा सके।
- एक ही पिपेट और टिप का उपयोग करके, सभी वॉल्यूम को कुएं से 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें डीपीबीएस की 10 एमएल और समरूपता होती है।
- 7 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर मिश्रण अपकेंद्रित्र।
नोट: सभी मिथाइलसेलुलोस को खत्म करने के लिए एक दूसरे धोने के कदम की आवश्यकता हो सकती है - वांछित विश्लेषण (इम्यूनोलाबेलिंग, प्रवाह साइटोमेट्री9,इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ...) के अनुसार उपयुक्त माध्यम में सुपरनेट्ट को त्यागें और मेगाकार्योसाइट पेलेट को फिर से रीसस्ट करें ।) (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए इस जोवे अंक में ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मेगाकारियोपोइसिस के प्रमुख चरणों कीसीटू अन्वेषण में कागज विधि भी देखें)।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त आंकड़े मूल रूप से 20169में रक्त में प्रकाशित किए गए थे ।
प्रोटोकॉल के अनुसार, कोशिकाओं को या तो तरल या मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोजेल माध्यम में वरीयता दी गई थी। तरल माध्यम में कोशिकाओं को सभी अच्छी तरह से तलछट है, कड़ी प्लास्टिक की सतह के साथ संपर्क में है और कुछ समय के लिए अंय कोशिकाओं के साथ । इसके विपरीत, मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोजेल में एम्बेडेड कोशिकाओं को जेल में सजातीय रूप से वितरित किया जाता है और पड़ोसी कोशिकाओं(चित्र 3 ए)से अलग किया जाता है। 2% की अंतिम एकाग्रता पर मिथाइलसेल्यूलोस जेल तरल संस्कृति(चित्रा 3B)की तुलना में मतलब मेगाकार्योसाइट व्यास को बहुत कम बढ़ाता है, जो उच्च रिपोर्ट किए गए प्लॉयडी9के अनुसार है। इसके विपरीत, मिथाइलसेल्यूलोस एकाग्रता में 0.5% की वृद्धि मेगाकार्योसाइट भेदभाव को कम करती है जैसा कि एक छोटे मतलब व्यास(चित्रा 3 B)द्वारा दिखाया गया है।
मेगाकार्योसाइट अल्ट्रास्ट्रक्चर में एक उल्लेखनीय अंतर तरल संस्कृति में विभेदित मेगाकार्योसाइट्स और बोन मैरो के भीतर वीवो में विभेदित लोगों के बीच मनाया जाता है। परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स की एक विशेषता विशेषता एक जटिल इंट्रासाइटोप्लाज्मिक झिल्ली नेटवर्क है, डीएमएस (सीमांकन झिल्ली प्रणाली) जो भविष्य के प्लेटलेट्स की झिल्ली के लिए एक जलाशय के रूप में कार्य करता है। परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स में डीएमएस इंटरविन्ड झिल्ली शीट बनाने के लिए आयोजित करता है जो अधिकांश साइटोप्लाज्म पर कब्जा करते हैं। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) द्वारा, वे बारीकी से apposed और साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों(चित्रा 3C ऊपरी पैनल) (TEM प्रक्रिया के लिए, कागज विधि देखें" इस एक ही JOVE मुद्दे में ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मेगाकारियोपॉइस के प्रमुख चरणों कीसीटू अन्वेषण में दिखाई देते हैं। तरल संस्कृति में, डीएमएस झिल्ली में ज्यादातर साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों(चित्रा 3 सी मध्य पैनल) के परिसीमन के बिना छोटे दौर, अंडाकार या विस्तारित वेसिकल्स की उपस्थिति होती है। इसके विपरीत, 2% मिथाइलसेलुलोस संस्कृति अधिकांश मेगाकारियोसाइट्स में डीएमएस के संगठन को बढ़ावा देती है, झिल्ली के साथ साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों को बारीकी से अप्वॉइंट और परिसीमन करता है, जो सीटू (चित्रा 3 सी लोअर पैनल) में एक जैसा दिखता है। यह परिणाम इंगित करता है कि 2% मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोगेल संस्कृति पर्यावरण माध्यम की यांत्रिक बाधाओं के कारण बेहतर मेगाकारियोसाइट भेदभाव के लिए अनुमति देती है।
3 दिन में तरल माध्यम में सेल हस्तांतरण के बाद, मेगाकारियोसाइट्स 4 घंटे 9 के बाद प्रोपलेटलेट्स का विस्तार करना शुरू कर देतेहैं। चित्रा 4 तरल परिवेश में पुनर्पन्नि के बाद 24 घंटे विस्तारित प्रोपलेट्स वाले मेगाकार्योसाइट्स के अनुपात की मात्रा को दर्शाता है। उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी और 20× उद्देश्य(चित्रा 4A)का उपयोग करके दस छवियों को बेतरतीब ढंग से प्रति अच्छी तरह से अधिग्रहीत किया गया था। क्वांटिफिकेशन को फिजी (इमेजजे)(चित्र 4बी)पर सेल काउंटर प्लगइन का उपयोग करके आंख बंद करके और मैन्युअल रूप से किया गया था। क्योंकि ये प्राथमिक कोशिका संस्कृतियां हैं, एक अंतर-प्रयोग परिवर्तनशीलता है लेकिन प्रोटोकॉल मजबूत बना हुआ है और एक अच्छी प्रजनन क्षमता प्रदान करता है। तरल पूर्व-संस्कृति स्थिति में, प्रॉप्लेलेट अनुपात 10% और 20% के बीच होना चाहिए जबकि हाइड्रोगेल प्री-कल्चर के लिए यह अनुपात दोगुना हो जाता है।
चित्रा 1। पूरी प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। हड्डियों को विच्छेदित किया जाता है, मज्जा को बाहर निकाल दिया जाता है और कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से अलग किया जाता है। ब्याज की स्टेम और जनक कोशिकाओं (लिन-कोशिकाओं) को इम्यूनोमैग्नेटिक निगेटिव सॉर्टिंग प्रक्रिया से अलग किया जाता है और तरल या हाइड्रोगेल माध्यम (दिन 0) में वरीयता प्राप्त होता है। संस्कृति के तीसरे दिन (जो कुल 4 दिनों की अवधि का प्रतिनिधित्व करता है), दोनों स्थितियों को अलग-अलग ताजा तरल संस्कृति परिवेश में फिर से निलंबित कर दिया जाता है। यह दूसरा खेती कदम 3 दिन से संस्कृति के दिन 4 तक किया जाता है । प्रोपलेट्स का विस्तार करने वाले एमकेएस का अनुपात संस्कृति के दिन 4 पर मापा जाता है। दृश्य स्पष्टता के लिए, एक कोशिका को प्रति अच्छी तरह से स्केमेट किया जाता है। ब्लू सर्कल बैंगनी में अपने नाभिक के साथ एक एकल कोशिका का चित्रण कर रहा है। अंतिम चरण में, दोनों एमके्स को प्रोपलेट के साथ प्रतिनिधित्व दिया जाता है। प्रोपलेटलेट बनाने वाले एमकेएस का अनुपात तरल या मिथाइलसेलुलोस पूर्व-संस्कृति के आधार पर भिन्न होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2। मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोजेल में सेल एम्बेडिंग। सीरिंज की दीवार को पूर्व कोटिंग करने के बाद,(ए)मिथाइलसेल्यूलोज की उचित मात्रा आकर्षित करता है; (ख, सी)सुई डिस्कनेक्ट और सिरिंज पर एक कनेक्टर पेंच; (घ)मिथाइलसेलुलोस को कनेक्टर के माध्यम से आधे रास्ते में धकेलें और एक दूसरी सिरिंज संलग्न करें; (ई)दो सिरिंज के बीच समान रूप से मिथाइलसेलुलोस वितरित करें और उन्हें डिस्कनेक्ट करें; (एफ)कनेक्टर असर सिरिंज के लिए सेल निलंबन जोड़ें; (जी)दो सिरिंज को फिर से कनेक्ट करें; (ज)एक सिरिंज से दूसरे समय के लिए पूरी मात्रा धक्का द्वारा समरूप; (I)पूरी मात्रा को संस्कृति पकवान में निष्कासित करके कोशिकाओं को बीज दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3। संस्कृति की स्थिति के अनुसार मेगाकार्योसाइट विशेषताएं। (A)लिक्विड (लेफ्ट पैनल) या 2% मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोजेल मीडियम (राइट पैनल) में कल्चर के तीसरे दिन मेगाकारियोसाइट्स की रिप्रेजेंटेटिव इमेजेज । स्केल बार = 50 माइक्रोन(बी)तरल माध्यम में उगाए जाने वाले मेगाकारियोसाइट्स का औसत व्यास, या 2% या 2.5% मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोजेल में। परिणाम 3 स्वतंत्र संस्कृतियों में एसडी ± मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, कुल के साथ कम से १०० megakaryocytes की जांच की । *, पी<0.05, ***पी < 0.0001, बोनफेरोनी के कई तुलना परीक्षण के साथ विचरण (ANOVA) के 1-तरह के विश्लेषण का उपयोग करके। (एगुइलर एट अल 2016 से अनुकूलित ग्राफ) (C)योजनाबद्ध दृश्य (बाएं) और मुरीन मेगाकारियोसाइट्स के प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी छवियां (मध्य); सही पैनल, सफेद वर्गों से विचारों को बंद करें (मध्य इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी छवियों के लिए स्केल बार = 5 माइक्रोन और क्लोज अप दृश्यों के लिए 2 माइक्रोन)। ऊपरी पैनल सीटू मेगाकारियोसाइट्स में होते हैं, मध्य तरल संस्कृति में विट्रो में उगाए जाने वाले मेगाकार्योसाइट्स का प्रतिनिधित्व करता है और निचले पैनल 3 डी मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोगेल में उगाए जाने वाले मेगाकारियोसाइट्स हैं। ये आंकड़े मूल रूप से ब्लड जर्नल, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_95में प्रकाशित किए गए थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4। प्रोपलेट क्वांटिफिकेशन के प्रतिनिधि परिणाम। (ए)संस्कृति के दिन 4 पर मेगाकारियोसाइट्स की प्रतिनिधि छवियां । कोशिकाओं को तरल(बाएं)या 2% मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोगेल माध्यम(दाएं)में तीन दिन इनक्यूबेटेड किया गया था और इसके बाद तरल माध्यम में एक दिन का पुनर्प्रेमी होता था । काले तीर मेगाकारियोसाइट्स को प्रोपलेटलेट्स का विस्तार करने का संकेत देते हैं। (स्केल बार = 50 माइक्रोन)। (ख)प्रोपलेटलेट फॉर्मेशन के प्रतिनिधि मात्राकरण आंकड़े। प्रोपलेटलेट गठन पहले दिन 0 से 3 दिन तक तरल या 2% मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोजेल माध्यम में पूर्व-संस्कारी के लिए 4 दिन में निर्धारित किया गया था। परिणाम प्रोपलेटलेट (मतलब ± एसडी) का विस्तार करने वाले मेगाकारियोसाइट्स के% के रूप में व्यक्त किए जाते हैं और 3 स्वतंत्र प्रयोगों से होते हैं, जिसमें प्रति शर्त > 750 (टी-टेस्ट, पी = 0.0023) प्रति मेगाकारियोसाइट्स की कुल संख्या होती है। प्रोपलेट्स का विस्तार करने वाले मेगाकारियोसाइट्स का औसत अनुपात तरल स्थिति में 16% और मिथाइलसेल्यूलोस हाइड्रोजेल प्री-कल्चर के लिए 39% है। यह परिणाम हाइड्रोजेल प्री-कल्चर के पहले प्रदर्शित और प्रकाशित प्रभाव से मेल खाता है जो तरल स्थिति की तुलना में प्रोपलेट फॉर्मेशन को बढ़ाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
पिछले दशक में, मैकेनोबायोलॉजी ने जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में अधिक से अधिक रुचि बढ़ाई है। अब यह आमतौर पर स्वीकार किया जाता है कि कोशिकाओं के आसपास का यांत्रिक वातावरण उनके व्यवहार में भूमिका निभाता है, इस बात का अध्ययन करने के महत्व पर जोर देता है कि मेगाकारियोसाइट्स कैसे समझते हैं और बाह्य यांत्रिक संकेतों का जवाब देते हैं। सीटू11में बोन मैरो टिश्यू की कठोरता को सही ढंग से मापना चुनौतीपूर्ण है , खासकर यदि हम हेमेटोपोइटिक लाल मज्जा पर विचार करते हैं क्योंकि यह बड़े स्तनधारियों में ट्रैबेकुलर हड्डियों के अंदर स्थित है जबकि डायफिसिस से अधिक आसानी से सुलभ मज्जा अनिवार्य रूप से एडीपोसाइट्स (पीला मज्जा)12से बना है। चूहों से एक अलग मज्जा के मामले में, जहां डायफिसिस में अनिवार्य रूप से लाल मज्जा होता है, एक और मुद्दा यह है कि, एक बार हड्डी से निकाले जाने के बाद, ऊतक एकजुट नहीं रहता है। हालांकि, शिन और सहयोगियों ने परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके माउस डायफिसिस मैरो कठोरता को मापने में कामयाब रहे और ईमैरो का मूल्य पाया = 0.3 ± 0.1 किपा, जो सबसे नरम ऊतकों के बीच मज्जा रखता है6।
यहां वर्णित प्रक्रिया का हित हाइड्रोगेल में तरल माध्यम में मेगाकारियोसाइट व्यवहार की तुलना करना है। तरल परिवेश में, कोशिकाओं को सभी अच्छी तरह से तलछट है, कड़ी प्लास्टिक की सतह के साथ संपर्क में है और कुछ समय के लिए अंय कोशिकाओं के साथ । इसके विपरीत, मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोजेल में एम्बेडेड कोशिकाओं को जेल में सजातीय रूप से वितरित किया जाता है और अन्य कोशिकाओं(चित्रा 3 ए)से पूरी तरह से अलग हो जाते हैं। इसलिए वे अनिवार्य रूप से कारावास द्वारा प्रदान किए गए यांत्रिक संकेतों के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं, juxtacrine संचार को छोड़कर । पैराक्रिन उत्तेजना को पूरी तरह से बाहर नहीं रखा जा सकता है। फिर भी, मिथाइलसेल्यूलोस हाइड्रोगेल में एम्बेडेड कोशिकाएं बोन मैरो की स्थिति के विपरीत एक-दूसरे से दूर हैं और हम इस प्रकार मान सकते हैं कि यदि स्रावित पदार्थ पड़ोसी कोशिकाओं तक पहुंचते हैं, तो वे बहुत पतला हो सकते हैं।
विधि स्थापित करने के लिए आसान है और विशिष्ट कौशल की आवश्यकता नहीं है। मिथाइलसेल्यूलोस एक भौतिक जेल है जिसकी बहुलक श्रृंखला गैर-सहसंयोजक क्रॉस-लिंकेज बनाती है। कम तापमान पर तरल होने के नाते, तापमान में वृद्धि करते समय यह जेलीफीज हो जाता है (कृपया जेल के यांत्रिक गुणों के लक्षण वर्णन के बारे में अधिक जानकारी के लिए Aguilar एट अल से लेख देखें 20169)। इस जेल राज्य को आसानी से जलीय समाधान में कमजोर पड़ने के बाद उलट दिया जा सकता है, जो कोशिकाओं की आसान वसूली में सक्षम बनाता है, चाहे जेल में या जीवित कोशिकाओं के रूप में तय किया जाए।
यहां एक महत्वपूर्ण कारक हाइड्रोगेल की कठोरता है। उपयुक्त मिथाइलसेल्यूलोस की मात्रा को बहुत ठीक से तिरस्कृत किया जाना चाहिए क्योंकि हाइड्रोगेल एकाग्रता में एक छोटा सा परिवर्तन भी परिवेश की कठोरता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकता है और इसलिए मेगाकार्योसाइट परिपक्वता पर। उदाहरण के लिए, यह पहले दिखाया गया था कि मिथाइलसेल्यूलोस एकाग्रता को 2 से बढ़ाकर 2.5% करने से जेल कठोरता (युवा के मॉड्यूलस) में 10 गुना की वृद्धि हुई। एक संभावित नुकसान यह है कि कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त होने के बाद प्रत्येक प्रयोगात्मक में मिथाइलसेल्यूलोज के सटीक रियोलॉजिकल गुणों को सत्यापित करने के लिए कोई आसान गुणवत्ता नियंत्रण नहीं है। फिर भी, एक आवश्यक कसौटी जो एक सही जेल एकाग्रता के बारे में आश्वस्त करेगी, हाइड्रोगेल के भीतर मेगाकारियोसाइट्स की उचित परिपक्वता है, जैसा कि उनके बड़े आकार से लगभग तरल माध्यम में समान है। उनके मतलब व्यास में कमी 2.5% मिथाइलसेलुलोस(चित्रा 3B)के साथ कठोरता बढ़ाने के दौरान क्या होता है के समान दोषपूर्ण भेदभाव को प्रतिबिंबित कर सकता है।
विधि की एक और सीमा यह है कि हाइड्रोगेल से सेल रिकवरी शास्त्रीय संस्कृति की तुलना में अधिक समय लेती है क्योंकि पहले अपकेंद्रित्रीकरण से पहले जेल को पतला करना आवश्यक है। यदि मिथाइलसेल्यूलोज को पूरी तरह से हटाने की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए आगे पश्चिमी दाग या आरएनए अलगाव प्रक्रिया के लिए सेल lysate प्राप्त करने के लिए, एक अतिरिक्त धोने कदम की आवश्यकता हो सकती है, जिसके दौरान प्रोटीन या आरएनए (प्रोटीन डेफोस्फोरिलेशन, आरएनए क्षरण ...) में समय संशोधन हो सकते हैं।
प्रक्रिया में विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु सेल गिनती है कि प्रत्येक शर्तों में बराबर होना चाहिए है । यह है कि तरल संस्कृति में के बाद से तुच्छ नहीं है, कोशिकाओं को अच्छी तरह से तलछट करते है और उनमें से कुछ प्लास्टिक की सतह है, जो हाइड्रोगेल में निलंबन में कोशिकाओं के लिए मामला नहीं है पर पालन करते हैं । एक नुकसान तरल स्थिति में कोशिकाओं का एक अधूरा संग्रह है, जिसके परिणामस्वरूप 3 दिन में तरल माध्यम में निलंबन के बाद "तरल" और "हाइड्रोजेल" स्थिति के बीच एक अलग सेल सामग्री होती है। इस तरह के अंतर से अंतिम आंकड़ों में विसंगतियां पैदा हो सकती हैं । एक चौकी के रूप में, कोशिकाओं को फिर से उभराने से पहले इस स्तर पर एक कोशिका संख्याकरण किया जा सकता है। नागोटे हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके इसे मैन्युअल रूप से करना बेहतर है क्योंकि यह मेगाकारियोसाइट्स जैसी बड़ी कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।
किसी भी प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए, संदूषण का खतरा है। संदूषण मिथाइलसेलुलोस पूर्व-संस्कृति स्थिति में असामान्य रूप से कम प्रोपलेट अनुपात का सबसे संभावित विवरण है, क्योंकि तरल माध्यम की तुलना में एक छोटा संदूषण का पता लगाना अधिक कठिन प्रतीत होता है। इसलिए, यह जब तक प्रोपलेट मात्राकरण नहीं हो जाता है, भ्रामक परिणाम देने के लिए अग्रणी हो सकता है। विशेष रूप से मिथाइलसेलुलोस सेल एनकैप्सुलेशन के दौरान अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं को कड़ाई से देखा जाना चाहिए जिसके लिए सीरिंज और कनेक्टर के कई और सटीक जोड़तोड़ की आवश्यकता होती है। मेगाकार्योसाइट व्यवहार्यता को 3 दिन में पुनर्सीमांकन से पहले मैनुअल गिनती के लिए एक नागोटे सेल चैंबर का उपयोग करके ट्राइपन ब्लू के साथ भी जांच की जानी चाहिए।
कुल मिलाकर, यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल शास्त्रीय तरल संस्कृति और मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोगेल का उपयोग करके 3 डी संस्कृति के बीच तुलना के लिए एक इन विट्रो मॉडल का वर्णन करता है। ध्यान दें, इस संस्कृति प्रोटोकॉल माउस प्राथमिक लिन के लिए वर्णित है- कोशिकाओं और अभी तक मानव कोशिकाओं के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है। यह 3 डी मॉडल मेगाकरियोसाइट व्यवहार और परिपक्वता9पर यांत्रिक वातावरण के प्रभाव की जांच करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। मेगाकारियोसाइट व्यवहार/परिपक्वता और प्रोपलेट गठन पर दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संस्कृति (यहां तक कि जेल पर) में यौगिकों को जोड़ना भी संभव है। अंत में, बोन मैरो में कोशिकाओं के सामने आने वाली यांत्रिक बाधाओं को पुन: उत्पन्न करके, यह संस्कृति प्रणाली असामान्य फेनोटाइप की जांच के लिए अनुमति देती है जिसे शास्त्रीय तरल संस्कृतियों में नहीं देखा जा सकता था जैसा कि पहले Myh9 नॉकआउट मेगाकारियोसाइट्स9,13, 14के लिए दिखाया गया था।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक फैबियन पर्टुय और एलिसिया अगुइलर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं जिन्होंने शुरू में प्रयोगशाला में इस तकनीक को विकसित किया था, साथ ही डोमिनिक कॉलिन (इंस्टीटयूट चार्ल्स सड्रॉन - स्ट्रासबर्ग) जो मिथाइलसेलुलोस हाइड्रोगेल के चिपचिपा गुणों की विशेषता है। इस काम को एआरएमईएसए (एसोसिएशन डी रेचेचे एट डेवेलोपमेंट एन मेडेसिन एट सैंटे पब्लिक) और एआरएन ग्रांट (एएनआर-18-सीई 14-0037 प्लैटफॉरमेचनिक्स) द्वारा समर्थित किया गया था। जूली बोशर प्रियतम डालना ला Recherche Médicale (FRM अनुदान संख्या FDT20201201010422) से एक प्राप्तकर्ता है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K.
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R.
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
