Summary
Filamentli mantar A. nidulanslarının hem batık kültürlerde hem de katı ortamda görüntülerini yakalamak, analiz etmek ve büyüme kinetiğini ölçmek için iletilen ışık mikroskopi tekniklerini kullanarak etiketsiz canlı görüntüleme protokolü sunuyoruz. Bu protokol floresan mikroskopi ile birlikte kullanılabilir.
Abstract
Çoğunlukla hyphae/mycelia apikal büyüme oranındaki değişikliklere bağlı olan filamentli mantarların koloni büyümesinin, koloni büyüklüğü karşılaştırılarak katılaşmış medyada makroskopik olarak tahmin edildiği iyi belirlenmiştir. Bununla birlikte, farklı çevresel/büyüme koşulları altında (pH, sıcaklık, karbon ve azot kaynakları, antibiyotikler vb.) genetik olarak farklı mantar suşlarının veya suşlarının büyüme hızını nicel olarak ölçmek zordur. Böylece, mantar hücre büyümesini daha iyi anlamak için büyüme kinetiğini ölçmek için tamamlayıcı yaklaşımların takibi zorunlu hale gelir. Ayrıca, Aspergillus spp. de dahil olmak üzere filamentli mantarların, katı ortamlar veya batık kültürler üzerinde hava altı koşullar altında farklı büyüme ve farklılaşma modlarına sahip olduğu iyi bilinmektedir. Burada, model mantarı Aspergillus nidulans'ınbüyüme kinetiğini analiz etmek için nicel bir mikroskobik yöntem hem batık kültürlerde hem de katı medyada canlı görüntüleme kullanarak detaylandırıyoruz. Farklı mantar suşlarının büyüme oranlarını, kullanıcıdan önceden görüntü analizi uzmanlığı gerektirmeyecek şekilde biyo-görüntüler için açık kaynaklı, özgür bir yazılım (örneğin Fiji) kullanarak tekrarlanabilir ve güvenilir bir şekilde yakalar, analiz eder ve ölçürüz.
Introduction
Filamentli mantarlar büyük sosyoekonomik ve ekolojik öneme sahiptir, hem enzim ve antibiyotik üretimi için endüstriyel / tarımsal araçlar olarak çok önemlidir1,2 ve mahsul bitkilerinin patojenleri olarak3, haşere böcekleri4 ve insanlar3. Ayrıca, Aspergillus nidulans gibi filamentli mantarlar, genetik, hücre ve evrimsel biyoloji çalışmaları ve hiphal uzatma çalışmaları gibi temel araştırmalar için model organizmalar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır5. Filamentli mantarlar, membran lipitlerin / proteinlerin sürekli tedariki ve genişleyen uçta hücre duvarının de novo sentezi yoluyla uzanan son derece polarize organizmalardır6. Hipnoz ucu büyümesinde ve polarite bakımında merkezi bir rol, çoğunlukla sitoskeletal bileşenlerden ve Golgi 6,7,8'inpolarizedağılımından oluşan yüksek sıralı bir yapı olan 'Spitzenkorper' (SPK) adlı özel bir yapıdır.
Çevresel uyaranlar/sinyaller, bu tür su-hava arayüzü, ışık, CO2 konsantrasyonu ve beslenme durumu bu kalıplar tarafından verilen gelişimsel kararlardan sorumludur9. Batık (sıvı) kültürlerde A. nidulanların farklılaşması bastırılır ve hiphal ucu uzaması ile büyüme meydana gelir6. Vejetatif büyüme sırasında, aseksüel sporlar (conidia) apikal uzantı ile çimlenir ve besinler ve alan mevcut olduğu sürece süresiz olarak büyümeye devam edebilecek farklılaşmamış bir birbirine bağlı hiphal hücreleri ağı olan miselyum oluşturur. Öte yandan, katı medya hipnoz ipuçları elongate ve vejetatif büyüme (gelişimsel yetkinlik) belirli bir süre sonra, aseksüel üreme başlatılır ve hava konidiophore sapları miselyumun özel ayak hücrelerinden uzanır6. Bunlar, uygun çevresel koşullar altında büyümeyi yeniden başlatabilen uzun haploid konidia10 zincirleri üreten konidiophores adı verilen özel gelişimsel çok hücreli yapılara yol açabilir.
Filamentli mantar büyümesini ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, bir Petri kabında bulunan besin agarındaki sporları aşılamak ve birkaç gün sonra koloninin çapını makroskopik olarakölçmektir 11. Koloninin çapı/alanı, en çok misel büyüme hızındaki değişikliklere ve konidiophore yoğunluğuna daha az bağlı12, daha sonra büyüme değeri olarak kullanılır. Katı yüzeylerde büyüyen mantar popülasyonu (koloni) boyutunu ölçmek oldukça yeterli olmasına rağmen, hiçbir şekilde büyümenin en doğru ölçüsü değildir. Nüfus düzeyi ortalamaları (mantar kolonisi büyüklüğü ortalamaları) ile karşılaştırıldığında, tek hücre ölçümleri bir hücre popülasyonunun heterojenliğini yakalayabilir ve hücrelerin yeni alt popülasyonlarının tanımlanmasına izin verebilir, durumlar13, dinamikler, yollar ve hücrelerin endojen ve çevresel değişikliklere yanıt verdiği biyolojik mekanizmalar14,15. Mantar hücresi büyümesini ve fenotipini zaman atlamalı mikroskopi ile izlemek tartışmasız en yaygın kullanılan nicel tek hücreli gözlem yaklaşımıdır.
Burada, hem batık kültürlerde hem de katı ortamda A. nidulans suşlarının kutupsal büyümesini analiz etmek ve ölçmek için floresan mikroskopisinin birlikte kullanımından bağımsız olarak kullanılabilen görüntüleri yakalamak için iletilen ışık mikroskopisi tekniklerini (faz kontrastı, diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ve polarize mikroskopi gibi) kullanarak etiketsiz bir canlı görüntüleme protokolünü detaylandırıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inoculum hazırlığı
NOT: Tüm adımlar laminer akış kabini altında yapılmalıdır.
- Steril bir aşılama döngüsü kullanarak gliserol stoğundan (-80 °C) incelenen suşla ilgili uygun beslenme gereksinimleriyle desteklenmiş minimal ortam (MM) plakalarına kadar mantar suşu çıkarın [MM: 10,0 g/L glikoz, 20 mL/L tuz çözeltisi (tuz çözeltisi: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4,2,0 mL/L kloroform) ve 1 mL/L iz elementler (eser elementler: 40 mg/L Na2B4O7· H2O, 400 mg/L CuSO4, 8 g/L ZnSO4, 800 mg/L MnSO4, 800 mg/L FePO4), pH'ı 1 M NaOH ile 6,8'e ayarlayın, % 1 (w/v) agar ve16 ve otoklavda açıklandığı gibi gerekli takviyeleri ekleyin] (Şekil 1).
NOT: Tuz çözeltisi, eser elementler çözeltisi ve takviyeleri otoklavlanır. - 37 °C'de 2-3 gün kuluçkaya yatır.
- Steril bir kürdan (veya aşı döngüsü) kullanın, az sayıda konidia aktarın, tek bir koloniye hafifçe dokunarak, tam ortam plakalarına (CM) [CM: 10,0 g/L glikoz, 2,0 g/L pepton, 1,0 g/L maya özü, 1,0 g/L casamino asitleri, 20 mL/L tuz çözeltisi, 1 mL/L eser elementler, 5 mL/L vitamin çözeltisi (vitamin çözeltisi: 0.1 g/L riboflavin, 0.1 g/L nikotinamid, 0.01 g/L p-amino benzoik asit, 0.05 g/L piridoksin HCl, 1.0 mg/L biotin), 1 M NaOH ile pH'ı 6.8'e ayarlayın, % 1 (w/v) agar ve16 ve otoklavda açıklandığı gibi gerekli takviyeleri ekleyin]. Vitamin çözeltisini 4 °C'de koyu bir şişede otoklavlayın ve saklayın.
NOT: Mantar büyümesinin tek tek kolonileri tanımlamak ve izole etmek için çok yoğun olması durumunda, tek koloniler elde etmek için yeni bir agar plakasına yeniden çizgi çizin. - 37 °C'de 3-4 gün kuluçkaya yatır.
- Steril bir kürdan kullanarak CM agar plakalarında yetişen kondiyumlu bir mantar kolonisinin yüzeyinden 1 cm çizerek yaklaşık 2 x 106 hücre/mL'lik bir konidial süspansiyon elde edin (Şekil S1).
NOT: Gerektiğinde, hemositometre ile konidiayı sayın. - Konidia kümelerinin sayısını azaltmak için% 0.05 (v/ v) Ara 80 içeren 1.0 mL otoklavlı damıtılmış su içeren steril 1.5 mL santrifüj tüpünde A. nidulans hasadı.
NOT: Conidia, ilgili bir canlılık kaybı olmadan 4 °C'de 2-3 haftaya kadar saklanabilir (A. Athanasopoulos ve V. Sophianopoulou, yayınlanmamış veriler). Bununla birlikte, konidial şişmeyi önlemek için misel parçalarını ve besinleri çıkarmak için konidial süspansiyonun filtrelenerek/veya yıkanması önerilir.
2. Agar (katı) ortamlarda yetişen filamentli mantarları görüntülemeye hazırlık
NOT: 'Ters agar yöntemi17,18'in değiştirilmiş bir sürümü kullanılır.
- Başlangıçta, Petri tabakları (Ø9 cm) 15 mL MM'nin üzerine birkaç noktada kuvvetli bir şekilde girdaplanmış konidial (yaklaşık 2 x10 4 hücre/mL) 10 μL aliquots ve % 1 (w/v) agar(Şekil 2).
NOT: 'Ters agar yönteminin' değiştirilmiş sürümünü kullanarak, mantar örneklerini büyüyen hyphae üzerinde belirgin zararlı etkiler olmadan saatlerce görüntüleyerek mümkündür. - Deneysel kültürü araştırılmak istenen gelişim evresine göre kuluçkaya yatırın.
- Steril bir neşter kullanarak koloniyi içeren ≈0,8 mm2 agar bloğunu dilimleyin.
NOT: Dilimlenecek agar bloğunun boyutları, daha sonra yerleştirilecek ekipmanın boyutlarına bağlıdır. Mevcut çalışmada, 8 kuyu μ slayt kullanılmıştır (aşağıya bakın). - Agar bloğunu ters çevirin ve canlı görüntüleme için uygun kapaklı μ kaydırağı veya benzeri 8 odalı bir kapak kılıfı kuyusuna yerleştirin.
NOT: İletilen ışık mikroskopisinin floresan (etiketleme) mikroskopisi ile birlikte kullanılması durumunda, agar bloğu görüntülemeden hemen önce canlı hücre boyama boyasını içeren bir sıvı ortam damlası üzerine çevrilebilir.
3. Sıvı ortamda yetişen filamentli mantarların görüntülenmesi için hazırlık
- 200 μL (sıvı) MM içeren 8 kuyulu bir μ kaydırağın kuyularına, kuvvetli bir şekilde girdaplı konidial süspansiyonun (yaklaşık 2 x 104 hücre/mL) 10 μL'lik aliquotlarını uygun takviyelerle aktarın (yukarıya bakın).
- İstenilen sıcaklıkta istediğiniz süre boyunca kuluçkaya yatırın (Şekil 3).
NOT: İletilen ışık mikroskopisi floresan (etiketleme) mikroskopisi ile birlikte kullanılacaksa, sıvı kültürleri deney sırasında istenilen herhangi bir zaman noktasında floresan boyaların eklenebilmesi açısından büyük avantaja sahiptir19.
4. Görüntü yakalayın
NOT: Mikroskop seçimi mevcut ekipmana bağlıdır. Her durumda mikroskop kurulumu ters bir aşama, bir çevre odası veya en azından hassas hava sıcaklığı kontrolüne sahip bir oda içermelidir.
- Başlamadan önce sıcaklığı stabilize etmek için termostatlı mikroskop odasını 37 °C'de (aksi belirtilmedikçe veya kullanılan mantar türleri için uygun olmadıkça) önceden ısıtın. Bu oda, zaman atlamalı deneyler sırasında mikroskop optiklerinin ve numune aşamasının sıcaklık modülasyonuna izin verir. Normal daldırma yağları(23 °C'de kullanılmak üzere tasarlanmıştır) yağlar 37 °C ve üzerinde kullanıldığında optik sapmaların 20'nin tanıtıldığını unutmayın.
NOT: Dar bir bütçeyle, kuluçka odaları karton ve yalıtım ambalaj malzemesi21 veya 3D yazıcı22kullanılarak yapılabilir. - Mikroskobu, tarayıcı gücünü, lazer gücünü ve bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımını yükleyin. μ kaydırağı (daha önce hazırlanmış) mikroskop aşamasına yerleştirin ve odaklanın.
- Görüntü analizi sırasında büyüme ölçümlerini kolaylaştırmak için yalıtılmış/örtüşmeyen hücreler (veya en azından aşırı kalabalık olmayan) içeren görüş alanlarını bulun. Sağlam istatistiksel analize izin vermek için örnek başına en az 50 büyüyen hücre yakalayın.
- İstenen iletilen ışık mikroskopisi yaklaşımını seçin. Başka biryerde açıklandığı gibi mantar hücrelerinin fotobleachingini en aza indirmek için pozlama süresini veya lazer gücünü ve piksel sabitleme süresini azaltın ve / veya iğne deliği çaplarını artırın.
- görüntüleri istenen zaman aralıklarında elde etmek ve zaman serisi alımını başlatmak için mikroskop ayarlayın.
NOT: Termal sürüklenme, çeşitli hücre boyutları ve hücre hareketi nedeniyle zaman içinde odak kayması için (özellikle uzun denemeler için) düzeltmek için mikroskop yazılımınızda varsa otomatik odaklama stratejisi kullanın.
5. Görüntü Analizi
NOT: Bu bölümde, A. nidulans'ınbüyüme hızını ölçmek için zaman atlamalı mikroskopi görüntülerini işlemenin temel adımları açıklanmaktadır. Görüntülerin açılması, görselleştirilmesi ve işlenmesi açık kaynaklı ImageJ/Fiji yazılımıile gerçekleştirilir 25.
- Eklentiler | kullanarak görüntüleri Fiji'ye aktarma Biyo-Formatlar | Varsayılan ayarlarla Fiji menüsünden Biyo-Format İthalatçısı (Şekil 4A).
NOT: Biyo-Format İthalatçısının görüntü kalibrasyonunu doğru tanıyıp tanımadığını kontrol edin. Üst bilgi alanı görüntü penceresinde gösterilen resim boyutu, orijinal resim boyutlarına eşit olmalıdır (Şekil 4B). ImageJ/Fiji yazılımındaki görüntü özelliklerini görüntülemek ve değiştirmek için Shift + P tuşlarına basın. - Gerektiğinde, farklı kareler arasında aydınlatma düzeltmesi için26 ile eşleşen histogramı kullanın (Görüntü | | ayarlama Çamaşır Suyu Düzeltme | Histogram Eşleştirme) (Şekil 4C).
- Gerektiğinde SIFT algoritması kullanın (Eklentiler | Kayıt | Görüntüyığınlarını hizalamak veya eşleştirmek için SIFT ile Doğrusal Yığın Hizalaması (Şekil 4D). Beklenen dönüşüm menüsünden "Çeviri" nin seçilmesi, herhangi bir x-y sürüklenmesini düzeltmek için yeterli olmalıdır.
NOT: Diğer eklentiler, Görüntü Sabitleyici (https://imagej.net/Image_Stabilizer) veya StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) gibi bir görüntü dilimleri yığınını hizalamak için de kullanılabilir. - Eğilmiş olanlardan kaçınarak kapak sarmalına paralel büyüyen hyphae'yi seçin. Kutup uzantısına göre yayılan hyphae'yi seçtiğinizden ve hyphae'nin yanal ve/veya apikal dallanmayı sunmasını önlediğinden emin olun.
- MTrackJ Kullanın (Eklentiler | MTrackJ) büyüyen hyphal ipuçlarını izlemek için eklenti (Şekil 4E)27. Parça eklemek için araç çubuğunda Ekle düğmesini seçin ve farenin sol tıklatmasını kullanarak ilk noktayı bir hipnoz ucuna yerleştirin. Zaman serisi otomatik olarak bir sonraki kareye taşınır. İzleme işlemini tamamlamak için, son noktada fareyi çift tıklatın (veya Esc tuşuna basın) (Şekil 4F). İlk zaman diliminde başka bir ilgi noktasına (yani büyüyen hipnoz ucuna) geçin ve başka bir hypha'nın büyüme hızını ölçerek prosedürü yeniden başlatın.
NOT: MTrackJ'yi yüklemek için https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ - Çıktı tablosunu açmak için MTrackJ iletişim kutusundaki Ölçü düğmesini (Şekil 4G)tıklatın. parça ölçümlerini kaydetme (Dosya | Farklı Kaydet) istediğiniz dosya formatına (örneğin, csv), analiz edin ve çizin (Şekil 4H).
NOT: Film düğmesini seçerek, görüntüyü ve parça ilerlemesini gösteren bir film üretilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolün ardından, filamentli mantar A. nidulans'ınfarklı büyüme / gelişim aşamalarına karşılık gelen çeşitli görüntüler yakaladık ve analiz ettik. Bu çalışmada sunulan veriler Fiji yazılımı kullanılarak işlendi ve analiz edildi. Ölçümler csv dosyaları olarak kaydedildi, istatistiksel olarak analiz edildi ve pandalar, numpy, istatistikmodelleri, matplotlib ve seaborn gibi yazılım kütüphaneleri kullanılarak ticari istatistiksel yazılım ve / veya Python programlama dili kullanılarak grafikler olarak hazırlandı. Daha fazla ayrıntıya atıf yapılan orijinal yayınlarda ulaşabilirsiniz.
Popülasyonların yanıtını yorumlamak için, popülasyonlar içindeki anahtar parametrelerin heterojenliğini belirlemek ve fizyolojik olarak farklı alt popülasyonları verimli bir şekilde tanımlamak önemlidir28. Şekil 5, WT suşu ile karşılaştırıldığında, ürünleri toksik fitoprodüks L-azetidin-2- karboksilik asit29'undetoksifikasyonu ve asimilasyonunda yer alan iki gende delesyonlar taşıyan azhAΔ ngnAΔ mutant suşunun büyümesini göstermektedir. Batık sıvı kültürlerindeki büyüme hızlarını ölçerek, çift mutantın WT suşuna kıyasla istatistiksel olarak daha düşük bir büyüme oranı tespit ediyoruz (t(715) = 20.61, p = <0.0001) (Şekil 5A-B). Büyümedeki bu fark, sadece bu suşların koloni alanını ölçerek tespit edilemedi (Şekil 5C-D), mikroskobik tek hücre analizinin, koloninin makroskopik gözlemi ile tespit etmesi zor büyüme oranlarındaki küçük farklılıkların belirlenmesinde daha etkili olduğunu vurgulayarak.
Tek hücreli uzun süreli canlı görüntüleme, hücresel protein dinamiklerinin mekansal ve zamansal bilgilerini elde etme çabasında önemli bir değere sahip. GFP etiketli çekirdek eisosomal protein PilA ve mRFP histoneH1'ibirlikte ifade eden konidial çimlenmenin uzun süreli canlı hücre görüntülemesi (Şekil 6, Video 1), PilA30'un mantar plazma membranında düşük hareketliliğe sahip statik yapılar oluşturduğunu göstermektedir31,32. Ayrıca Şekil 7, organellerin ve hücre yapılarının dinamiklerini incelemek için agar ortamında yetişen suşların canlı görüntülenmesi için floresan boyaların kullanılabileceğini göstermektedir. Burada FM4-6433, A. nidulans'taki mitokondriyal ağı ve vakuolar sistemi görselleştirmek için kullanıldı.
Şekil 1: Inoculum hazırlık prosedürünün şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Agar ortamında yetişen filamentli mantarların görüntülenmesi için izlenen prosedürün şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Sıvı ortamda yetişen filamentli mantarların görüntülenmesi için izlenen prosedürün şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Görüntü analizi prosedürünün şematik gösterimi. Zaman atlamalı mikroskopi görüntülerinin işlenmesi ve A. nidulans'ınbüyüme hızının ölçülmesi için adımlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Geleneksel nüfus ölçümlerinin tek hücre ölçümleri ile karşılaştırılması. (A) 25 °C'de tek azot kaynağı olarak üre içeren batık sıvı kültürlerinde yetişen azhAΔ ngnAΔ çift silme ve WT suşlarının temsili konfokal mikroskopi görüntüleri. Tüm suşlar 25 °C'de toplam 18 saat kuluçkaya yatırıldı ve çerçeveler 15 dakika aralıklarla yakalandı. 2048 × 2048 piksel görüntüleri, HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 yağ daldırma hedefi ile donatılmış bir TCS SP8 MP (Leica, Almanya) mikroskobu kullanılarak 115.02 x 115.02 nm piksel boyutuyla toplandı. (B) (A) ölçümleri kutu ve bıyık çizimlerinde çizilir. İstatistiksel önemi t-Test ile analiz edildi ve p < 0.001'i gösteren yıldızlarla (***) tasvir edildi. (C) 25 °C WT'de büyüme ve katı MM'de çift silme zorlanması. Koloniler farklı zaman aralıklarında (18 saat, 36 saat ve 72 saat) fotoğraflandı, imagej programındaki bir cetvelle mekansal olarak kalibre edildi ve manuel olarak ölçüldü. (D)(C) içinde sunulan kolonilerin alanının ölçümleri kutu ve bıyık arsaları olarak çizilir. Kolonilerin alanının farklılıkları, çift mutantın farklı zaman noktaları arasında WT suşuna kıyasla istatistiksel olarak anlamlı değildi (18h: t(8) = 0.69, p = 0,50, 36h: t(6) = 0,27, p = 0,5068, 72h: t(6) = 0,39, p = 0,70 ). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Genetik olarak kodlanmış floresan etiketlerle kaynaşmış ilgi proteinlerini birlikte ifade eden konidial çimlenmenin uzun süreli canlı hücre görüntülemesi. (A)z düzleminde oluşturulan 4 dilimden oluşan maksimum yoğunluk projeksiyonları (MIP), PilA-GFP ve H1-mRFP'yi birlikte ifade eden bir gerinim. Conidia, agar ortamında tespit edildi ve hücrelerin ağar'a yapışmasına yardımcı olmak için 30 °C'de yaklaşık 1 saat kuluçkaya yatırıldı. Conidia içeren agar bloğu dilimlendi, μ kaydırağın kuyularına yerleştirildi ve 30 ° C'de toplam 18 saat kuluçkaya kaldırıldı. Çerçeveler, HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 yağ daldırma hedefi (92.26 x 92.26 nm piksel boyutu ile) ile donatılmış bir TCS SP8 MP (Leica, Almanya) mikroskobu kullanılarak 25 dakika aralıklarla yakalandı. Görüntüler, 488-nm dalga boyunda heyecan verici GFP ve 495 ila 558 nm arasında değişen spektral banttaki floresan tespiti ve 561-nm dalga boyunda heyecan verici mRFP ve spektral bantta 580 ila 660 nm arasında değişen floresan tespit edildi. (B)(A)ölçümleri (çimlenme hızı ve hiphal ucu uzantısı) çizgi grafik olarak çizilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: FM4-64 katı ortamda büyüyen hyphae etiketlemesi. Bir WT suşunun Conidia'sı 30 ° C'de 16 saat boyunca% 1 agar MM Petri kaplarında yetiştirildi. Büyüyen mikroplar 10 μM FM4-64 içeren 10 μL MM ile 20 dakika kuluçkaya yatırıldı. Kuluçkadan sonra, lekeli mikroplar içeren bir agar bloğu dilimlendi, 8 μ kaydırağa yerleştirildi ve ardından 30 ° C'de 47 dakikalık bir kovalamaca yapıldı. Çerçeveler, HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 yağ daldırma hedefi (184.52 x 184.52 nm piksel boyutu ile) ile donatılmış bir TCS SP8 MP mikroskop kullanılarak 30 °C'de her 7 dakikada bir çekildi. Görüntüler, 514-nm dalga boyunda heyecan verici FM4-64 ile elde edildi ve spektral bantta 596 ila 682 nm arasında değişen floresan tespit edildi. FM4-64 floresan sinyali ters görüntü olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Konidiophore oluşumunun erken evreleri. (A) WT suşunun conidia'sı agar ortamında 30 °C'de 136 saat kültürlendi, dilimlendi ve μ bir kaydırak kuyularına yerleştirildi. Çerçeveler her 20 dakikada bir çekildi. 2048 × 2048 piksel görüntüleri, HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 yağ daldırma hedefi ile donatılmış bir TCS SP8 MP (Leica, Almanya) mikroskobu kullanılarak 245.2 x 245.2 nm piksel boyutuyla toplandı. Görüntüler konidiophore veziküllerinin (siyah ok) oluşumunun yanı sıra metula (mavi ok) oluşumunu (kahverengi ok) ve olgunlaşmasını göstermektedir. (B) (A) ölçümleri (çimlenme hızı ve tek kutuplu hipnoz ucu uzantısı) çizgi grafik olarak çizilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: PilA- GFP ve H1-mRFP'yi birlikte ifade eden konidial çimlenmenin uzun süreli canlı hücre görüntülemesi.
Video 2: Conidiophore oluşumunun ilk aşamaları A. nidulans.
Şekil S1: Konidial süspansiyonun hazırlanması. Steril bir kürdan ile kazınarak, konidi bir plakanın yaklaşık 1 cm2 yüzeyi, yaklaşık 2 x 106 konidia / ml'lik bir süspansiyon elde edilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mantar hücre büyümesini ve fenotipini zaman atlamalı mikroskopi ile izlemek, hücresel davranışı gerçek zamanlı ve nicel ve doğru bir şekilde değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır ve belirli bir ilaç tedavisinin ve/veya genetik müdahalenin zaman içinde tespit edilebilir hücre büyümesi veya fenotipik farklılıklarla sonuçlanıp sonuçlanmadığını belirlemek için güçlü bir yaklaşımdır.
Bu çalışmada, A. nidulans'ta mikrop tüpü ve hiphal ucu büyümesinin dinamikleri de dahil olmak üzere mantar gelişimini ölçmek ve nicel olarak analiz etmek için güvenilir bir canlı hücre görüntüleme metodolojisi tanımlanmıştır. Zaman içinde morfolojik değişiklikleri izlemek, iletilen ışık mikroskopisi tekniklerini kullanarak, stresli, ölmekte olan veya ölen hücreleri tanımlamak için oldukça yardımcı olabilir. Bu tür dinamik süreçlerin tek hücre düzeyinde ayrıntılı bir bilgisi, karışık bir hücre popülasyonu içindeki heterojenliği değerlendirmeye izin verir ve uzun süreli bir perspektifte, hücrelerin endojen ve çevresel sinyallere yanıt verdiği yolların ve ayrıntılı mekanizmaların tanımlanmasına izin verir.
Bu yöntemin bir avantajı, boyaları / etiketleri tanıtmadan görüntü kontrastı oluşturmak için hücrelerin doğal ışık kırma özelliklerini kullanan etiketsiz görüntüleme yaklaşımına (yine de floresan mikroskopi ile kolayca birleştirilebilir) dayandırılmasıdır, bu da sonuçları şaşırtabilir. Floresan belirteçler hücresel bölmeleri ve proteinleri etiketlemek ve hücrelerin segmentasyonunu ve takibini önemli ölçüde kolaylaştırmak için kullanılabilirken, iletilen ışık mikroskopisi genetik mühendislik hücrelerine olan ihtiyacı atlatır, araştırmacıların maliyetten ve zaman alan boya / etiket optimizasyonundan kaçınmalarını ve ayrıca floresan görüntülemeden gelen olası fototoksiklik etkilerinden kaçınmalarını sağlar13,34.
Bu protokol, hyphae veya psödoohyphae oluşturan mantarların büyüme kinetiğini incelemek için uygundur. Ayrıca, bu yaklaşım farklı suşların farklı hücre yapılarını görüntülemek ve farklı gelişim evreleri altında görüntülemek için son derece uygundur. Şekil 8 ve Video 2'de, A. nidulans konidiophore (yani aseksüel sporlar taşıyan yapılar) gelişiminin ilk aşamalarını sunuyoruz. Bununla birlikte, bu yöntemin konidiophore oluşumunu görüntüleme için en uygun olmadığı belirtilmelidir, çünkü her ikisi de konidiofore gelişimi için gerekli olan karbon / azot açlığı ve hava maruziyeti yaklaşımımızla standartlaştırılamaz35.
Ek olarak, bu protokol, filamentli hyphae, psödoohyphal hücreleri, maya form hücreleri ve çeşitli hücre dışı matris36formlarından oluşan yoğun bir heterojen, yüzeyle ilişkili koloni oluşturan dikey uzantıya tabi olan mantar biyofilmlerini izlemek için uygun değildir. Tekniğin bir diğer sınırlaması, etiketsiz mikroskobik analizin çimlenme/farklılaşma dinamiklerinin nitel ve nicel analizi için kesin bir yöntemi temsil etmesine rağmen, bu tür verilerin manuel olarak değerlendirilmesi, özellikle birçok suş veya/ve koşullar incelendiğinde zaman alıcıdır. Bu nedenle, yüksek verimli zaman atlamalı görüntüleme mikroskopisinden elde edilen veriler, hiphal gelişimi ve kondiyal çimlenme37, 38 , 39'unotomatik veya yarı otomatik görüntü analizini sağlayan uygun hesaplama yazılımı ile analiz edilmelidir.
Özetle, burada, kullanıcının önceden herhangi bir görüntü analizi deneyimine ihtiyaç duymadan mantar büyüme kinetiğini tekrarlanabilir ve güvenilir bir şekilde analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, mantar büyümesi ve farklılaşmasının objektif ve doğru ölçülmesine izin verir ve mantar yaşam döngülerini ve mantar patojenitesini incelemek için tamamlayıcı bir görüntüleme yaklaşımı sağlar37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen"Rekabetçilik, Girişimcilik ve İnovasyon" (NSRF 2014-2020) Operasyonel Programı (NSRF 2014-2020) tarafından finanse edilen ve Yunanistan ve AB tarafından ortaklaşa finanse edilen "Araştırma ve yenilik Altyapısının Güçlendirilmesi" Eylemi kapsamında uygulanan "Temel Biyolojik Süreçleri Görselleştirmek ve İzlemek için Bir Yunan Araştırma Altyapısı (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) projesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C.
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H.
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F.
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
