Summary
В настоящее время признано, что трехмерная среда клеток может играть важную роль в их поведении, созревании и / или дифференцировки. Этот протокол описывает трехмерную модель клеточной культуры, предназначенную для изучения влияния физической локализации и механических ограничений на мегакариоциты.
Abstract
3D-среда, приводящая как к ограничению, так и к механическим ограничениям, все чаще признается в качестве важного детерминанта поведения клеток. Таким образом, 3D-культура была разработана для лучшего подхода к ситуации in vivo. Мегакариоциты дифференцируются от гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC) в костном мозге (BM). БМ является одной из самых мягких тканей тела, заключенной внутри кости. Поскольку кость плохо растяжима в клеточном масштабе, мегакариоциты одновременно подвергаются слабой жесткости и высокой конфайнментности. В этом протоколе представлен метод восстановления отрицательных (Lin-) HSPC линии мыши путем иммуномагнитной сортировки и их дифференцировки в зрелые мегакариоциты в 3D-среде, состоящей из метилцеллюлозы. Метилцеллюлоза не реагирует по отношению к мегакариоцитам, и ее жесткость может быть скорректирована до нормального костного мозга или увеличена, чтобы имитировать патологический фиброзный костный мозг. Процесс восстановления мегакариоцитов для дальнейших клеточных анализов также подробно описан в протоколе. Хотя расширение проплатлетов предотвращается в 3D-среде, ниже описано, как повторно суспендировать мегакариоциты в жидкой среде и количественно оценить их способность расширять проplatelets. Мегакариоциты, выращенные в 3D-гидрогеле, обладают более высокой способностью к образованию проплацетов по сравнению с теми, которые выращиваются в жидкой среде. Эта 3D-культура позволяет i) дифференцировать прародителей в сторону мегакариоцитов, достигающих более высокого состояния созревания, ii) рекапитулировать фенотипы, которые могут наблюдаться in vivo, но оставить незамеченными в классических жидких культурах, и iii) изучать пути трансдукции, индуцированные механическими сигналами, предоставляемыми 3D-средой.
Introduction
Клетки в организме испытывают сложную 3D-микросреду и подвергаются взаимодействию между химическими и механофизическими сигналами, включая жесткость из ткани и ограничение из-за соседних клеток и окружающих матриц 1,2,3. Важность жесткости и удержания для поведения клеток была признана только в последние десятилетия. В 2006 году основополагающая работа Engler et al. 4 подчеркнула важность механической среды для дифференцировки клеток. Авторы продемонстрировали, что изменение жесткости клеточного субстрата привело к ориентации стволовых клеток на различные линии дифференцировки. С тех пор влияние механических сигналов на судьбу и поведение клеток становится все более признанным иизученным. Несмотря на то, что это одна из самых мягких тканей организма, костный мозг имеет 3D-структурную организацию, которая ограничена внутри кости. Жесткость костного мозга, хотя технически трудно измерить точно, по оценкам, лежит между 15 и 300 Па 5,6. Внутри стромы клетки плотно ограничены друг другом. Кроме того, большинство из них мигрируют в сторону синусоидальных сосудов, чтобы войти в кровообращение. Эти условия создают дополнительные механические ограничения на соседние клетки, которые должны приспосабливаться к этим силам. Механические сигналы представляют собой важный параметр, последствия которого для дифференцировки мегакариоцитов и образования проплатлетов были изучены совсем недавно. Хотя мегакариоциты могут дифференцироваться in vitro в традиционной жидкой культуре, они не достигают степени созревания, наблюдаемой in vivo,отчасти из-за отсутствия механических сигналов из 3D-среды 7. Выращивание прародителей, встроенных в гидрогель, приносит 3D-механические сигналы, которых не хватает в жидкой среде.
Гидрогели широко используются в течение нескольких десятилетий в гематологической области, в частности, для выращивания клеток в колониеобразующих анализах для количественной оценки гемопоэтических прародителей. Однако такие гидрогели редко использовались для изучения биологического воздействия 3D-механической среды на созревание и дифференцировку кроветворных клеток. За последние несколько лет наша лаборатория разработала 3D-модель культуры с использованием гидрогеля 8 на основеметилцеллюлозы. Этот нереактивный физический гель является полезным инструментом для имитации физических ограничений нативной среды мегакариоцитов. Его получают из целлюлозы путем замены гидроксильных остатков (-OH) метоксидными группами (-OCH3). Как степень метилозамещения, так и концентрация метилцеллюлозы определяют жесткость гидрогеля после его желляции. На этапе разработки данной методики было продемонстрировано, что модуль Юнга в диапазоне от 30 до 60 Па является оптимальной жесткостью геля для роста мегакариоцитов 9.
Следующий протокол описывает метод выращивания мышиных мегакариоцитарных прародителей в 3D-гидрогеле метилцеллюлозы. Ранее было показано, что по сравнению со стандартной жидкой культурой эта гидрогелевая культура повышает степень полиплоидизации мегакариоцитов, улучшает созревание и внутриклеточную организацию, а также увеличивает способность мегакариоцитов к продлению проплацирования после повторного суспендирования в жидкой среде 9. В данной рукописи подробно описан протокол выделения Lin− клеток костного мозга мыши и их встраивания в гидрогель метилцеллюлозы для 3D-культуры, а также количественная оценка их способности производить проплацелеты и восстановление клеток для дальнейших анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты должны проводиться в соответствии с институциональными руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных. Все протоколы, показанные на видео, были выполнены в строгом соответствии с европейским законодательством и рекомендациями Наблюдательного совета Etablissement Français du Sang (EFS). Первая версия этого протокола была первоначально опубликована в 2018 году в Журнале Methods in Molecular Biology 8.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлено схематическое представление всего процесса. Этот процесс включает в себя 1) рассечение кости, извлечение костного мозга и механическую изоляцию клеток костного мозга, 2) магнитную сортировку отрицательных (Lin-) клеток линии, 3) посев в жидкий или метилцеллюлозный гидрогель и 4) ресуспензию мегакариоцитов, выращенных в 3D-геле, для исследования образования проплатлетов в жидкой среде.
1. Сбор костей у взрослых мышей
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе важно свести к минимуму микробное загрязнение.
- Подготовьте трубку объемом 15 мл для сбора костной ткани с помощью модифицированной среды Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM), содержащей 1% от общего объема смеси антибиотиков пенициллин-стрептомицин-глутамин (PSG) (пенициллин 10000 Ед/мл, стрептомицин 100000 мкг/мл и L-глутамин 29,2 мг/мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если все используемые мыши имеют одинаковый генотип, объедините все кости в одну трубку, содержащую 1 мл DMEM - PSG 1% на количество мышей. Антибиотики важны для предотвращения возможного размножения бактерий во время отбора проб костей. - Заполните пробирку 50 мл этанолом 70% для дезинфекции костей и еще одну для промывки инструментов во время процедуры. Используйте стерилизованные инструменты для рассечения.
- Обезболивают мышей с помощью ингаляции изофлурана (4%) и быстро приступают к вывиху шейки матки, чтобы усыпить мышей. Быстро погружайте организм в 70% этанол для дезинфекции и предотвращения микробного загрязнения.
- Быстро рассекает большеберцовую и бедренную кости.
- С помощью скальпеля отрежьте эпифизы бокового конца лодыжки для большеберцовой кости и бокового конца бедра для бедренной кости.
- Погрузите кости на одну секунду в 70% этанол, прежде чем погружать их в среду DMEM, содержащую 1% PSG.
2. Диссоциация костного мозга и выделение lin-клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола выполняется под ламинарной вытяжкой. Для одной культуры все колодцы являются частью одного эксперимента и не могут рассматриваться как независимые биологические реплики. Клетки всех мышей объединяются вместе, чтобы обеспечить однородность всех скважин и иметь возможность сравнивать их друг с другом, устраняя возможную межиндовую изменчивость. Для независимых биологических реплик культуру необходимо повторить.
- Поместите кости в чашку Петри и дважды поднимите их в стерильном фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco (DPBS), чтобы удалить потенциальные загрязняющие вещества.
- Готовят ДМЭМ - 1% ПСЖ в тубах 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте 2 мл DMEM - 1% PSG на мышей, используемых для эксперимента. - Наполните шприц 5 мл, оснащенный иглой 21-го калибра с DMEM - 1% PSG.
- Удерживая кость щипцами, вводят только скос иглы на коленном боковом конце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эпифиз коленной стороны должен оставаться нетронутым от рассечения, оставляя небольшую полость в его центре, через которую вставляется игла. Оставшийся эпифиз будет поддерживать кость, прикрепленную к игле во время промывки. Будьте осторожны, чтобы не вводить больше, чем скос в кости, так как это может раздавиться и повредить костный мозг. - Быстро нажмите на шприц-поршень, чтобы смыть костный мозг в трубку 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание брызг и облегчения промывки костного мозга и освобождения поместите свободный конец кости на стенку трубки, погруженной в ДМЭМ - 1% ПСГ. На практике объем от 500 мкл до 1 мл обычно достаточен для изгнания костного мозга из кости. Когда костный мозг был полностью изгнан, кость стала белой. В случае, если костный мозг не был полностью изгнан из диафиза, о чем судят по некоторому оставшемуся красному цвету, можно повторить прилив со свежей средой. - Повторите шаги 2.4. и 2.5. для всех костей, заправляя шприц 5 мл DMEM - 1% PSG при необходимости.
- Используйте тот же шприц объемом 5 мл с иглой 21 калибра для переноса общего объема среды, содержащей промытый костный мозг, в трубки с круглым дном по 10 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет абсолютной необходимости переходить на трубку с круглым дном 10 мл, но это облегчает переход к следующим шагам диссоциации. Не стесняйтесь менять шприц и / или иглу, если подозревается риск загрязнения. - Приступайте к диссоциации клеток путем аспирации и изгнания клеток среды и костного мозга последовательно два раза через иглу 21-го калибра, три раза через 23-й калибр и один раз через иглу 25-го калибра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пузырьков воздуха, так как это может быть вредно для клеток. - Переложите суспензию в пробирки по 15 мл.
- Измерьте количество ячеек и проверьте жизнеспособность с помощью автоматизированного счетчика клеток или камеры клеток для ручного подсчета в присутствии трипан-синего цвета, чтобы исключить мертвые клетки.
- Центрифугировать 15 мл в пробирках в течение 7 мин при 300 х г. Используя передаточную пипетку 1 мл, осторожно вытаскивайте пипетку и выбрасывайте супернатант.
- Изолируйте стволовые и прогениторные клетки методом отрицательной иммуномагнитной сортировки с помощью набора для изоляции гемопоэтических клеток мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этой сортировки клеток является извлечение клеток, которые являются отрицательными для всех селекционных антител (CD5, CD11b, CD19, CD45R / B220, Ly6G / C (Gr-1), TER119, 7-4) и, следовательно, устранение клеток, которые уже участвуют в линии дифференцировки, отличных от мегакариоцитарной. - Следуя инструкциям набора, повторно суспендируют клеточную гранулу в свежеприготовленной М-среде (PBS с 2% от конечного объема фетальной бычий сыворотки (FBS), ЭДТА 1 мМ) до концентрации 1 × 108 клеток/мл и распределяют суспензию в круглодонных полистирольных трубках по 5 мл до максимального объема 2 мл.
- Добавляют в полистирольные пробирки: обычную крысиную сыворотку в концентрации 50 мкл/мл, а также смесь биотинилированных антител (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) в концентрации 50 мкл смеси на мл и гомогенизируют, осторожно щелкая пробирками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти антитела будут связываться с клетками, уже участвующими в пути дифференцировки, за исключением мегакариоцитарного пути. - Высиживать трубки на льду в течение 15 мин.
- Добавьте магнитные шарики со стрептавидиновым покрытием в концентрации 75 мкл/мл и гомогенизируйте, осторожно щелкнув трубками.
- Снова высиживают на льду в течение 10 мин.
- При необходимости отрегулируйте до конечного объема 2,5 мл на тюбик со средой M.
- Гомогенизируйте суспензию, осторожно щелкнув трубкой непосредственно перед тем, как поместить ее, без колпачков, внутрь магнита и подождите три минуты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, уже участвующие в пути дифференцировки и покрытые магнитными шариками, будут удерживаться на стенке трубки внутри магнита. - Инвертировать магнит и трубку для переноса содержимого трубки в новую круглодонную полистирольную трубку 5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не вынимайте трубку из магнита для передачи; это делается путем инвертирования магнита с трубкой, все еще включенной. Используйте устойчивое движение и не встряхивайте трубку. - Отбросьте первоначальную трубку, содержащую нежелательные магнитно-меченые ячейки, и поместите новую, без колпачка, в магнит еще на три минуты.
- Продолжая, как на шаге 2.20, перенесите изолированные Lin− клетки в новую трубку 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если на предыдущих этапах было использовано несколько полистирольных трубок по 5 мл, объедините все ячейки в одну и ту же трубку 15 мл. Клетки, восстановленные после сортировки клеток, являются гемопоэтическими стволовыми клетками и прародителями. Наличие тромбопоэтина (ТПО), основного физиологического регулятора мегакариопоезиса 10,направит дифференцировку клеток в сторону мегакариоцитарной клеточной линии. - Измерьте число ячеек Lin− и жизнеспособность, как на шаге 2.10.
- Рассчитайте требуемый объем клеточной суспензии для центрифуги, чтобы иметь 1 x 106 жизнеспособных ячеек x номер скважины, число скважин - количество скважин для посева в условии.
- Готовят по одной пробирке для каждого состояния с соответствующим объемом клеточной суспензии и центрифуги при 300 х г в течение 7 мин.
- Для жидких культур отбросьте супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу в полной культуральную среду (ДМЭМ, ПСГ 1% от конечного объема, FBS 10% от конечного объема, гирудин 100 Ед/мл, ТПО 50 нг/мл) для достижения конечной концентрации 2 × 106 жизнеспособных клеток/мл (равной 1 × 106 клеток на 500 мкл в лунке). Инкубировать клетки при 37 °C при 5% CO2. (= день 0 культуры)
ПРИМЕЧАНИЕ: См. следующий абзац для культур метилцеллюлозы В качестве примера для приготовления полной питательной среды для одной скважины используйте 435 мкл DMEM, 50 мкл 100% FBS для 10% финала, 5 мкл 100% PSG для 1% финала, 5 мкл 10 000 Ед/мл для 100 Ед/мл финала и 5 мкл 5 мкг/мл TPO для 50 нг/мл финала. Обычно используются 4-скважинные или 24-скважинные культурные пластины, поскольку их диаметр скважины хорошо подходит для 500 мкл, необходимых для каждой скважины.
3. Встраивание клеток в гидрогель метилцеллюлозы
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что следующий протокол описывает способ получения одной скважины из гидрогеля клеточной культуры, адаптированной к количеству необходимых скважин.
- Разморозить 1 мл аликвоты 3% раствора метилцеллюлозы при комнатной температуре. Подготовьте одну отдельную дополнительную аликвоту метилцеллюлозы для покрытия шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ: При концентрации 3% метилцеллюлоза остается жидкой при комнатной температуре (20-25 °C). - Обложить шприц Luer lock 1 мл, оснащенный иглой 18-го калибра с метилцеллюлозой, извлекая 1 мл метилцеллюлозы из дополнительной аликвоты. Полностью изгнать метилцеллюлозу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта ступень покрытия гарантирует, что объем метилцеллюлозы, собранной на этапе 3.3, является точным. - С помощью того же шприца и иглы, но используя новую метилцеллюлозную аликвоту, нарисуйте соответствующий объем метилцеллюлозы(рисунок 2А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения конечной концентрации 2% метилцеллюлозы в конечном объеме 500 мкл на скважину требуется 333 мкл 3% метилцеллюлозы. - Осторожно извлеките иглу. Используя стерилизованные щипцы, привинтите на конец шприца разъем замка Luer(рисунок 2B-C).
- Прикрепите второй, без покрытия, шприц замка Luer 1 мл к разъему замка Luer, чтобы соединить два шприца вместе(рисунок 2D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости покрывать этот второй шприц. - Равномерно распределите объем метилцеллюлозы между двумя шприцевами(рисунок 2Е)и отложите их в сторону до этапа 3.11.
- Готовят концентрированную культуральную среду DMEM таким образом, чтобы получить в конечном объеме метилцеллюлозы (этап 3.11) концентрацию, идентичную концентрации жидкой питательной среды для каждого соединения (PSG 1% от конечного объема, FBS 10% от конечного объема, гирудин 100 Ед/мл, TPO 50 нг/мл).
- Готовят 167 мкл концентрированной питательной среды на конечную скважину 1 × 106 клеток. Этот объем среды рассчитывают таким образом, чтобы получить конечную концентрацию метилцеллюлозы 2%. Общий объем в скважине составит 500 мкл (167 мкл клеточной суспензии в концентрированной культуральной среде + 333 мкл метилцеллюлозы) и все компоненты будут иметь концентрацию, идентичную таковой в жидких скважинах.
- В качестве примера, чтобы подготовить полную культуральную среду для одной скважины, используют 102 мкл DMEM, 50 мкл 100% FBS для 10% финала, 5 мкл 100% PSG для 1% финала, 5 мкл 10 000 Ед/мл для 100 Ед/мл финала и 5 мкл 5 мкг/мл TPO для 50 нг/мл финала. Он дает объем 167 мкл, используемый для повторного суспендирования клеток, а при добавлении 333 мкл метилцеллюлозы конечный объем составит 500 мкл.
- После завершения этапа центрифугирования 2.26 отбросьте супернатант и повторно суспендируем клеточную гранулу в концентрированной культуральная среда в соотношении 1 × 106 клеток на 167 мкл.
- Возьмите обратно шприцы и отсоедините один из них от разъема.
- Пипетка 167 мкл клеточной суспензии.
- Добавьте суспензию ячейки непосредственно в разъем шприца(рисунок 2F),следя за тем, чтобы не вводить пузырьки воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляя суспензию ячейки, медленно одновременно вытягивайте плунжер шприца, чтобы освободить место для суспензии ячейки. - Осторожно соедините два шприца(рисунок 2G)без потери подвески в резьбе винта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед повторным подключением нарисуйте плунжер, чтобы оставить разъем наполовину пустым и дать достаточно места для подключения второго шприца без переполнения подвески. - Медленно гомогенизируют метилцеллюлозную среду клеточной суспензией с десятью плунжерными движениями между двумя шприцевыми(рисунок 2H).
- Стяните общий объем в один шприц и отсоедините два шприца, оставив разъем на пустом.
- Опорожняют содержимое шприца в колодец из 4-х скважинной пластины(рисунок 2I).
- Инкубировать клетки при 37 °C при 5% CO2 (= день 0 культуры).
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно подготовить две метилцеллюлозные скважины с одной парой шприцев. Увеличьте на два объем метилцеллюлозы и объем клеточной суспензии, чтобы иметь 2 х106 клеток. После завершения шага 3.13. распределите объем поровну между двумя шприцами, чтобы в каждом из них было 500 мкл. Отключите их и опорожняйте тот, который не является разъемом в колодец культуры. Снова подключите шприцы, чтобы перенести громкость с того, который удерживал разъем, на другой. Отсоедините шприцы, у которых 500 мкл, не должен иметь прикрепленный соединитель, и засейте клетки во вторую культуру хорошо. 3% метилцеллюлоза приобретается в качестве запасного раствора в модифицированной среде Dulbecco (IMDM) Iscove, в то время как концентрированные клетки суспендируются в DMEM. Первоначально были проведены сравнительные тесты, чтобы убедиться, что эта смешанная среда не повлияла на результат эксперимента, особенно по сравнению с жидкой культурой в 100% DMEM.
4. Ресуспенсия клеток для анализа проплатлетов
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ способности образовывать проплацелеты должен проводиться в сопоставимых условиях между жидкими и метилцеллюлозными мегакариоцитами. Физические ограничения, оказываемые гидрогелем метилцеллюлозы, ингибируют расширение проплатлета. Поэтому клетки, выращенные на метилцеллюлозе, повторно суспендируют в свежей жидкой среде на 3-й день культуры, чтобы позволить им расширить проплацелеты. Метилцеллюлозный гидрогель представляет собой физический гидрогель, который легко разбавляется при добавлении в жидкую среду. Важно отметить, что во избежание артефактов от повторного суспензии и центрифугирования клетки в состоянии контрольной жидкой среды должны обрабатываться одновременно так же, как клетки, выращенные метилцеллюлозой. См. схематическое представление эксперимента(рисунок 1).
- Приготовьте 10 мл DMEM - 1% PSG, предварительно нагретого при 37 °C в 15 мл пробирке для каждой скважины для повторного суспендации.
- Осторожно повторно суспендировать клетки из каждой скважины в 10 мл ДМЭМ – 1% ПСГ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно сделайте несколько движений вверх и вниз, чтобы полностью разбавить метилцеллюлозу. Для жидких колодцев обязательно соберите все ячейки, отложенные на дне колодца. - Центрифуг в тубах 5 мин при 300 × г.
- Тем временем готовят полную питательную среду (ДМЭМ, ПСГ 1% от конечного объема, ФБС 10% от конечного объема, гирудин 100 Ед/мл, ТПО 50 нг/мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе каждую скважину извлекают для разбавления наполовину, поэтому готовят 1 мл полной культурной среды на скважину. - Выбросьте супернатант и повторно суспендьте гранулу клетки в 1 мл питательной среды для каждой пробирки.
- Пересеять 500 мкл клеточной суспензии на скважину в пластину с 4 или 24 скважинами и инкубировать при 37 °C при 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из одной начальной скважины получите 2 скважины для визуализации проплатлетов в двух экземплярах. Обратите внимание, что, поскольку эти дубликаты происходят из одного и того же образца, они не могут рассматриваться как независимые реплики. - Через 24 часа после пересевки, на 4-й день посева, случайным образом получить по 10 изображений на скважину с помощью яркой полевой микроскопии и 20× объектива.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки, как правило, группируются в центре скважины, убедитесь, что на поле не слишком много ячеек, так как это может затруднить визуализацию и количественную оценку проплатлетов. Убедитесь, что вы захватили не менее 5 мегакариоцитов на поле. - Подсчитайте общее количество мегакариоцитов и мегакариоцитов, распространяющих проplatelets на каждом изображении, и рассчитайте долю мегакариоцитов, расширяющих проплацелеты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка не автоматизирована; выполните подсчет ячеек вручную. Подсчет может быть облегчен с помощью плагина счетчика ячеек ImageJ для нажатия на ячейки, чтобы отметить их по мере их подсчета. 10 месторождений, приобретенных на скважину, и скважины в двух экземплярах представляют собой примерно 150-300 мегакариоцитов на состояние.
5. Фиксация и извлечение клеток для будущих анализов
ВНИМАНИЕ: Этот протокол использует фиксаторы, которые должны обрабатываться под вытяжным капюшоном, с защитным снаряжением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы сохранить нетронутыми гелевые ограничения, наложенные на клетки, до тех пор, пока они не будут полностью зафиксированы. Поэтому, независимо от используемого фиксатора, его необходимо добавлять в колодец поверх метилцеллюлозы, не нарушая гель. Тот же протокол применяется к жидким культурам.
- Добавьте объем фиксаторного раствора, равный посеянному объему (500 мкл в этом протоколе), поверх метилцеллюлозы, не нарушая работу геля. Подождите соответствующее время в соответствии с используемым фиксатором (не менее 10 минут).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксаторная диффузия по всему гелю должна быть очень быстрой, о чем свидетельствует быстрое изменение цвета геля (от розового до желто-оранжевого оттенка). Параформальдегид (8% в DPBS, 500 мкл на скважину) обычно используется для иммуномаркировки, в то время как глутаральдегид (5% в какодилатном буфере, 500 мкл на скважину) используется для анализа электронной микроскопии. - Используя пипетку P1000, аккуратно сделайте несколько пипеток вверх и вниз с фиксатором и гелем, чтобы однородно разбавить метилцеллюлозу.
- Используя ту же пипетку и наконечник, перенесите весь объем из скважины в трубку объемом 15 мл, содержащую 10 мл DPBS, и гомогенизируйте.
- Центрифугировать смесь при 300 × г в течение 7 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для удаления всей метилцеллюлозы может потребоваться второй этап промывки - Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу мегакариоцитов в соответствующей среде согласно желаемому анализу (иммуномаркировка, проточная цитометрия9,электронная микроскопия ...) (для электронной микроскопии см. также статью метод«Исследование in situ основных этапов мегакариопоэтиса с использованием просвечивающих электронных микроскопий» в этом выпуске JoVE).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Данные, полученные с помощью этого протокола, были первоначально опубликованы в Blood в 2016году 9.
Согласно протоколу, клетки были посеяны либо в жидкой, либо в метилцеллюлозно-гидрогелевую среду. Ячейки в жидкой среде все осаждены на дне скважины, в контакте с жесткой пластиковой поверхностью и иногда с другими ячейками. Напротив, клетки, встроенные в гидрогель метилцеллюлозы, равномерно распределены в геле и изолированы от соседних клеток(рисунок 3А). Метилцеллюлозный гель в конечной концентрации 2% очень незначительно увеличивает средний диаметр мегакариоцитов по сравнению с жидкой культурой(рисунок 3В),в соответствии с более высокой заявленной плоидностью9. Напротив, увеличение концентрации метилцеллюлозы на 0,5% ухудшает дифференцировку мегакариоцитов, о чем свидетельствует меньший средний диаметр(рисунок 3B).
Заметная разница в ультраструктуре мегакариоцитов наблюдается между мегакариоцитами, дифференцированными в жидкой культуре, и мегакариоцитами, дифференцированными in vivo внутри костного мозга. Характерной особенностью зрелых мегакариоцитов является сложная интрацитоплазматическая мембранная сеть DMS (Demarcation Membrane System), которая служит резервуаром для мембраны будущих тромбоцитов. В зрелых мегакариоцитах DMS организуется с образованием переплетенных мембранных листов, которые занимают большую часть цитоплазмы. При просвечивающих электронных микроскопиях (ТЭМ) они, по-видимому, плотно аппонируются и очерчивают цитоплазматические территории(рисунок 3C верхняя панель) (для процедуры ТЕА см. бумажный метод «Исследованиеin situ основных этапов мегакариопоэтиса с использованием просвечивающих электронных микроскопий» в этом же выпуске JOVE). В жидких культурах мембраны ДМС имеют в основном вид небольших круглых, овальных или удлиненных везикул без разграничения цитоплазматических территорий(рисунок 3C средней панели). Напротив, 2% культура метилцеллюлозы способствует организации DMS в большинстве мегакариоцитов, с мембранами, близко расположенными и разграничивающими цитоплазматические территории, напоминающие ту, что in situ (рисунок 3C нижняя панель). Этот результат указывает на то, что 2% культура гидрогеля метилцеллюлозы позволяет лучше дифференцировать мегакариоциты из-за механических ограничений среды окружающей среды.
После переноса клеток в жидкую среду на 3 день мегакариоциты начинают расширять проплацелеты через 4 ч 9. На фиг.4 показана количественная оценка доли мегакариоцитов, имеющих расширенные проплацелеты через 24 ч после повторной суспензии в жидкой среде. Десять изображений были случайным образом получены на скважину с использованием яркой полевой микроскопии и 20× объектива(рисунок 4A). Количественная оценка выполнялась вслепую и вручную с помощью плагина счетчика ячеек на Фиджи (ImageJ)(рисунок 4B). Поскольку это первичные клеточные культуры, существует межэкспериментная изменчивость, но протокол остается надежным и обеспечивает хорошую воспроизводимость. В жидком предкультурном состоянии доля проплатлетов должна составлять от 10% до 20%, тогда как для гидрогеля предварительной культуры эта доля удваивается.
Рисунок 1. Схематическое представление всего процесса. Кости рассекаются, костному мозг вымывается, а клетки механически диссоциируют. Стволовые и прогениторные клетки, представляющие интерес (Lin-cells), выделяют иммуномагнитной отрицательной сортировкой и высевают в жидкую или гидрогелевую среду (день 0). На 3-й день культуры (которая в общей сложности составляет продолжительность 4 дня) оба условия повторно суспендируются в отдельной среде свежей жидкой культуры. Этот второй этап культивирования проводится с 3 по 4 день культуры. Доля МК, распространяющих проплатлеты, измеряется на 4 день культуры. Для визуальной ясности одна ячейка схематизирована на колодец. Синий круг изображает одну клетку с ядром в фиолетовом цвете. На заключительном этапе оба МК представлены проплатлетом. Доля МК, образующих проплацелеты, варьируется в зависимости от жидкой или метилцеллюлозной предкультуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Встраивание клеток в гидрогель метилцеллюлозы. После предварительного нанесения шприцев на стенку,(А)вытягивается соответствующий объем метилцеллюлозы; (B, C) отсоедините иглу и прикрутите разъем к шприцевым шприцам; (D)протолкнуть метилцеллюлозу на полпути через соединитель и прикрепить второй шприц; (E)равномерно распределить метилцеллюлозу между двумя шприцевами и отсоединить их; (F)добавить суспензию ячейки к шприцу, несущему соединитель; (G)воссоединить два шприца; (H)гомогенизировать, переталкивая весь объем от одного шприца к другому несколько раз; (I)засеять клетки, вытеснив весь объем в культуральное блюдо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Характеристика мегакариоцитов в зависимости от состояния культуры. (A)Репрезентативные изображения мегакариоцитов на 3-й день культуры в жидкой (левая панель) или 2% метилцеллюлозно-гидрогелевой среде (правая панель). Шкала бар = 50 мкм(B)Средний диаметр мегакариоцитов, выращенных в жидкой среде, или в 2% или 2,5% метилцеллюлозного гидрогеля. Результаты выражаются как среднее ± SD в 3 независимых культурах, в общей сложности исследовано не менее 100 мегакариоцитов. *, P<0,05, ***P < 0,0001, используя 1-сторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с помощью множественного сравнительного теста Бонферрони. (график адаптирован из Aguilar et al. 2016) (C)Схематический вид (слева) и репрезентативные изображения электронной микроскопии (посередине) мышиных мегакариоцитов; правые панели, виды крупным планом с белых квадратов (шкала = 5 мкм для средних электронных микроскопических изображений и 2 мкм для крупных площадей). Верхние панели представляют собой мегакариоциты in situ, средние представляют собой мегакариоциты, выращенные in vitro в жидкой культуре, а нижние панели представляют собой мегакариоциты, выращенные в 3D-гидрогеле метилцеллюлозы. Эти данные были первоначально опубликованы в Blood Journal, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_95. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Репрезентативные результаты количественной оценки проплатлетов. (А)репрезентативные изображения мегакариоцитов на 4 день культуры. Клетки инкубировали три дня в жидкой(слева)или 2% метилцеллюлозной гидрогелевой среде(справа)с последующим одним днем повторного суспендирования в жидкой среде. Черными стрелками обозначены мегакариоциты, расширяющие проплацеты. (Шкала = 50 мкм). (B)Репрезентативные количественные данные образования проплатлетов. Образование проплатлетов количественно определяется на 4-й день для мегакариоцитов, предварительно культивируемых с 0-го по 3-й день в жидкой или 2% метилцеллюлозной гидрогелевой среде. Результаты выражены в % мегакариоцитов, распространяющих проплацелеты (средняя ± SD) и получены из 3 независимых экспериментов, при этом общее количество мегакариоцитов, исследованных на состояние >750 (t-тест, p = 0,0023). Средняя доля мегакариоцитов, распространяющих проплацелеты, составляет 16% в жидком состоянии и 39% для предкультурного гидрогеля метилцеллюлозы. Этот результат соответствует ранее продемонстрированным и опубликованным эффектам гидрогелевой прекультуры, который увеличивает образование проплатлетов по сравнению с жидким состоянием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В предыдущее десятилетие механобиология вызывала все больший интерес ко многим областям биологии. В настоящее время общепризнано, что механическая среда, окружающая клетки, играет определенную роль в их поведении, подчеркивая важность изучения того, как мегакариоциты чувствуют и реагируют на внеклеточные механические сигналы. Трудно точно измерить жесткость ткани костного мозга in situ11,особенно если мы рассмотрим кроветворный красный костный мозг, поскольку он расположен внутри трабекулярных костей у крупных млекопитающих, в то время как более легкодоступный костный мозг из диафиза состоит по существу из адипоцитов (желтый костный мозг)12. В случае изолированного костного мозга у мышей, где диафиз содержит по существу красный костный мозг, другая проблема заключается в том, что после извлечения из кости ткань не остается сплоченной. Тем не менее, Шин и его коллеги сумели измерить жесткость костного мозга мыши с помощью атомно-силовой микроскопии и обнаружили значение Eкостного мозга = 0,3 ± 0,1 кПа, что помещает костный мозг среди самых мягких тканей6.
Интерес процедуры, описанной здесь, заключается в сравнении поведения мегакариоцитов в жидкой среде с поведением в гидрогеле. В жидкой среде все клетки оседали на дне колодца, в контакте с жесткой пластиковой поверхностью и иногда с другими клетками. Напротив, клетки, встроенные в гидрогель метилцеллюлозы, равномерно распределены в геле и полностью изолированы от других клеток(рисунок 3А). Таким образом, они подчиняются главным образом механическим сигналам, обеспечиваемым конфайнментом, за исключением противопоставленной связи. Паракрино-стимуляция не может быть полностью исключена. Тем не менее, клетки, встроенные в гидрогель метилцеллюлозы, удалены друг от друга, вопреки ситуации в костном мозге, и поэтому мы можем предположить, что если секретируемые вещества достигают соседних клеток, они могут быть очень разбавленными.
Метод прост в настройке и не требует специальных навыков. Метилцеллюлоза представляет собой физический гель, полимерные цепи которого образуют нековалентные поперечные связи. Будучи жидким при низкой температуре, он желеобразен при повышении температуры (см. статью из Aguilar et al. 20169 для получения дополнительной информации о характеристике механических свойств геля). Это состояние геля может быть легко обращено вспять после разбавления в водном растворе, что позволяет легко восстановить клетки, закрепленные в геле или в виде живых клеток.
Критическим фактором здесь является жесткость гидрогеля. Соответствующий объем метилцеллюлозы должен быть очень точно дозирован, так как даже небольшое изменение концентрации гидрогеля может оказать важное влияние на жесткость среды и, следовательно, на созревание мегакариоцитов. Например, ранее было показано, что увеличение концентрации метилцеллюлозы с 2 до 2,5% увеличивает жесткость геля (модуль Юнга) в 10 раз. Одна из возможных ловушек заключается в том, что нет простого контроля качества для проверки точных реологических свойств метилцеллюлозы в каждой экспериментальной скважине после того, как она была засеяна клетками. Тем не менее, важным критерием, который убедит о правильной концентрации геля, является правильное созревание мегакариоцитов в гидрогеле, что отражается в их большом размере, примерно аналогичном размеру в жидкой среде. Уменьшение их среднего диаметра может отражать дефектную дифференциацию, аналогичную той, которая возникает при увеличении жесткости с 2,5% метилцеллюлозы(рисунок 3B).
Другим ограничением метода является то, что восстановление клеток из гидрогеля занимает больше времени, чем в классической культуре, так как перед центрифугированием необходимо сначала разбавить гель. Если метилцеллюлоза должна быть полностью удалена, например, для получения клеточного лизата для дальнейшей процедуры западного блотирования или выделения РНК, может потребоваться дополнительная этап промывки, в течение которого могут происходить модификации в белках или РНК (дефосфорилирование белка, деградация РНК ...).
Критическим моментом, который следует учитывать в процедуре, является количество ячеек, которое должно быть равным в каждом условии. Это не так тривиально, так как в жидкой культуре клетки имеют тенденцию к осадку на дне скважины, а некоторые из них прилипают к пластиковой поверхности, что не относится к клеткам в суспензии в гидрогеле. Одной из ловушек является неполный сбор клеток в жидком состоянии, приводящий к различному содержанию клеток между «жидким» и «гидрогелевидным» состоянием после суспензии в жидкой среде на 3-й день. Такая разница может привести к расхождениям в итоговом данных. В качестве контрольной точки нумерация ячеек может быть выполнена на этом этапе перед повторным сеянием клеток. Предпочтительно делать это вручную с помощью гемоцитометра Nageotte, так как он особенно подходит для более крупных клеток, таких как мегакариоциты.
Как и для любой первичной клеточной культуры, существует возможный риск заражения. Загрязнение является наиболее вероятным объяснением необычно низкой доли проплатлетов в предкультурном состоянии метилцеллюлозы, поскольку небольшое загрязнение оказывается более трудным для обнаружения, чем в жидкой среде. Поэтому он может быть незамеченным до количественной оценки проплатлета, что приводит к вводящим в заблуждение результатам. Надлежащая лабораторная практика должна строго соблюдаться, особенно во время инкапсуляции клеток метилцеллюлозы, которая требует многочисленных и точных манипуляций со шприцами и соединителями. Жизнеспособность мегакариоцитов также должна быть проверена с помощью трипанового синего цвета с использованием клеточной камеры Nageotte для ручного подсчета перед повторным сеянием на 3-й день.
В целом, протокол, представленный здесь, описывает модель in vitro для сравнения между классической жидкой культурой и 3D-культурой с использованием гидрогеля метилцеллюлозы. Следует отметить, что этот протокол культивирован для мышиных первичных Lin- клеток и еще не был адаптирован к клеткам человека. Эта 3D-модель является полезным инструментом для исследования влияния механической среды на поведение и созревание мегакариоцитов9. Также возможно добавление соединений в культуру (даже на гель) для изучения влияния препаратов на поведение/созревание мегакариоцитов и образование проплатлетов. Наконец, воспроизводя механические ограничения, с которыми клетки могут сталкиваться в костном мозге, эта система культивирования позволяет проводить исследования аномальных фенотипов, которые не могли наблюдаться в классических жидких культурах, как ранее было показано для нокаутных мегакариоцитов Myh9 9,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Фабьена Пертюя и Алисию Агилар, которые изначально разработали эту методику в лаборатории, а также Доминика Коллина (Institut Charles Sadron - Страсбург), который охарактеризовал вязкоупругие свойства гидрогеля метилцеллюлозы. Эта работа была поддержана ARMESA (Ассоциация исследований и развития в медицине и санте-публике) и грантом ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Жюли Бошер является получателем гранта ФДТ2020120104222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K.
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R.
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
