Summary
Es ist jetzt anerkannt, dass die dreidimensionale Umgebung von Zellen eine wichtige Rolle bei ihrem Verhalten, ihrer Reifung und / oder Differenzierung spielen kann. Dieses Protokoll beschreibt ein dreidimensionales Zellkulturmodell, das entwickelt wurde, um die Auswirkungen von physikalischer Eindämmung und mechanischen Einschränkungen auf Megakaryozyten zu untersuchen.
Abstract
Die 3D-Umgebung, die sowohl zu Einschluss als auch zu mechanischen Einschränkungen führt, wird zunehmend als wichtige Determinante des Zellverhaltens erkannt. Die 3D-Kultur wurde daher entwickelt, um sich der In-vivo-Situation besser zu nähern. Megakaryozyten unterscheiden sich von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) im Knochenmark (BM). Der BM ist eines der weichsten Gewebe des Körpers, das im Knochen eingeschlossen ist. Da der Knochen auf der Zellskala schlecht dehnbar ist, werden Megakaryozyten gleichzeitig einer schwachen Steifigkeit und einer hohen Einschließung ausgesetzt. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Rückgewinnung von mouse lineage negative (Lin-) HSPCs durch immunmagnetische Sortierung und deren Differenzierung in reife Megakaryozyten in einem 3D-Medium aus Methylcellulose dar. Methylcellulose ist gegenüber Megakaryozyten nicht reaktiv und ihre Steifigkeit kann an die eines normalen Knochenmarks angepasst oder erhöht werden, um ein pathologisches fibrotisches Knochenmark nachzuahmen. Der Prozess zur Gewinnung der Megakaryozyten für weitere Zellanalysen ist ebenfalls im Protokoll detailliert beschrieben. Obwohl die Proplatelet-Erweiterung innerhalb des 3D-Milieus verhindert wird, wird im Folgenden beschrieben, wie die Megakaryozyten in flüssigem Medium resuspendiert und ihre Fähigkeit, Proplatelets zu verlängern, quantifiziert werden können. Megakaryozyten, die in 3D-Hydrogel gezüchtet werden, haben eine höhere Fähigkeit, Proplatelette zu bilden, verglichen mit denen, die in einem flüssigen Milieu gezüchtet werden. Diese 3D-Kultur ermöglicht es, i) Vorläufer in Richtung Megakaryozyten zu differenzieren, die einen höheren Reifezustand erreichen, ii) Phänotypen zu rekapitulieren, die in vivo beobachtet werden können, aber in klassischen flüssigen Kulturen unbemerkt bleiben, und iii) Transduktionswege zu untersuchen, die durch die mechanischen Hinweise einer 3D-Umgebung induziert werden.
Introduction
Zellen im Körper erleben eine komplexe 3D-Mikroumgebung und sind dem Zusammenspiel zwischen chemischen und mechanophysikalischen Hinweisen ausgesetzt, einschließlich Steifigkeit aus dem Gewebe und Einschluss aufgrund benachbarter Zellen und der umgebenden Matrix 1,2,3. Die Bedeutung von Steifheit und Einschluss für das Zellverhalten wurde erst in den letzten Jahrzehnten erkannt. Im Jahr 2006 hob die bahnbrechende Arbeit von Engler et al. 4 die Bedeutung der mechanischen Umgebung für die Zelldifferenzierung hervor. Die Autoren zeigten, dass die Variation der Zellsubstratsteifigkeit zur Orientierung von Stammzellen auf verschiedene Differenzierungslinien führte. Seitdem wird der Einfluss mechanischer Hinweise auf das Schicksal und Verhalten von Zellen zunehmend erkannt unduntersucht. Obwohl es eines der weichsten Gewebe des Organismus ist, hat das Knochenmark eine 3D-Strukturorganisation, die im Knochen eingeschlossen ist. Die Marksteifigkeit, obwohl technisch schwierig, genau zu messen, wird auf 15 bis 300 Pa geschätzt 5,6. Innerhalb des Stromas sind die Zellen eng aufeinander beschränkt. Darüber hinaus wandern die meisten von ihnen in Richtung der Sinusoidgefäße, um in den Blutkreislauf einzudringen. Diese Bedingungen erzeugen zusätzliche mechanische Einschränkungen für benachbarte Zellen, die sich an diese Kräfte anpassen müssen. Mechanische Hinweise stellen einen wichtigen Parameter dar, dessen Konsequenzen für die Megakaryozytendifferenzierung und Proplatletbildung erst kürzlich erforscht wurden. Obwohl Megakaryozyten in vitro in traditioneller Flüssigkultur differenzieren können, erreichen sie nicht den in vivobeobachteten Reifegrad, was zum Teil auf das Fehlen der mechanischen Hinweise aus der 3D-Umgebung zurückzuführen ist 7. Wachsende Vorläufer, die in Hydrogel eingebettet sind, bringen mechanische 3D-Hinweise, die im flüssigen Milieu fehlen.
Hydrogele werden seit mehreren Jahrzehnten im hämatologischen Bereich häufig eingesetzt, insbesondere um Zellen in koloniebildenden Assays zur Quantifizierung hämatopoetischer Vorläufer zu züchten. Solche Hydrogele wurden jedoch selten verwendet, um den biologischen Einfluss der mechanischen 3D-Umgebung auf die Reifung und Differenzierung hämatopoetischer Zellen zu untersuchen. In den letzten Jahren hat unser Labor ein 3D-Kulturmodell mit einem Hydrogel 8auf Methylcellulosebasis entwickelt. Dieses nicht reaktive physikalische Gel ist ein nützliches Werkzeug, um die physikalischen Einschränkungen der nativen Megakaryozytenumgebung nachzuahmen. Es wird aus Cellulose durch Ersatz von Hydroxylresten (-OH) durchMethoxidgruppen (-OCH3) gewonnen. Sowohl der Grad der Methylsubstitution als auch die Methylcellulosekonzentration bestimmen die Hydrogelsteifigkeit nach der Jellifikation. Während der Entwicklungsphase dieser Technik wurde gezeigt, dass ein Elastizitätsmodul im Bereich von 30 bis 60 Pa die optimale Gelsteifigkeit für das Megakaryozytenwachstum ist 9.
Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode zur Züchtung von megakaryozytären Vorläuferzellen der Maus in einem 3D-Methylcellulose-Hydrogel. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Hydrogelkultur im Vergleich zur Standardflüssigkeitskultur den Grad der Megakaryozytenpolyploidisierung erhöht, die Reifung und intrazelluläre Organisation verbessert und die Fähigkeit von Megakaryozyten erhöht, Proplatele zu verlängern, sobald sie in einem flüssigen Medium resuspendiert sind 9. Dieses Manuskript beschreibt detailliert das Protokoll für die Isolierung von Lin−-Zellen aus dem Knochenmark der Maus und deren Einbettung in ein Methylcellulose-Hydrogel für die 3D-Kultur sowie die Quantifizierung ihrer Fähigkeit, Proplatelets herzustellen und die Rückgewinnung der Zellen für weitere Analysen.
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Protocol
Alle Versuche sollten in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt werden. Alle im Video gezeigten Protokolle wurden in strikter Übereinstimmung mit dem europäischen Recht und den Empfehlungen des Prüfungsausschusses des Etablissement Français du Sang (EFS) durchgeführt. Eine erste Version dieses Protokolls wurde ursprünglich 2018 in Methods in Molecular Biology 8veröffentlicht.
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des gesamten Prozesses. Dieser Prozess umfasst 1) Knochendissektion, Knochenmarkentnahme und mechanische Isolierung von Knochenmarkzellen, 2) magnetische Sortierung von Lineage-negativen (Lin-) Zellen, 3) Aussaat in flüssigem oder Methylcellulose-Hydrogel und 4) Resuspension von Megakaryozyten, die in 3D-Gel gezüchtet wurden, um die Propanletbildung in flüssigem Medium zu untersuchen.
1. Knochenentnahme an erwachsenen Mäusen
HINWEIS: In diesem Abschnitt ist es wichtig, die mikrobielle Kontamination zu minimieren.
- Bereiten Sie ein 15-ml-Röhrchen für die Knochenentnahme mit Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) vor, das 1% des Gesamtvolumens der Penicillin-Streptomycin-Glutamin (PSG) -Antibiotikamischung (Penicillin 10000 U / ml, Streptomycin 100000 μg / ml und L-Glutamin 29,2 mg / ml) enthält.
HINWEIS: Wenn alle verwendeten Mäuse den gleichen Genotyp haben, poolen Sie alle Knochen in derselben Röhre, die 1 ml DMEM - PSG 1% pro Anzahl von Mäusen enthält. Antibiotika sind wichtig, um eine mögliche Bakterienvermehrung während der Knochenprobe zu verhindern. - Füllen Sie ein 50-ml-Röhrchen mit Ethanol zu 70% zur Knochendesinfektion und zu einem weiteren zum Spülen von Instrumenten während des Eingriffs. Verwenden Sie sterilisierte Dissektionsinstrumente.
- Betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran-Inhalation (4%) und gehen Sie schnell zur zervikalen Luxation über, um die Mäuse einzuschläfern. Tauchen Sie den Körper schnell in 70% Ethanol ein, um mikrobielle Kontamination zu desinfizieren und zu vermeiden.
- Sezieren Sie schnell die Tibien und Femuren.
- Schneiden Sie mit einem Skalpell die Epiphysen des Knöchelseitenendes für die Tibia und des Hüftseitenendes für den Femur weg.
- Tauchen Sie die Knochen für eine Sekunde in 70% Ethanol, bevor Sie sie in DMEM-Medium mit 1% PSG tauchen.
2. Knochenmarkdissoziation und Lin-Zell-Isolierung
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls wird unter einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt. Für eine Kultur sind alle Vertiefungen Teil desselben Experiments und können nicht als unabhängige biologische Replikate betrachtet werden. Die Zellen aller Mäuse werden gebündelt, um die Homogenität aller Vertiefungen zu gewährleisten und sie miteinander vergleichen zu können, während mögliche interindividuelle Variabilität eliminiert wird. Für unabhängige biologische Replikate muss die Kultur wiederholt werden.
- Legen Sie die Knochen in eine Petrischale und heben Sie sie zweimal in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco auf, um potenzielle Verunreinigungen zu entfernen.
- Bereiten Sie DMEM - 1% PSG in einem 50 ml Röhrchen vor.
HINWEIS: Geben Sie 2 ml DMEM - 1% PSG pro Maus an, die für das Experiment verwendet werden. - Füllen Sie eine 5 ml Spritze, die mit einer 21-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit DMEM - 1% PSG.
- Halten Sie den Knochen mit einer Pinzette fest und führen Sie nur die Abschrägung der Nadel am Ende der Knieseite ein.
HINWEIS: Die knieseitige Epiphyse sollte von der Dissektion intakt bleiben und eine kleine Höhle in ihrer Mitte hinterlassen, durch die die Nadel eingeführt werden kann. Die verbleibende Epiphyse behält den Knochen bei, der während der Spülung an der Nadel befestigt ist. Achten Sie darauf, nicht mehr als die Fase in den Knochen einzuführen, da dies das Mark zerquetschen und beschädigen könnte. - Drücken Sie schnell auf den Spritzenkolben, um das Mark in ein 50-ml-Rohr zu spülen.
HINWEIS: Um Spritzer zu vermeiden und die Knochenmarkspülung und -befreiung zu erleichtern, legen Sie das freie Ende des Knochens an die Röhrenwand, eingetaucht in DMEM - 1% PSG. In der Praxis reicht im Allgemeinen ein Volumen zwischen 500 μL und 1 ml aus, um das Mark aus dem Knochen zu entfernen. Wenn das Mark vollständig ausgestoßen wurde, ist der Knochen weiß geworden. Falls das Mark nicht vollständig aus der Diaphyse ausgestoßen wurde, wie durch eine verbleibende rote Farbe beurteilt, ist es möglich, die Spülung mit frischem Medium zu wiederholen. - Wiederholen Sie die Schritte 2.4. und 2.5. für alle Knochen die 5 ml Spritze bei Bedarf mit DMEM - 1% PSG nachfüllen.
- Verwenden Sie die gleiche 5-ml-Spritze mit der 21-Gauge-Nadel, um das Gesamtvolumen des Mediums, das gespültes Mark enthält, in runde 10-ml-Röhrchen zu übertragen.
HINWEIS: Es ist nicht unbedingt notwendig, zu einem 10-ml-Rohr mit rundem Boden zu wechseln, aber es erleichtert das Fortfahren mit den folgenden Dissoziationsschritten. Zögern Sie nicht, Spritze und/oder Nadel zu wechseln, wenn das Risiko einer Kontamination vermutet wird. - Fahren Sie mit der Zelldissoziation fort, indem Sie die Medium- und Markzellen nacheinander zweimal durch eine 21-Gauge-Nadel, dreimal durch eine 23-Gauge-Nadel und einmal durch eine 25-Gauge-Nadel absaugen und ausstoßen.
HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen, da dies für die Zellen schädlich sein kann. - Übertragen Sie die Suspension in 15 ml Rohre.
- Messen Sie die Zellzahl und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit mit einem automatisierten Zellzähler oder einer Zellkammer für die manuelle Zählung in Gegenwart von Trypanblau, um tote Zellen auszuschließen.
- Zentrifugieren Sie die 15 mL Röhrchen für 7 min bei 300 x g. Mit einer 1 ml Transferpipette vorsichtig auspipetten und den Überstand entsorgen.
- Isolieren Sie Stamm- und Vorläuferzellen durch negative immunmagnetische Sortierung mit einem hämatopoetischen Zellisolationskit der Maus.
HINWEIS: Ziel dieser Zellsortierung ist es, die Zellen zu gewinnen, die für alle Selektionsantikörper negativ sind (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) und somit die Zellen zu eliminieren, die bereits in einer anderen Differenzierungslinie als der megakaryozytären bestehen. - Gemäß den Anweisungen des Kits wird das Zellpellet in frisch zubereitetem M-Medium (PBS mit 2% des Endvolumens des fetalen Rinderserums (FBS), EDTA 1 mM) auf eine Konzentration von 1 × 108 Zellen/ml resuspendiert und die Suspension in 5 mL Polystyrolröhrchen mit rundem Boden auf ein maximales Volumen von 2 ml verteilt.
- Zu den Polystyrolröhrchen geben: normales Rattenserum in einer Konzentration von 50 μL/ml sowie das biotinylierte Antikörper-Gemisch (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) in einer Konzentration von 50 μL Mix pro ml und homogenisieren Sie durch vorsichtiges Flicken der Röhrchen.
HINWEIS: Diese Antikörper binden an Zellen, die sich bereits in einem Differenzierungsweg befinden, mit Ausnahme des megakaryozytären Signalwegs. - Die Röhren 15 Min auf Eis inkubieren.
- Mit Streptavidin beschichtete Magnetperlen in einer Konzentration von 75 μL/ml zugeben und durch vorsichtiges Streichen der Röhrchen homogenisieren.
- 10 Min. erneut auf Eis inkubieren.
- Stellen Sie bei Bedarf mit M-Medium auf ein Endvolumen von 2,5 ml pro Röhrchen ein.
- Homogenisieren Sie die Suspension, indem Sie das Röhrchen vorsichtig streichen, kurz bevor Sie sie ohne ihre Kappen in einen Magneten legen und drei Minuten warten.
HINWEIS: Die Zellen, die bereits in einen Differenzierungsweg eingebunden und mit magnetischen Kügelchen beschichtet sind, werden an der Wand der Röhre im Inneren des Magneten zurückgehalten. - Invertieren Sie Magnet und Rohr, um den Rohrinhalt in ein neues 5-ml-Polystyrolrohr mit rundem Boden zu übertragen.
HINWEIS: Nehmen Sie das Rohr für die Übertragung nicht aus dem Magneten; Dies geschieht, indem der Magnet mit dem Rohr noch invertiert wird. Verwenden Sie eine gleichmäßige Bewegung und schütteln Sie den Schlauch nicht. - Verwerfen Sie das ursprüngliche Röhrchen, das unerwünschte magnetisch markierte Zellen enthält, und legen Sie das neue ohne Kappe für weitere drei Minuten in den Magneten.
- In Schritt 2.20 werden die isolierten Lin−-Zellen in ein neues 15-ml-Röhrchen überführt.
HINWEIS: Wenn für die vorherigen Schritte mehrere 5-ml-Polystyrolröhrchen verwendet wurden, poolen Sie alle Zellen in derselben 15-ml-Röhre. Die nach der Zellsortierung gewonnenen Zellen sind hämatopoetische Stammzellen und Vorläuferzellen. Das Vorhandensein von Thrombopoietin (TPO), dem wichtigsten physiologischen Regulator der Megakaryopoese 10,wird die Zelldifferenzierung in Richtung der megakaryozytären Zelllinie lenken. - Messen Sie die Anzahl und Lebensfähigkeit der Lin−-Zellen wie in Schritt 2.10.
- Berechnen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension zur Zentrifuge, um 1 x 106 lebensfähige Zellen x Well Number zu haben, Well Number ist die Anzahl der Wells, die pro Bedingung ausgesät werden sollen.
- Bereiten Sie ein Röhrchen pro Bedingung mit dem entsprechenden Volumen der Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 x g für 7 min vor.
- Bei flüssigen Kulturen verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in einem vollständigen Kulturmedium (DMEM, PSG 1% des Endvolumens, FBS 10% des Endvolumens, Hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/ml), um die Endkonzentration von 2 × 106 lebensfähigen Zellen/ml (entspricht 1 × 106 Zellen pro 500 μL Well) zu erreichen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C unter 5% CO2. (= Tag 0 der Kultur)
HINWEIS: Siehe den nächsten Absatz für Methylcellulosekulturen Verwenden Sie beispielsweise zur Herstellung eines vollständigen Kulturmediums für eine Vertiefung 435 μL DMEM, 50 μL 100% FBS für 10% Endwert, 5 μL 100% PSG für 1% Final, 5 μL 10 000 U/ml für 100 U/ml end und 5 μL 5 μg/ml TPO für 50 ng/ml end. Typischerweise werden 4-Well- oder 24-Well-Kulturplatten verwendet, da ihr Bohrlochdurchmesser gut zu den 500 μL passt, die pro Vertiefung benötigt werden.
3. Zelleinbettung in Methylcellulose-Hydrogel
HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass das folgende Protokoll die Methode beschreibt, um eine einzelne Hydrogelzellkultur zu erhalten, die sich an die Anzahl der benötigten Vertiefungen anpasst.
- 1 mL Aliquots aus 3% iger Methylcellulose-Stammlösung bei Raumtemperatur auftauen. Bereiten Sie ein separates zusätzliches Aliquot Methylcellulose für die Spritzenbeschichtung vor.
ANMERKUNG: Bei einer Konzentration von 3 % bleibt Methylcellulose bei Raumtemperatur (20-25 °C) flüssig. - Beschichten Sie eine 1 mL Luer Lock Spritze, die mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit Methylcellulose, indem Sie 1 ml Methylcellulose aus dem zusätzlichen Aliquot ziehen. Die Methylcellulose vollständig ausstoßen.
HINWEIS: Dieser Beschichtungsschritt stellt sicher, dass das volumen der in Schritt 3.3 gesammelten Methylcellulose exakt ist. - Ziehen Sie mit der gleichen Spritze und Nadel, aber mit einem neuen Methylcellulose-Aliquot, das entsprechende Volumen methylcellulose (Abbildung 2A).
HINWEIS: Um eine Endkonzentration von 2% Methylcellulose in einem Endvolumen von 500 μL pro Bohrung zu erreichen, sind 333 μL 3% Methylcellulose erforderlich. - Entfernen Sie vorsichtig die Nadel. Schrauben Sie mit einer sterilisierten Pinzette einen Luer-Lock-Anschluss an das Ende der Spritze (Abbildung 2B-C).
- Befestigen Sie eine zweite, unbeschichtete 1 mL Luer Lock-Spritze am Luer Lock-Steckverbinder, um die beiden Spritzen miteinander zu verbinden (Abbildung 2D).
HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, diese zweite Spritze zu beschichten. - Verteilen Sie das Methylcellulosevolumen gleichmäßig auf die beiden Spritzen (Abbildung 2E) und legen Sie sie bis Schritt 3.11 beiseite.
- Das konzentrierte DMEM-Kulturmedium wird so hergestellt, dass im endgültigen Methylcellulosevolumen (Schritt 3.11) für jede Verbindung eine Konzentration erhalten wird, die mit der des flüssigen Kulturmediums identisch ist (PSG 1% des Endvolumens, FBS 10% des Endvolumens, Hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
- Bereiten Sie 167 μL konzentriertes Kulturmedium pro Endvertiefung von 1 × 106 Zellen vor. Dieses Mediumvolumen wird so berechnet, dass eine endgültige Methylcellulosekonzentration von 2% erreicht wird. Das Gesamtvolumen im Bohrloch wird 500 μL betragen (167 μL Zellsuspension in konzentriertem Kulturmedium + 333 μL Methylcellulose) und alle Komponenten werden eine Konzentration aufweisen, die mit der in flüssigen Vertiefungen identisch ist.
- Um beispielsweise ein komplettes Kulturmedium für eine Vertiefung vorzubereiten, verwenden Sie 102 μL DMEM, 50 μL 100% FBS für 10% Final, 5 μL 100% PSG für 1% Final, 5 μL 10 000 U/ml für 100 U/ml Final und 5 μL 5 μg/ml TPO für 50 ng/ml Final. Es ergibt ein Volumen von 167 μL, das zur Resuspendierung der Zellen verwendet wird, und mit der Zugabe von 333 μL Methylcellulose beträgt das Endvolumen 500 μL.
- Nach Abschluss des Zentrifugationsschrittes 2.26 wird der Überstand verworfen und das Zellpellet im konzentrierten Kulturmedium im Verhältnis 1 × 106 Zellen pro 167 μL resuspendiert.
- Nehmen Sie die Spritzen zurück und trennen Sie eine davon vom Stecker.
- 167 μL der Zellsuspension pipettieren.
- Geben Sie die Zellsuspension direkt in den Spritzenanschluss (Abbildung 2F), und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen.
HINWEIS: Ziehen Sie beim Hinzufügen der Zellsuspension langsam gleichzeitig den Spritzenkolben, um Platz für die Zellsuspension zu schaffen. - Schließen Sie die beiden Spritzen vorsichtig wieder an (Abbildung 2G), ohne die Aufhängung im Schraubgewinde zu verlieren.
HINWEIS: Ziehen Sie vor dem erneuten Anschließen den Kolben, um den Stecker halb leer zu lassen und genügend Platz für die zweite Spritze zu lassen, ohne dass die Aufhängung überläuft. - Das Methylcellulosemedium mit der Zellsuspension mit zehn Hin- und Her-Kolbenbewegungen zwischen den beiden Spritzen langsam homogenisieren (Abbildung 2H).
- Ziehen Sie das Gesamtvolumen in eine Spritze und trennen Sie die beiden Spritzen, wobei der Stecker auf der leeren Spritze verbleibt.
- Entleeren Sie den Inhalt der Spritze in eine Vertiefung einer 4-Well-Platte (Abbildung 2I).
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C unter 5%CO2 (= Tag 0 der Kultur).
HINWEIS: Es ist möglich, zwei Methylcellulose-Vertiefungen mit einem Spritzenpaar herzustellen. Erhöhen Sie um zwei das Volumen von Methylcellulose und das Volumen der Zellsuspension, um 2 x106 Zellen zu haben. Nach Abschluss von Schritt 3.13. Verteilen Sie das Volumen gleichmäßig zwischen den beiden Spritzen, um jeweils 500 μL zu haben. Trennen Sie sie und leeren Sie die ohne den Verbinder in einem Kulturbrunnen. Schließen Sie die Spritzen wieder an, um das Volumen von dem Gerät, das den Stecker behalten hat, auf das andere zu übertragen. Trennen Sie die Spritzen, die mit dem 500 μL sollte den Verbinder nicht befestigt haben, und säen Sie die Zellen in einer zweiten Kultur gut aus. Die 3%ige Methylcellulose wird als Stammlösung in Iscoves Modified Dulbecco's Medium (IMDM) gekauft, während konzentrierte Zellen in DMEM suspendiert werden. Es wurden zunächst Vergleichstests durchgeführt, um sicherzustellen, dass dieses Mischmedium keinen Einfluss auf das Ergebnis des Experiments hatte, insbesondere im Vergleich zur flüssigen Kultur in 100% DMEM.
4. Zell-Resuspension für die Proplatlet-Analyse
ANMERKUNG: Die Analyse der Fähigkeit, Proplatelette zu bilden, muss unter vergleichbaren Bedingungen zwischen flüssigen und Methylcellulose-gezüchteten Megakaryozyten durchgeführt werden. Die physikalischen Einschränkungen, die durch das Methylcellulose-Hydrogel ausgeübt werden, hemmen die Proplatlet-Erweiterung. Daher werden methylcellulosegewachsene Zellen am Tag 3 der Kultur in frischem flüssigem Medium resuspendiert, damit sie Proplatele verlängern können. Methylcellulosehydrogel ist ein physikalisches Hydrogel, das bei Zugabe von flüssigem Medium leicht verdünnt werden kann. Um Artefakte vor resuspension und zentrifugation zu vermeiden, müssen Zellen im Zustand des Kontrollflüssigkeitsmediums gleichzeitig auf die gleiche Weise behandelt werden wie Methylcellulose-gezüchtete Zellen. Beziehen Sie sich auf die schematische Darstellung des Experiments (Abbildung 1).
- Bereiten Sie 10 ml DMEM - 1% PSG vorgewärmt bei 37 °C in einem 15 ml Röhrchen für jede Vertiefung vor, um sie zu resuspendieren.
- Resuspendieren Sie vorsichtig die Zellen aus jeder Vertiefung in den 10 ml DMEM - 1% PSG.
HINWEIS: Führen Sie vorsichtig mehrere Auf- und Abwärtsbewegungen durch, um die Methylcellulose vollständig zu verdünnen. Achten Sie bei den Flüssigkeitsbrunnen darauf, alle am Boden des Brunnens abgelagerten Zellen zu sammeln. - Zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 min bei 300 × g.
- Bereiten Sie in der Zwischenzeit das komplette Kulturmedium vor (DMEM, PSG 1% des Endvolumens, FBS 10% des Endvolumens, Hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/ml).
HINWEIS: Bei diesem Schritt wird jede Vertiefung entnommen, um die Hälfte verdünnt zu werden, daher 1 ml vollständiges Kulturmedium pro Vertiefung herstellen. - Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 1 ml Kulturmedium für jedes Röhrchen.
- 500 μL Zellsuspension pro Vertiefung in eine 4- oder 24-Well-Platte neu aussäten und bei 37 °C unter 5%CO2inkubieren.
HINWEIS: Erhalten Sie aus einer Anfangsbohrung 2 Vertiefungen für die Proplatletvisualisierung in zweifacher Form. Bitte beachten Sie, dass diese Duplikate, da sie aus derselben Stichprobe stammen, nicht als unabhängige Replikate betrachtet werden können. - 24 Stunden nach dem erneuten Aussäen, am Tag 4 der Kultur, erfassen Sie zufällig 10 Bilder pro Vertiefung mit Hellfeldmikroskopie und dem 20× Objektiv.
HINWEIS: Die Zellen neigen dazu, sich in der Mitte des Bohrlochs zu gruppieren, stellen Sie sicher, dass sie nicht zu viele Zellen auf dem Feld haben, da dies die Visualisierung und Quantifizierung von Proplatleten erschweren kann. Stellen Sie sicher, dass Sie mindestens 5 Megakaryozyten pro Feld erfassen. - Zählen Sie die Gesamtzahl der Megakaryozyten und der Megakaryozyten, die Proplatelets in jedem Bild verlängern, und berechnen Sie den Anteil der Megakaryozyten, die Proplatelets verlängern.
HINWEIS: Die Quantifizierung ist nicht automatisiert; Führen Sie die Zellenzählung manuell durch. Das Zählen kann durch die Verwendung des Zellzähler-Plugins von ImageJ erleichtert werden, um auf die Zellen zu klicken, um sie bei der Zählung zu markieren. 10 Felder, die pro Bohrloch und Bohrungen in Zweifachform erworben wurden, repräsentieren ungefähr 150-300 Megakaryozyten pro Zustand.
5. Zellfixierung und -abruf für zukünftige Analysen
VORSICHT: Dieses Protokoll verwendet Fixateure, die unter einem Abzug gehandhabt werden müssen, wobei Schutzausrüstung getragen werden muss.
HINWEIS: Ziel ist es, die auf die Zellen angewendeten Gelbeschränkungen intakt zu halten, bis sie vollständig fixiert sind. Daher und unabhängig vom verwendeten Fixiermittel muss es in der Vertiefung auf der Methylcellulose hinzugefügt werden, ohne das Gel zu stören. Das gleiche Protokoll wird auf flüssige Kulturen angewendet.
- Fügen Sie ein Volumen fixativer Lösung, das dem ausgesäten Volumen (500 μL in diesem Protokoll) entspricht, auf die Methylcellulose auf, ohne das Gel zu stören. Warten Sie auf die entsprechende Zeit entsprechend dem verwendeten Fixiermittel (mindestens 10 min).
HINWEIS: Die fixierende Diffusion im gesamten Gel sollte sehr schnell sein, wie eine schnelle Änderung der Gelfarbe zeigt (von rosa zu einem gelb-orangen Farbton). Paraformaldehyd (8% in DPBS, 500 μL pro Well) wird normalerweise für die Immunmarkierung verwendet, während Glutaraldhehydhyd (5% im Cacodylatpuffer, 500 μL pro Well) für die elektronenmikroskopische Analyse verwendet wird. - Verwenden Sie eine P1000-Pipette vorsichtig mehrere Up-and-Down-Pipettierungen mit dem Fixiermittel und dem Gel, um die Methylcellulose homogen zu verdünnen.
- Übertragen Sie mit derselben Pipette und Spitze das gesamte Volumen aus dem Bohrloch in ein 15-ml-Röhrchen mit 10 ml DPBS und homogenisieren Sie es.
- Zentrifugieren Sie die Mischung bei 300 × g für 7 min.
HINWEIS: Möglicherweise ist ein zweiter Waschschritt erforderlich, um die gesamte Methylcellulose zu eliminieren - Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Megakaryozytenpellet im entsprechenden Medium gemäß der gewünschten Analyse (Immunmarkierung, Durchflusszytometrie9,Elektronenmikroskopie ...) (zur Elektronenmikroskopie siehe auch die Paper-Methode"In situ exploration of the major steps of megakaryopoiesis using transmission electron microscopy" in dieser JoVE-Ausgabe).
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Representative Results
Die mit diesem Protokoll erhaltenen Daten wurden ursprünglich 2016 in Blood veröffentlicht9.
Gemäß dem Protokoll wurden die Zellen entweder in flüssigem oder Methylcellulose-Hydrogel-Medium ausgesät. Zellen in flüssigem Medium haben sich alle am Boden des Brunnens sedimentiert, in Kontakt mit der steifen Kunststoffoberfläche und manchmal mit anderen Zellen. Im Gegensatz dazu sind zellen, die in Methylcellulosehydrogel eingebettet sind, homogen im Gel verteilt und werden von benachbarten Zellen isoliert (Abbildung 3A). Methylcellulosegel bei einer Endkonzentration von 2% erhöht den mittleren Megakaryozytendurchmesser im Vergleich zur Flüssigkultur sehr leicht (Abbildung 3B), in Übereinstimmung mit der höher berichteten Ploidie9. Im Gegensatz dazu beeinträchtigt eine Erhöhung der Methylcellulosekonzentration um 0,5% die Megakaryozytendifferenzierung, wie ein kleinerer mittlerer Durchmesser zeigt (Abbildung 3B).
Ein spürbarer Unterschied in der Megakaryozyten-Ultrastruktur wird zwischen Megakaryozyten, die in Flüssigkultur differenziert sind, und solchen, die in vivo im Knochenmark differenziert sind, beobachtet. Ein charakteristisches Merkmal reifer Megakaryozyten ist ein komplexes intrazytoplasmatisches Membrannetzwerk, das DMS (Demarkation Membrane System), das als Reservoir für die Membran der zukünftigen Blutplättchen dient. In reifen Megakaryozyten organisiert sich das DMS zu verflochtenen Membranschichten, die den größten Teil des Zytoplasmas einnehmen. Durch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) scheinen sie eng besiedelt zu sein und zytoplasmatische Territorien abzugrenzen(Abbildung 3C oberes Panel) (für das TEM-Verfahren siehe die Papiermethode"In situ exploration of the major steps of megakaryopoiesis using transmission electron microscopy" in derselben JOVE-Ausgabe). In flüssiger Kultur haben DMS-Membranen meist das Aussehen kleiner runder, ovaler oder länglicher Vesikel ohne Abgrenzung zytoplasmatischer Territorien(Abbildung 3C mittleres Panel). Im Gegensatz dazu fördert die 2% ige Methylcellulosekultur die Organisation des DMS in einer Mehrheit der Megakaryozyten, wobei membranen eng anliegen und zytoplasmatische Territorien abgrenzen, die denen in situ ähneln(Abbildung 3C unteres Panel). Dieses Ergebnis zeigt, dass die 2% Methylcellulose-Hydrogel-Kultur aufgrund der mechanischen Einschränkungen des Umweltmediums eine bessere Megakaryozytendifferenzierung ermöglicht.
Nach dem Zelltransfer in ein flüssiges Medium an Tag 3 beginnen Megakaryozyten nach 4 h 9mit der Verlängerung von Proplaten. Abbildung 4 zeigt die Quantifizierung des Anteils der Megakaryozyten mit ausgedehnten Proplaten 24 h nach Resuspension im flüssigen Milieu. Zehn Bilder wurden zufällig pro Vertiefung aufgenommen, wobei die Hellfeldmikroskopie und das 20×Objektiv verwendet wurden (Abbildung 4A). Die Quantifizierung wurde blind und manuell mit dem Zellzähler-Plugin auf Fiji (ImageJ) durchgeführt (Abbildung 4B). Da es sich um primäre Zellkulturen handelt, gibt es eine Variabilität zwischen den Experimenten, aber das Protokoll bleibt robust und bietet eine gute Reproduzierbarkeit. Im flüssigen Vorkulturzustand sollte der Proplatanteil zwischen 10% und 20% liegen, während dieser Anteil für die Hydrogel-Präkultur verdoppelt wird.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des gesamten Prozesses. Knochen werden seziert, Mark ausgespült und Zellen mechanisch dissoziiert. Stamm- und Vorläuferzellen von Interesse (Lin-Zellen) werden durch ein immunmagnetisches Negativsortierverfahren isoliert und entweder in flüssigem oder Hydrogelmedium (Tag 0) ausgesät. Am Tag 3 der Kultur (der insgesamt eine Dauer von 4 Tagen darstellt) werden beide Bedingungen in einem separaten Milieu der frischen Flüssigkultur resuspendiert. Dieser zweite Kultivierungsschritt wird vom Tag 3 bis zum Tag 4 der Kultur durchgeführt. Der Anteil der MKs, die Proplatelets ausdehnen, wird an Tag 4 der Kultur gemessen. Zur visuellen Klarheit wird pro Vertiefung eine Zelle schematisiert. Der blaue Kreis zeigt eine einzelne Zelle mit ihrem Kern in Lila. Im letzten Schritt werden beide MKs mit proplatelet dargestellt. Der Anteil der MKs, die Proplatelets bilden, variiert je nach Flüssig- oder Methylcellulose-Vorkultur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Zelleinbettung in Methylcellulose-Hydrogel. Nach dem Vorbeschichten der Spritzenwand(A)das entsprechende Volumen Methylcellulose ziehen; (B, C) die Nadel trennen und einen Stecker an die Spritze schrauben; ( D) die Methylcellulose zur Hälfte durch den Verbinder drücken und eine zweite Spritze anbringen; E) die Methylcellulose gleichmäßig auf die beiden Spritzen verteilen und trennen; F) die Zellsuspension in die Spritze geben, die den Stecker trägt; ( G) die beiden Spritzen wieder verbinden; (H) homogenisieren, indem das gesamte Volumen einige Male von einer Spritze zur anderen gedrückt wird; (I) säen Sie die Zellen aus, indem Sie das gesamte Volumen in eine Kulturschale ausstoßen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Megakaryozyten-Eigenschaften je nach Kulturzustand. (A) Repräsentative Bilder von Megakaryozyten an Tag 3 der Kultur in Flüssigkeit (linkes Bild) oder 2% Methylcellulose-Hydrogel-Medium (rechtes Bild). Maßstabsbalken = 50 μm(B)Mittlerer Durchmesser von Megakaryozyten, die in flüssigem Medium oder in 2% oder 2,5% Methylcellulose-Hydrogel gezüchtet wurden. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD in 3 unabhängigen Kulturen ausgedrückt, wobei insgesamt mindestens 100 Megakaryozyten untersucht wurden. *, P<0,05, ***P < 0,0001, unter Verwendung der 1-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Multiple-Vergleichstest von Bonferroni. (Grafik angepasst an Aguilar et al. 2016) ( C) Schematische Ansicht (links) und repräsentative elektronische Mikroskopiebilder (Mitte) von murinen Megakaryozyten; rechte Tafeln, Nahaufnahmen aus den weißen Quadraten (Maßstabsleiste = 5 μm für die mittleren elektronischen Mikroskopiebilder und 2 μm für Nahaufnahmen). Obere Panels sind in situ Megakaryozyten, die Mitte stellt Megakaryozyten dar, die in vitro in flüssiger Kultur gezüchtet wurden, und untere Panels sind Megakaryozyten, die in 3D-Methylcellulose-Hydrogel gezüchtet wurden. Diese Daten wurden ursprünglich im Blood Journal, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_95veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Repräsentative Ergebnisse der Proplatlet-Quantifizierung. (A) repräsentative Bilder von Megakaryozyten am Tag 4 der Kultur. Die Zellen wurden drei Tage in flüssigem (links) oder 2% Methylcellulose-Hydrogel-Medium (rechts) inkubiert, gefolgt von einem Tag Resuspension in flüssigem Medium. Schwarze Pfeile zeigen Megakaryozyten an, die Proplatele verlängern. (Maßstabsleiste = 50 μm). (B) Repräsentative Quantifizierungsdaten der Proplatbildung. Proplatletbildung quantifiziert an Tag 4 für Megakaryozyten, die zuvor von Tag 0 bis Tag 3 in flüssigem oder 2% Methylcellulose-Hydrogel-Medium vorkultiviert wurden. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der Megakaryozyten ausgedrückt, die Proplatelette verlängern (mittlere ± SD) und stammen aus 3 unabhängigen Experimenten, wobei eine Gesamtzahl von Megakaryozyten pro Zustand >750 untersucht wurde (t-Test, p = 0,0023). Der mittlere Anteil der Megakaryozyten, die Proplatelets verlängern, beträgt 16% im flüssigen Zustand und 39% für die Methylcellulose-Hydrogel-Präkultur. Dieses Ergebnis entspricht dem zuvor nachgewiesenen und veröffentlichten Effekt der Hydrogel-Präkultur, der die Proplatletbildung im Vergleich zum flüssigen Zustand erhöht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In den letzten zehn Jahren hat die Mechanobiologie in vielen Bereichen der Biologie immer mehr Interesse geweckt. Es ist jetzt allgemein anerkannt, dass die mechanische Umgebung, die die Zellen umgibt, eine Rolle in ihrem Verhalten spielt, was die Bedeutung der Untersuchung betont, wie Megakaryozyten extrazelluläre mechanische Hinweise wahrnehmen und darauf reagieren. Es ist schwierig, die Steifigkeit des Knochenmarkgewebes in situ11genau zu messen, insbesondere wenn wir das hämatopoetische rote Mark betrachten, da es sich bei großen Säugetieren in trabekulären Knochen befindet, während das leichter zugängliche Mark aus der Diaphyse im Wesentlichen aus Adipozyten (gelbes Mark) besteht12. Im Falle eines isolierten Knochenmarks von Mäusen, bei dem die Diaphyse im Wesentlichen rotes Mark enthält, besteht ein weiteres Problem darin, dass das Gewebe nach der Extraktion aus dem Knochen nicht kohäsiv bleibt. Shin und seine Mitarbeiter schafften es jedoch, die Steifigkeit des Herzmarks der Maus mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie zu messen und fanden einen Wert vonE-Mark = 0,3 ± 0,1 kPa, wodurch das Mark zu den weichsten Geweben gehört6.
Das Interesse des hier beschriebenen Verfahrens besteht darin, das Megakaryozytenverhalten in flüssigem Medium mit dem im Hydrogel zu vergleichen. Im flüssigen Milieu haben sich alle Zellen am Boden des Brunnens sedimentiert, in Kontakt mit der steifen Kunststoffoberfläche und manchmal mit anderen Zellen. Im Gegensatz dazu sind Zellen, die in Methylcellulosehydrogel eingebettet sind, homogen im Gel verteilt und vollständig von den anderen Zellen isoliert (Abbildung 3A). Daher werden sie im Wesentlichen mechanischen Hinweisen unterworfen, die durch den Einschluss bereitgestellt werden, mit Ausnahme der Juxtacrin-Kommunikation. Die parakrine Stimulation kann nicht völlig ausgeschlossen werden. Dennoch sind die im Methylcellulose-Hydrogel eingebetteten Zellen entgegen der Situation im Knochenmark weit voneinander entfernt und wir können daher davon ausgehen, dass sezernierte Substanzen, wenn sie benachbarte Zellen erreichen, sie sehr verdünnt sein können.
Die Methode ist einfach einzurichten und erfordert keine spezifischen Fähigkeiten. Methylcellulose ist ein physikalisches Gel, dessen Polymerketten nicht-kovalente Vernetzungen bilden. Da es bei niedriger Temperatur flüssig ist, geleelt es beim Erhöhen der Temperatur (siehe den Artikel von Aguilar et al. 20169 für weitere Informationen über die Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften des Gels). Dieser Gelzustand kann nach Verdünnung in wässriger Lösung leicht umgekehrt werden, was eine einfache Wiederherstellung der Zellen ermöglicht, unabhängig davon, ob sie in Gel oder als lebende Zellen fixiert sind.
Ein kritischer Faktor ist dabei die Steifigkeit des Hydrogels. Das entsprechende Methylcellulosevolumen sollte sehr genau dosiert werden, da bereits eine kleine Änderung der Hydrogelkonzentration einen wichtigen Einfluss auf die Steifigkeit des Milieus und damit auf die Megakaryozytenreifung haben kann. Zum Beispiel wurde zuvor gezeigt, dass eine Erhöhung der Methylcellulosekonzentration von 2 auf 2,5% die Gelsteifigkeit (Elastizitätsmodul) um das 10-fache erhöht. Ein möglicher Fallstrick ist, dass es keine einfache Qualitätskontrolle gibt, um die genauen rheologischen Eigenschaften der Methylcellulose in jeder experimentellen Vertiefung zu überprüfen, sobald sie mit Zellen ausgesät wurde. Nichtsdestotrotz ist ein wesentliches Kriterium, das eine korrekte Gelkonzentration sichert, die richtige Reifung der Megakaryozyten innerhalb des Hydrogels, was sich in ihrer Größe widerspiegelt, die in etwa der in flüssigem Medium ähnelt. Eine Abnahme ihres mittleren Durchmessers könnte eine fehlerhafte Differenzierung widerspiegeln, ähnlich wie sie bei zunehmender Steifigkeit mit 2,5% Methylcellulose auftritt (Abbildung 3B).
Eine weitere Einschränkung der Methode besteht darin, dass die Zellgewinnung aus dem Hydrogel mehr Zeit in Anspruch nimmt als in der klassischen Kultur, da es notwendig ist, das Gel vor der Zentrifugation zuerst zu verdünnen. Wenn Methylcellulose vollständig entfernt werden muss, z. B. um Zelllysat für weitere Western-Blot- oder RNA-Isolationsverfahren zu erhalten, kann ein zusätzlicher Waschschritt erforderlich sein, während dessen Modifikationen in Proteinen oder RNA auftreten können (Proteindephosphorylierung, RNA-Abbau ...).
Ein kritischer Punkt, der bei der Prozedur zu berücksichtigen ist, ist die Zellzahl, die unter allen Bedingungen gleich sein muss. Dies ist nicht so trivial, da zellen in der flüssigen Kultur dazu neigen, am Boden des Brunnens zu sedimentieren und einige von ihnen auf der Kunststoffoberfläche haften, was bei Zellen in Suspension in Hydrogel nicht der Fall ist. Ein Fallstrick ist eine unvollständige Sammlung der Zellen im flüssigen Zustand, was nach der Suspension in flüssigem Medium an Tag 3 zu einem unterschiedlichen Zellgehalt zwischen "flüssig" und "Hydrogel" führt. Ein solcher Unterschied kann zu Diskrepanzen in den endgültigen Daten führen. Als Checkpoint kann in diesem Stadium eine Zellnummerierung durchgeführt werden, bevor die Zellen wieder eingesät werden. Es ist vorzuziehen, dies manuell mit einem Nageotte-Hämozytometer zu tun, da es besonders für größere Zellen wie Megakaryozyten geeignet ist.
Wie bei jeder primären Zellkultur besteht ein mögliches Kontaminationsrisiko. Eine Kontamination ist die wahrscheinlichste Erklärung für einen ungewöhnlich niedrigen Proplatletanteil im Methylcellulose-Vorkulturzustand, da eine kleine Kontamination schwieriger zu erkennen zu sein scheint als in flüssigem Medium. Daher kann es bis zur Proplatlet-Quantifizierung unbemerkt bleiben, was zu irreführenden Ergebnissen führt. Gute Laborpraktiken müssen strikt eingehalten werden, insbesondere bei der Verkapselung von Methylcellulosezellen, die zahlreiche und präzise Manipulationen von Spritzen und Verbindern erfordert. Die Lebensfähigkeit der Megakaryozyten sollte auch mit Trypanblau unter Verwendung einer Nageotte-Zellkammer zur manuellen Zählung überprüft werden, bevor sie am Tag 3 erneut ausgesät wird.
Insgesamt beschreibt das hier bereitgestellte Protokoll ein In-vitro-Modell für den Vergleich zwischen klassischer Flüssigkultur und einer 3D-Kultur unter Verwendung von Methylcellulosehydrogel. Bemerkenswert ist, dass dieses Kulturprotokoll für primäreLin-Zellen der Maus beschrieben ist und noch nicht an menschliche Zellen angepasst wurde. Dieses 3D-Modell ist ein nützliches Werkzeug, um den Einfluss der mechanischen Umgebung auf das Verhalten und die Reifung von Megakaryozyten zu untersuchen9. Es ist auch möglich, Verbindungen in der Kultur (sogar auf dem Gel) hinzuzufügen, um den Einfluss von Medikamenten auf das Megakaryozytenverhalten / die Reifung und die Proplatbildung zu untersuchen. Schließlich ermöglicht dieses Kultursystem durch die Reproduktion der mechanischen Einschränkungen, denen Zellen im Knochenmark begegnen können, die Untersuchung abnormaler Phänotypen, die in klassischen Flüssigkulturen nicht beobachtet werden konnten, wie zuvor für Myh9 Knockout-Megakaryozyten9,13,14gezeigt wurde .
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Fabien Pertuy und Alicia Aguilar, die diese Technik zunächst im Labor entwickelt haben, sowie Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasbourg), der die viskoelastischen Eigenschaften des Methylcellulose-Hydrogels charakterisierte. Diese Arbeit wurde von ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) und einem ARN-Stipendium (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics) unterstützt. Julie Boscher ist Empfängerin der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-Förderkennzeichen FDT202012010422).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
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- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
