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Biology

लाइव माइक्रोस्कोपी और ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एस्परगिलस निदुलन्स विकास दर का मात्रात्मक विश्लेषण

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62778
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Microbial Molecular Genetics Laboratory, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD), 2Light Microscopy Unit, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD)

Summary

हम दोनों जलमग्न संस्कृतियों और ठोस मीडिया में फिलामेंटस कवक ए निदुलांन के विकास कीजिक्स को कैप्चर करने, विश्लेषण करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करके एक लेबल-मुक्त लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर किया जा सकता है।

Abstract

यह अच्छी तरह से स्थापित है कि फिलामेंटस कवक की कॉलोनी वृद्धि, ज्यादातर हाइफाई/माइसेलिया एपिकल विकास दर में परिवर्तन पर निर्भर है, कॉलोनी के आकार की तुलना करके जम मीडिया पर अनुमानित है। तथापि, विभिन्न पर्यावरणीय/विकास स्थितियों (पीएच, तापमान, कार्बन और नाइट्रोजन स्रोतों, एंटीबायोटिक दवाओं आदि) के तहत आनुवंशिक रूप से विभिन्न कवक उपभेदों या उपभेदों की वृद्धि दर को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इस प्रकार, कवक कोशिका विकास को बेहतर ढंग से समझने के लिए विकास गतिज की मात्रा निर्धारित करने के लिए पूरक दृष्टिकोणों की खोज अनिवार्य हो जाती है। इसके अलावा, यह सर्वविदित है कि एस्परगिलस स्पीप सहित फिलामेंटस कवक में ठोस मीडिया या जलमग्न संस्कृतियों पर उप-हवाई परिस्थितियों के तहत विकास और भेदभाव के अलग-अलग तरीके हैं। यहां, हम डूबे हुए संस्कृतियों और ठोस मीडिया दोनों में लाइव इमेजिंग का उपयोग करके मॉडल कवक एस्परगिलस निदुलन्सके विकास का मूल्यांकन करने के लिए एक मात्रात्मक सूक्ष्म विधि का विस्तार करते हैं। हम एक खुले स्रोत, जैव-छवियों के लिए मुफ्त सॉफ्टवेयर (जैसे, फिजी) का उपयोग करके एक खुले स्रोत, मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विभिन्न फंगल उपभेदों की छवियों को कैप्चर, विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करते हैं, जिससे उपयोगकर्ता से किसी भी पूर्व छवि विश्लेषण विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं होती है।

Introduction

फिलामेंटस कवक महान सामाजिक आर्थिक और पारिस्थितिक महत्व के हैं, एंजाइम और एंटीबायोटिकउत्पादन1,2 के लिए औद्योगिक/कृषि उपकरणों के रूप में महत्वपूर्ण होने के नाते और फसल पौधों के रोगजनकों के रूप में3,कीट कीड़े4 और मनुष्य3। इसके अलावा, एस्परगिलस निदुलन जैसे फिलामेंटस कवक का व्यापक रूप से मौलिक अनुसंधान के लिए मॉडल जीवों के रूप में उपयोग किया जाता है, जैसे आनुवंशिकी, कोशिका और विकासवादी जीव विज्ञान में अध्ययन के साथ-साथ हाइफाल एक्सटेंशन5के अध्ययन के लिए। फिलामेंटस कवक अत्यधिक ध्रुवीकृत जीव होते हैं जो झिल्ली लिपिड/प्रोटीन की निरंतर आपूर्ति और विस्तार टिप6पर सेल दीवार के डी नोवो संश्लेषण के माध्यम से बढ़ जाते हैं। हाइफाल टिप विकास और ध्रुवीयता रखरखाव में एक केंद्रीय भूमिका 'स्पित्ज़ेंकोर्पर' (एसपीके) नामक एक विशेष संरचना है, जो एक अत्यधिक व्यवस्थित संरचना है जिसमें ज्यादातर साइटोस्केलेटलघटक और गोलगी6,7,8के ध्रुवीकृत वितरण शामिल हैं।

पर्यावरणीय उत्तेजनाओं/संकेतों, इस तरह के पानी-हवा इंटरफेस, प्रकाश, सीओ2 एकाग्रता, और पोषण की स्थिति इन सांचों द्वारा किए गए विकासात्मक निर्णयों के लिए जिम्मेदार हैं9। जलमग्न (तरल) संस्कृतियों में ए निदुलनों का भेदभाव दमित होता है और विकास हाइफाल टिप विस्तार6से होता है। वनस्पति वृद्धि के दौरान, अलैंगिक बीजाणु (शंकु) एपिकल एक्सटेंशन द्वारा अंकुरित होते हैं, जो इंटरकनेक्टेड हाइफाल कोशिकाओं, माइसेलियम का एक अविभेदित नेटवर्क बनाते हैं, जो पोषक तत्वों और स्थान उपलब्ध होने तक अनिश्चित काल तक बढ़ता रह सकता है। दूसरी ओर, ठोस मीडिया हाइफल युक्तियों पर और वनस्पति विकास (विकासात्मक क्षमता) की एक परिभाषित अवधि के बाद, अलैंगिक प्रजनन शुरू किया जाता है और हवाई शंकुखोर डंठल माइसेलियम6की विशेष पैर कोशिकाओं से विस्तारित होते हैं। ये विशेष विकासात्मक बहुकोशिकीय संरचनाओं को जन्म देते हैं जिन्हें कोनिओफोरस कहा जाता है, जो हैप्लॉयड कोनिडिया10 की लंबी श्रृंखलाओं का उत्पादन करते हैं जो अनुकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों में विकास को पुनः आरंभ कर सकते हैं।

फिलामेंटस फंगल ग्रोथ को मापने के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि पेट्री डिश में निहित पोषक तत्वों के पौधों पर बीजाणुओं को टीका लगाना और11दिनों बाद कॉलोनी के व्यास को स्थूल रूप से मापना है । कॉलोनी का व्यास/क्षेत्र, जो माइसेषीय विकास दर में परिवर्तन पर सबसे अधिक निर्भर है और कोनिडोफोर घनत्व12पर कम है, तो विकास के मूल्य के रूप में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, ठोस सतहों पर बढ़ते फंगल आबादी (कॉलोनी) आकार को मापने काफी पर्याप्त है, यह किसी भी तरह से विकास का सबसे सटीक उपाय नहीं है। जनसंख्या स्तर औसत (कवक कॉलोनी के आकार का औसत) की तुलना में, एकल कोशिका माप कोशिकाओं की आबादी की विषमता को पकड़ सकते हैं और कोशिकाओं की उप-आबादी की पहचान की अनुमति दे सकते हैं,13,गतिशीलता, रास्ते के साथ-साथ जैविक तंत्र जिसके द्वारा कोशिकाएं अंतर्जात और पर्यावरणीय परिवर्तनों का जवाब देती हैं14,15। समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा कवक सेल विकास और फेनोटाइप की निगरानी करना यकीनन सबसे व्यापक रूप से नियोजित मात्रात्मक एकल सेल अवलोकन दृष्टिकोण है।

इसके साथ ही, हम छवियों को कैप्चर करने के लिए प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों (जैसे चरण-विपरीत, अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और ध्रुवीकृत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक लेबल-मुक्त लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं, जो स्वतंत्र रूप से फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के संयुक्त उपयोग से विश्लेषण करने और दोनों जलमग्न संस्कृतियों और ठोस मीडिया में ए निदुलांन उपभेदों के ध्रुवीय विकास की मात्रा निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

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Protocol

1. इनोकुलम तैयारी

नोट: सभी कदम एक laminar प्रवाह कैबिनेट के तहत किया जाना चाहिए ।

  1. ब्याज की फंगल तनाव बाहर लकीर, एक ग्लिसरोल स्टॉक (-80 डिग्री सेल्सियस) से एक बाँझ टीका पाश का उपयोग कर, न्यूनतम मीडिया (एमएम) की प्लेटों पर जांच की गई तनाव से संबंधित उचित पोषण आवश्यकताओं के साथ पूरक [एमएम: 10.0 ग्राम/एल ग्लूकोज, 20 मिलीएल/एल नमक समाधान (नमक समाधान: 26 ग्राम/एल केसीएल, 26 ग्राम/एल एमजीसो4·7H 2O, 76 ग्राम/एल केएच2पीओ4,2.0 एमएल/एल क्लोरोफॉर्म) और 1 एमएल/एल ट्रेस तत्व (ट्रेस तत्व: 40 मिलीग्राम/एलएनए 2बी4ओ7· एच2ओ, 400 मिलीग्राम/एल CuSO4,8 g/L ZnSO4,800 मिलीग्राम/एल एमएनएसओ4,800 मिलीग्राम/एल फेपो4, 1एम NaOH के साथ 6.8 करने के लिए पीएच समायोजित करें, 1% (w/v) एगर जोड़ें और आवश्यक पूरक के रूप मेंवर्णित 16 और autoclave में वर्णित है](चित्रा 1)।
    नोट: नमक समाधान, ट्रेस तत्वों के समाधान और पूरक ऑटोक्लेव किए जाते हैं।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिनों के लिए इनक्यूबेट।
  3. एक बाँझ टूथपिक (या एक टीका पाश) का उपयोग करें, कोनिडिया की एक छोटी संख्या हस्तांतरण, धीरे से एक कॉलोनी को छूने से, पूर्ण मीडिया (सीएम) की प्लेटों के लिए [मुख्यमंत्री: १०.० ग्राम/एल ग्लूकोज, २.० ग्राम/एल पेप्टोन, १.० ग्राम/एल खमीर निकालने, १.० ग्राम/एल casamino एसिड, 20 mL/L नमक समाधान, 1 mL/L ट्रेस तत्वों, 5 mL/L विटामिन समाधान (विटामिन समाधान: 0.1 ग्राम/एल राइबोफ्लेविन, 0.1 ग्राम/एल निकोटिनामाइड, 0.01 ग्राम/एल पी-अमीनो बेंजोइक एसिड, 0.05 ग्राम/एल पाइरिडोक्सिन एचसीएल, 1.0 मिलीग्राम/एल बायोटिन), पीएच को 1 एम नाओएच के साथ6.8 में समायोजित करें, 1% (w/v) एगर जोड़ें और आवश्यक पूरक के रूप में 16 और autoaveclcl में वर्णित है]। ऑटोक्लेव और विटामिन के घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरी बोतल में स्टोर करें।
    नोट: यदि फंगल विकास व्यक्तिगत उपनिवेशों की पहचान करने और अलग-थलग करने के लिए बहुत घना है, तो एकल उपनिवेशों को प्राप्त करने के लिए एक नई आगर प्लेट पर फिर से लकीर।
  4. 3-4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. एक बाँझ टूथपिक(चित्रा S1)का उपयोग कर, सीएम आगर प्लेटों पर उगाया एक शंकुधारी कवक कॉलोनी की सतह से 1 सेमी खरोंच द्वारा लगभग 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल का एक शंकु निलंबन प्राप्त करें ।
    नोट: जब आवश्यक हो, एक हीमोसाइटोमीटर के साथ कोनिडिया गिनती।
  6. एक बाँझ 1.5 मिलील सेंट्रलाइज ट्यूब में ए निदुलन्स की फसल कोनिडिया क्लिंप्स की संख्या को कम करने के लिए 0.05% (v/v) ट्वीन 80 युक्त ऑटोक्लेव्ड आसुत पानी के साथ।
    नोट: कोनिडिया को व्यवहार्यता के प्रासंगिक नुकसान के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है (ए ए एथेनासोपोलोस और वी सोफियानोपाउलू, अप्रकाशित डेटा)। हालांकि, शंकुधारी सूजन को रोकने के लिए, माइसील भागों और पोषक तत्वों को हटाने के लिए शंकुधारी निलंबन को फ़िल्टर करने और/या धोने की सिफारिश की जाती है ।

2. आगर (ठोस) माध्यमों पर बढ़ रही फिलामेंटस कवक इमेजिंग के लिए तैयारी

नोट: 'उल्टे आगर विधि17, 18काएक संशोधित संस्करण का उपयोग कियाजाता है।

  1. प्रारंभ में, पेट्री डिश (Ø9 सेमी) 15 एमएल एमएम पर कई बिंदुओं पर पेट्री डिश (डब्ल्यू/वी) एगर(चित्रा2) के साथ कई बिंदुओं पर सख्ती से भंवर वाले शंकुधारी (लगभग 2 x 104 कोशिकाओं/एमएल) के 10 μL aliquots हाजिर करें ।
    नोट: 'उल्टे आगर विधि' के संशोधित संस्करण का उपयोग करना, बढ़ती हाइफा पर स्पष्ट हानिकारक प्रभावों के बिना कई घंटों के लिए फंगल नमूनों की छवि संभव है।
  2. जांच किए जाने के उद्देश्य से विकास के चरण के अनुसार प्रायोगिक संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  3. बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके कॉलोनी युक्त आगर के ≈0.8 मिमी2 ब्लॉक को स्लाइस करें।
    नोट: आगर ब्लॉक के आयामों को कटा हुआ है उपकरण के आयामों पर निर्भर करता है बाद में रखा जाएगा । वर्तमान कार्य में, 8 अच्छी तरह से μ स्लाइड का उपयोग किया जाता है (नीचे देखें)।
  4. उलटा और एगर ब्लॉक को लाइव इमेजिंग के लिए उपयुक्त कवरलिप के साथ μ-स्लाइड या इसी तरह के 8 चैंबर कवरग्लास के कुएं में रखें।
    नोट: यदि प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग फ्लोरेसेंस (लेबलिंग) माइक्रोस्कोपी के संयोजन में किया जाएगा, तो एगर ब्लॉक को इमेजिंग से ठीक पहले लाइव सेल धुंधला डाई युक्त तरल माध्यम की बूंद पर उलटा किया जा सकता है।

3. तरल माध्यम पर बढ़ रही फिलामेंटस कवक इमेजिंग के लिए तैयारी

  1. उचित पूरक के साथ 200 माइक्रोन (तरल) एमएम युक्त 8 अच्छी तरह से μ स्लाइड के कुओं में एक सख्ती से भंवर शंकुधारी निलंबन (लगभग 2 x 104 कोशिकाओं/एमएल) के 10 μL aliquots स्थानांतरित करें ।ऊपर देखें।)
  2. वांछित तापमान(चित्र 3)पर वांछित समय के लिए इनक्यूबेट ।
    नोट: यदि फ्लोरेसेंस (लेबलिंग) माइक्रोस्कोपी के संयोजन में प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाएगा, तो तरल संस्कृतियों को महान लाभ होता है कि प्रयोग19के दौरान किसी भी वांछित समय बिंदु पर फ्लोरोसेंट रंगों को जोड़ा जा सकता है।

4. छवियों को कैप्चर करें

नोट: माइक्रोस्कोप का चुनाव उपलब्ध उपकरणों पर निर्भर करता है। किसी भी मामले में माइक्रोस्कोप सेटअप में एक उल्टे चरण, एक पर्यावरण कक्ष या सटीक हवा के तापमान नियंत्रण वाले कमरे में शामिल होना चाहिए।

  1. शुरू करने से पहले तापमान को स्थिर करने के लिए थर्मोस्टैटेड माइक्रोस्कोप कक्ष को 37 डिग्री सेल्सियस (जब तक कि अन्यथा संकेतित या उपयोग की गई फंगल प्रजातियों के लिए उपयुक्त न हो) पर प्रीहीट करें। यह कक्ष समय-चूक प्रयोगों के दौरान माइक्रोस्कोप प्रकाशिकी और नमूना चरण के तापमान मॉड्यूलेशन की अनुमति देता है। ध्यान रखें कि ऑप्टिकल विपथन20 शुरू किए जाते हैं जब सामान्य विसर्जन तेल (23 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग के लिए डिज़ाइन किए गए) तेलों का उपयोग 37 डिग्री सेल्सियस या उससे ऊपर किया जाता है।
    नोट: एक तंग बजट पर, इनक्यूबेशन कक्षों कार्डबोर्ड और इन्सुलेट पैकिंग सामग्री21 से बाहर किया जा सकता है या एक 3 डी प्रिंटर22का उपयोग करके ।
  2. माइक्रोस्कोप, स्कैनर पावर, लेजर पावर और कंप्यूटर को चालू करें और इमेजिंग सॉफ्टवेयर लोड करें। μ-स्लाइड (पहले तैयार) को माइक्रोस्कोप स्टेज में रखें और फोकस करें ।
  3. छवि विश्लेषण के दौरान विकास मापन को सुविधाजनक बनाने के लिए अलग-अलग/ओवरलैपिंग कोशिकाएं (या कम से कम भीड़ नहीं) वाले दृश्यों के क्षेत्रों का पता लगाएं। मजबूत सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देने के लिए प्रति नमूना कम से कम 50 बढ़ती कोशिकाओं को कैप्चर करें।
  4. वांछित संचारित प्रकाश माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का चयन करें। एक्सपोजर समय या लेजर पावर और पिक्सेल को कम करने के लिए समय और/या पिनहोल व्यास में वृद्धि, ताकि फंगल कोशिकाओं के फोटोब्लैचिंग को कम करने के लिए, जैसा कि कहीं और 23,24वर्णित है ।
  5. वांछित समय अंतराल पर छवियों को प्राप्त करने और समय श्रृंखला अधिग्रहण शुरू करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें।
    नोट: समय के साथ फोकल बहाव (विशेष रूप से लंबे प्रयोगों के लिए) के लिए सही करने के लिए, थर्मल बहाव, विविध सेल आकार, और सेल गति के कारण आपके माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में उपलब्ध होने पर ऑटोफोकस रणनीति का उपयोग करें।

5. छवि विश्लेषण

नोट: यह खंड ए निदुलन्सकी विकास दर को मापने के लिए समय-चूक माइक्रोस्कोपी छवियों के प्रसंस्करण के प्रमुख चरणों का वर्णन करता है । छवियों का उद्घाटन, दृश्य और प्रसंस्करण ओपन सोर्स इमेजजे/फिजी सॉफ्टवेयर25के साथ पूरा किया जाता है ।

  1. प्लगइन्स | का उपयोग करके फिजी के लिए छवियों को आयात करें बायो-फॉर्मेट | डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स(चित्रा 4A)के साथ फिजी मेनू से बायो-फॉर्मेट आयातक।
    नोट: देखें कि क्या बायो-फॉर्मेट आयातक छवि अंशांकन को ठीक से पहचानता है या नहीं। ऊपरी सूचना क्षेत्र छवि खिड़की में दिखाया गया चित्र आयाम, मूल चित्र आयामों(चित्र 4B) केबराबर होना चाहिए। इमेजजे/फिजी सॉफ्टवेयर में इमेज प्रॉपर्टीज को प्रदर्शित करने और बदलने के लिए प्रेस शिफ्ट + पी।
  2. जहां जरूरत हो, विभिन्न फ्रेमों के बीच रोशनी सुधार के लिए हिस्टोग्राम मिलान26 का उपयोग करें(इमेज | | समायोजित करें ब्लीच सुधार | हिस्टोग्राम मिलान)(चित्र 4सी)।
  3. जहां जरूरत हो, वहां सिफ्ट-एल्गोरिदम का उपयोग करें(प्लगइन्स | पंजीकरण | इमेज स्टैक(चित्रा 4डी)को संरेखित करने या मिलान करने के लिए यूईआरईआर के साथ रैखिक स्टैक अलाइनमेंट) । अपेक्षित परिवर्तन मेनू से"अनुवाद"का चयन किसी भी एक्स-वाई बहाव को सही करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
    नोट: अन्य प्लगइन्स का उपयोग इमेज स्लाइस के ढेर को संरेखित करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे इमेज स्टेबलाइजर (https://imagej.net/Image_Stabilizer) या स्टैक्रेग (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)।
  4. उन लोगों से बचने के लिए जो कवरस्लिप के समानांतर बढ़ते हैं, उन हाइफाई का चयन करें जो झुकाए जाते हैं। ध्रुवीय विस्तार द्वारा प्रचारित करने वाले हाइफा का चयन करना सुनिश्चित करें और पार्श्व और/या एपिकल ब्रांचिंग पेश करने वाले हाइफा से बचें।
  5. MTrackJ(प्लगइन्स | का उपयोग करें एमट्रैकजे)प्लगइन बढ़ते हाइफाल टिप्स(चित्रा 4E)27को ट्रैक करने के लिए । ट्रैक जोड़ने के लिए टूलबार में ऐड बटन चुनें और माउस के बाएं क्लिक का इस्तेमाल करते हुए पहला पॉइंट हाइफाल टिप पर रखें । टाइम सीरीज अपने आप अगले फ्रेम में चली जाएगी । ट्रैकिंग प्रक्रिया को पूरा करने के लिए, अंतिम बिंदु (या ईएससी कुंजी दबाए)(चित्रा 4F)पर माउस पर डबल क्लिक करें। प्रारंभिक समय सीमा में ब्याज के एक और बिंदु (यानी, बढ़ती हाइफाल टिप) पर जाएं और एक और हाइफा की विकास दर को मापकर प्रक्रिया को पुनः आरंभ करें।
    नोट: MTrackJ स्थापित करने के लिए https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ पर प्रस्तुत निर्देशों का पालन करें
  6. आउटपुट टेबल खोलने के लिए MTrackJ डायलॉग(चित्रा 4G)में उपाय बटन पर क्लिक करें । ट्रैक मापन सहेजें(फाइल | वांछित फ़ाइल प्रारूप (जैसे, सीएसवी) के लिए सहेजें, विश्लेषण करें और उन्हें प्लॉट करें(चित्रा 4H)।
    नोट: फिल्म बटन का चयन करके, एक फिल्म छवि और ट्रैक प्रगति दिखा उत्पादन किया है ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के बाद, हमने फिलामेंटस कवक ए निदुलांसके विभिन्न विकास/विकासात्मक चरणों के अनुरूप विभिन्न छवियों पर कब्जा कर लिया और उनका विश्लेषण किया । इस अध्ययन में प्रस्तुत आंकड़ों को फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके संसाधित और विश्लेषण किया गया था। माप सीएसवी फाइलों के रूप में सहेजे गए थे, सांख्यिकीय रूप से विश्लेषण किया गया था और वाणिज्यिक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर और/या पायथन प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोग करके पंडों, नुंपी, स्टेटस्मोडेल, मैटप्लॉटलिब और सीबोर्न जैसे सॉफ्टवेयर पुस्तकालयों का उपयोग करके रेखांकन के रूप में तैयार किया गया था । अधिक जानकारी उद्धृत मूल प्रकाशनों में पाया जा सकता है ।

आबादी की प्रतिक्रिया की व्याख्या करने के लिए, आबादी के भीतर प्रमुख मापदंडों की विषमता का निर्धारण करना और शारीरिक रूप से अलग-अलग उप-आबादी28की कुशलतापूर्वक पहचान करना महत्वपूर्ण है। चित्रा 5 AzhA एंग्नाएक उत्परिवर्ती तनाव के विकास से पता चलता है, दो जीन में विलोपन असर, जिनमें से उत्पादों विषहरण और विषाक्त फाइटोप्रोडक्ट एल-azetidine-2-carboxylic एसिड29के आत्मसात में फंसाया जाता है, WT तनाव की तुलना में । जलमग्न तरल संस्कृतियों में उनकी विकास दर को मापने, हम डब्ल्यूटीई तनाव (टी (715) = 20.61, पी = <0,0001)(चित्रा 5A-B)की तुलना में डबल उत्परिवर्ती की सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कम वृद्धि दर का पता लगाते हैं। विकास में यह अंतर केवल इन उपभेदों(चित्रा 5C-D)के कॉलोनी क्षेत्र को मापने योग्य नहीं था, इस बात पर जोर देता है कि सूक्ष्म एकल कोशिका विश्लेषण विकास दरों में छोटे अंतर को निर्धारित करने में अधिक प्रभावी है जो कॉलोनी के स्थूल अवलोकन के साथ पता लगाना मुश्किल है।

एकल कोशिका दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग सेलुलर प्रोटीन गतिशीलता की स्थानिक और लौकिक जानकारी प्राप्त करने के प्रयास में महत्वपूर्ण मूल्य का है। लंबे समय तक लाइव सेल इमेजिंग(चित्रा 6,वीडियो 1)सह-जीएफपी लेबल कोर आइसोसोमल प्रोटीन पिला और एमआरएफपी हिस्टोन एच1 को व्यक्त करने से पता चलता है कि पिला30 फंगल प्लाज्मा झिल्ली31, 32पर कम गतिशीलता के साथ स्थिर संरचनाएं बनाती है। इसके अलावा, चित्रा 7 से पता चलता है कि फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग एगर माध्यम पर उगाए गए उपभेदों की लाइव इमेजिंग के लिए किया जा सकता है, ताकि ऑर्गेनेल्स और सेल संरचनाओं की गतिशीलता का अध्ययन किया जा सके। यहां, FM4-6433 का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क और ए निदुलांस में वैक्यूलर सिस्टम की कल्पना करने के लिए किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1:इनोकुलम तैयारी प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:आगर माध्यम पर बढ़ रही फिलामेंटस कवक इमेजिंग के लिए अपनाई गई प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:तरल माध्यम में बढ़ रही फिलामेंटस कवक इमेजिंग के लिए अपनाई गई प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:छवि विश्लेषण प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। समय-चूक माइक्रोस्कोपी छवियों के प्रसंस्करण और ए निदुलांसकी विकास दर को मापने के लिए कदम । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:एकल सेल माप के साथ पारंपरिक जनसंख्या माप की तुलना। (ए)25 डिग्री सेल्सियस पर एकमात्र नाइट्रोजन स्रोत के रूप में यूरिया युक्त जलमग्न तरल संस्कृतियों में उगाए जाने वाले अझा एनजीएनए एनजीएनए एनवाईएनएडबल विलोपन और डब्ल्यूटी उपभेदों की प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां । सभी उपभेदों को कुल 18 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था, 25 डिग्री सेल्सियस पर और फ्रेम 15 मिनट के अंतराल पर कब्जा कर लिया गया था । 2048 × 2048 पिक्सल की छवियां टीसीएस एसपी8 एमपी (लीका, जर्मनी) माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 115.02 x 115.02 एनएम के पिक्सेल आकार के साथ एकत्र की गई थीं, जो एचसी प्लान एपीओ 63x, एनए 1.40 तेल विसर्जन उद्देश्य से लैस थे। (ख)के माप(ए)बॉक्स और मूंछ भूखंडों में प्लॉट किए जाते हैं । सांख्यिकीय महत्व टी परीक्षण के माध्यम से विश्लेषण किया गया था और तारक (*) के साथ चित्रित किया गया है, पी < ०.००१ का संकेत है । (ग)डब्ल्यूटीटी के 25 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि और ठोस एमएम पर डबल विलोपन तनाव । कालोनियों को अलग-अलग समय अंतराल (18 घंटे, 36 घंटे और 72 घंटे) पर फोटो खिंचवाने थे, इमेजजे कार्यक्रम में एक शासक के साथ मैन्युअल रूप से कैलिब्रेट और मापा गया था। (घ)में प्रस्तुत कॉलोनियों के क्षेत्र के माप(सी)बॉक्स और मूंछ भूखंडों के रूप में भूखंडों रहे हैं । कालोनियों के क्षेत्र के मतभेद डब्ल्यूटीई तनाव (18h: टी (8) = 0.69 की तुलना में डबल म्यूटेंट के विभिन्न समय बिंदुओं के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थे, पी = 0.50, 36h: टी (6) = 0.27, पी = 0.5068, 72h: टी (6) = 0.39, पी = 0.70). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:शंकुधारी अंकुरण की दीर्घकालिक लाइव सेल इमेजिंग आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट टैग के साथ जुड़े ब्याज के प्रोटीन को व्यक्त करती है। (A)जेड प्लेन में उत्पन्न 4 स्लाइसों की अधिकतम तीव्रता वाले अनुमानों (एमआईपी), एक तनाव के सह-व्यक्त करने वाले पिला-जीएफपी और एच 1-एमआरएफपी। कोनिडिया को एगर मीडियम पर देखा गया और 30 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया ताकि एगर को कोशिकाओं की आसंजन में मदद मिल सके । कोनिडिया युक्त आगर ब्लॉक को कटा हुआ था, एक μ-स्लाइड के कुओं में रखा गया था और कुल 18 घंटे के लिए, 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था । एचसी प्लान एपीओ 63x, एनए 1.40 तेल विसर्जन उद्देश्य (92.26 x 92.26 एनएम के पिक्सेल आकार के साथ) से लैस टीसीएस एसपी8 एमपी (लीका, जर्मनी) माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 25 मिनट के अंतराल पर फ्रेम कैप्चर किए गए थे। चित्र रोमांचक GFP द्वारा 488-एनएम तरंगदैर्ध्य पर प्राप्त किए गए थे और 495 से 558 एनएम तक के स्पेक्ट्रल बैंड में फ्लोरेसेंस का पता लगा रहे थे, और 561-एनएम तरंगदैर्ध्य पर रोमांचक एमआरएफपी द्वारा और 580 से 660 एनएम तक के स्पेक्ट्रल बैंड में फ्लोरेसेंस का पता लगाया गया था। (ख)माप (अंकुरण का वेग और हाइफाल टिप एक्सटेंशन)(ए)को लाइन ग्राफ के रूप में प्लॉट किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:FM4-64 ठोस माध्यम पर बढ़ रही hyphae की लेबलिंग । एक डब्ल्यूटी तनाव के कोनिडिया 30 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए 1% एगर एमएम पेट्री व्यंजन पर खेती की गई थी। बढ़ते जर्मलिंग को 20 मिनट के लिए 10 माइक्रोन एमएम के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था जिसमें 10 माइक्रोन एफएम 4-64 थे । इनक्यूबेशन बाद, दाग वाले जर्मलिंग युक्त एक एगर ब्लॉक को कटा हुआ था, 8 μ-स्लाइड में रखा गया था जिसके बाद 30 डिग्री सेल्सियस पर 47 मिनट का पीछा किया गया था। एचसी प्लान एपीओ 63x, एनए 1.40 तेल विसर्जन उद्देश्य (184.52 x 184.52 एनएम के पिक्सेल आकार के साथ) से लैस टीसीएस एसपी8 एमपी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 30 डिग्री सेल्सियस पर हर 7 मिनट पर फ्रेम कैप्चर किए गए थे। चित्र रोमांचक FM4-64 द्वारा 514-एनएम तरंगदैर्ध्य पर प्राप्त किए गए थे और 596 से 682 एनएम तक के स्पेक्ट्रल बैंड में फ्लोरेसेंस का पता लगा रहे थे। FM4-64 फ्लोरेसेंस सिग्नल को उल्टे छवि के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8:conidiophore गठन के प्रारंभिक चरण । (A)डब्ल्यूटी स्ट्रेन के कोनिडिया को आगर मीडियम पर 30 डिग्री सेल्सियस पर १३६ घंटे के लिए सुसंस्कृत किया गया था, बाहर कटा हुआ और एक μ स्लाइड के कुओं में रखा गया था । फ्रेम हर 20 मिनट पर कब्जा कर लिया गया । 2048 × 2048 पिक्सल की छवियां टीसीएस एसपी8 एमपी (लीका, जर्मनी) माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 245.2 x 245.2 एनएम के पिक्सेल आकार के साथ एकत्र की गई थीं, जो एचसी प्लान एपीओ 63x, एनए 1.40 तेल विसर्जन उद्देश्य से लैस थीं। छवियां शंकुखोर वेसिकल्स (काला तीर) के साथ-साथ गठन (भूरे तीर) और मेटुले (नीले तीर) की परिपक्वता के गठन को दर्शाती हैं। (ख)माप (अंकुरण का वेग और एकध्रुवीय हाइफाल टिप एक्सटेंशन) (ए) को लाइन ग्राफ के रूप में प्लॉट किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: लंबे समय तक शंकुधारी अंकुरण की लाइव सेल इमेजिंग पीला-जीएफपी और एच1-एमआरएफपी को व्यक्त करते हुए । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 2: ए निदुलां में कोनिओफोर फॉर्मेशन के शुरुआती दौर। इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा S1: शंकुधारी निलंबन की तैयारी। एक बाँझ टूथपिक के साथ स्क्रैप करके एक शंकुयुक्त प्लेट की लगभग 1 सेमी2 सतह, लगभग 2 x 10 6 कोनिडिया/मिलीलीटर का निलंबन प्राप्त कियाजाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा कवक कोशिका विकास और फेनोटाइप की निगरानी करना वास्तविक समय में सेलुलर व्यवहार का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है और मात्रात्मक रूप से और सही ढंग से यह निर्धारित करता है कि क्या किसी विशेष दवा उपचार और/या आनुवंशिक हस्तक्षेप के परिणामस्वरूप पता लगाने योग्य सेल विकास या समय के साथ फेनोटाइपिक मतभेद होते हैं ।

इस अध्ययन में, एक विश्वसनीय लाइव-सेल इमेजिंग पद्धति को मापने और मात्रात्मक रूप से फंगल विकास का विश्लेषण करने के लिए वर्णित किया गया था, जिसमें ए निदुलांसमें रोगाणु ट्यूब और हाइफाल टिप वृद्धि की गतिशीलता शामिल है। समय के साथ रूपात्मक परिवर्तनों की निगरानी, संचारित प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करके, उन कोशिकाओं की पहचान करने में अत्यधिक सहायक हो सकता है जो तनावग्रस्त हैं, मर रहे हैं या मर चुके हैं। एकल कोशिका स्तर पर ऐसी गतिशील प्रक्रियाओं का विस्तृत ज्ञान कोशिकाओं की मिश्रित आबादी के भीतर विषमता का आकलन करने की अनुमति देता है और लंबे समय के परिप्रेक्ष्य में, रास्तों और विस्तृत तंत्रों की पहचान की अनुमति देता है जिसके द्वारा कोशिकाएं अंतर्जात और पर्यावरणीय संकेतों का जवाब देती हैं।

इस विधि का एक लाभ यह है कि यह एक लेबल मुक्त इमेजिंग दृष्टिकोण पर आधारित है (जो फिर भी आसानी से फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़ा जा सकता है) कि कोशिकाओं के अंतर्निहित प्रकाश अपवर्तन गुणों का उपयोग करता है रंगों को शुरू करने के बिना छवि विपरीत बनाने के लिए/ जबकि फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग सेलुलर डिब्बों और प्रोटीन को टैग करने और कोशिकाओं के विभाजन और ट्रैकिंग को काफी सुविधाजनक बनाने के लिए किया जा सकता है, संचारित प्रकाश माइक्रोस्कोपी आनुवंशिक रूप से इंजीनियरिंग कोशिकाओं की आवश्यकता को दरकिनार करता है, जिससे शोधकर्ताओं को लागत और समय लेने वाली डाई/लेबल अनुकूलन से बचने में सक्षम बनाया जा सकता है और फ्लोरेसेंस इमेजिंग13, 34से आने वाले संभावित फोटोटॉक्सिकिटी प्रभावों से बचने के लिए भी।

यह प्रोटोकॉल कवक के विकास काइनेटिक्स का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है जो हाइफे या छद्म रूपी बनाते हैं। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण विभिन्न उपभेदों की विभिन्न कोशिका संरचनाओं और विभिन्न विकासात्मक चरणों के तहत इमेजिंग के लिए अत्यधिक उपयुक्त है। चित्रा 8 और वीडियो 2में, हम ए निदुलन्स कोनिओफोर (यानी, अलैंगिक बीजाणुओं वाले संरचनाओं) के विकास के प्रारंभिक चरणों को प्रस्तुत करते हैं। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, यह विधि इमेजिंग कोनिओफोर गठन के लिए सबसे उपयुक्त नहीं है, क्योंकि कार्बन/नाइट्रोजन भुखमरी और हवा के संपर्क में, दोनों कोनिडियोफोर के विकास के लिए आवश्यक है, हमारे दृष्टिकोण35द्वारा मानकीकृत नहीं किया जा सकता है।

इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल फंगल बायोफिल्म्स को ट्रैक करने के लिए खराब अनुकूल है, जो ऊर्ध्वाधर विस्तार के अधीन हैं, जो एक घने विषम, सतह से जुड़े कॉलोनी के गठन के अधीन हैं जिसमें फिलामेंटस हाइफे, छद्म कृत्रिम कोशिकाएं, खमीर-फॉर्म कोशिकाएं और बाह्यकालीन मैट्रिक्स36के विभिन्न रूप शामिल हैं। तकनीक की एक और सीमा यह है कि हालांकि लेबल मुक्त सूक्ष्म विश्लेषण अंकुरण/भेदभाव गतिशीलता के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक सटीक विधि का प्रतिनिधित्व करता है, इस तरह के डेटा का मैनुअल मूल्यांकन समय लेने वाली है, खासकर जब कई उपभेदों या/और शर्तों की जांच की जाती है । इस प्रकार, उच्च-थ्रूपुट टाइम-लैप्स इमेजिंग माइक्रोस्कोपी के डेटा का विश्लेषण उपयुक्त कम्प्यूटेशनल सॉफ्टवेयर द्वारा किया जाना चाहिए जिससे हाइफाल विकास और शंकुधारी अंकुरण37,38, 39के स्वचालित या अर्ध-स्वचालित छवि विश्लेषण को सक्षम किया जा सके।

संक्षेप में, इसके साथ हम उपयोगकर्ता से किसी भी पूर्व छवि विश्लेषण अनुभव की आवश्यकता के बिना प्रजनन योग्य और विश्वसनीय तरीके से फंगल विकास काइनेटिक्स का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल कवक विकास और भेदभाव के उद्देश्य और सटीक मात्राकरण की अनुमति देता है, और फंगल जीवन चक्र और कवक रोगजनकता37का अध्ययन करने के लिए एक पूरक इमेजिंग दृष्टिकोण प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को आंशिक रूप से परियोजना "एक ग्रीक रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर फॉर विजुअलाइजिंग एंड मॉनिटरिंग फंडामेंटल बायोलॉजिकल प्रोसेस (बायोइमेजिंग-जीआर)) (एमआईएस 5002755) द्वारा समर्थित किया गया था, जिसे ऑपरेशनल प्रोग्राम "प्रतिस्पर्धात्मकता, उद्यमिता और नवाचार" (एनएसआरएफ 2014-2020) द्वारा वित्त पोषित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide 8 Well Ibidi 80826 Imaging slides
4-Aminobenzoic acid Merck A9878
azhAΔ ngnAΔ Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino Acids Gibco 223030
Biotin Merck B4639
Chloroform Merck 67-66-3
Copper(II) sulfate pentahydrate Merck C8027
Glucose Merck G8270
GraphPad Prism 8.0 GraphPad Software Statistical Software
ImageJ NIH Image processing and analysis software
Inoculating Loop Merck I8263-500EA
Iron(III) phosphate Merck 1.03935
Leica Application Suite X Leica Microsystems Microscope software
Magnesium sulfate heptahydrate Merck 63138
Manganese(II) sulfate monohydrate Merck M7899
Microscope Leica TCS SP8 Leica Microsystems
Nicotinamide (Niacinamide) Supelco 47865-U
Peptone Millipore 68971
Petri Dishes for Microbiology Culture KISKER G090
Potassium chloride Merck P4504
Potassium phosphate monobasic Merck P5655
Pyridoxine hydrochloride Merck P6280
Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile KISKER G052-S
Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile KISKER G053-S
Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL KISKER VL004G
Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL KISKER VL700G
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear KISKER GC.TIPS.B
Riboflavin (B2) Supelco 47861
Scalpel blades NO. 11 OdontoMed2011 S2771
Sodium chloride Merck S7653
Sodium hydroxide Merck S8045
Sodium tetraborate decahydrate Merck S9640
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+  pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021
WT Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149
Yeast Extract Millipore 70161
ZnSO4

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References

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जीव विज्ञान अंक 173 एस्परगिलस विकास दर कवक लाइव सेल इमेजिंग इमेजजे
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Athanasopoulos, A., Biratsi, A., Gournas, C., Sophianopoulou, V. Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software. J. Vis. Exp. (173), e62778, doi:10.3791/62778 (2021).

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