Summary
Vi presenterer en etikettfri live bildeprotokoll ved hjelp av overførte lysmikroskopiteknikker for å fange bilder, analysere og kvantifisere vekstkinetikken til den filamentøse soppen A. nidulans i både nedsenkede kulturer og solide medier. Denne protokollen kan brukes sammen med fluorescensmikroskopi.
Abstract
Det er veletablert at kolonivekst av filamentøse sopp, for det meste avhengig av endringer i hyphae/mycelia apikal vekstrate, er makroskopisk estimert på størknede medier ved å sammenligne kolonistørrelse. Men å kvantitativt måle vekstraten for genetisk forskjellige soppstammer eller stammer under ulike miljø/ vekstforhold (pH, temperatur, karbon og nitrogenkilder, antibiotika, etc.) er utfordrende. Dermed blir jakten på komplementære tilnærminger for å kvantifisere vekstkinetikk obligatorisk for bedre å forstå soppcellevekst. Videre er det velkjent at filamentøse sopp, inkludert Aspergillus spp., har tydelige vekstmåter og differensiering under under-luftforhold på faste medier eller nedsenkede kulturer. Her beskriver vi en kvantitativ mikroskopisk metode for å analysere vekstkinetikken til modellsvampen Aspergillus nidulans, ved hjelp av levende avbildning i både nedsenkede kulturer og faste medier. Vi tar bilder, analyserer og kvantifiserer vekstrater av forskjellige soppstammer på en reproduserbar og pålitelig måte ved hjelp av en åpen kildekode, gratis programvare for biobilder (f.eks. Fiji), på en måte som ikke krever noen tidligere bildeanalyseekspertise fra brukeren.
Introduction
Filamentøse sopp er av stor sosioøkonomisk og økologisk betydning, og er både avgjørende som industrielle / landbruksverktøy for enzym- og antibiotikaproduksjon1,2 og som patogener av avlingsplanter3, skadedyrsinsekter4 og mennesker3. Videre er filamentøse sopp som Aspergillus nidulans mye brukt som modellorganismer for grunnleggende forskning, for eksempel studier i genetikk, celle- og evolusjonsbiologi samt for studiet av hyphal forlengelse5. Filamentøse sopp er svært polariserte organismer som forlenger gjennom kontinuerlig tilførsel av membranlipider / proteiner og de novosyntesen av cellevegg på forlengelsesspissen6. En sentral rolle i hyphalspissens vekst og polaritetsvedlikehold er en spesialisert struktur kalt 'Spitzenkorper' (SPK), en høyt bestilt struktur som hovedsakelig består av cytoskeletalkomponenter og polarisert distribusjon av Golgi6,7,8.
Miljøstimuli/signaler, slikt vann-luft-grensesnitt, lys, CO2-konsentrasjon og ernæringsstatus er ansvarlig for utviklingsbeslutningene som tas av disse formene9. I nedsenkede (flytende) kulturer er differensiering av A. nidulans undertrykt og veksten skjer ved hyphalspissforlengelse6. Under vegetativ vekst spiser aseksuelle sporer (conidia) ved apikal forlengelse, og danner et uavklart nettverk av sammenkoblede hyphalceller, myceliet, som kan fortsette å vokse på ubestemt tid så lenge næringsstoffer og plass er tilgjengelige. På den annen side, på faste medier hyphal tips forlenge og etter en definert periode med vegetativ vekst (utviklingskompetanse), aseksuelle reproduksjon er initiert og luft conidiophore stilker strekker seg fra spesialiserte fotceller i mycelium6. Disse gir opphav til spesialiserte utviklingsmessige multicellulære strukturer kalt conidiophores, som produserer lange kjeder av haploid conidia10 som kan starte veksten på nytt under gunstige miljøforhold.
En mye brukt metode for måling av filamentøs soppvekst er å inokulere sporer på næringsagar inneholdt i en Petri-tallerken og makroskopisk måle koloniens diameter noen dager senere11. Koloniens diameter/ område, mest avhengig av endringer i mycelial vekstrate og mindre på conidiophore tetthet12, brukes deretter som en verdi av vekst. Selv om måling av sopppopulasjon (koloni) størrelse som vokser på faste overflater er ganske tilstrekkelig, er det på ingen måte det mest nøyaktige målet på vekst. Sammenlignet med gjennomsnittet på befolkningsnivå (gjennomsnitt av soppkolonistørrelse), kan enkeltcellemålinger fange heterogeniteten til en cellepopulasjon og tillate identifisering av nye underpopulasjoner av celler, stater13, dynamikk, veier samt de biologiske mekanismene som celler reagerer på endogene og miljømessige endringer14,15. Overvåking av soppcellevekst og fenotype ved tidsforløpmikroskopi er uten tvil den mest brukte kvantitative enkeltcelleobservasjonsmetoden.
Heretter beskriver vi en etikettfri live bildebehandlingsprotokoll ved hjelp av overførte lysmikroskopiteknikker (for eksempel fasekontrast, differensialinterferenskontrast (DIC) og polarisert mikroskopi) for å fange bilder, som uavhengig av kombinert bruk av fluorescensmikroskopi kan brukes til å analysere og kvantifisere polar vekst av A. nidulansstammer i både nedsenkede kulturer og faste medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inoculum forberedelse
MERK: Alle trinn skal utføres under et laminært strømningsskap.
- Strekk ut soppstamme av interesse, fra et glyserollager (-80 °C) ved hjelp av en steril inokulasjonssløyfe, på plater av minimalt medium (MM) supplert med de riktige ernæringskravene som er relevante for belastningen undersøkt [MM: 10,0 g / L glukose, 20 ml / l saltoppløsning (saltoppløsning: 26 g / L KCl, 26 g / L MgSO4·7H, O2 76 g/L KH2PO4, 2,0 ml/l kloroform) og 1 ml/l sporstoffer (sporstoffer: 40 mg/l Na2B4O7· H2O, 400 mg/L CuSO4, 8 g/L ZnSO4, 800 mg/L MnSO4, 800 mg/L FePO4), juster pH til 6,8 med 1 M NaOH, tilsett 1 % (w/v) agar og de nødvendige tilleggene som beskrevet i16 og autoklavering] (Figur 1).
MERK: Saltoppløsning, sporstoffløsning og kosttilskudd er autoklavert. - Inkuber i 2-3 dager ved 37 °C.
- Bruk en steril tannpirker (eller en inokulasjonssløyfe), overfør et lite antall conidia, ved å berøre en enkelt koloni forsiktig, til plater av komplette medier (CM) [CM: 10,0 g / L glukose, 2,0 g / L peptone, 1,0 g / l gjærekstrakt, 1,0 g / l casaminosyrer, 20 ml / l saltoppløsning, 1 ml / l sporstoffer, 5 ml / l vitaminoppløsning (vitaminløsning: vitaminløsning: 0,1 g/l riboflavin, 0,1 g/L nikotinamid, 0,01 g/L p-amino benzosyre, 0,05 g/L pyridoksin HCl, 1,0 mg/l biotin), juster pH til 6,8 med 1 M NaOH, tilsett 1 % (w/v) agar og de nødvendige tilskuddene som beskrevet i16 og autoklavering]. Autoklav og oppbevar vitaminoppløsningen i en mørk flaske ved 4 °C.
MERK: I tilfelle soppvekst er for tett til å identifisere og isolere individuelle kolonier, re-stripe på en ny agar plate for å oppnå enkeltkolonier. - Inkuber i 3-4 dager ved 37 °C.
- Få en konidial suspensjon på ca. 2 x10 6 celler/ml ved å skrape 1 cm fra overflaten av en sammenhengende soppkoloni dyrket på CM-agarplater, ved hjelp av en steril tannpirker (Figur S1).
MERK: Når det er nødvendig, tell conidia med et hemocytometer. - Høst conidia av A. nidulans i et sterilt 1,5 ml sentrifugerør med 1,0 ml autoklavert destillert vann som inneholder 0,05% (v / v) Tween 80 for å redusere antall konidia klumper.
MERK: Conidia kan oppbevares i opptil 2-3 uker ved 4 °C uten relevant tap av levedyktighet (A. Athanasopoulos og V. Sophianopoulou, upubliserte data). Det anbefales imidlertid å filtrere og/eller vaske konidial suspensjon for å fjerne mycelialdeler og næringsstoffer, for å forhindre konidial hevelse.
2. Forberedelse for avbildning av filamentøse sopp som vokser på agar (faste) medier
MERK: En modifisert versjon av 'invertert agar metode17,18 brukes.
- I utgangspunktet, spot 10 μL aliquots av kraftig virvelet conidial (ca. 2 x 104 celler / ml) på flere punkter på Petri retter (Ø9 cm) 15 ml MM med 1% (w / v) agar (Figur 2).
MERK: Ved hjelp av den modifiserte versjonen av den "inverterte agarmetoden" er det mulig å bilde soppprøver i mange timer uten tilsynelatende skadelige effekter på voksende hyphae. - Inkuber den eksperimentelle kulturen i henhold til utviklingsstadiet som er ment å bli undersøkt.
- Skjær ut en ≈0,8 mm2 blokk med agar som inneholder kolonien ved hjelp av en steril skalpell.
MERK: Dimensjonene på agarblokken som skal kuttes ut, avhenger av dimensjonene på utstyret som skal plasseres etterpå. I dette arbeidet brukes 8 brønner μ lysbilder (se nedenfor). - Snu og plasser agarblokken i en brønn av en μ-slide eller lignende 8 kammeret coverglass med dekslerlip egnet for levende bildebehandling.
MERK: I tilfelle overført lysmikroskopi vil bli brukt i kombinasjon med fluorescens (merking) mikroskopi, kan agarblokken inverteres på en dråpe flytende medium som inneholder levende cellefarging fargestoff, like før avbildning.
3. Forberedelse for avbildning av filamentøse sopp som vokser på flytende medium
- Overfør 10 μL aliquots av en kraftig virvelert konidial suspensjon (ca. 2 x 104 celler/ml) i brønnene til en 8 brønn μ-slide som inneholder 200 μL (væske) MM med passende kosttilskudd (se ovenfor).
- Inkuber for ønsket tid ved ønsket temperatur (Figur 3).
MERK: Hvis overført lysmikroskopi skal brukes i kombinasjon med fluorescens (merking) mikroskopi, har flytende kulturer den store fordelen at fluorescerende fargestoffer kan tilsettes på et hvilket som helst ønsket tidspunkt under eksperimentet19.
4. Ta bilder
MERK: Valget av mikroskop avhenger av tilgjengelig utstyr. I alle fall bør mikroskopoppsettet inkludere et invertert stadium, et miljøkammer eller i det minste et rom med presis lufttemperaturkontroll.
- Forvarm det termostatede mikroskopkammeret ved 37 °C (med mindre annet er angitt eller egnet for de brukte soppartene) for å stabilisere temperaturen før du starter. Dette kammeret tillater temperaturmodulering av mikroskopoptikken og prøvestadiet under tidsforløpeksperimenter. Vær oppmerksom på at optiske avvik20 innføres når normale nedsenkningsoljer (designet for bruk ved 23 °C) oljer brukes ved 37 °C eller høyere.
MERK: På et stramt budsjett kan inkubasjonskamrene være laget av papp og isolerende emballasjemateriale21 eller ved hjelp av en 3D-skriver22. - Slå på mikroskopet, skannerens strøm, laserstrømmen og datamaskinen, og last inn bildebehandlingsprogramvaren. Plasser μ-sklien (klargjort tidligere) i mikroskopstadiet og fokuser.
- Finn synsfelt som inneholder isolerte/ikke overlappende celler (eller i det minste ikke overbefolket), for å lette vekstmålinger under bildeanalyse. Registrer minst 50 voksende celler per prøve for å tillate robust statistisk analyse.
- Velg ønsket overført lysmikroskopitilnærming. Reduser eksponeringstiden eller laserkraften og pikselboetiden og/eller øk pinhole-diameteren for å minimere fotobleking av soppceller, som beskrevet andre steder 23,24.
- Angi mikroskop for å skaffe bilder ved ønskede tidsintervaller og oppkjøp av starttidsserier.
MERK: For å korrigere for fokaldrift over tid (spesielt for lange eksperimenter), på grunn av termisk drift, bruker forskjellige cellestørrelser og cellebevegelse en autofokusstrategi hvis tilgjengelig i mikroskopprogramvaren.
5. Bildeanalyse
MERK: Denne delen beskriver de viktigste trinnene for behandling av mikroskopibilder for behandling av tidsforløp for måling av vekstraten for A. nidulans. Åpning, visualisering og behandling av bilder oppnås med open source ImageJ / Fiji-programvaren25.
- Importer bildene til Fiji ved hjelp av plugins | | i bioformat Bioformater Importør fra Fiji -menyen med standardinnstillinger (Figur 4A).
MERK: Kontroller om Bio-Formats Importer gjenkjenner bildekalibreringen på riktig måte. Bildedimensjonen som vises i bildevinduet for det øvre informasjonsfeltet, må være lik de opprinnelige bildedimensjonene (Figur 4B). Trykk Skift + P for å vise og endre bildeegenskaper i ImageJ/Fiji-programvaren. - Bruk histogram som samsvarer med26 ved behov for belysningskorrigering mellom ulike rammer (Bilde | Juster | Blekemiddelkorrigering | Samsvarende histogram) (Figur 4C).
- Bruk om nødvendig SIFT-algoritme (Plugins | Registrering | Lineær stakkjustering med SIFT) for justering eller samsvarende bildestakker (Figur 4D). Å velge "Oversettelse" fra den forventede transformasjonsmenyen bør være nok til å korrigere enhver x-y-drift.
MERK: Andre plugins kan også brukes til å justere en stabel med bildestykker, for eksempel Bildestabilisator (https://imagej.net/Image_Stabilizer) eller StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/). - Velg hyphae som vokser parallelt med coverlip, og unngår de som er vippet. Pass på at du velger hyphae som forplantes av polar forlengelse og unngår hyphae som presenterer lateral og / eller apikal forgrening.
- Bruke MTrackJ (Plugins | MTrackJ) plugin for å spore voksende hyphal tips (Figur 4E)27. Hvis du vil legge til et spor, velger du Legg til -knappen på verktøylinjen og plasserer det første punktet ved en hyphalspiss med venstre museklikk. Tidsserien flyttes automatisk til neste bilde. Hvis du vil fullføre sporingsprosessen, dobbeltklikker du musen på det siste punktet (eller trykker ESC- tasten) (Figur 4F). Flytt til et annet interessepunkt (dvs. voksende hyphalspiss) i den første tidsrammen og start prosedyren på nytt ved å måle vekstraten til en annen hypha.
MERK: For å installere MTrackJ følg instruksjonene som presenteres på https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ - Klikk Mål -knappen i dialogboksen MTrackJ (Figur 4G) for å åpne utdatatabellen. Lagre spormålinger (Fil | Lagre som) i ønsket filformat (f.eks. csv), analyser og tegn dem inn (Figur 4H).
MERK: Ved å velge Film-knappen produseres det en film som viser bildet og sporprogresjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter denne protokollen fanget og analyserte vi ulike bilder som tilsvarer forskjellige vekst / utviklingsstadier av den filamentøse soppen A. nidulans. Dataene som presenteres i denne studien ble behandlet og analysert ved hjelp av Fiji-programvaren. Målinger ble lagret som CSV-filer, statistisk analysert og utarbeidet som grafer ved hjelp av kommersiell statistisk programvare og / eller Python programmeringsspråk ved hjelp av programvarebiblioteker som pandas, numpy, statsmodels, matplotlib og sjøbåren. Du finner flere detaljer i de siterte originalpublikasjonene.
For å tolke befolkningens respons er det viktig å bestemme heterogenitet av nøkkelparametere i populasjonene og effektivt identifisere fysiologiske distinkte subpopulasjoner28. Figur 5 viser veksten av azhAΔ ngnAΔ mutantstammen, som bærer slettinger i to gener, hvis produkter er involvert i avgiftning og assimilering av det giftige fytoproduktet L-azetidin-2- karboksylsyre29, sammenlignet med WT-stammen. Når vi måler vekstraten i nedsenkede flytende kulturer, oppdager vi en statistisk signifikant lavere vekstrate for dobbeltmutanten sammenlignet med WT-stammen (t(715) = 20,61, p = <0 0001) (Figur 5A-B). Denne forskjellen i vekst var ikke påviselig og målte bare koloniområdet for disse stammene (Figur 5C-D), og understreket at mikroskopisk enkeltcelleanalyse er mer effektiv for å bestemme små forskjeller i vekstrater som er vanskelige å oppdage med makroskopisk observasjon av kolonien.
Enkeltcellet langtids levende avbildning er av betydelig verdi i arbeidet med å oppnå romlig og tidsmessig informasjon om cellulær proteindynamikk. Langtids levende celleavbildning (Figur 6, Video 1) av konidial spiring som bidrar til å uttrykke det GFP-merkede kjerneeosomale proteinet PilA og mRFP-histonen H1, viser at PilA30 danner statiske strukturer med lav mobilitet ved soppplasmamembran31,32. Videre viser figur 7 at fluorescerende fargestoffer kan brukes til levende avbildning av stammer dyrket på agarmedium, for å studere dynamikken i organeller og cellestrukturer. Her ble FM4-6433 brukt til å visualisere mitokondrienettverk og vakuolarsystemet i A. nidulans.
Figur 1: Skjematisk representasjon av inokulumforberedelsesprosedyren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk fremstilling av prosedyren som følges for avbildning av filamentøse sopp som vokser på agar medium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk fremstilling av prosedyren som følges for avbildning av filamentøse sopp som vokser i flytende medium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Skjematisk representasjon av bildeanalyseprosedyre. Fremgangsmåte for behandling av mikroskopibilder med tidsforløp og måling av vekstraten for A. nidulans. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenligne tradisjonelle populasjonsmålinger med måling av enkeltceller. (A) Representative konfokale mikroskopibilder av azhAΔ ngnAΔ dobbel sletting og WT-stammer, dyrket i nedsenkede flytende kulturer som inneholder urea som eneste nitrogenkilde ved 25 °C. Alle stammer ble inkubert i totalt 18 timer, ved 25 °C og rammer ble fanget ved 15 minutters intervaller. Bilder av 2048 × 2048 piksler ble samlet inn med en pikselstørrelse på 115.02 x 115.02 nm ved hjelp av et TCS SP8 MP (Leica, Tyskland) mikroskop utstyrt med HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 olje nedsenking mål. (B) Mål på (A) tegnes inn i boks-og-whiskers-plott. Statistisk signifikans ble analysert via t-test og er avbildet med stjerner (***), noe som indikerer p < 0,001. (C) Vekst ved 25 °C WT og dobbel slettingsstamme på fast MM. Kolonier ble fotografert ved forskjellige tidsintervaller (18 timer, 36 t og 72 timer), romlig kalibrert og målt manuelt med en linjal i ImageJ-programmet. (D) Målinger av kolonområdet som presenteres i (C) plottes som boks-og-whiskers-plott. Forskjeller i kolonområdet var ikke statistisk signifikante mellom de ulike tidspunktene i den doble mutanten sammenlignet med WT-stammen (18t: t(8) = 0,69, p = 0,50, 36t: t(6) = 0,27, p = 0,5068, 72t: t(6) = 0,39, p = 0,70 ). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Langsiktig levende celleavbildning av konidial spiring som bidrar til å uttrykke proteiner av interesse smeltet sammen med genetisk kodede fluorescerende koder. (A) Maksimal intensitet projeksjoner (MIP) av 4 skiver generert i z-planet, av en stamme co-uttrykke PilA-GFP og H1-mRFP. Conidia ble oppdaget på agar medium og inkubert i ca 1 time ved 30 °C for å hjelpe adhesjon av cellene til agaren. Agarblokken som inneholder conidia ble kuttet ut, plassert i brønner av en μ-sklie og inkubert i totalt 18 timer, ved 30 °C. Rammer ble tatt med 25 minutters intervaller ved hjelp av et TCS SP8 MP (Leica, Tyskland) mikroskop utstyrt med HC Plan APO 63x, N.A. 1,40 oljeinnlevelsesmål (med en pikselstørrelse på 92,26 x 92,26 nm). Bilder ble hentet av spennende GFP ved 488 nm bølgelengde og detektering av fluorescens i spektralbåndet fra 495 til 558 nm, og ved spennende mRFP ved 561 nm bølgelengde og detektering av fluorescens i spektralbåndet fra 580 til 660 nm. (B) Målinger (hastigheten på spiring og hyphalspissforlengelse) av (A) er plottet inn som linjediagram. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: FM4-64 merking av hyphae som vokser på fast medium. Conidia av en WT-stamme ble dyrket på 1% agar MM Petri retter i 16 timer ved 30 °C. De voksende bakteriene ble inkubert i 20 min med 10 μL MM som inneholder 10 μM FM4-64. Etter inkubasjon ble en agarblokk som inneholdt fargede bakterier kuttet ut, plassert i 8 μ-slide etterfulgt av en 47 min jakt ved 30 °C. Rammer ble tatt hver 7 min ved 30 °C ved hjelp av et TCS SP8 MP mikroskop utstyrt med HC Plan APO 63x, N.A. 1,40 oljeinnlevelsesmål (med en pikselstørrelse på 184,52 x 184,52 nm). Bildene ble hentet av spennende FM4-64 ved bølgelengde på 514 nm og påviste fluorescens i spektralbåndet fra 596 til 682 nm. FM4-64 fluorescenssignalet vises som invertert bilde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Tidlige stadier av conidiophore formasjon. (A) Conidia av WT stamme ble dyrket på agar medium i 136 h ved 30 °C, skiver ut og plassert i brønner av en μ-slide. Rammer ble tatt hvert 20. Bilder av 2048 × 2048 piksler ble samlet inn med en pikselstørrelse på 245.2 x 245.2 nm ved hjelp av et TCS SP8 MP (Leica, Tyskland) mikroskop, utstyrt med HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 olje nedsenkning mål. Bilder viser dannelsen av conidiophore vesikler (svart pil) samt dannelsen (brun pil) og modning av metulae (blå pil). (B) Målinger (hastigheten på spiring og unipolær hyphalspissforlengelse) av (A) er plottet som linjediagram. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Langsiktig live celle avbildning av conidial spiring co-uttrykke PilA-GFP og H1-mRFP. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Tidlige stadier av conidiophore formasjon i A. nidulans. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Figur S1: Fremstilling av konidial suspensjon. Ved å skrape med en steril tannpirker oppnås en ca. 1 cm2 overflate av en sammenhengende plate, en suspensjon på ca. 2 x 106 conidia/ml. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overvåking av soppcellevekst og fenotype ved tidsforløpmikroskopi er en kraftig tilnærming for å vurdere cellulær atferd i sanntid og kvantitativt og nøyaktig avgjøre om en bestemt legemiddelbehandling og / eller genetisk intervensjon resulterer i påviselig cellevekst eller fenotypiske forskjeller over tid.
I denne studien ble en pålitelig levende celleavbildningsmetodikk beskrevet for å måle og kvantitativt analysere sopputvikling, inkludert dynamikken i bakterierør og hyphalspissvekst i A. nidulans. Overvåking av morfologiske endringer over tid, ved hjelp av overførte lysmikroskopiteknikker, kan være svært nyttig for å identifisere celler som er stresset, døende eller døde. En detaljert kunnskap om slike dynamiske prosesser på encellet nivå gjør det mulig å vurdere heterogenitet i en blandet populasjon av celler og i et langsiktig perspektiv tillater identifisering av veier og detaljerte mekanismer som celler reagerer på endogene og miljømessige signaler.
En fordel med denne metoden er at den er basert på en etikettfri avbildningstilnærming (som likevel lett kan kombineres med fluorescensmikroskopi) som bruker iboende lysbrytningsegenskaper til celler for å skape bildekontrast uten å introdusere fargestoffer / etiketter, noe som kan forvirre resultatene. Mens fluorescerende markører kan brukes til å merke cellulære rom og proteiner og betydelig lette segmentering og sporing av celler, omgår overført lysmikroskopi behovet for genetisk ingeniørceller, slik at forskere kan unngå kostnadene og den tidkrevende farge- / etikettoptimaliseringen og også for å unngå sannsynlige fototoksisitetseffekter som kommer fra fluorescensavbildning13,34.
Denne protokollen er egnet til å studere vekstkinetikk av sopp som danner hyphae eller pseudohyphae. Videre er denne tilnærmingen svært egnet for avbildning av forskjellige cellestrukturer av forskjellige stammer og under forskjellige utviklingsstadier. I figur 8 og video 2presenterer vi de første stadiene av A. nidulans conidiophore (dvs. strukturer som bærer aseksuelle sporer) utvikling. Det må imidlertid bemerkes at denne metoden ikke er den mest egnede for avbildning av conidiophore-dannelse, siden karbon / nitrogen sult og lufteksponering, begge nødvendige for utvikling av conidiophores, ikke kan standardiseres av vår tilnærming35.
I tillegg er denne protokollen dårlig egnet til å spore soppbiofilmer, som er gjenstand for vertikal forlengelse som danner en tett heterogen, overflaterelatert koloni bestående av filamentøs hyphae, pseudohyphalceller, gjærformceller og ulike former for ekstracellulær matrise36. En annen begrensning ved teknikken er at selv om etikettfri mikroskopisk analyse representerer en presis metode for kvalitativ og kvantitativ analyse av spiring/differensieringsdynamikk, er manuell evaluering av slike data tidkrevende, spesielt når mange stammer eller/og forhold undersøkes. Dermed bør data fra high-throughput time-lapse imaging microscopy analyseres av egnet beregningsprogramvare som muliggjør automatisert eller halvautomatisk bildeanalyse av hyphalutvikling og conidial spiring37,38,39.
Oppsummert presenterer vi heri en protokoll for å analysere soppvekstkinetikk på en reproduserbar og pålitelig måte uten behov for noen tidligere bildeanalyseopplevelse fra brukeren. Denne protokollen tillater objektiv og nøyaktig kvantifisering av soppvekst og differensiering, og gir en komplementær avbildningstilnærming for å studere sopplivssykluser og sopppatogenisitet37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av prosjektet "A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)" (MIS 5002755) som er implementert under aksjonen "Forsterkning av forsknings- og innovasjonsinfrastrukturen", finansiert av det operative programmet "Competitiveness, Entrepreneurship and Innovation" (NSRF 2014-2020) og medfinansiert av Hellas og E. U.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C.
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H.
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F.
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
