Summary
이제 세포의 3차원 환경이 행동, 성숙 및/또는 분화에서 중요한 역할을 할 수 있음을 인정합니다. 이 프로토콜은 거대 카르요세포에 대한 물리적 봉쇄 및 기계적 제약의 영향을 연구하도록 설계된 3차원 세포 배양 모델을 설명합니다.
Abstract
감금과 기계적 제약으로 이어지는 3D 환경은 세포 행동의 중요한 결정요인으로 점점 더 인식되고 있습니다. 따라서 3D 배양은 생체 내 상황에 더 잘 접근하기 위해 개발되었습니다. 메가카요세포는 골수(BM)에서 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)와 분화한다. BM은 뼈 안에 갇혀 있는 신체의 가장 부드러운 조직 중 하나입니다. 뼈는 세포 규모에서 제대로 확장되지 않으며, 메가카요세포는 약한 강성과 높은 감금을 수반한다. 이 프로토콜은 면역 자기 분류에 의한 마우스 계보 음성(Lin-) HSPC의 회수 방법을 제시하고 메틸셀룰로오스로 구성된 3D 배지에서 성숙한 메가카요사이클로 분화한다. 메틸셀룰로오스는 메가카요세포로 반응하지 않으며 그 강성은 정상적인 골수에 맞게 조정되거나 병리학적인 섬유질 골수를 모방하기 위해 증가될 수 있다. 추가 세포 분석을 위해 메가카요세포를 복구하는 프로세스는 또한 프로토콜에 상세합니다. 프로플라츠판 확장은 3D 밀리유 내에서 방지되지만, 액체 배지에서 거대 카르요퀴트를 재중단하고 프로플라츠를 확장하는 능력을 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 3D 하이드로겔에서 자란 메가카요세포는 액체 밀리우에서 자란 것과 비교하여 프로플라츠를 형성하는 더 높은 용량을 가지고 있습니다. 이러한 3D 배양은 i)가 더 높은 성숙 상태에 도달하는 메가카르요세포쪽으로 선조들을 구별할 수 있게 하고, ii) 생체내에서 관찰될 수 있지만 고전 액체 배양에서 주목받지 못하는 표현형을 회수하고, iii) 3D 환경에 의해 제공되는 기계적 단서에 의해 유도된 변환 경로를 연구할 수 있다.
Introduction
본체내 세포는 복잡한 3D 마이크로환경을 경험하고, 인접한 세포와 주변 매트릭스 1,2,3로인한 조직 및 감금으로부터의 강성을 포함하는 화학적 및 메카노물리적 단서 간의 상호작용을 받는다. 세포 행동에 대한 강성과 감금의 중요성은 지난 수십 년 동안만 인식되었습니다. 2006년, Engler 외 4의 정액 작업은 세포 분화를 위한 기계적 환경의 중요성을 강조했습니다. 저자는 세포 기질 강성의 변이가 다양한 분화 혈통을 향해 줄기 세포의 방향을 초래한다는 것을 보여주었습니다. 그 이후로, 세포 운명과 행동에 기계 단서의 영향은 점점 인식되고공부되고있다. 그것은 유기체의 가장 부드러운 조직 중 하나임에도 불구하고, 골수는 뼈 안에 갇혀 있는 3D 구조 조직을 가지고 있습니다. 골수 강성은 기술적으로 정확하게 측정하기 어렵지만 15 ~300 Pa 5,6사이에 있는 것으로 추정됩니다. 스트로마 내에서 세포는 서로 단단히 제한됩니다. 또한, 그들 대부분은 혈액 순환을 입력 하는 부비 동 성 혈관쪽으로 마이그레이션. 이러한 조건은 인접 한 셀에 추가 기계적 제약 조건을 만듭니다., 이러한 힘에 적응 해야. 기계적 단서는 메가카요세포 분화 및 프로플라틀 형성에 대한 결과가 최근에 탐구된 중요한 매개 변수를 나타냅니다. 메가카요세포는 전통적인 액체 배양에서 시험관내에서 분화할 수 있지만, 3D환경으로부터의 기계적 단서가 없기 때문에 부분적으로 생체 내에서 관찰되는 성숙도에 도달하지 못하고 있다 7. 하이드로겔에 내장된 성장하는 선조는 액체 밀리우가 부족한 3D 기계적 단서를 제공합니다.
하이드로겔은 혈액학적 분야에서 수십 년 동안 널리 사용되어 왔으며, 특히 조혈 선조를 정량화하기 위해 식민지 형성 분석에서 세포를 성장시키는 데 사용되어 왔습니다. 그러나, 이러한 하이드로겔은 3D 기계적 환경이 조혈 세포의 성숙과 분화에 미치는 생물학적 영향을 탐구하는 데 거의 사용되지 않았습니다. 지난 몇 년 동안 우리의 실험실은 메틸 셀룰로오스 기반 하이드로겔 8을 사용하여 3D 배양 모델을 개발했습니다. 이 비반응성 물리적 젤은 네이티브 거대 카르요세포 환경의 물리적 제약을 모방하는 유용한 도구입니다. 그것은 메탈옥사이드 군(-OCH3)에의해 하이드록실 잔류물(-OH)의 대체에 의해 셀룰로오스로부터 유래된다. 메틸 대체정도와 메틸셀룰로오스 농도모두 젤화되면 하이드로겔 강성을 결정한다. 이 기술의 개발 단계에서, 30~60Pa 범위의 영의 계수는 메가카요세포 성장에 가장 적합한 겔 강성임을 입증했다 9.
다음 프로토콜은 3D 메틸셀룰로오스 하이드로겔에서 마우스 거대 촉매 선조를 성장시키는 방법을 설명합니다. 이전에는 표준 액체 배양과 비교하여, 이러한 하이드로겔 배양은 메가카요퀴트 폴리플로이이드화의 정도를 증가시키고, 성숙및 세포내 조직을 향상시키고, 액체 배지 9에서다시 중단된 프로플라틀을 연장하기 위해 메가카르요사이클의 용량을 증가시킨다는 것을 이전에 보여주었다. 이 원고는 마우스 골수 Lin−세포의 분리와 3D 배양을 위한 메틸셀룰로오스 하이드로겔에 포함시키는 프로토콜과 추가 분석을 위한 프로플라틀을 생성하는 능력의 정량화를 자세히 설명합니다.
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Protocol
모든 실험은 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 제도적 지침에 따라 수행되어야합니다. 비디오에 표시된 모든 프로토콜은 유럽 법과 Etablissement Français du Sang (EFS)의 검토 위원회의 권고에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 이 프로토콜의 첫 번째 버전은 원래 분자 생물학 8의방법에서 2018 년에 발표되었다.
참고: 그림 1은 전체 프로세스에 대한 회로도를 제공합니다. 이 과정에는 1) 골수 세포의 골해부, 골수 검색 및 기계적 절연, 2) 계보 음성(Lin-) 세포, 3) 액체 또는 메틸셀룰로오스 하이드로겔에서 파종, 액체 배지의 프롬플래틀 형성을 검사하기 위해 3D 젤로 자란 메가카요퀴테의 재현수 등이 포함된다.
1. 성인 마우스의 뼈 컬렉션
참고: 이 섹션에서는 미생물 오염을 최소화하는 것이 중요합니다.
- 덜벡코의 수정 독수리 매체(DMEM)로 뼈 수집을 위한 15mL 튜브를 준비하여 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(PSG) 항생제 믹스(페니실린 10000 U/mL, 연쇄토마이신 10000 μg/mL/L9)의 총 부피의 1%를 함유하고 있습니다.
참고: 사용된 모든 마우스가 동일한 유전자형을 가지고 있는 경우, DMEM의 1mL을 포함하는 동일한 튜브에 있는 모든 뼈를 풀 - PSG 1% 마우스의 수당. 항생제는 뼈 샘플링의 시간 도중 가능한 박테리아 증식을 방지하기 위하여 중요합니다. - 50mL 튜브에 에탄올 70%를 골소독용으로 채우고, 다른 튜브는 시술 중에 계측기 헹구기 위해 한다. 살균 된 해부 장비를 사용합니다.
- 이소플루란 흡입(4%)을 사용하여 마우스를 마취시키고 마우스를 안락사시키기 위해 자궁 경부 탈구를 급속히 진행한다. 미생물 오염을 소독하고 피하기 위해 70% 에탄올에 몸을 빠르게 침지합니다.
- 티비아와 대퇴골을 빠르게 해부합니다.
- 메스를 사용하여 경골과 대퇴골의 엉덩이 쪽 끝을 위해 발목 측 끝의 피피를 잘라냅니다.
- 1% PSG가 포함된 DMEM 배지에 몰입하기 전에 70%의 에탄올에서 1초 동안 뼈를 담급니다.
2. 골수 해리 및 린 세포 격리
참고: 프로토콜의 이 부분은 라미나르 플로우 후드에서 수행됩니다. 하나의 문화에 대 한, 모든 우물은 동일한 실험의 일부이며 독립적인 생물학적 복제로 간주 될 수 없습니다. 모든 마우스의 세포는 모든 우물의 균질성을 보장하고 가능한 개별 간 가변성을 제거하면서 서로 비교할 수 있도록 함께 풀링됩니다. 독립적인 생물학적 복제를 위해서는 배양을 반복해야 합니다.
- 뼈를 페트리 접시에 놓고 멸균 덜벡코의 인산염 완충식식염(DPBS)에 두 번 올라가 잠재적인 오염 물질을 제거합니다.
- DMEM 준비 - 50 mL 튜브에서 1 % PSG.
참고: DMEM 2mL 제공 - 실험에 사용되는 마우스당 1% PSG. - DMEM - 1 % PSG와 21 게이지 바늘장착 5 mL 주사기를 채웁니다.
- 집게로 뼈를 잡고 무릎 쪽 끝에 바늘의 벨만 소개합니다.
참고 : 무릎 측 epiphysis는 해부에서 그대로 유지되어야하며 바늘을 삽입하는 중심에 작은 구멍을 남깁니다. 나머지 표피는 홍조 하는 동안 바늘에 부착 된 뼈를 유지 합니다. 골수를 찌그러지고 손상시킬 수 있으므로 뼈에 베벨 이상을 도입하지 않도록 주의하십시오. - 주사기 플런저를 빠르게 눌러 골수를 50mL 튜브로 플러시합니다.
참고 : 튀는 것을 피하고 골수 플러시 및 해방을 용이하게하기 위해 DMEM에 침지 된 튜브 벽에 뼈의 자유 끝을 배치 - 1 % PSG. 실제로 500 μL과 1mL 사이의 부피는 일반적으로 골수를 뼈에서 추방하기에 충분합니다. 골수가 완전히 추방되었을 때, 뼈는 흰색이되었습니다. 골수가 일부 남은 붉은 색에 의해 판단된 바와 같이 다이아피증에서 완전히 추방되지 않은 경우, 신선한 배지로 플러시를 반복할 수 있다. - 2.4 단계를 반복합니다. 및 2.5. 모든 뼈에 대해, DMEM으로 5 mL 주사기를 리필 - 필요한 경우 1 % PSG.
- 21 게이지 바늘과 동일한 5mL 주사기를 사용하여 플러시 골수를 함유한 배지의 총 부피를 둥근 바닥 10mL 튜브로 전송한다.
참고: 둥근 바닥 10mL 튜브로 전환할 필요는 없지만 다음과 같은 해리 단계로 쉽게 진행할 수 있습니다. 오염의 위험이 의심되는 경우 주사기 및 / 또는 바늘을 변경하는 것을 주저하지 마십시오. - 21 게이지 바늘을 통해 21 게이지 바늘을 통해 2회 연속적으로 2회, 23게이지를 통해, 25게이지 바늘을 통해 한 번씩 매혹및 매회 세포를 흡입하고 추방하여 세포 해리로 진행한다.
참고: 세포에 해로울 수 있으므로 기포를 피하십시오. - 서스펜션을 15mL 튜브로 옮기습니다.
- 셀 번호를 측정하고 죽은 세포를 제외하는 trypan blue의 존재에서 수동 계수에 대한 자동 셀 카운터 또는 셀 챔버를 사용하여 생존가능성을 확인합니다.
- 원심 분리기 는 300 x g에서7 분 동안 15 mL 튜브를 합니다. 1mL 이송 파이펫을 사용하여 조심스럽게 피펫을 꺼내 서퍼를 폐기하십시오.
- 마우스 조혈 세포 격리 키트를 사용하여 음의 면역자기 분류에 의해 줄기 및 전구 세포를 분리한다.
참고: 본 세포 선별의 목적은 모든 선택 항체(CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4)에 대해 부정적인 세포를 회수하여 이미 메가카르시(megakarcytic)와 다른 다른 분화 계보에 종사하는 세포를 제거하는 것이다. - 키트 지침에 따라, 새로 준비된 M 배지(태아소 혈청(FBS), EDTA 1 mMMMMMM의 최종 부피의 2%를 가진 PBS를 1× 10 8세포/mL의 농도로 재보중단하고, 원형 바닥 5mL 폴리스티렌 튜브의 최대 2mL로 서스펜션을 분배한다.
- 폴리스티렌 튜브에 추가: 50 μL/mL의 농도에서 일반 쥐 혈청뿐만 아니라 바이오타이닝 항체 믹스 (CD5, CD11b, CD19, CD45R /B220, Ly6G /C (Gr-1), TER119, 7-4) 50 μL의 농도로 부드럽게 mL및 mL의 혼합의 50 μL의 농도.
참고: 이러한 항체는 이미 메가카요세포 경로를 제외한 분화 경로로 종사하는 세포에 결합할 것이다. - 15 분 동안 얼음에 튜브를 배양.
- 75 μL/mL 농도의 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 구슬을 넣고 튜브를 부드럽게 가볍게 쓸어서 균질화합니다.
- 10 분 동안 얼음에 다시 배양.
- 필요한 경우 M 배지를 사용하여 튜브당 2.5mL의 최종 부피에 적응하십시오.
- 캡없이 자석 안쪽에 튜브를 조심스럽게 가볍게 쓸어 넘기고 3 분 동안 기다립니다.
참고: 이미 분화 경로에 종사하고 자기 구슬로 코팅된 세포는 자석 내부의 튜브 벽에 유지됩니다. - 자석과 튜브를 반전하여 튜브 함량을 새로운 라운드 바닥 5 mL 폴리스티렌 튜브로 전송합니다.
참고: 전송을 위해 자석에서 튜브를 꺼내지 마십시오. 그것은 여전히 튜브와 자석을 반전하여 이루어집니다. 꾸준한 움직임을 사용하고 튜브를 흔들지 마십시오. - 원치 않는 자기 표지 된 세포를 포함하는 초기 튜브를 버리고 캡없이 3 분 동안 자석에 새 튜브를 놓습니다.
- 단계 2.20에서 진행, 새로운 15 mL 튜브로 고립 된 Lin− 세포를 전송.
참고: 이전 단계에 5mL 폴리스티렌 튜브가 여러 번 사용된 경우 동일한 15mL 튜브에 모든 세포를 풀로 놓습니다. 세포 분류 후 회복된 세포는 조혈 줄기 세포 및 선조이다. 메가카요포이시스(10)의 주요 생리조절자인 혈전포이에틴(TPO)의 존재는, 메가카요사이클세포주쪽으로 세포 분화를 지시할 것이다. - 2.10 단계에서와 같이 Lin− 셀 수와 생존가능성을 측정합니다.
- 1 x 106 실행 가능한 셀 x Well Number, Well Number가 조건당 종자할 우물의 수이기 때문에 원심분리기로 셀 서스펜션의 필요한 부피를 계산합니다.
- 7 분 동안 300 x g에서 세포 현탁액및 원심분리기의 적절한 볼륨으로 조건당 하나의 튜브를 준비합니다.
- 액체 배양의 경우, 최종 부피의 DMEM, PSG 1%, 최종 부피의 FBS 10%, Hirudin 100 U/mL, TPO 50 ng/mL)의 최종 농도를 달성하기 위해 완전한 배양 배지(DMEM, PSG 1%, 최종 부피의 FBS 10%, TPO 50 ng/mL)에서 세포 펠릿을 재보페하여 2× 106셀/mL(50l당 10×106셀의 최종 농도)를 달성한다. 5% CO2 하에서 37°C에서 세포를 배양한다. (= 문화의 0일)
참고: 메틸셀룰로오스 문화에 대한 다음 단락을 예로 들어 보겠습니다. 하나의 우물에 대한 완전한 배양 매체를 준비하려면 DMEM435 μL, 100% FBS의 50 μL을 10% 최종 10% 최종용으로 사용하고, 1% 최종 100% PSG의 5μL, 100 U/mL의 5 μL, 5 μg/mL TPO 5 μL 5 μL을 최종 5μg/mL의 5 μL을 사용합니다. 4웰 또는 24웰 배양 판은 일반적으로 잘 직경이 잘 사용되며 웰당 필요한 500 μL에 적합합니다.
3. 메틸셀룰로오스 하이드로겔에 셀 포함
참고: 다음 프로토콜은 하이드로겔 세포 배양의 단일 우물을 획득하고 필요한 우물수에 적응하는 방법을 설명합니다.
- 실온에서 3% 메틸셀룰로오스 재고 용액의 1mL 알리쿼트. 주사기 코팅을 위해 메틸셀룰로오스를 별도의 1개의 추가 알리쿼트준비.
참고: 3%의 농도에서 메틸셀룰로오스는 실온(20-25°C)에서 액체로 남아 있습니다. - 추가 알리쿼트에서 메틸셀룰로오스 1mL를 그려 메틸셀룰로오스가 장착된 1mL 루어 잠금 주사기를 코팅합니다. 메틸셀룰로오스를 완전히 추방하십시오.
참고: 이 코팅 단계는 3.3 단계에서 수집된 메틸셀룰로오스의 부피가 정확하다는 것을 보장합니다. - 동일한 주사기와 바늘을 사용하지만 새로운 메틸셀룰로오스 알리쿼트를 사용하여 메틸셀룰로오스(그림2A)의적절한 부피를 그립니다.
참고: 우물당 500 μL의 최종 부피에서 2% 메틸셀룰로오스의 최종 농도를 달성하려면 3%의 메틸셀룰로오스의 333 μL이 필요합니다. - 조심스럽게 바늘을 제거합니다. 멸균 된 집게를 사용하여 주사기(도 2B-C)의끝에 Luer 잠금 커넥터를 나사.
- 두 주사기를 함께 연결하기 위해 두 번째, 비 코팅, 1 mL Luer 잠금 주사기를 Luer 잠금 커넥터에 부착합니다(그림2D).
참고 : 이 두 번째 주사기를 코팅 할 필요가 없습니다. - 두 주사기(그림2E)사이에 메틸셀룰로오스 볼륨을 동등하게 분배하고 3.11단계까지 제쳐두십시오.
- 최종 메틸셀룰로오스 부피(Step 3.11)에서 얻을 수 있도록 농축DMEM 배양 배지를 준비하여 각 화합물에 대한 액체 배양 배지 중 하나와 동일한 농도(최종 부피의 PSG 1%, 최종 부피의 FBS 10%, 히루딘 100 U/mL, TPO 50 ng/mL).
- 1 × 106 세포의 최종 우물 당 농축 배양 배지의 167 μL을 준비합니다. 이러한 양의 매체는 2%의 최종 메틸셀룰로오스 농도를 얻기 위해 계산된다. 우물의 총 부피는 500 μL(167 μL의 농축 배양 배지 + 메틸셀룰로오스의 333 μL)이며 모든 성분은 액체 우물에서 그와 동일한 농도를 갖출 것이다.
- 예를 들어, 하나의 우물에 대한 완전한 배양 매체를 준비하려면 DMEM 102 μL, 100% FBS 50 μL, 1% 최종 1% 최종 100% PSG 5 μL, 100 U/mL의 5 μL, 5 μg/mL 최종 5 μg/mL TL5 μg/mL의 5 μL을 사용합니다. 세포를 재보설하는 데 사용되는 167 μL의 부피를 제공하며 메틸셀룰로오스의 333 μL을 첨가하면 최종 부피가 500 μL이 됩니다.
- 원심분리 단계를 완료한 후 2.26, 167 μL당 1× 106세포의 비율로 농축 배양 배지에서 체퍼를 버리고 세포 펠릿을 재연한다.
- 주사기를 다시 가져 와서 커넥터에서 그 중 하나를 분리합니다.
- 피펫 167 μL 셀 서스펜션.
- 주사기커넥터(그림 2F)에셀 서스펜션을 직접 추가하여 기포를 도입하지 않도록 합니다.
참고: 셀 서스펜션을 추가하는 동안 주사기 플런저를 동시에 천천히 그려 셀 서스펜션을 위한 공간을 확보합니다. - 나사 스레드에서 서스펜션을 잃지 않고 두 주사기(그림2G)를조심스럽게 다시 연결합니다.
참고: 다시 연결하기 전에 플런저를 그려 커넥터를 반쯤 비워두고 두 번째 주사기가 넘쳐흐르는 없이 연결할 수 있는 충분한 공간을 확보합니다. - 두 주사기(도2H)사이의10개의 앞뒤로 플런저 움직임으로 세포 현탁액으로 메틸셀룰로오스 배지를 천천히 균질화한다.
- 총 볼륨을 하나의 주사기로 끌어들이고 두 주사기를 분리하여 커넥터를 빈 주사기에 남깁니다.
- 주사기의 함량을 4웰플레이트(도 2I)의우물로 비웁니다.
- 5% CO2 (= 문화의 일 0)에서 37 °C에서 세포를 배양한다.
참고: 주사기 한 켤레로 메틸셀룰로오스 우물 2개를 준비할 수 있습니다. 메틸셀룰로오스의 2부피와 세포 현탁액의 부피가 2 x106 세포가 증가하였다. 3.13 단계를 완료한 후. 두 주사기 사이에 볼륨을 동등하게 분배하여 각각 500 μL을 갖습니다. 연결을 끊고 문화권에서 커넥터가 없는 연결을 비웁습니다. 주사기를 다시 연결하여 커넥터를 다른 커넥터로 유지한 볼륨에서 볼륨을 전송합니다. 주사기를 분리하면 500 μL을 가진 커넥터가 부착되어 있지 않아야하며 두 번째 배양에서 세포를 잘 시드하십시오. 3% 메틸셀룰로오스는 이스코브의 변형된 덜베코 의 배지(IMDM)에서 주식 용액으로 구입되고 농축된 세포는 DMEM에서 중단된다. 비교 테스트는 처음에 이 혼합 매체가 실험결과에 영향을 미치지 않았는지 확인하기 위해 이루어졌으며, 특히 100% DMEM의 액체 배양과 비교됩니다.
4. 프로플라틀 분석을 위한 세포 회수
참고: 프로플라츠를 형성하는 능력의 분석은 액체와 메틸셀룰로오스 재배 메가카요세포 사이의 유사한 조건에서 수행되어야 한다. 메틸셀룰로오스 하이드로겔에 의해 가해지는 물리적 제약은 프로플라츠렛 확장을 억제한다. 따라서, 메틸셀룰로오스 재배 세포는 배양 3일째에 신선한 액체 배지에서 다시 매립되어 프로플라츠판을 연장할 수 있게 한다. 메틸셀룰로오스 하이드로겔은 액체 배지 첨가 시 쉽게 희석되는 물리적 하이드로겔입니다. 중요한 것은, 재서스펜션 및 원심분리에서 유물을 피하기 위해, 제어 액체 중간 상태의 세포는 메틸셀룰로오스 재배 세포와 같은 방식으로 동시에 처리되어야 한다. 실험의 회로도 표현을참조하십시오(도 1).
- DMEM의 10mL - 1% PSG는 15mL 튜브에서 37°C에서 예열되어 각 웰을 재일시 중단합니다.
- DMEM의 10mL - 1 % PSG에서 각 우물에서 조심스럽게 세포를 재중단합니다.
참고: 메틸셀룰로오스를 완전히 희석시키기 위해 몇 가지 상하 움직임을 부드럽게 합니다. 액체 우물의 경우 우물 바닥에 증착 된 모든 세포를 수집해야합니다. - 300 g에서튜브 5 분 원심 분리 × .
- 한편 완전한 배양 매체(DMEM, PSG 1% 최종 볼륨의 FBS 10%, 히루딘 100 U/mL, TPO 50 ng/mL)를 준비한다.
참고: 이 단계에서 각 웰은 반으로 희석되기 위해 회수되므로 웰당 완전한 배양 배지 1mL을 준비합니다. - 상체를 버리고 각 튜브에 대한 배양 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
- 4 또는 24웰 플레이트에서 잘 당 셀 서스펜션 500 μL을 재시드하고 5% CO2미만의 37°C에서 배양한다.
참고: 초기 우물에서 프로플라츠렛 시각화를 위해 2개의 우물을 중복으로 가져옵니다. 이러한 중복 복제본은 동일한 샘플에서 유래하기 때문에 독립적인 복제본으로 간주할 수 없습니다. - 재시딩 후 24시간, 배양 4일째에, 밝은 필드 현미경 검사법과 20× 목표를 사용하여 웰당 10개의 이미지를 무작위로 획득합니다.
참고: 세포는 우물의 중앙에 그룹화하는 경향이 있으며, 프로플라틀 시각화 및 정량화를 어렵게 만들 수 있으므로 필드에 너무 많은 셀이 없는지 확인합니다. 필드당 최소 5메가카르요세포를 포획해야 합니다. - 각 이미지에서 프로플라셋을 확장하는 거대 카르요세포와 거대 카르요세포의 총 수를 계산하고 프로플라셋을 확장하는 메가카요사이클의 비율을 계산합니다.
참고: 정량화는 자동화되지 않습니다. 셀 카운팅을 수동으로 수행합니다. 계산은 ImageJ의 셀 카운터 플러그인을 사용하여 셀을 클릭하여 셀을 사용하여 셀을 계산할 때 표시하여 용이하게 할 수 있습니다. 우물당 취득한 10개 필드와 우물을 복제하여 조건당 약 150-300메가카르요사이클을 나타낸다.
5. 향후 분석을 위한 셀 고정 및 검색
주의: 이 프로토콜은 보호 장비를 착용하고 연기 후드 아래에서 처리해야 하는 고정제를 사용합니다.
참고: 목적은 완전히 고정될 때까지 셀에 적용되는 젤 제약 조건을 그대로 유지하는 것입니다. 따라서, 고착에 관계없이, 젤을 방해하지 않고 메틸셀룰로오스 의 상단에 우물에 첨가되어야 한다. 동일한 프로토콜이 액체 배양에 적용됩니다.
- 젤을 방해하지 않고 메틸셀룰로오스 위에 시드 부피(이 프로토콜의 500 μL)와 동일한 고정 용액을 추가합니다. 사용된 고정(최소 10분)에 따라 적절한 시간을 기다립니다.
참고: 젤 색상(분홍색에서 노란색-주황색 그늘까지)의 급격한 변화에 의해 밝혀짐에 따라 젤 전체에 고정 확산이 매우 빨라야 합니다. 파라포름알데히드(DPBS의 8%, 웰당 500 μL)는 일반적으로 면역 라벨링에 사용되며, 글루타랄데히드(카코딜레이트 완충액의 5%, 웰당 500 μL)은 전자 현미경 분석에 사용된다. - P1000 파이펫을 사용하여 메틸셀룰로오스를 균질하게 희석시키기 위해 고정 및 젤로 여러 개의 상하 파이펫팅을 부드럽게 수행합니다.
- 동일한 파이펫과 팁을 사용하여, 모든 부피를 우물에서 10mL의 DPBS를 포함하는 15mL 튜브로 옮기고 균질화한다.
- 300 × g에서 혼합물을 원심분리하여 7분 동안.
참고: 모든 메틸셀룰로오스를 제거하기 위해 두 번째 세척 단계가 필요할 수 있습니다. - 상체를 버리고 원하는 분석 (면역 라벨링, 유동 세포측정9,전자 현미경 검사법 ...) 에 따라 적절한 배지에서 메가 카요세포 펠릿을 재중단합니다. (전자 현미경 검사법의 경우"이 JoVE 문제점에서 "투과 전자 현미경을 이용한 메가카요포에이스의 주요 단계의시상 탐사"를 참조).
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Representative Results
이 프로토콜을 사용하여 얻은 데이터는 원래 2016 년9에혈액에 게시되었습니다.
프로토콜에 따르면, 세포는 액체 또는 메틸셀룰로오스 하이드로겔 배지에서 시드되었다. 액체 매체의 세포는 모두 딱딱한 플라스틱 표면과 접촉하고 다른 세포와 언젠가 접촉하여 우물 의 바닥에 퇴적되어 있습니다. 대조적으로, 메틸셀룰로오스 하이드로겔에 내장된 세포는 겔에 균질하게 분포되고 이웃 세포로부터 분리된다(도3A). 메틸셀룰로오스 겔은 최종 농도에서 2%의 매우 약간 증가하여 액체 배양(도3B)에비해 평균 메가카요사이클지름을 매우 약간증가시킨다고보고된 9. 대조적으로, 메틸셀룰로오스 농도를 0.5% 증가시킴으로써 더 작은 평균직경(도 3B)에도시된 바와 같이 메가카요사이클 분화를 손상시다.
메가카요세포 극구조의 눈에 띄는 차이는 액체 배양에서 분화된 거대카르요세포와 골수 내의 생체내에서 분화된 거대카르요세포 사이에서 관찰된다. 성숙한 거대 핵세포의 특징은 복잡한 내트라피토플라심 막 네트워크, 미래 혈소판의 막에 대한 저수지 역할을 하는 DMS(분권 멤브레인 시스템)이다. 성숙한 거대 카르요사이클에서 DMS는 세포질의 대부분을 차지하는 얽힌 멤브레인 시트를 형성하기 위해 조직합니다. 전송 전자 현미경 검사법 (TEM)에 의해, 그들은 밀접하게 삽화되고 세포질 영토(도 3C 상부 패널) (TEM 절차에 대한, 종이 방법을 참조하십시오 "전송 전자 현미경을 사용하여 메가 카로키에이스의 주요 단계의현장에서 탐사"이 같은 JOVE 문제점에서). 액체 배양에서, DMS 멤브레인은 주로 세포질 영토의 제한없이 작은 둥근, 타원형 또는 길쭉한 소포의 모양을 가지고(그림 3C 중간 패널). 대조적으로, 2% 메틸셀룰로오스 배양은 막이 밀접하게 제거되고 세포질 영토를 구분하는 거대 카르요세포의 대다수에서 DMS의 조직을 촉진합니다(그림3C 하부 패널). 이러한 결과는 2% 메틸셀룰로오스 하이드로겔 배양이 환경 매체의 기계적 제약으로 인해 더 나은 메가카요사이클분화를 허용한다는 것을 나타낸다.
세포가 3일째에 액체 배지로 전달된 후, 메가카요세포는 4h 9후에 프로플라틀을 확장하기 시작한다. 도 4는 액체 밀리우에서 재서스펜션 후 24시간 연장된 프로플라틀을 갖는 메가카르요세포의 비율의 정량화를 나타낸다. 10개의 이미지는 밝은 필드 현미경 검사법과 20×목표(그림 4A)를사용하여 우물당 무작위로 획득하였다. 정량화는 피지 (ImageJ)(그림4B)에셀 카운터 플러그인을 사용하여 맹목적으로 수동으로 수행되었다. 이들은 1 차적인 세포 배양이기 때문에, 실험 간 가변성이 있습니다 그러나 프로토콜은 견고하고 좋은 재현성을 제공합니다. 액체 사전 배양 조건에서, 프로 플라츠렛 비율은 하이드로겔 사전 배양에 대해 두 배가되는 반면, 프로플라츠비율은 10%에서 20% 사이여야 한다.
그림 1. 전체 프로세스의 회로도 표현. 뼈는 해부되고, 골수는 밖으로 플러시되고 세포는 기계적으로 해화됩니다. 스템 및 전구세포(Lin-cells)는 면역자기 음성 선별 절차에 의해 격리되고 액체 또는 하이드로겔 배지(일0)에서 종자된다. 문화의 3 일째 (총 4 일의 기간을 나타내는) 두 조건은 별도의 신선한 액체 배양 milieu에서 다시 중단됩니다. 이 두 번째 배양 단계는 문화의 3 일째부터 4 일까지 수행됩니다. 프로플라츠를 확장하는 MK의 비율은 문화의 4일째에 측정됩니다. 시각적 선명도를 위해 한 셀은 웰당 스키마화됩니다. 파란색 원은 보라색의 핵이있는 단일 세포를 묘사합니다. 마지막 단계에서는 두 MK가 프로플라틀렛으로 표시됩니다. 프로 플라츠판을 형성하는 MK의 비율은 액체 또는 메틸셀룰로오스 사전 배양에 따라 다릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 메틸셀룰로오스 하이드로겔에 세포 포함. 미리 코팅 후 주사기 벽을 코팅한 후,(A)메틸셀룰로오스의 적절한 부피를 끌어낸다; (B, C)바늘을 분리하고 커넥터를 주사기에 나사로 연결; (D)메틸셀룰로오스를 커넥터를 통해 중간으로 밀어 두 번째 주사기를 부착; (E)두 주사기 사이에 메틸셀룰로오스를 동등하게 분배하고 분리; (F)커넥터를 베어링 주사기에 셀 서스펜션을 추가; (G)두 주사기를 다시 연결; (H)전체 볼륨을 하나의 주사기에서 다른 주사기로 몇 번 밀어 균일화; (I)전체 양을 배양 접시로 추방하여 세포를 시드한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 문화 조건에 따른 메가카요세포 특성. (A)액체(왼쪽 패널) 또는 2% 메틸셀룰로오스 하이드로겔 배지(오른쪽 패널)의 문화3일째에 메가카요세포의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 50 μm(B)액체 배지에서 자란 메가 카요세포의 평균 직경, 또는 2% 또는 2.5% 메틸셀룰로오스 하이드로겔. 결과는 3개의 독립적인 문화에서 ± 평균으로 표현되고, 적어도 100개의 거대 karyocytes를 검토했습니다. *, P<0.05, ***P < 0.0001, 본페로니의 다중 비교 테스트와 분산 (ANOVA)의 1 방향 분석을 사용하여. (아길라르 등에서 적응한 그래프 2016) (C)모린 메가카요낭의 회로도(왼쪽) 및 대표적인 전자 현미경 이미지(가운데); 오른쪽 패널, 흰색 사각형에서 보기를 닫습니다 (중간 전자 현미경 이미지에 대한 스케일 바 = 5 μm 및 가까이 보기를위한 2 μm). 상부 패널은 시투 메가카요세포에, 중간은 액체 배양에서 시험관내에서 재배된 거대카르요세포를 나타내며, 하부 패널은 3D 메틸셀룰로오스 하이드로겔에서 재배된 거대 카르요사이클이다. 이 데이터는 원래 혈액 저널에 발표 되었다, DOI10.1007/978-1-4939-8585-2_95. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 프로플라틀 정량화의 대표적인 결과. (A)문화의 4일째에 메가카르요세포의 대표적인 이미지. 세포는액체(왼쪽)또는 2% 메틸셀룰로오스 하이드로겔배지(오른쪽)에서3일 간 배양되었고, 그 다음으로 액체 배지에서 1일 의 재발이 뒤따랐다. 검은 화살은 프로플라츠를 확장하는 거대 카르요세포들을 나타냅니다. (배율 막대 = 50 μm). (B)프로플라틀형성의 대표적인 정량화 데이터. 프로플라톤 형성은 이전에 액체 또는 2 % 메틸 셀룰로오스 하이드로겔 배지에서 0 일부터 3 일까지 미리 배양 된 메가 카요사이클에 대해 4 일째에 정량화되었다. 결과는 프로플라틀릿(평균 ± SD)의 %로 표현되고 3개의 독립적인 실험에서, 조건당 총 수의 메가카요세포가 >750(t-test, p = 0.0023)이다. 프로플라츠를 확장하는 메가카요사이클의 평균 비율은 액체 상태의 16% 및 메틸셀룰로오스 하이드로겔 프리 배양의 경우 39%입니다. 이 결과는 액체 상태에 비해 프로플라틀 형성을 증가 하이드로겔 사전 배양의 이전에 입증 및 출판 된 효과에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
지난 10 년 동안, mechanobiology생물학은 생물학의 많은 지역에 점점 더 많은 관심을 제기했습니다. 이제 세포를 둘러싼 기계적 환경이 그들의 행동에 중요한 역할을 한다는 것을 일반적으로 인정하며, 메가카르요세포가 세포외 기계적 단서를 감지하고 반응하는 방법을 연구하는 것이 중요하다는 것을 강조합니다. 특히 대형 포유류의 궤적 뼈 내부에 위치하고 있는 조혈적 붉은 골수를 고려하는 경우, 특히 치석에서 골수 조직의강성을 정확하게 측정하는 것은 어려운 일이며, 당뇨병으로부터 더 쉽게 접근할 수 있는 골수는 본질적으로 지방분(yellow marrow)12로구성된다. 당뇨병이 본질적으로 빨간 골수를 포함하는 마우스에서 고립된 골수의 경우, 또 다른 문제는 일단 뼈에서 추출되면 조직이 응집력을 유지하지 않는다는 것입니다. 그러나, 신과 협력자는 원자력 현미경을 사용하여 마우스 diaphysis 골수 강성을 측정하고 e골수 = 0.3 ± 0.1 kPa의 값을 발견, 이는 가장 부드러운 조직 중 골수를 배치6.
여기서 설명된 절차의 관심은 하이드로겔에서 액체 매체에서 메가카요퀴테 거동을 비교하는 것입니다. 액체 milieu에서, 세포는 뻣뻣한 플라스틱 표면과 접촉하고 다른 세포와 언젠가 접촉, 우물의 바닥에 모든 퇴적물을 가지고있다. 대조적으로, 메틸셀룰로오스 하이드로겔에 내장된 세포는 겔내균질적으로 분포되고 다른 세포로부터 완전히 분리된다(도3A). 따라서 그들은 병치린 통신을 제외하고, 감금에 의해 제공되는 기계적 단서에 본질적으로 제출된다. 파라크린 자극은 완전히 배제될 수 없습니다. 그럼에도 불구 하 고, 메 틸 셀룰로오스 하이드로겔에 포함 된 세포는 골수의 상황에 반대 서로 멀리 하 고 따라서 우리는 따라서 분 비 물질 이웃 세포에 도달 하는 경우, 그들은 매우 희석 될 수 있습니다 가정할 수 있습니다.
이 방법은 쉽게 설정할 수 있으며 특정 기술이 필요하지 않습니다. 메틸셀룰로오스는 폴리머 체인이 비공유 교차 연결체를 형성하는 물리적 젤입니다. 저온에서 액체인, 온도를 상승 할 때 젤리 (젤의 기계적 특성의 특성화에 대한 자세한 내용은 Aguilar 등 에서 기사를 참조하십시오 20169). 이 젤 상태는 수성 용액에서 희석 후 쉽게 반전 될 수 있으며, 이는 젤에 고정되거나 살아있는 세포로 고정되어 있든 세포의 쉬운 회복을 가능하게합니다.
여기서 중요한 요소는 하이드로겔의 강성입니다. 하이드로겔 농도의 작은 변화조차도 밀리유의 강성에 중요한 영향을 미치고 따라서 메가카요시테 성숙에 중요한 영향을 미칠 수 있으므로 적절한 메틸셀룰로오스 부피는 매우 정밀하게 분배되어야 합니다. 예를 들어, 이전에 메틸셀룰로오스 농도를 2에서 2.5% 증가시켜 겔 강성(Young's modulus)을 10배 증가시키는 것으로 나타났습니다. 한 가지 가능한 함정은 세포와 시드된 후에 각 실험에서 메틸셀룰로오스의 정확한 유변학적 특성을 확인하기 위한 쉬운 품질 관리가 없다는 것입니다. 그럼에도 불구 하 고, 올바른 젤 농도 대 한 안심 하는 필수 기준은 하이드로겔 내에서 메가 karyocytes의 적절 한 성숙, 액체 매체에서 대략 비슷한 그들의 큰 크기에 의해 반영. 평균 직경의 감소는 2.5%의 메틸셀룰로오스(그림3B)로강성을 증가시킬 때 발생하는 것과 유사한 결함이 있는 분화를 반영할 수 있다.
이 방법의 또 다른 제한은 하이드로겔로부터의 세포 회수가 원심분리 전에 젤을 먼저 희석할 필요가 있기 때문에 고전적인 배양보다 더 많은 시간이 걸린다는 것이다. 메틸셀룰로오스를 완전히 제거해야 하는 경우, 예를 들어 추가 서부 블롯 또는 RNA 절연 절차를 위해 세포 용액을 얻기 위해, 단백질 또는 RNA(단백질 탈포로이션, RNA 분해...)에서 시간 수정이 발생할 수 있는 추가 세척 단계가 필요할 수 있다.
절차에서 고려해야 할 중요한 점은 각 조건에서 동일해야 하는 세포 수입니다. 이것은 액체 배양에서, 세포는 우물의 바닥에 퇴적물을 경향이 그들 중 일부는 하이드로겔에서 현탁액에 있는 세포의 경우는 아닙니다 플라스틱 표면에 부착하기 때문에 그 사소한 것이 아닙니다. 1개의 함정은 액체 상태에서 세포의 불완전한 집합이며, 3일째에 액체 배지에서 현탁액 후 "액체"와 "하이드로겔" 상태 사이의 다른 세포 함량을 초래한다. 이러한 차이는 최종 데이터의 불일치로 이어질 수 있습니다. 검사점으로서 세포를 시드하기 전에 이 단계에서 세포 수치를 수행할 수 있습니다. 메가카르요세포와 같은 더 큰 세포에 특히 적합하기 때문에 나조테 혈세포계를 수동으로 사용하는 것이 바람직하다.
어떤 1 차 적인 세포 배양에 관해서는, 오염의 가능한 위험이 있습니다. 오염은 메틸셀룰로오스 이전 배양 조건에서 비정상적으로 낮은 프로플라틀비율에 대한 가장 가능성이 높은 설명이며, 작은 오염은 액체 배지보다 검출하기가 더 어려워 보인다. 따라서, 그것은 증판 정량화 까지 주목 갈 수 있습니다., 오해의 소지가 결과 로 이어지는. 좋은 실험실 관행은 주사기와 커넥터의 수많은 정확한 조작을 필요로 메틸 셀룰로오스 세포 캡슐화 하는 동안 특히 엄격 하 게 관찰 해야 합니다. 메가카요세포 생존능력은 3일째에 재시드되기 전에 나조테 셀 챔버를 사용하여 Trypan blue로 확인되어야 합니다.
전반적으로, 여기에 제공된 프로토콜은 메틸셀룰로오스 하이드로겔을 사용하여 고전적인 액체 배양과 3D 배양 사이의 비교를 위한 체외 모델을 설명합니다. 참고, 이 배양 프로토콜은 마우스 기본 Lin-세포에 대해 설명되며 아직 인간 세포에 적응되지 않았습니다. 이 3D 모델은 기계 환경이 메가카요사이클 거동 및성숙도 9에미치는 영향을 조사하는 데 유용한 도구이다. 또한 메가카요세포 행동/성숙 및 프로플라틀 형성에 대한 약물의 영향을 연구하기 위해 배양(젤에서도)에 화합물을 첨가할 수 있다. 마지막으로, 골수에서 세포가 발생할 수 있는 기계적 제약을 재현함으로써, 본 배양 시스템은 Myh9 녹아웃 메가카요세포9,13,14에대해 이전에 나타난 바와 같이 고전적인 액체 배양에서 관찰할 수 없었던 비정상적인 표현형에 대한 조사를 허용한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 처음에 실험실에서이 기술을 개발 파비엔 퍼투이와 알리시아 아길라르뿐만 아니라 메틸 셀룰로오스 하이드로 겔의 점탄성 특성을 특징으로 도미니크 콜린 (연구소 찰스 사드론 - 스트라스부르)에게 감사드립니다. 이 작품은 ARMESA (협회 드 레체 에 데벨로페멘트 en Médecine et Santé Publique)와 ARN 보조금 (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics)에 의해 지원되었다. 줄리 보셔는 퐁디션 부어 라 레체쉬 메디칼 (FRM 교부번호 FDT202012010422)에서 받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
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- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
