Summary
نحن نقدم بروتوكول التصوير الحي الخالي من التسمية باستخدام تقنيات المجهر الخفيفة المرسلة لالتقاط الصور وتحليل وقياس حركة النمو للفطريات الخيطية A. nidulans في كل من الثقافات المغمورة ووسائل الإعلام الصلبة. يمكن استخدام هذا البروتوكول بالتزامن مع المجهر الفلوري.
Abstract
ومن الثابت أن نمو مستعمرة من الفطريات الخيطية، تعتمد في الغالب على التغيرات في معدل النمو apical hyphae / mycelia، ويقدر بشكل كلي على وسائل الإعلام الصلبة من خلال مقارنة حجم المستعمرة. ومع ذلك ، لقياس كمي معدل نمو سلالات الفطريات المختلفة وراثيا أو سلالات في ظل ظروف بيئية / النمو المختلفة (درجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، ومصادر الكربون والنيتروجين ، والمضادات الحيوية ، وما إلى ذلك) أمر صعب. وهكذا، فإن السعي إلى اتباع نهج تكميلية لقياس حركة النمو يصبح إلزاميا من أجل فهم أفضل لنمو الخلايا الفطرية. وعلاوة على ذلك، فمن المعروف جيدا أن الفطريات الخيطية، بما في ذلك أسبيرغيلوس SPP.، لديها أنماط متميزة من النمو والتمايز في ظل ظروف شبه جوية على وسائل الإعلام الصلبة أو الثقافات المغمورة. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة مجهرية كمية لتحليل الحركية النمو من الفطريات نموذج Aspergillus nidulans، وذلك باستخدام التصوير الحي في كل من الثقافات المغمورة ووسائل الإعلام الصلبة. نحن نلتقط الصور ونحلل ونتحديد معدلات نمو السلالات الفطرية المختلفة بطريقة قابلة للاستنساخ وموثوقة باستخدام برمجيات مفتوحة المصدر ومجانية للصور الحيوية (مثل فيجي) ، بطريقة لا تتطلب أي خبرة سابقة في تحليل الصور من المستخدم.
Introduction
الفطريات الخيطية ذات أهمية اجتماعية واقتصادية وإيكولوجية كبيرة ، كونها حاسمة كأدوات صناعية / زراعية لإنتاج الإنزيمات والمضادات الحيوية1،2 وكعوامل ممرضة لنباتات المحاصيل3، حشرات الآفات4 والبشر3. وعلاوة على ذلك، تستخدم الفطريات الخيطية مثل النيدولان أسبيرغيلوس على نطاق واسع ككائنات نموذجية للبحوث الأساسية، مثل الدراسات في علم الوراثة والخلايا والبيولوجيا التطورية وكذلك لدراسة تمديد الواصلة5. الفطريات الخيطية هي كائنات شديدة الاستقطاب التي استطالة من خلال العرض المستمر من الدهون الغشائية / البروتينات وتوليف دي نوفو من جدار الخلية في طرف تمديد6. دور مركزي في نمو طرف الواصلة وصيانة القطبية هو هيكل متخصص يسمى 'Spitzenkorper' (SPK) ، وهو هيكل مرتبة للغاية تتكون في معظمها من مكونات الهيكل الخلوي والتوزيع المستقطب من غولجي6،7،8.
المحفزات البيئية / الإشارات، مثل هذه الواجهة المياه والهواء، والضوء،تركيز ثاني أكسيد الكربون، والحالة الغذائية هي المسؤولة عن القرارات التنموية التي اتخذتها هذه القوالب9. في الثقافات المغمورة (السائل) يتم قمع تمايز النيدولان A. ويحدث النمو عن طريق استطالة طرف الواصلة6. خلال النمو النباتي ، تنبت الجراثيم اللاجنسية (كونيديا) عن طريق التمديد apical ، وتشكيل شبكة غير متمايزة من الخلايا الواصلة المترابطة ، والميسيليوم ، والتي قد تستمر في النمو إلى أجل غير مسمى طالما تتوفر العناصر الغذائية والفضاء. من ناحية أخرى ، على نصائح الواصلة وسائل الإعلام الصلبة استطالة وبعد فترة محددة من النمو النباتي (الكفاءة التنموية) ، ويبدأ التكاثر اللاجنسي وسيقان conidiophore الجوية تمتد من خلايا القدم المتخصصة من الميسيليوم6. هذه تؤدي إلى هياكل متعددة الخلايا التنموية المتخصصة تسمى conidiophores، والتي تنتج سلاسل طويلة من haploid كونيديا10 التي يمكن أن تستأنف النمو في ظل ظروف بيئية مواتية.
وهناك طريقة تستخدم على نطاق واسع لقياس النمو الفطري الخيطي هو تطعيم الجراثيم على أجار المغذيات الواردة في طبق بيتري وقياس قطر المستعمرة بالمنظار بعد بضعة أيام11. القطر / منطقة المستعمرة ، والأكثر اعتمادا على التغيرات في معدل النمو mycelial وأقل على كثافة conidiophore12، ثم يستخدم كقيمة للنمو. على الرغم من أن قياس حجم السكان الفطرية (مستعمرة) تنمو على الأسطح الصلبة كافية جدا، فإنه ليس بأي حال من الأحوال مقياس الأكثر دقة للنمو. بالمقارنة مع متوسطات مستوى السكان (متوسطات حجم المستعمرة الفطرية) ، يمكن أن تلتقط قياسات الخلية الواحدة عدم التجانس في مجموعة الخلايا وتسمح بتحديد المجموعات الفرعية الجديدة من الخلايا ، والدول13، والديناميات ، والمسارات ، وكذلك الآليات البيولوجية التي تستجيب بها الخلايا للتغيرات الذاتية والبيئية14،15. يمكن القول إن رصد نمو الخلايا الفطرية والنمط الظاهري عن طريق المجهر الفاصل الزمني هو النهج الكمي الأكثر استخداما لمراقبة الخلايا المفردة.
هنا، نقوم بتفصيل بروتوكول التصوير الحي الخالي من التسميات باستخدام تقنيات المجهر الخفيفة المرسلة (مثل تباين المرحلة، وتباين التداخل التفاضلي (DIC)، والتنظير المجهري المستقطب) لالتقاط الصور، والتي يمكن استخدامها بشكل مستقل عن الاستخدام المشترك للتنظير المجهري الفلوري لتحليل وقياس النمو القطبي لسلالات النيدولان A. في كل من الثقافات المغمورة والوسائط الصلبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد إنكولوم
ملاحظة: يجب تنفيذ كافة الخطوات ضمن خزانة تدفق صفح.
- الشرائط من سلالة الفطرية من الاهتمام، من مخزون الجلسرين (-80 درجة مئوية) باستخدام حلقة تلقيح معقمة، على لوحات من الحد الأدنى من الوسائط (MM) تكملها المتطلبات الغذائية المناسبة ذات الصلة بالسلالة التي تم فحصها [MM: 10.0 غرام / لتر جلوكوز، 20 مل / لتر محلول ملحي (محلول الملح: 26 غرام/ لتر KCl، 26 غرام/L MgSO4·7H2O، 76 غرام/لتر KH2PO4،2.0 مل/لتر كلوروفورم) و1 مل/لتر عناصر تتبع (العناصر النزرة: 40 ملغم/لترنا 2ب4س7· H2O, 400 ملغم/لتر CuSO4, 8 غ/لتر ZnSO4, 800 ملغم/لتر MnSO4, 800 ملغم/ل فيبو4),ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع 1 M NaOH, إضافة 1 ٪ (ث/v) أجار والمكملات المطلوبة كما هو موضح في16 و أوتوكلاف](الشكل 1).
ملاحظة: محلول الملح، حل العناصر النزرة والمكملات الغذائية هي autoclaved. - حضانة لمدة 2-3 أيام في 37 درجة مئوية.
- استخدام مسواك معقمة (أو حلقة تلقيح)، نقل عدد قليل من كونيديا، عن طريق لمس بلطف مستعمرة واحدة، إلى لوحات من وسائل الإعلام كاملة (CM) [CM: 10.0 غرام / لتر الجلوكوز، 2.0 غرام / لتر بيبتون، 1.0 غرام / لتر استخراج الخميرة، 1.0 غرام / لتر أحماض كازامينو، 20 مل / لتر محلول الملح، 1 مل / لتر العناصر النزرة، 5 مل / لتر محلول فيتامين (حل فيتامين: 0.1 غرام/لتر ريبوفلافين، 0.1 غرام/لتر نيكوتيناميد، 0.01 غرام/لتر من حمض البنزويك الأميني، 0.05 غرام/لتر بيريدوكسين HCl، 1.0 ملغم/لتر بيوتين)، ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع 1 M NaOH، إضافة 1 ٪ (ث / v) أجار والمكملات المطلوبة على النحو المبين في16 وautclave]. أوتوكلاف وتخزين محلول فيتامين في زجاجة داكنة في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: في حالة نمو الفطريات كثيفة جدا لتحديد وعزل المستعمرات الفردية، وإعادة خط على لوحة أجار جديدة للحصول على مستعمرات واحدة. - حضانة لمدة 3-4 أيام في 37 درجة مئوية.
- الحصول على تعليق مرتبة من حوالي 2 × 106 خلايا / مل عن طريق خدش 1 سم من سطح مستعمرة الفطرية مرتبة نمت على لوحات أجار CM، وذلك باستخدام مسواك معقمة (الشكل S1).
ملاحظة: عند الضرورة، عد كونيديا مع مقياس الدم. - حصاد كونيديا من النيدولانات A. في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل مع 1.0 مل من الماء المقطر autoclaved تحتوي على 0.05٪ (v/v) توين 80 للحد من عدد كتل كونيديا.
ملاحظة: يمكن تخزين كونيديا لمدة تصل إلى 2-3 أسابيع عند 4 درجات مئوية دون فقدان ذي صلة بقابلية البقاء (أ. أثاناسوبولوس و ف. صوفيانوبولو، بيانات غير منشورة). ومع ذلك، فمن المستحسن لتصفية و / أو لغسل تعليق المخروطية لإزالة الأجزاء والمواد المغذية mycelial، من أجل منع تورم conidial.
2. التحضير لتصوير الفطريات الخيطية تنمو على أجار (الصلبة) وسائل
ملاحظة: يتم استخدام إصدار معدل من 'المقلوبة أجار الطريقة17،18.
- في البداية، بقعة 10 ميكرولتر aliquots من conidial دوامة بقوة (حوالي 2 × 104 خلايا / مل) في عدة نقاط على أطباق بيتري (Ø9 سم) 15 مل من MM مع 1٪ (ث / v) أجار (الشكل 2).
ملاحظة: باستخدام النسخة المعدلة من "طريقة أجار مقلوبة"، فمن الممكن لتصوير عينات الفطرية لعدة ساعات دون آثار ضارة واضحة على hyphae المتنامية. - احتضان الثقافة التجريبية وفقا للمرحلة التنموية التي يعتزم التحقيق فيها.
- قطعة من كتلة ≈0.8 ملم2 من أجار تحتوي على مستعمرة باستخدام مشرط معقم.
ملاحظة: أبعاد كتلة أجار إلى شرائح يعتمد على أبعاد المعدات التي سيتم وضعها بعد ذلك. في العمل الحالي، يتم استخدام 8 شرائح μ جيدا (انظر أدناه). - عكس ووضع كتلة أجار في بئر من الشريحة μ أو ما شابه ذلك 8 coverglass غرف مع coverlip مناسبة للتصوير الحي.
ملاحظة: في حالة استخدام المجهر الخفيف المنقول بالاقتران مع المجهر الفلوري (وضع العلامات) ، يمكن عكس كتلة أجار على قطرة من الوسط السائل تحتوي على صبغة تلطيخ الخلية الحية ، قبل التصوير مباشرة.
3. التحضير لتصوير الفطريات الخيطية تنمو على المتوسط السائل
- نقل 10 ميكرولتر aliquots من تعليق كوني دوامة بقوة (حوالي 2 × 104 خلايا / مل) في آبار بئر 8 μ الشريحة التي تحتوي على 200 ميكروغرام من (السائل) MM مع المكملات المناسبة (انظر أعلاه).
- حضانة الوقت المطلوب في درجة الحرارة المطلوبة (الشكل 3).
ملاحظة: إذا تم استخدام المجهر الخفيف المنقول بالاقتران مع المجهر الفلوري (وضع العلامات) ، فإن الثقافات السائلة لها ميزة كبيرة تتمثل في إمكانية إضافة الأصباغ الفلورية في أي نقطة زمنية مرغوبة أثناء التجربة19.
4. التقاط الصور
ملاحظة: اختيار المجهر يعتمد على المعدات المتاحة. على أي حال يجب أن يتضمن إعداد المجهر مرحلة مقلوبة أو غرفة بيئية أو على الأقل غرفة مع تحكم دقيق في درجة حرارة الهواء.
- سخني غرفة المجهر الحراري عند 37 درجة مئوية (ما لم يذكر خلاف ذلك أو مناسب للأنواع الفطرية المستخدمة) لتثبيت درجة الحرارة قبل البدء. تسمح هذه الغرفة بتعديل درجة حرارة مجهر البصريات ونماذج المرحلة خلال التجارب الفاصل الزمني. كن على علم بأن الانحرافات البصرية20 يتم إدخالها عند استخدام زيوت الغمر العادية (المصممة للاستخدام عند 23 درجة مئوية) في 37 درجة مئوية أو أكثر.
ملاحظة: على ميزانية ضيقة، يمكن إجراء غرف الحضانة من الورق المقوى ومواد التعبئة العازلة21 أو باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد22. - قم بتشغيل المجهر وطاقة الماسح الضوئي وطاقة الليزر والكمبيوتر، ثم قم بتحميل برنامج التصوير. ضع الشريحة μ (التي تم إعدادها مسبقا) في مرحلة المجهر والتركيز.
- ابحث عن مجالات الرؤية التي تحتوي على خلايا معزولة/غير متداخلة (أو على الأقل غير مكتظة)، من أجل تسهيل قياسات النمو أثناء تحليل الصورة. التقاط ما لا يقل عن 50 خلية متنامية لكل عينة للسماح بإجراء تحليل إحصائي قوي.
- حدد نهج المجهر الضوئي الذي يتم نقله. تقليل وقت التعرض أو قوة الليزر وبكسل يسكن الوقت و / أو زيادة أقطار الثقب، من أجل تقليل photobleaching من الخلايا الفطرية، كما هو موضح في مكان آخر 23،24.
- تعيين المجهر للحصول على الصور في فترات زمنية المطلوبة وبدء الحصول على سلسلة زمنية.
ملاحظة: لتصحيح الانجراف البؤري بمرور الوقت (خاصة للتجارب الطويلة)، بسبب الانجراف الحراري، وأحجام الخلايا المتنوعة، وحركة الخلية استخدم استراتيجية التركيز البؤري التلقائي إذا كانت متوفرة في برنامج المجهر الخاص بك.
5. تحليل الصور
ملاحظة: يصف هذا القسم الخطوات الرئيسية لمعالجة صور المجهر الفاصل الزمني لقياس معدل نمو النيدولانات A. يتم إنجاز فتح وتصور ومعالجة الصور مع المصدر المفتوح ImageJ / فيجي البرمجيات25.
- استيراد الصور إلى فيجي باستخدام الإضافات | | التنسيقات الحيوية Bio-Formats المستورد من القائمة فيجي مع الإعدادات الافتراضية (الشكل 4A).
ملاحظة: تحقق ما إذا كان مستورد التنسيقات الحيوية يتعرف بشكل صحيح على معايرة الصورة. يجب أن يكون بعد الصورة المعروض في إطار صورة حقل المعلومات العلوي مساويا لأبعاد الصورة الأصلية(الشكل 4B). اضغط على Shift + P لعرض وتغيير خصائص الصورة في برنامج ImageJ/Fiji. - عند الحاجة، استخدم الرسم البياني المطابق26 لتصحيح الإضاءة بين الإطارات المختلفة (image | ضبط | | تصحيح التبييض مطابقة الرسم البياني) (الشكل 4C).
- عند الحاجة ، استخدم خوارزمية SIFT(الإضافات | | التسجيل محاذاة المكدس الخطي مع SIFT) لمحاذاة أو مطابقة مداخن الصور (الشكل 4D). اختيار"الترجمة"من قائمة التحول المتوقع ينبغي أن يكون كافيا لتصحيح أي الانجراف س ص.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام المكونات الإضافية الأخرى لمحاذاة مجموعة من شرائح الصور، مثل مثبت الصور (https://imagej.net/Image_Stabilizer) أو StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/). - حدد hyphae التي تنمو بالتوازي مع coverslip، وتجنب تلك التي تميل. تأكد من تحديد hyphae التي تنتشر عن طريق التمديد القطبي وتجنب الهيجة تقديم الجانبية و / أو المتفرعة apical.
- استخدام MTrackJ (الإضافات | MTrackJ) البرنامج المساعد لتتبع تزايد نصائح واصلة (الشكل 4E)27. لإضافة مسار، حدد الزر إضافة في شريط الأدوات ووضع النقطة الأولى في طرف واصلة باستخدام النقرة اليسرى للفأرة. سيتم نقل السلسلة الزمنية تلقائيا إلى الإطار التالي. لإكمال عملية التتبع، انقر نقرا مزدوجا فوق الماوس على النقطة الأخيرة (أو اضغط على مفتاح Esc)(الشكل 4F). الانتقال إلى نقطة أخرى من الاهتمام (أي، تزايد تلميح واصلة) في الإطار الزمني الأولي وإعادة تشغيل الإجراء عن طريق قياس معدل النمو من hypha آخر.
ملاحظة: لتثبيت MTrackJ اتبع الإرشادات المقدمة في https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ - انقر فوق الزر قياس في مربع الحوار MTrackJ (الشكل 4G) لفتح جدول الإخراج. حفظ قياسات المسار (ملف | حفظ ك)إلى تنسيق الملف المطلوب (على سبيل المثال، csv)، تحليل ورسم لهم(الشكل 4H).
ملاحظة: عن طريق تحديد الزر فيلم، يتم إنتاج فيلم يعرض الصورة وتتبع التقدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد هذا البروتوكول ، التقطنا وحللنا صورا مختلفة تتوافق مع مراحل النمو / النمو المختلفة للفطريات الخيطية A. nidulans. وقد تم تجهيز وتحليل البيانات المقدمة في هذه الدراسة باستخدام برنامج فيجي. تم حفظ القياسات كملفات csv ، وتحليلها إحصائيا وإعدادها كرسم بياني باستخدام البرامج الإحصائية التجارية و / أو لغة برمجة Python باستخدام مكتبات البرامج مثل الباندا ، والنومبى ، والإحصائيات ، والماتوبلوتليب والمولود. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل في المنشورات الأصلية المذكورة.
من أجل تفسير استجابة السكان ، من المهم تحديد عدم تجانس المعلمات الرئيسية داخل السكان وتحديد المجموعات الفرعية المتميزة من الناحية الفسيولوجية28بكفاءة. يظهر الشكل 5 نمو سلالة متحولة azhAΔ ngnAΔ ، تحمل حذف في جينين ، وتورطت منتجاتهما في إزالة السموم واستيعاب المنتج النباتي السام L-azetidine-2 - حمض الكاربوكسيليك29، بالمقارنة مع سلالة WT. قياس معدل نموها في الثقافات السائلة المغمورة، ونحن الكشف عن انخفاض معدل النمو من الناحية الإحصائية كبيرة من متحولة مزدوجة مقارنة مع سلالة WT (t(715) = 20.61، ص = <0،0001) (الشكل 5A-B). لم يكن هذا الاختلاف في النمو قابلا للكشف عن منطقة المستعمرة فقط لهذه السلالات(الشكل 5C-D)،مؤكدا أن تحليل الخلية المفردة المجهرية أكثر فعالية في تحديد الاختلافات الصغيرة في معدلات النمو التي يصعب اكتشافها مع المراقبة العيانية للمستعمرة.
خلية واحدة على المدى الطويل التصوير الحي ذو قيمة كبيرة في الجهود الرامية إلى الحصول على المعلومات المكانية والزمنية من ديناميات البروتين الخلوي. على المدى الطويل تصوير الخلايا الحية (الشكل 6, فيديو 1) من الإنبات المخروطي المشارك في التعبير عن البروتين eisosomal الأساسية GFP المسمى بيلا و MRFP هيستون H1 يظهر أن بيلا30 أشكال هياكل ثابتة مع انخفاض الحركة في غشاء البلازما الفطرية31,32. وعلاوة على ذلك، يبين الشكل 7 أنه يمكن استخدام الأصباغ الفلورية للتصوير الحي للسلالات التي تزرع على المتوسط أغار، من أجل دراسة ديناميات العضيات وهياكل الخلايا. هنا، تم استخدام FM4-6433 لتصور شبكة الميتوكوندريا ونظام vacuolar في النيدولان A.
الشكل 1:التمثيل التخطيطي لإجراء إعداد inoculum. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:التمثيل التخطيطي للإجراء المتبع لتصوير الفطريات الخيطية المتنامية على وسيط أجار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:التمثيل التخطيطي للإجراء المتبع لتصوير الفطريات الخيطية المتنامية في الوسط السائل.
الشكل 4: التمثيل التخطيطي لإجراء تحليل الصورة. خطوات لمعالجة الصور المجهرية الفاصل الزمني وقياس معدل نمو النيدولان A. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:مقارنة قياسات السكان التقليدية مع قياسات الخلية الواحدة. (أ) صور تمثيلية مجهرية كونفوجكال من azhAΔ ngnAΔ حذف مزدوج وسلالات WT، نمت في الثقافات السائلة المغمورة التي تحتوي على اليوريا كمصدر النيتروجين الوحيد في 25 درجة مئوية. وتم احتضان جميع السلالات لما مجموعه 18 ساعة، عند 25 درجة مئوية، وتم التقاط الإطارات على فترات زمنية 15 دقيقة. تم جمع صور 2048 × 2048 بكسل مع حجم بكسل من 115.02 × 115.02 نانومتر باستخدام المجهر TCS SP8 MP (لايكا، ألمانيا) مجهزة HC خطة APO 63x، N.A. 1.40 هدف الغمر النفط. (ب)يتم رسم قياسات(أ)في مؤامرات مربع وشعيرات. تم تحليل الأهمية الإحصائية عن طريق t-Test ويتم تصويرها بالعلامات النجمية (***)، مما يشير إلى p < 0.001. (ج)تم تصوير النمو عند 25 درجة مئوية من WT وضغط الحذف المزدوج على مستعمرات MM الصلبة على فترات زمنية مختلفة (18 ساعة و 36 ساعة و 72 ساعة) ، معايرتها مكانيا وقياسها يدويا مع مسطرة في برنامج ImageJ. (د)يتم رسم قياسات منطقة المستعمرات المعروضة في(C)كمؤامرات مربع وشعيرات. لم تكن الاختلافات في مساحة المستعمرات ذات دلالة إحصائية بين النقاط الزمنية المختلفة للمتحول المزدوج مقارنة بسلالة WT (18h: t(8) = 0.69، ع = 0.50، 36h: t(6) = 0.27، ع = 0.5068، 72h: t(6) = 0.39، ع = 0.70 ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6:تصوير الخلايا الحية على المدى الطويل من الإنبات المخروطي المشارك في التعبير عن البروتينات ذات الاهتمام تنصهر مع علامات الفلورسنت المشفرة وراثيا. (أ)أقصى إسقاطات الكثافة (MIP) من 4 شرائح ولدت في الطائرة z، من سلالة المشاركة في التعبير عن بيلا-GFP وH1-mRFP. تم رصد كونيديا على المتوسط أجار واحتضانها لحوالي 1 ساعة في 30 درجة مئوية من أجل المساعدة في التصاق الخلايا إلى أجار. تم تقطيع كتلة أجار التي تحتوي على كونيديا إلى شرائح، ووضعها في آبار من الشريحة μ واحتضانها لما مجموعه 18 ساعة، عند 30 درجة مئوية. تم التقاط الإطارات على فترات 25 دقيقة ، وذلك باستخدام مجهر TCS SP8 MP (لايكا ، ألمانيا) المجهز بخطة HC APO 63x ، N.A. 1.40 هدف الغمر النفطي (بحجم بكسل 92.26 × 92.26 نانومتر). تم الحصول على الصور من قبل GFP مثيرة في الطول الموجي 488 نانومتر والكشف عن الفلورسينس في النطاق الطيفي تتراوح بين 495 إلى 558 نانومتر، وmRFP مثيرة في الطول الموجي 561 نانومتر والكشف عن مضان في النطاق الطيفي تتراوح بين 580 إلى 660 نانومتر. (ب)يتم رسم القياسات (سرعة الإنبات وتمديد طرف الواصلة) من(A)كرسم بياني خطي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: FM4-64 وضع العلامات من hyphae تنمو على المتوسط الصلبة. تمت زراعة كونيديا من سلالة WT على 1٪ أطباق أجار MM بيتري لمدة 16 ساعة في 30 درجة مئوية. تم احتضان الجراثيم المتنامية لمدة 20 دقيقة مع 10 ميكرولتر من MM تحتوي على 10 ميكرومتر FM4-64. بعد الحضانة، تم تقطيع كتلة أجار تحتوي على جراثيم ملطخة، ووضعها في 8 μ شريحة تليها مطاردة لمدة 47 دقيقة عند 30 درجة مئوية. تم التقاط الإطارات كل 7 دقائق عند 30 درجة مئوية باستخدام مجهر TCS SP8 MP المجهز بمجهر HC Plan APO 63x ، N.A. 1.40 هدف الغمر في الزيت (بحجم بكسل 184.52 × 184.52 نانومتر). تم الحصول على الصور من قبل FM4-64 مثيرة في الطول الموجي 514 نانومتر والكشف عن مضان في النطاق الطيفي تتراوح بين 596 إلى 682 نانومتر. تظهر إشارة الفلورسينس FM4-64 كصورة مقلوبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: تم استزراعالمراحل المبكرة من تشكيل كونيديوفور. (A) كونيديا من سلالة WT على متوسط أجار لمدة 136 ساعة عند 30 درجة مئوية ، مقطعة إلى شرائح ووضعها في آبار من μ الشريحة. تم التقاط الإطارات كل 20 دقيقة. تم جمع صور 2048 × 2048 بكسل مع حجم بكسل من 245.2 × 245.2 نانومتر باستخدام المجهر TCS SP8 MP (لايكا، ألمانيا)، مجهزة HC خطة APO 63x، N.A. 1.40 هدف الغمر النفط. تظهر الصور تشكيل الحويصلات conidiophore (السهم الأسود) وكذلك تشكيل (السهم البني) ونضوج الميتولاي (السهم الأزرق). (ب)يتم رسم قياسات (سرعة الإنبات وتمديد طرف الواصلة أحادي القطب) من (A) كرسم بياني خطي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: تصوير الخلايا الحية على المدى الطويل من الإنبات المخروطي المشارك في التعبير عن PilA- GFP و H1-mRFP. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 2: المراحل المبكرة من تشكيل conidiophore A. nidulans. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
الشكل S1: إعداد تعليق مخروطي. عن طريق كشط مع مسواك معقمة سطح2 سم تقريبا 1 من لوحة مرتبة، يتم الحصول على تعليق ما يقرب من 2 × 106 كونيديا / مل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مراقبة نمو الخلايا الفطرية والنمط الظاهري عن طريق المجهر الفاصل الزمني هو نهج قوي لتقييم السلوك الخلوي في الوقت الحقيقي وكميا ودقيقا تحديد ما إذا كان علاج المخدرات معينة و / أو التدخل الجيني يؤدي إلى نمو الخلايا التي يمكن الكشف عنها أو الاختلافات الظاهري مع مرور الوقت.
في هذه الدراسة ، وصفت منهجية تصوير موثوقة للخلايا الحية لقياس وتحليل التطور الفطري كميا ، بما في ذلك ديناميكيات الأنبوب الجرثومي ونمو طرف الواصلة في النيدولانات A.. رصد التغيرات المورفولوجية مع مرور الوقت، وذلك باستخدام تقنيات المجهر الخفيفة المنقولة، يمكن أن تكون مفيدة للغاية لتحديد الخلايا التي تعاني من الإجهاد، والموت أو الموت. وتتيح المعرفة المفصلة بهذه العمليات الدينامية على مستوى الخلية الواحدة تقييم عدم التجانس داخل مجموعة مختلطة من الخلايا ومن منظور طويل الأجل، مما يسمح بتحديد المسارات والآليات التفصيلية التي تستجيب بها الخلايا للإشارات الذاتية والبيئية.
إحدى مزايا هذه الطريقة هي أنها تستند إلى نهج التصوير الحر للتسمية (والذي يمكن مع ذلك دمجه بسهولة مع المجهر الفلوري) الذي يستخدم خصائص الانكسار الضوئي المتأصلة للخلايا لإنشاء تباين الصورة دون إدخال الأصباغ / التسميات ، مما قد يربك النتائج. في حين يمكن استخدام علامات الفلورسنت لوضع علامة على المقصورات الخلوية والبروتينات وتسهيل تجزئة وتتبع الخلايا بشكل كبير ، فإن المجهر الخفيف المنقول يتحايل على الحاجة إلى خلايا الهندسة الوراثية ، مما يمكن الباحثين من تجنب التكلفة وتحسين الصبغة / التسمية المستهلكة للوقت وكذلك لتجنب آثار السمية الضوئية المحتملة القادمة من التصوير الفلوري13،34.
هذا البروتوكول مناسب لدراسة حركة نمو الفطريات التي تشكل الهيفا أو الزائفة. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج مناسب للغاية لتصوير هياكل الخلايا المختلفة من سلالات مختلفة وتحت مراحل نمو مختلفة. في الشكل 8 والفيديو 2، نقدم المراحل الأولية من تطوير A. nidulans conidiophore (أي الهياكل التي تحمل الجراثيم اللاجنسية). ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن هذه الطريقة ليست الأنسب لتشكيل conidiophore التصوير ، لأن الكربون / النيتروجين المجاعة والتعرض للهواء ، وكلاهما ضروري لتطوير conidiophores ، لا يمكن توحيدها من خلال نهجنا35.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا البروتوكول غير مناسب بشكل جيد لتتبع الأغشية الحيوية الفطرية ، والتي تخضع للتمداد الرأسي الذي يشكل مستعمرة كثيفة غير متجانسة مرتبطة بالسطح تتألف من غشاء الهيفا الخيطي والخلايا الزائفة الشكل وخلايا شكل الخميرة وأشكال مختلفة من المصفوفة خارج الخلية36. وثمة قيد آخر على هذه التقنية هو أنه على الرغم من أن التحليل المجهري الحر للعلامة يمثل طريقة دقيقة للتحليل النوعي والكمي لديناميات الإنبات/التمايز، فإن التقييم اليدوي لهذه البيانات يستغرق وقتا طويلا، لا سيما عندما يتم فحص العديد من السلالات أو/والظروف. وهكذا ، ينبغي تحليل البيانات من التصوير المجهري الفاصل الزمني عالي الإنتاجية من خلال برنامج حسابي مناسب يمكن من تحليل الصور الآلي أو شبه الآلي لتطوير الواصلة والإنبات المخروطي37و38و39.
باختصار ، نقدم هنا بروتوكولا لتحليل حركة النمو الفطري بطريقة قابلة للاستنساخ وموثوقة دون الحاجة إلى أي تجربة تحليل صورة مسبقة من المستخدم. يسمح هذا البروتوكول بالتحديد الكمي الموضوعي والدقيق لنمو الفطريات وتمايزها ، ويوفر نهجا تصويريا تكميليا لدراسة دورات الحياة الفطرية والإمراض الفطري37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل جزئيا مشروع "بنية تحتية للبحوث اليونانية لتصور ورصد العمليات البيولوجية الأساسية (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) الذي ينفذ في إطار عمل "تعزيز البنية التحتية للبحوث والابتكار"، بتمويل من البرنامج التشغيلي "القدرة التنافسية وريادة الأعمال والابتكار" (NSRF 2014-2020) والذي تشارك في تمويله اليونان والاتحاد الأوروبي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C.
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H.
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F.
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
