Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para ajuste fino de regiões de interesse (ROIs) para tecnologias de Ômica Espacial para melhor caracterizar o microambiente tumoral e identificar populações celulares específicas. Para ensaios proteômicos, protocolos personalizados automatizados podem orientar a seleção de ROI, enquanto os ensaios transcriptômicos podem ser ajustados utilizando ROIs tão pequenos quanto 50 μm.
Abstract
A multiplexação permite a avaliação de vários marcadores no mesmo tecido, proporcionando contexto espacial. As tecnologias Spatial Omics permitem a multiplexação de proteínas e RNA, alavancando anticorpos e sondas oligo-marcados foto-cliváveis, respectivamente. Os oligos são clivados e quantificados a partir de regiões específicas em todo o tecido para elucidar a biologia subjacente. Aqui, o estudo demonstra que protocolos automatizados de visualização de anticorpos personalizados podem ser utilizados para orientar a seleção de ROI em conjunto com ensaios de proteômica espacial. Este método específico não mostrou desempenho aceitável com ensaios de transcriptômica espacial. O protocolo descreve o desenvolvimento de um ensaio de imunofluorescência (FI) de 3 plexos para visualização de marcadores em uma plataforma automatizada, usando amplificação de sinal de tiramida (TSA) para amplificar o sinal fluorescente de um determinado alvo de proteína e aumentar o pool de anticorpos para escolher. O protocolo de visualização foi automatizado usando um ensaio de 3 plexos completamente validado para garantir a qualidade e a reprodutibilidade. Além disso, a troca de DAPI por corantes SYTO foi avaliada para permitir a obtenção de imagens de ensaios de FI baseados em TSA na plataforma de perfil espacial. Além disso, testamos a capacidade de selecionar pequenas ROIs usando o ensaio de transcriptômica espacial para permitir a investigação de áreas de interesse altamente específicas (por exemplo, áreas enriquecidas para um determinado tipo de célula). Foram coletadas ROIs de 50 μm e 300 μm de diâmetro, o que corresponde a aproximadamente 15 células e 100 células, respectivamente. As amostras foram transformadas em bibliotecas e sequenciadas para investigar a capacidade de detectar sinais de pequenas ROIs e regiões específicas do perfil do tecido. Determinamos que as tecnologias de proteômica espacial se beneficiam altamente de protocolos automatizados e padronizados para orientar a seleção de ROI. Embora esse protocolo de visualização automatizada não fosse compatível com ensaios de transcriptômica espacial, pudemos testar e confirmar que populações celulares específicas podem ser detectadas com sucesso mesmo em pequenas ROIs com o protocolo de visualização manual padrão.
Introduction
Os avanços nas técnicas de multiplexação continuam a fornecer melhores ferramentas de caracterização para alvos presentes em tumores. O microambiente tumoral (EMT) é um sistema complexo de células tumorais, infiltrando células imunes e estroma, onde a informação espacial é fundamental para melhor compreender e interpretar os mecanismos de interação entre biomarcadores de interesse1. Com técnicas emergentes, como o GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) e o 10x Visium, vários alvos podem ser detectados e quantificados simultaneamente dentro de seu contexto espacial. O uso de protocolos de imunofluorescência que facilitam a visualização tecidual pode melhorar ainda mais as capacidades de perfil espacial dessas tecnologias.
A tecnologia Spatial Omics em que nos concentramos para o desenvolvimento deste método consiste em ensaios espaciais de proteômica e transcriptômica onde oligonucleotídeos são ligados a anticorpos ou sondas de RNA através de um ligador fotoclivista sensível a UV. As lâminas histológicas são marcadas com esses anticorpos ou sondas oligoconjugados e, em seguida, fotografadas na plataforma de perfil espacial. Em seguida, ROIs de diferentes tamanhos e formas são selecionados para iluminação, e os oligonucleotídeos fotoclivados são aspirados e coletados em uma placa de 96 poços. Os oligonucleotídeos fotoclivados são preparados para serem quantificados com o sistema Nanostring nCounter ou o Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figura 1)4,5.
As distribuições celulares variam dentro dos tecidos, e a capacidade de caracterizar locais específicos das células usando marcadores selecionados e diferentes tamanhos de ROI é de grande importância para entender completamente o ambiente tecidual e identificar características específicas. Na tecnologia Spatial Omics mencionada aqui, o protocolo de visualização padrão usa anticorpos diretamente conjugados e é um protocolo manual. Os marcadores padrão para distinguir entre tumor e estroma são pancitoqueratina (panCK) e CD456,7, mas marcadores adicionais são necessários para atingir populações celulares específicas de interesse. Além disso, o uso de anticorpos fluorescentes diretamente conjugados carece de amplificação, o que limita a seleção de anticorpos a marcadores abundantes. Além disso, os ensaios manuais estão sujeitos a mais variabilidade do que os fluxos de trabalho automatizados8. Portanto, é desejável ter um protocolo de visualização personalizável, automatizado e amplificado para a seleção de ROI.
Aqui, o estudo demonstra que, para ensaios de proteômica espacial, a tecnologia TSA pode ser usada para protocolos de visualização em uma plataforma automatizada, resultando em um ensaio mais direcionado e padronizado. Além disso, os ensaios baseados em TSA permitem o uso de marcadores de baixa expressão, aumentando a gama de alvos que podem ser selecionados para visualização. Um ensaio de 3 plexos para panCK, PAF e Anticorpo X foi desenvolvido usando uma plataforma automatizada onde panCK e PAF foram usados para diferenciar entre tumor e estroma, respectivamente. O anticorpo X é uma proteína estromal frequentemente encontrada em tumores, mas sua biologia e impacto na imunidade antitumoral não são totalmente compreendidos. Caracterizar o contexto imunológico em áreas ricas em anticorpos X pode elucidar seu papel na imunidade antitumoral e na resposta terapêutica, bem como seu potencial como alvo de medicamentos.
Embora os painéis automatizados personalizados de visualização TSA tenham se mostrado bem-sucedidos para ensaios de proteômica espacial, a aplicação desses ensaios para ensaios de transcriptômica espacial não pôde ser confirmada. Isso provavelmente se deve aos reagentes e ao protocolo utilizado para os protocolos de visualização automatizada, que parecem comprometer a integridade do RNA. Reconhecer que um protocolo de rotulagem automatizado para marcadores de visualização pode ser usado para ensaios de proteômica espacial, mas não para ensaios de transcriptômica espacial, fornece orientação importante sobre os projetos de ensaios da tecnologia Spatial Omics.
Além disso, o estudo demonstra que o ensaio de transcriptômica espacial pode ser usado para traçar o perfil de alvos em regiões tão pequenas quanto 50 μm de diâmetro, ou aproximadamente 15 células. Duas ROIs de tamanhos diferentes foram selecionadas para testar a capacidade do ensaio de também detectar transcritos em pequenas ROIs. Para cada região de interesse, oligos correspondentes a 1.800 alvos de mRNA foram coletados e transformados em bibliotecas de acordo com o protocolo da plataforma de perfil espacial. As bibliotecas foram indexadas individualmente, posteriormente agrupadas e sequenciadas. Isso permitiu a avaliação da eficiência do agrupamento e da capacidade de identificar populações celulares específicas em pequenas ROIs.
Este trabalho mostra que, para ensaios de proteômica espacial, um protocolo automatizado para orientar a seleção de ROI em marcadores específicos de interesse pode ser usado para direcionar seletivamente a interrogação de áreas teciduais relevantes e caracterizar o ambiente espacial do tecido. Além disso, demonstramos que ROIs menores podem ser usadas para ensaios transcriptômicos espaciais para detectar e caracterizar populações celulares específicas.
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Protocol
Todos os tecidos humanos foram adquiridos de biobancos comerciais ou bancos de tecidos credenciados sob a garantia de que a aprovação apropriada do Conselho de Revisão Institucional e o consentimento informado foram obtidos.
Observação : O protocolo é executado usando o Discovery Ultra e o GeoMx Digital Spatial Profiler. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre reagentes, equipamentos e software usados neste protocolo.
1. Protocolo de visualização automatizada para ensaios de proteômica espacial
- Programa de autocoloração para aplicação de anticorpos de visualização fluorescente
- No software autostamant, clique no botão home e escolha Protocolos. Em seguida, clique em Criar/Editar Protocolos e selecione RUO DISCOVERY Universal como procedimento.
- Clique em Primeira Sequência > Desparafinização > Depar v2. Para Temperatura Média, escolha 72 graus C, clique em Pré-tratamento e selecione Condicionamento celular e Reservatório CC1. Para Very High Temperature, escolha 100 Deg C, clique em CC1 8 Min e continue clicando até que CC1 64 Min seja selecionado.
- Clique em Inibidor > Inibidor DISCOVERY e, para Tempo de Incubação, escolha 8 Minutos. Em seguida, clique em Anticorpo > High Temp Ab Incubation; para Baixa Temperatura, escolha 37 ° C; para Anticorpo, escolha o número do anticorpo no rótulo do dispensador (Anticorpo 6 neste exemplo); para Mais Tempo de Incubação, selecione 32 Minutos.
NOTA: Este protocolo tem três números de anticorpos diferentes. O primeiro anticorpo é FAP, o segundo é Pan-Citoqueratina e o terceiro é o Anticorpo X. - Clique em Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, em seguida, para Antibody Blocking, escolha Gt Ig Block e, para Incubation Time, escolha 4 Minutes. Em seguida, em Multimer HRP Reagent, selecione OMap anti-Rb HRP e, para Tempo de Incubação, escolha 16 Minutos. Em seguida, clique em Cy5 e, para Tempo de Incubação Longo, escolha 0 H 8 Min.
- Clique em Dual Sequence e escolha Antibody Denaturation, em seguida, selecione Antibody Denature CC2-1 e, para Very High Temperature, escolha 100 Deg C. Certifique-se de que o tempo de incubação é de 8 min. Em seguida, clique em Inibidor de DS e selecione Neutralizar.
- Clique em DS Antibody, e para Very Low Temperature, escolha 37 Deg C. Em seguida, em Anticorpo, escolha o número do anticorpo no rótulo do dispensador (Anticorpo 3 neste exemplo) e, para Tempo de Incubação Plus, selecione 32 Minutos.
- Clique em DS Multimer HRP e escolha DS Multimer HRP Blocker. Em seguida, para Bloqueio de Anticorpos, selecione Gt Ig Block e, para Tempo de Incubação, escolha 4 Minutos. Em seguida, em Multimer HRP Reagent, selecione OMap anti-Ms HRP e, para Tempo de Incubação, escolha 16 Minutos. Em seguida, clique em DS Rhodamine 6G e, para Tempo de Incubação Longo, escolha 0 Hr 8 Min.
- Clique em Tripla Mancha e selecione TS Desnaturação de Anticorpos, em seguida, selecione Desnaturação de Anticorpos CC2-2 e, para Temperatura Muito Alta, selecione 100 Deg C. Certifique-se de que o tempo de incubação é de 8 min. Em seguida, clique em Inibidor de TS e selecione TS Neutralizar.
- Clique em TS Anticorpo e, para Temperatura Muito Baixa, selecione 37 graus C. Em seguida, em Anticorpo, selecione o número do anticorpo no rótulo do dispensador (Anticorpo 7 neste exemplo) e, para Tempo de Incubação Adicional, selecione 32 Minutos.
- Clique em TS Multimer HRP e escolha TS Multimer HRP Blocker. Em seguida, para Bloqueio de Anticorpos, selecione Gt Ig Block e, para Tempo de Incubação, escolha 4 Minutos. Em seguida, em Multimer HRP Reagent, selecione OMap anti-Rb HRP e, para Tempo de Incubação, escolha 16 Minutos. Em seguida, clique em TS FAM e, para Tempo de Incubação Longo, escolha 0 H 8 Min.
- Adicione um título ao protocolo. Selecione um número de protocolo, adicione um comentário e clique em Ativo seguido de Salvar.
- Preparar diapositivos, imprimir etiquetas e iniciar a execução do autostainer
- O fornecedor de panificação adquiriu seções de tecido humano FFPE (fixadas em formalina e embutidas em parafina) em um forno ajustado a 70 °C por 20-60 min. Enquanto os slides estiverem assando, imprima as etiquetas clicando em Criar Etiqueta no software de coloração automática. Em seguida, clique em Protocolos, selecione o número do protocolo e clique em Fechar/Imprimir. Adicione informações relevantes na etiqueta do slide e clique em Imprimir.
- Retire as lâminas do forno e deixe-as esfriar até a temperatura ambiente (RT). Aplique as etiquetas de protocolo impressas anteriormente aos slides correspondentes.
- Carregar os dispensadores de anticorpos recarregáveis com anticorpos de acordo com o número do rótulo do anticorpo atribuído na etapa 1.1. Neste protocolo, use o Anticorpos 6 para PAF a 1 μg/mL, use o Anticorpo 3 para Pan-Citoqueratina a 0,1 μg/mL e use o Anticorpo 7 para o Anticorpo X a 2,5 μg/mL. Diluir cada anticorpo no diluente especificado e preparar os dispensadores de anticorpos recarregáveis.
- Reúna os dispensadores de reagentes pré-cheios de bloqueio, detecção e amplificação mencionados acima e coloque-os em uma bandeja de reagentes. Carregue slides nas bandejas de slides (até 30 slides por execução) e clique em Executando seguido de Sim. Observe que o DAPI não é usado para contracoloração nuclear.
- Confirme o início da execução verificando a duração da execução no software de retenção automática. O protocolo leva ~ 11 h para conclusão e pode ser executado durante a noite.
- No dia seguinte, garanta a conclusão da corrida observando luzes verdes piscando nos slots da bandeja deslizante. Em seguida, retire as lâminas do instrumento e lave-as vigorosamente em 1x Buffer de Reação até que a solução de cobertura líquida seja completamente removida.
- Protocolo de plataforma de perfil espacial para ensaio proteômico
- Siga o protocolo de proteômica espacial indicado na nota abaixo. Inclua as seguintes alterações no protocolo para habilitar o procedimento de rotulagem automatizada de 3 plexos.
- Execute as etapas 1.2.1-1.2.6 no dia anterior ao início do protocolo de proteômica espacial e vá direto para a etapa de recuperação de antígenos do protocolo de proteômica espacial após a execução da etapa 1.2.6. Omita o procedimento de visualização descrito no protocolo de proteômica de perfil espacial.
- Substitua o SYTO 13 pelo SYTO 64 a 5000 nM para permitir a integração do fluoróforo. Diluir SYTO 64 em 1x TBS e incubar em uma câmara de umidade por 15 min.
- Ao configurar os parâmetros de varredura na plataforma de perfil espacial, selecione os filtros e canais de foco de acordo com os fluoróforos usados no painel de visualização para permitir a integração de 3 plexos. Use FITC para DISCOVERY FAM e defina a exposição para 200 ms, use Cy3 para DISCOVERY Rhodamine 6G e defina a exposição para 200 ms, use Texas Red para SYTO 64 e defina a exposição para 50 ms (especifique isso como o canal de foco) e, finalmente, use Cy5 para DISCOVERY Cy5, defina a exposição para 200 ms, e salvar alterações.
NOTA: Instruções detalhadas do protocolo proteômico de perfil espacial são encontradas na guia Suporte do site oficial, selecionando Documentação > Manuais do Usuário. Aqui, procure o protocolo de proteína para nCounter usando Bond RX.
2. Seleção de ROI para ensaios de transcriptômica espacial
- Asse as seções de pellets de células FFPE em um forno ajustado a 70 °C por 20-60 min. Siga o protocolo NGS da plataforma de perfil espacial indicado na nota abaixo e digitalize slides na plataforma de perfil espacial, selecionando tamanhos de 50 μm e 300 μm. A seguinte recomendação é destacada para o ensaio de transcriptômica espacial:
- Ao preparar a biblioteca, se vários tamanhos de ROIs foram selecionados, junte ROIs de tamanhos semelhantes para criar uma biblioteca por tamanho. Isso é para garantir que profundidades de sequenciamento suficientes sejam alcançadas para todos os ROIs sem viés de tamanho.
NOTA: Instruções detalhadas da plataforma de perfil espacial são encontradas na guia Suporte do site oficial, selecionando Documentação > Manuais do Usuário. Aqui, procure o protocolo de RNA para aplicações NGS usando Bond RX.
- Ao preparar a biblioteca, se vários tamanhos de ROIs foram selecionados, junte ROIs de tamanhos semelhantes para criar uma biblioteca por tamanho. Isso é para garantir que profundidades de sequenciamento suficientes sejam alcançadas para todos os ROIs sem viés de tamanho.
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Representative Results
Protocolo de visualização automatizada para orientar a seleção de ROI
Neste artigo, apresentamos o uso de um protocolo IF automatizado e personalizado baseado em TSA para visualizar o tecido e selecionar ROIs específicas. O desenvolvimento do painel de visualização usando melanoma e pele humana normal como tecidos de controle consistiu em testes de estabilidade de epítopos, ajuste fino das intensidades dos marcadores e avaliação de sangramento através de controles de deixar um de fora. Para testar se a estabilidade do epítopo dos anticorpos é afetada por etapas repetitivas de eluição, os sinais de PAF e Anticorpo X foram avaliados qualitativamente após a marcação em cada posição do 3-plex. O sinal de anticorpos X permaneceu consistente em todas as posições, enquanto a intensidade do sinal de PAF diminuiu após uma eluição (Figura 2). Estudos internos anteriores mostraram que o epítopo panCK é estável ao longo de um ensaio de 3 plexos. Portanto, a PAF foi escolhida para estar na 1ª posição no 3-plex, o panCK foi colocado na 2ª e o Anticorpo X na3ª posição. Como o sinal de PAF foi mais fraco em geral em comparação com o Anticorpo X e o panCK, o PAF foi pareado com o fluoróforo mais brilhante, Cy5.
O 3-plex automatizado foi otimizado com controles leave one out, onde cada marcador foi omitido do protocolo 3-plex uma vez para confirmar que não houve sangramento em canais vizinhos (Figura 3).
Os fluoróforos utilizados na plataforma de coloração automatizada foram testados na plataforma de perfil espacial para confirmar que os filtros são compatíveis com os fluoróforos TSA no painel de visualização de 3 plexos. Como o protocolo de 3 plexos usa FITC, Cy3 e Cy5, e o canal DAPI é usado para clivagem UV na plataforma de perfil espacial, uma contramancha nuclear no canal Texas Red teve que ser usada. Dois corantes nucleares diferentes, SYTO 59 e SYTO 64, foram testados, e os corantes mostraram um sinal nuclear distinto nos tecidos do cólon. No entanto, o SYTO 59 também exibiu algum sinal de sangramento no canal Cy5, enquanto o canal Cy5 estava limpo ao usar o SYTO 64 (Figura 4). Portanto, o SYTO 64 foi a escolha preferida para a detecção nuclear.
Testes adicionais do SYTO 64 mostraram que este corante não era fotoestável e fotobranqueado rapidamente durante a imagem. Uma vez que o sinal é branqueado, o sistema de imagem se concentra no fundo, o que pode ser interpretado como um sinal inespecífico (Figura 5). Aumentar a concentração do corante nuclear para aumentar a intensidade do sinal ajudou a minimizar esse problema.
Os tecidos marcados com o protocolo de visualização manual panCK/CD45, que usa anticorpos diretamente conjugados, foram comparados aos tecidos marcados com o protocolo de visualização personalizada automatizada panCK/FAP/Antibody X. Ambos os protocolos compartilham panCK como um marcador comum, e o sinal foi comparável entre os dois protocolos (Figura 6).
Para garantir que um protocolo de visualização modificado não tenha impacto no ensaio de proteômica espacial upstream, comparamos os valores de contagem obtidos após a coleta da Plataforma de Perfil Espacial e o processamento da Plataforma de Contagem ao usar o protocolo de visualização manual panCK/CD45. Isso usa anticorpos diretamente conjugados ou o protocolo de visualização personalizada automatizado de 3 plexos, que usa TSA. Quatro tecidos de câncer colorretal (CCR) foram marcados com o protocolo de visualização manual panCK/CD45 ou o protocolo de visualização personalizada automatizada de 3 plexos em combinação com o ensaio de proteômica espacial. ROIs semelhantes foram escolhidas para cada protocolo, e os dados de contagem das ROIs correspondentes foram comparados usando a normalização de limpeza para S6 e Histone. Tendências semelhantes foram observadas entre essas ROIs, conforme mostrado no mapa de calor log2 (Figura 7A), com um valor de R de Spearman de 0,88 para todos os marcadores incluídos no ensaio de proteômica espacial (Figura 7B). Dos 31 anticorpos utilizados nos ensaios, 23 anticorpos apresentaram um valor de Spearman R maior ou igual a 0,5.
Como a proteômica espacial e os protocolos transcriptômicos diferem, avaliamos se o protocolo de visualização automatizada também poderia ser aplicado a ensaios de transcriptômica espacial. O protocolo de visualização automatizada requer que o ensaio IHC seja realizado antes da detecção de RNA, enquanto o protocolo manual original detecta o RNA primeiro antes de aplicar o protocolo de visualização. O protocolo de visualização automatizada de 3 plexos foi testado lado a lado com o protocolo de visualização manual CK/CD45 em combinação com o ensaio de transcriptômica espacial. Os dados de sequenciamento para o protocolo de visualização automatizada de 3 plexos Quartile 3 count (Q3), normalizado no software de perfil espacial, apresentaram valores menores quando comparados ao protocolo de visualização manual CK/CD45 (Figura 8A), o que também é refletido pelos baixos valores de Spearman R de 0,15 (Figura 8B). Além disso, observou-se perda de amplitude dinâmica ao utilizar o protocolo automatizado de visualização de 3 plexos (Figura 8C).
Essa perda de contagens com o protocolo de visualização automatizada indica que esse protocolo compromete a integridade do RNA e que a detecção do RNA antes de realizar o ensaio de visualização é necessária para conservar a qualidade do RNA. Como este painel de visualização automatizada requer que a parte da proteína seja realizada antes da detecção de RNA, esse protocolo não é adequado para ensaios de RNA.
Tamanho da seleção de ROI em ensaios de transcriptômica espacial
Para entender melhor o impacto do tamanho do ROI na saída de dados de RNA, as contagens de RNA de ROIs de diferentes tamanhos foram comparadas. O ensaio de transcriptômica espacial foi realizado em linhagens celulares SUDHL1 e JURKAT para minimizar as diferenças inerentes aos tecidos. ROIs circulares de 50 μm e 300 μm de diâmetro foram selecionadas e comparadas entre si utilizando a normalização Q3 no software de perfil espacial. As contagens de RNA para alvos selecionados em diferentes linhagens celulares foram comparáveis entre os dois tamanhos de ROI após a normalização (Figura 9A,B).
Figura 1: Fluxo de trabalho de criação de perfil espacial digital. (A) As lâminas são marcadas com anticorpos (ensaio proteômico espacial) ou sondas (ensaio transcriptômico espacial), bem como marcadores de visualização. (B) Os slides são colocados na plataforma de criação de perfil espacial para criar imagens e selecionar ROIs. (C) Os oligos são clivados pela luz UV e coletados em uma placa de 96 poços. Esse processo é repetido para cada ROI selecionado. (D) As amostras são processadas e os dados são gerados usando a plataforma de contagem ou um sequenciador. Este valor foi modificado do site Nanostring technologies 4,5. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estabilidade do epítopo. (A-C) Anticorpos X e (D-F) PAF testados em pele humana normal e melanoma, respectivamente. Cada marcador na (A,D) 1ª, (B,E) 2ª e (C,F) 3ª posição de um 3-plex. O anticorpo X é estável em todas as posições, enquanto (D) a PAF apresenta intensidade de sinalização decrescente após uma e duas eluções (E-F), respectivamente. Anticorpo X em verde, FAP em vermelho, DAPI em cinza. As barras de escala estão a 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Deixe um de fora dos controles para o protocolo de visualização personalizada automatizada de 3 plexos em tecidos do pâncreas humano. Para todas as imagens, o Anticorpo X é representado em verde, panCK em ciano e FAP em vermelho. A primeira linha mostra o (A) 3-plex e os canais únicos para (B) Anticorpo X em FITC, (C) panCK em Cy3 e (D) FAP em Cy5. A segunda linha mostra o controle de saída 3-plex para (E) Anticorpos X e (F-H) os canais únicos para cada marcador. A terceira linha mostra o controle de saída 3-plex para (I) panCK e (J-L) os canais únicos para cada marcador. A quarta linha mostra o controle de saída 3-plex para (M) FAP e (N-P) os canais únicos para cada marcador. Nenhum sangramento foi observado em nenhum dos controles de saída de um lado, conforme indicado pela falta de sinal nos canais correspondentes quando testado (F) sem PAF, (K) sem panCK e (P) sem Anticorpo X. As barras de escala estão a 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Teste de corante SYTO. O canal Texas Red exibe o sinal nuclear em Colon para (A) SYTO 59 com sangramento em (B) canal Cy5 (vermelho). O canal Texas Red mostra o sinal nuclear em Colon para (D) SYTO 64 sem sangrar no canal (E) Cy5. Texas Red e Cy5 canais em Colon exibidos juntos para mostrar (C) sangramento de SYTO 59 e (F) nenhum sangramento para SYTO 64. As barras de escala estão a 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Fotoestabilidade do SYTO 64. Amostras de cólon marcadas com SYTO 64 (A) antes e (B) após o fotobranqueamento. A imagem B mostra o sinal inespecífico que se torna mais visível após a perda do sinal nuclear. As barras de escala estão a 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Comparação da marcação panCK. sinal panCK em amostras de câncer colorretal (CRC) com (A) protocolo de visualização manual panCK/CD45 e (B) protocolo de visualização automatizada panCK/FAP/Anticorpo X. Não foram observadas diferenças no sinal panCK entre os dois protocolos. As barras de escala estão a 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Comparação dos valores de contagem para o ensaio de proteômica espacial usando dois protocolos de visualização diferentes em ROIs semelhantes de quatro tecidos de CCR. (A) Log 2 Mapa de calor de todos os marcadores incluídos no ensaio de proteômica espacial comparando o protocolo panCK/CD45 manual (preto) com o protocolo automatizado de 3 plexos (cinza). (B) A correlação de Spearman do Log 2 para todos os marcadores apresenta um valor de R de 0,88. A análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism 7 ou com a linguagem de programação Python. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Comparação dos valores de contagem para o ensaio de transcriptômica espacial usando dois protocolos de visualização diferentes. (A) Log 2 Mapa de calor de alvos selecionados incluídos no ensaio de transcriptômica espacial comparando o protocolo panCK/CD45 manual (preto) com o protocolo automatizado de 3 plexos (cinza). (B) A correlação de Spearman do Log 2 para todos os marcadores apresenta um valor de R de 0,15. (C) A média (azul) e o desvio padrão em que a faixa dinâmica é perdida no protocolo automatizado de 3 plexos. A análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism 7 ou com a linguagem de programação Python. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Comparação dos valores de contagem de RNA para o ensaio de transcriptômica espacial em pellets celulares. Resultados comparáveis foram observados para ROIs de 50 μm (preto) e 300 μm (cinza) de diâmetro para alvos selecionados em linhagens celulares (A) SUDHL1 e (B) JURKAT. Não foi observada diferença significativa pelo teste t. Média e desvio padrão mostrados para n = 3 ROIs por tamanho. A análise estatística foi realizada por meio do software GraphPad Prism 7. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Até o momento, anticorpos fluorescentes diretamente conjugados em um protocolo manual são mais comumente utilizados como painéis de visualização para ensaios de proteômica espacial ou transcriptômica espacial 9,10. No entanto, o uso de anticorpos fluorescentes diretamente conjugados pode ser um desafio para marcadores menos abundantes, limitando a seleção de anticorpos adequados. Este protocolo mostra que a marcação de marcadores de visualização pode ser automatizada em uma plataforma de coloração automatizada usando tecnologias TSA para suportar ensaios de proteômica espacial. Isso permite mais flexibilidade na personalização de painéis de visualização, o que permite uma seleção de ROI mais direcionada e a aquisição de dados biológicos relevantes de áreas específicas de um tecido. A tecnologia TSA também permite a visualização de marcadores de baixa abundância e, assim, aumenta o número de potenciais anticorpos adequados. Além disso, a automação do protocolo de visualização garante a reprodutibilidade e a qualidade do procedimento de rotulagem.
O desenvolvimento de um ensaio de FI de 3 plexos requer uma avaliação cuidadosa das intensidades de sinal do marcador/fluoróforo nos tecidos de controle apropriados. Recomenda-se titular as concentrações de anticorpos para obter a melhor relação sinal-ruído, o que ajudará a minimizar o sangramento em canais adjacentes. Além disso, a estabilidade do epítopo para cada marcador de interesse deve ser testada para garantir que o epítopo não seja afetado por etapas repetidas de eluição. Uma vez que a ordem dos anticorpos no painel é confirmada, o ensaio precisa ser ajustado usando controles de deixar um de fora. Aqui, um marcador específico é omitido no painel e o canal correspondente na imagem adquirida é revisado quanto a sangramento e cross-talk.
Foi demonstrado aqui que os ensaios baseados em TSA podem ser fotografados na plataforma de perfil espacial e que as alternativas DAPI precisam ser usadas para coloração nuclear. Testamos os corantes SYTO e determinamos que, ao decidir sobre qual corante SYTO usar, o sinal precisa ser cuidadosamente avaliado para evitar o sangramento em canais adjacentes. Outra limitação do uso de corantes SYTO é que alguns corantes SYTO fotobranqueiam mais rapidamente, como SYTO 64 e SYTO 83 (dados internos), o que poderia afetar a quantificação nuclear. Portanto, a exposição à luz das lâminas coradas deve ser evitada o máximo possível. Outros grupos mostraram o uso do SYTO 1311,12, que é mais fotoestável (dados internos) e poderia ser utilizado em um painel, desde que os marcadores de interesse sejam atribuídos a fluoróforos compatíveis com o corante nuclear de escolha.
Embora os ensaios fluorescentes automatizados baseados na TSA tenham funcionado bem para visualização em combinação com ensaios de proteômica espacial, determinou-se aqui que a combinação de um protocolo de visualização automatizada de 3 plexos com um protocolo de transcriptômica espacial resultou em perda de faixa dinâmica, o que poderia ser devido às condições mais duras do protocolo de adicionar etapas extras de recuperação / eluição de antígenos que podem afetar a integridade do RNA. Portanto, o protocolo de visualização automatizada de 3 plexos só deve ser adaptado para ensaios proteômicos, o que é uma limitação e requer abordagens alternativas de visualização para ensaios baseados em RNA. Como alternativa à visualização do mesmo slide, seções seriadas coradas com marcadores de interesse poderiam ser sobrepostas para facilitar a seleção do ROI13. Além disso, a literatura descreve o uso da hibridização in situ em lâminas adjacentes para orientar a seleção do ROI14. No entanto, essas abordagens podem ser limitadas pela disponibilidade de tecidos, variabilidade seção a seção e registros de célula para célula.
Também testamos a usabilidade de diferentes tamanhos de ROI para ensaios de transcriptômica espacial. O uso de pequenas ROIs de 50 μm permite que o pesquisador adquira dados de regiões específicas, permitindo uma leitura mais detalhada de células selecionadas ou áreas de interesse. As limitações da seleção de pequenos ROIs são que o número de células presentes pode não ser abundante o suficiente para obter valores de contagem que possam ser distinguidos do plano de fundo. Uma opção é selecionar populações de células puras para capturar alvos menos abundantes. No entanto, a seleção de ROI para células individuais é limitada pela alta relação sinal-ruído15. Além disso, é importante considerar os tamanhos de ROI para a preparação da biblioteca se ROIs de tamanhos diferentes forem coletados em um único experimento. Se os tamanhos de ROI diferirem significativamente, pode ser benéfico agrupar os ROIs de acordo com seus tamanhos e construir bibliotecas separadas para evitar que grandes ROIs sejam super-representados em uma biblioteca. Isso também garantirá que cada ROI obtenha cobertura de sequenciamento suficiente de acordo com seu tamanho.
Outros fatores a serem considerados ao realizar experimentos de Ômica Espacial são que os dados podem mostrar variações devido à variabilidade deslizante a slide, e uma menor expressão de certos alvos pode trazer antecedentes e diferenças nos valores de correlação. Controles adequados e abordagens de normalização precisam ser considerados ao planejar experimentos e avaliar dados. Para ensaios de proteômica espacial no nCounter, a normalização para alvos de limpeza ou para as IgGs de controle negativo são os métodos preferidos de acordo com a experiência interna e as recomendações do fornecedor, onde a correlação entre as metas de limpeza ou com as IgGs de controle negativo precisa ser avaliada16. Entretanto, dependendo dos tecidos utilizados, a melhor normalização precisa ser definida para cada estudo17,18. Por exemplo, a literatura afirma que, para os estudos de Ômica Espacial do câncer de mama, o GAPDH, que é comumente usado para normalizar os alvos de limpeza, tem sido menos concordante do que S6 e Histone19. Portanto, S6 e Histona têm sido os alvos de limpeza recomendados para normalização em tecidos de câncer de mama19.
Para ensaios de transcriptômica espacial, as estratégias de normalização precisam ser definidas dependendo do desenho do estudo (por exemplo, tipos de tecido e seleção de ROI). Algumas estratégias que são utilizadas no RNA-Seq, como a normalização do quartil superior ou da média aparada dos valores de M (TMM), poderiam ser aplicadas para normalizar os dados sequenciados19,20.
Os ensaios de transcriptômica espacial fornecem informações sobre milhares de alvos e estão se tornando mais comumente usados para explorar todo o transcriptoma, onde compartimentos específicos de EMT são selecionados e analisados em conjunto com o RNA-seq20 de núcleo único ou o sequenciamento de RNA de célula única21. Demonstramos que os protocolos de visualização para orientar a seleção de ROI para avaliar a distribuição espacial dos alvos poderiam ser automatizados para ensaios de proteômica espacial, mas não para ensaios de transcriptômica espacial. Além disso, apresentamos que ROIs tão pequenas quanto 50 μm podem ser selecionadas para permitir uma investigação mais aprofundada de uma determinada região tecidual. Futuras aplicações desta tecnologia irão melhorar a compreensão do microambiente tumoral.
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Disclosures
Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan e Sandra Rost são funcionárias e acionistas da Genentech, membro do Grupo Roche. Outras empresas que fazem parte da Roche produzem reagentes e instrumentos utilizados neste manuscrito. Ciara Martin é funcionária em tempo integral da NanoString Technologies Inc, que produz reagentes e instrumentos usados neste manuscrito.
Acknowledgments
Os autores reconhecem Thomas Wu por processar arquivos NGS. Agradecemos a James Ziai pelas discussões dos resultados e revisão do manuscrito e Meredith Triplet e Rachel Taylor pela revisão interna do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
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