Summary
Мы представляем протокол визуализации в реальном времени без меток, использующий методы микроскопии пропускаемого света для захвата изображений, анализа и количественной оценки кинетики роста нитевидного гриба A. nidulans как в погруженных культурах, так и в твердых средах. Этот протокол может использоваться в сочетании с флуоресцентной микроскопией.
Abstract
Хорошо известно, что рост колонии нитевидных грибов, в основном зависящий от изменений скорости роста гиф/мицелия, макроскопически оценивается на затверделых средах путем сравнения размеров колоний. Однако количественно измерить скорость роста генетически различных грибковых штаммов или штаммов в различных условиях окружающей среды / роста (рН, температура, источники углерода и азота, антибиотики и т. Д.) Является сложной задачей. Таким образом, стремление к комплементарным подходам к количественной оценке кинетики роста становится обязательным, чтобы лучше понять рост грибковых клеток. Кроме того, хорошо известно, что нитевидные грибы, включая Aspergillus spp., имеют различные способы роста и дифференциации в субвоздушных условиях на твердых средах или погруженных культурах. Здесь мы подробно описываем количественный микроскопический метод анализа кинетики роста модельного гриба Aspergillus nidulans,используя живую визуализацию как в погруженных культурах, так и в твердых средах. Мы захватываем изображения, анализируем и количественно определяем темпы роста различных штаммов грибов воспроизводимым и надежным способом, используя бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом для биоизобликов (например, Фиджи), таким образом, чтобы не требовал от пользователя какого-либо предварительного опыта анализа изображений.
Introduction
Нитевидные грибы имеют большое социально-экономическое и экологическое значение, будучи как промышленными/сельскохозяйственными инструментами для производства ферментов иантибиотиков 1,2, так и патогенами сельскохозяйственных растений3,насекомых-вредителей4 и человека3. Кроме того, нитевидные грибы, такие как Aspergillus nidulans, широко используются в качестве модельных организмов для фундаментальных исследований, таких как исследования в области генетики, клеточной и эволюционной биологии, а также для изучения гифального расширения5. Нитевидные грибы представляют собой высокополяризованные организмы, которые удлиняются за счет непрерывного снабжения мембранных липидов/белков и de novo синтеза клеточной стенки на расширяющейся кончике6. Центральную роль в росте и поддержании полярности гифального кончика играет специализированная структура под названием «Шпитценкорпер» (SPK), высокоупорядоченная структура, состоящая в основном из цитоскелетных компонентов и поляризованного распределения Гольджи6,7,8.
Стимулы/сигналы окружающей среды, такие как водно-воздушный интерфейс, свет, концентрация CO2 и состояние питания, отвечают за решения развития, принимаемые этими формами9. В погруженных (жидких) культурах дифференциация A. nidulans подавляется и рост происходит путем удлинения гифального кончика6. Во время вегетативного роста беспощадные споры (конидии) прорастают апикальным расширением, образуя недифференцированную сеть взаимосвязанных гифальных клеток, мицелий, который может продолжать расти бесконечно, пока доступны питательные вещества и пространство. С другой стороны, на твердых носителях гифальные кончики удлиняются и после определенного периода вегетативного роста (развития компетентности) инициируется бесполое размножение и воздушные конидиофорные стебли простираются от специализированных клеток стопы мицелия6. Они порождают специализированные многоклеточные структуры развития, называемые конидиофорами, которые производят длинные цепи гаплоидных конидий10, которые могут возобновить рост при благоприятных условиях окружающей среды.
Широко используемым методом измерения роста нитевидных грибов является инокуляция спор на питательный агар, содержащийся в чашке Петри, и макроскопическое измерение диаметра колонии через несколькодней 11. Диаметр/площадь колонии, наиболее зависящая от изменений скорости роста мицелиала и меньше от плотности конидиофора12,затем используется в качестве значения роста. Хотя измерение размера грибковой популяции (колонии), растущей на твердых поверхностях, вполне адекватно, это ни в коем случае не самая точная мера роста. По сравнению со средними показателями популяционного уровня (средними значениями размера грибковой колонии), измерения одной клетки могут фиксировать гетерогенность клеточной популяции и позволяют идентифицировать новые субпопудрения клеток, состояния13,динамику, пути, а также биологические механизмы, с помощью которых клетки реагируют на эндогенные и экологические изменения14,15. Мониторинг роста и фенотипа грибковых клеток с помощью покадровой микроскопии, возможно, является наиболее широко используемым количественным подходом к наблюдению за одной клеткой.
Здесь мы подробно описываем протокол визуализации в реальном времени без меток с использованием методов микроскопии пропускаемого света (таких как фазовый контраст, дифференциальный интерференционный контраст (DIC) и поляризованная микроскопия) для захвата изображений, которые независимо от совместного использования флуоресцентной микроскопии могут быть использованы для анализа и количественной оценки полярного роста штаммов A. nidulans как в погруженных культурах, так и в твердых средах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление инокулятов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны выполняться под ламинарной проточной шкафом.
- Вывод интересующих грибкового штамма из запаса глицерина (-80 °C) с использованием стерильной петли инокуляции на пластины с минимальной средой (MM), дополненной соответствующими требованиями к питанию, относящимися к исследуемому штамму [MM: 10,0 г / л глюкозы, 20 мл / л раствора соли (раствор соли: 26 г / л KCl, 26 г / л MgSO4· 7H2O, 76 г/л KH2PO4, 2,0 мл/л хлороформа) и 1 мл/л микроэлементов (микроэлементы: 40 мг/л Na2B4O7· H2O,400 мг/л CuSO4,8 г/л ZnSO4,800 мг/л MnSO4,800 мг/л FePO4),отрегулировать рН до 6,8 с 1 M NaOH, добавить 1 % (мас./об.) агара и необходимые добавки, как описано в16 и автоклаве](рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор соли, раствор микроэлементов и добавки являются автоклавными. - Инкубировать в течение 2-3 дней при 37 °C.
- Используйте стерильную зубочистку (или петлю прививки), перенесите небольшое количество конидий, осторожно коснувшись одной колонии, на пластины полной среды (CM) [CM: 10,0 г / л глюкозы, 2,0 г / л пептона, 1,0 г / л дрожжевого экстракта, 1,0 г / л казаминозацидов, 20 мл / л солевого раствора, 1 мл / л микроэлементов, 5 мл / л витаминного раствора (витаминный раствор: 0,1 г/л рибофлавина, 0,1 г/л никотинамида, 0,01 г/л п-аминобензойной кислоты, 0,05 г/л пиридоксина HCl, 1,0 мг/л биотина), довести рН до 6,8 с 1 М NaOH, добавить 1 % (мас./об.) агара и необходимые добавки, как описано в16 и автоклаве]. Автоклав и храните раствор витамина в темном флаконе при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если грибковый рост слишком плотный, чтобы идентифицировать и изолировать отдельные колонии, повторно проложите полосу на новой агаровой пластине, чтобы получить отдельные колонии. - Инкубировать в течение 3-4 дней при 37 °C.
- Получают конидиальную суспензию приблизительно 2 х 106 клеток/мл, поцарапав 1 см от поверхности конидидированной грибковой колонии, выращенной на пластинах агара СМ, используя стерильную зубочистку(рисунок S1).
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости подсчитывать конидии с помощью гемоцитометра. - Собирают конидии A. nidulans в стерильной центрифужной трубке 1,5 мл с 1,0 мл автоклавной дистиллированной воды, содержащей 0,05% (v/v) Tween 80 для уменьшения количества сгустков конидий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конидии могут храниться до 2-3 недель при 4 °C без соответствующей потери жизнеспособности (A. Athanasopoulos and V. Sophianopoulou, неопубликованные данные). Тем не менее, рекомендуется фильтровать и / или промывать конидиальную суспензию для удаления мицелиальных частей и питательных веществ, чтобы предотвратить конидиальный отек.
2. Подготовка к визуализации нитевидных грибов, растущих на агаровых (твердых) средах
ПРИМЕЧАНИЕ: Используется модифицированная версия метода 'инвертированного агара17,18.
- Первоначально обнаружите 10 мкл аликвот энергично вихревой конидиальной (приблизительно 2 x 104 клетки/мл) в нескольких точках на чашках Петри (Ø9 см) 15 мл ММ с 1% (мас./об.) агаром(рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используя модифицированную версию «метода перевернутого агара», можно визуализировать образцы грибов в течение многих часов без видимого пациозного воздействия на растущие гифы. - Инкубируют экспериментальную культуру в соответствии с стадией развития, предназначенной для исследования.
- Вырежьте ≈0,8 мм2 блока агара, содержащего колонию, с помощью стерильного скальпеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры агарового блока, который должен быть разрезан, зависят от размеров оборудования, которое будет размещено впоследствии. В настоящей работе используются 8 скважин μ-слайдов (см. ниже). - Инвертируйте и поместите агаровый блок в колодец μ-слайда или аналогичного 8-камерного покровного стекла с крышкой, подходящего для визуализации в реальном времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если микроскопия пропускаемого света будет использоваться в сочетании с флуоресцентной (маркировкой) микроскопией, блок агара может быть инвертирован на каплю жидкой среды, содержащей краситель для окрашивания живых клеток, непосредственно перед визуализацией.
3. Подготовка к визуализации нитевидных грибов, растущих на жидкой среде
- Перенос 10 мкл аликвот энергично вихревой конидиальной суспензии (приблизительно 2 х 104 ячейки/мл) в скважины 8 скважин μ-слайда, содержащего 200 мкл (жидкого) ММ с соответствующими добавками (см. выше).
- Инкубировать в течение нужного времени при нужной температуре(рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если пропускаемая световая микроскопия будет использоваться в сочетании с флуоресцентной (маркировкой) микроскопией, жидкие культуры имеют большое преимущество, что флуоресцентные красители могут быть добавлены в любой желаемый момент времени во время эксперимента19.
4. Захват изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор микроскопа зависит от имеясь оборудования. В любом случае установка микроскопа должна включать в себя перевернутую ступень, камеру окружающей среды или, по крайней мере, помещение с точным контролем температуры воздуха.
- Предварительно разогрейте термостатированную камеру микроскопа при 37 °C (если не указано иное или как подходящее для используемых грибковых видов) для стабилизации температуры перед запуском. Эта камера позволяет осуществлять температурную модуляцию оптики микроскопа и стадии образца во время покадровых экспериментов. Имейте в виду, что оптические аберрации20 вводятся, когда обычные погружные масла (предназначенные для использования при 23 °C) масла используются при 37 °C или выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: При ограниченном бюджете инкубационные камеры могут быть изготовлены из картона и изоляционного упаковочного материала21 или с помощью 3D-принтера22. - Включите микроскоп, питание сканера, мощность лазера и компьютер и загрузите программное обеспечение для обработки изображений. Поместите μ-слайд (подготовленный ранее) в стадию микроскопа и сфокусироваться.
- Найдите поля зрения, которые содержат изолированные / не перекрывающиеся ячейки (или, по крайней мере, не переполненные), чтобы облегчить измерения роста во время анализа изображений. Захватите не менее 50 растущих клеток на образец, чтобы обеспечить надежный статистический анализ.
- Выберите нужный подход к микроскопии пропускаемого света. Уменьшить время экспозиции или мощность лазера и время выдержки пикселей и/или увеличить диаметры точечных отверстий, чтобы свести к минимуму фотоотбеливание грибковых клеток, как описано в других местах 23,24.
- Установите микроскоп для получения изображений через нужные промежутки времени и начните сбор временных рядов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы скорректировать фокальный дрейф с течением времени (особенно для длительных экспериментов) из-за теплового дрейфа, различных размеров ячеек и движения клеток, используйте стратегию автофокусировки, если она доступна в программном обеспечении микроскопа.
5. Анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном разделе описаны ключевые этапы обработки покадровых микроскопических изображений для измерения скорости роста A. nidulans. Открытие, визуализация и обработка изображений осуществляется с помощью программного обеспечения ImageJ/Fiji с открытым исходным кодом25.
- Импортируйте изображения на Фиджи с помощью плагинов | Биоформаты | Импортер биоформатов из меню Фиджи с настройками по умолчанию(рисунок 4A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, правильно ли импортер биоформатов распознает калибровку изображения. Размер рисунка, показанный в верхнем информационном поле изображения окна, должен быть равен исходным размерам изображения(рисунок 4B). Нажмите Shift + P для отображения и изменения свойств изображения в программном обеспечении ImageJ/Fiji. - При необходимости используйте гистограмму, соответствующую26, для коррекции освещенности между различными кадрами (Image | Отрегулируйте | | коррекции отбеливателя Сопоставление гистограмм)(рисунок 4C).
- При необходимости используйте SIFT-алгоритм (Плагины | Регистрационный | Линейное выравнивание стека с помощью SIFT) для выравнивания или сопоставления стеков изображений(рисунок 4D). Выбора«Перевод»из ожидаемого меню преобразования должно быть достаточно, чтобы исправить любой дрейф x-y.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие плагины также могут использоваться для выравнивания стека фрагментов изображения, такие как Image Stabilizer (https://imagej.net/Image_Stabilizer) или StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/). - Выбирайте гифы, которые растут параллельно покрову, избегая наклоненных. Обязательно выбирайте гифы, которые распространяются полярным расширением, и избегайте гиф, представляющих боковое и / или апикальное ветвление.
- Использование MTrackJ (плагины | MTrackJ) плагин для отслеживания растущих гифтальных подсказок(рисунок 4E)27. Чтобы добавить трек, нажмите кнопку Добавить на панели инструментов и поместите первую точку на подсказку гифа левой кнопкой мыши. Временной ряд автоматически перейдет к следующему кадру. Чтобы завершить процесс отслеживания, дважды щелкните мышью на конечной точке (или нажмите клавишу Esc)(рисунок 4F). Перейдите к другой точке интереса (т.е. растущему гифальному наконечнику) в начальных временных рамках и перезапустите процедуру, измерив скорость роста другой гифы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки MTrackJ следуйте инструкциям, представленным на https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ - Нажмите кнопку Measure в диалоговом окне MTrackJ(рисунок 4G),чтобы открыть выходную таблицу. Сохранение измерений трека (Файл | Сохранить как) в нужный формат файла (например, csv), проанализировать и построить их(рисунок 4H).
ПРИМЕЧАНИЕ: При нажатии кнопки «Фильм» создается фильм, показывающий изображение и прогрессию трека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следуя этому протоколу, мы захватили и проанализировали различные изображения, соответствующие различным стадиям роста/развития нителезного гриба A. nidulans. Данные, представленные в этом исследовании, были обработаны и проанализированы с использованием программного обеспечения Fiji. Измерения были сохранены в виде csv-файлов, статистически проанализированы и подготовлены в виде графиков с использованием коммерческого статистического программного обеспечения и / или языка программирования Python с использованием программных библиотек, таких как pandas, numpy, statsmodels, matplotlib и seaborn. Более подробную информацию можно найти в цитируемых оригинальных публикациях.
Для интерпретации реакции популяций важно определить неоднородность ключевых параметров внутри популяций и эффективно идентифицировать физиологически различные субпопуляции28. На фиг.5 показан рост мутантного штамма azhAΔ ngnAΔ, несущего делеции в двух генах, продукты которых участвуют в детоксикации и усвоении токсичного фитопродукта L-азетидина-2-карбоновой кислоты29,по сравнению со штаммом WT. Измеряя скорость их роста в погруженных жидких культурах, мы обнаруживаем статистически значимую более низкую скорость роста двойного мутанта по сравнению со штаммом WT (t(715) = 20,61, p = <0001)(рисунок 5A-B). Эта разница в росте не была обнаружена, измеряя только площадь колонии этих штаммов(рисунок 5C-D),подчеркивая, что микроскопический анализ одиночных клеток более эффективен при определении небольших различий в скоростях роста, которые трудно обнаружить при макроскопическом наблюдении за колонией.
Одноклеточная долгосрочная живая визуализация имеет важное значение в усилиях по получению пространственной и временной информации о динамике клеточного белка. Долгосрочная визуализация живых клеток(Рисунок 6,Видео 1)конидиальной прорастания, совместно экспрессирующей меченый GFP основной эисосомальный белок PilA и гистон mRFP H1, показывает, что PilA30 образует статические структуры с низкой подвижностью на грибковой плазматической мембране31,32. Кроме того, на рисунке 7 показано, что флуоресцентные красители могут быть использованы для живой визуализации штаммов, выращенных на агаровидной среде, с целью изучения динамики органелл и клеточных структур. Здесь FM4-6433 использовался для визуализации митохондриальной сети и вакуолярной системы у A. nidulans.
Рисунок 1:Схематическое изображение процедуры приготовления инокулятов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Схематическое представление процедуры, выполненной для визуализации нитевидных грибов, растущих на агартовой среде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Схематическое представление процедуры, выполненной для визуализации нитевидных грибов, растущих в жидкой среде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Схематическое представление процедуры анализа изображений. Этапы обработки покадровых микроскопических изображений и измерения скорости роста A. nidulans. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Сравнение традиционных измерений популяции с измерениями одной клетки. (A) Репрезентативные конфокальные микроскопические изображения штаммов azhAΔ ngnAΔ с двойным делецией и WT, выращенных в погруженных жидких культурах, содержащих мочевину в качестве единственного источника азота при 25 °C. Все штаммы инкубировали в общей сложности 18 ч при 25 °C, а рамки захватывали с интервалом в 15 минут. Изображения 2048 × 2048 пикселей были собраны с размером пикселя 115,02 x 115,02 нм с помощью микроскопа TCS SP8 MP (Leica, Германия), оснащенного масляным погружным объективом HC Plan APO 63x, N.A. 1.40. (B)Измерения(A)строятся на участках с коробкой и усами. Статистическая значимость была проанализирована с помощью t-Test и изображена звездочками (***), указывающими на p < 0,001. (C)Рост при 25 °C WT и двойное удаление деформации на твердом ММ. Колонии фотографировали на разных временных интервалах (18 ч, 36 ч и 72 ч), пространственно калибровали и измеряли вручную с помощью линейки в программе ImageJ. (D)Измерения площади колоний, представленные в(C),строятся в виде участков с коробчатыми и усами. Различия площади колоний не были статистически значимыми между различными временными точками двойного мутанта по сравнению со штаммом WT (18h: t(8) = 0,69, p = 0,50, 36h: t(6) = 0,27, p = 0,5068, 72h: t(6) = 0,39, p = 0,70). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Долгосрочная визуализация живых клеток конидиальной прорастания, совместно экспрессируя интересующие белки, слитые с генетически закодированными флуоресцентными метками. (A)Проекции максимальной интенсивности (MIP) 4 срезов, генерируемых в плоскости z, штамма, совместно экспрессирующих PilA-GFP и H1-mRFP. Конидии были обнаружены на агаровой среде и инкубированы в течение примерно 1 ч при 30 °C, чтобы помочь адгезии клеток к агару. Блок агара, содержащий конидии, нарезали, помещали в колодцы μ-слайда и инкубировали в общей сложности 18 ч при 30 °C. Кадры снимались с интервалом в 25 минут с помощью микроскопа TCS SP8 MP (Leica, Германия), оснащенного масляным погружным объективом HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 (с размером пикселя 92,26 x 92,26 нм). Изображения были получены путем возбуждения GFP на длине волны 488 нм и обнаружения флуоресценции в спектральной полосе в диапазоне от 495 до 558 нм, а также путем возбуждения mRFP на длине волны 561 нм и обнаружения флуоресценции в спектральной полосе в диапазоне от 580 до 660 нм. (B) Измерения (скорость прорастания и расширение гифального кончика) (A) строятся в виде линейного графика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7:FM4-64 маркировка гиф, растущих на твердой среде. Конидии штамма WT культивировали на 1% чашках агара ММ Петри в течение 16 ч при 30 °C. Растущие зародыши инкубировали в течение 20 мин с 10 мкл ММ, содержащими 10 мкМ FM4-64. После инкубации блок агара, содержащий окрашенные зародыши, вырезали, помещали в 8 μ-слайд с последующей 47-минутной погоней при 30 °C. Кадры снимались каждые 7 мин при 30 °C с помощью микроскопа TCS SP8 MP, оснащенного масляным погружным объективом HC Plan APO 63x, N.A. 1.40 (с размером пикселя 184,52 x 184,52 нм). Изображения были получены с помощью возбуждающего FM4-64 на длине волны 514 нм и обнаружения флуоресценции в спектральной полосе в диапазоне от 596 до 682 нм. Флуоресцентный сигнал FM4-64 отображается как перевернутое изображение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8:Ранние стадии образования конидиофоров. (А) Конидии штамма WT культивировали на ага роевой среде в течение 136 ч при 30 °C, нарезали и помещали в колодцы μ-слайда. Кадры снимались каждые 20 минут. Изображения 2048 × 2048 пикселей были собраны с размером пикселя 245,2 x 245,2 нм с помощью микроскопа TCS SP8 MP (Leica, Германия), оснащенного масляным погружным объективом HC Plan APO 63x, N.A. 1.40. Изображения показывают образование везикул конидиофора (черная стрелка), а также образование (коричневая стрелка) и созревание метул (синяя стрелка). (B)Измерения (скорость прорастания и однополярное расширение гифального кончика) (A) строятся в виде линейного графика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Долгосрочная визуализация живых клеток конидиальной прорастания, совместно экспрессирующей PilA-GFP и H1-mRFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Ранние стадии образования конидиофоров у A. nidulans. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Рисунок S1: Приготовление конидиальной суспензии. Путем выскабливания стерильной зубочисткой приблизительно 1см2 поверхности конидированной пластины получают суспензию приблизительно 2 х10 6 конидий/мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мониторинг роста и фенотипа грибковых клеток с помощью покадровой микроскопии является мощным подходом к оценке клеточного поведения в режиме реального времени и количественно и точно определить, приводит ли конкретное лекарственное лечение и / или генетическое вмешательство к обнаруживаемому росту клеток или фенотипическим различиям с течением времени.
В этом исследовании была описана надежная методология визуализации живых клеток для измерения и количественного анализа развития грибков, включая динамику роста зародышевой трубки и гифального кончика у A. nidulans. Мониторинг морфологических изменений с течением времени с использованием методов микроскопии с передаваемым светом может быть очень полезен для выявления клеток, которые находятся в стрессе, умирают или мертвы. Детальное знание таких динамических процессов на одноклеточном уровне позволяет оценить гетерогенность в смешанной популяции клеток и в долгосрочной перспективе позволяет идентифицировать пути и детальные механизмы, с помощью которых клетки реагируют на эндогенные и экологические сигналы.
Одним из преимуществ этого метода является то, что он основан на подходе к визуализации без меток (который, тем не менее, может быть легко объединен с флуоресцентной микроскопией), который использует присущие клеткам свойства преломления света для создания контраста изображения без введения красителей / меток, что может спутать результаты. В то время как флуоресцентные маркеры могут использоваться для маркировки клеточных компартментов и белков и значительно облегчают сегментацию и отслеживание клеток, прошедшие световые микроскопии обходят необходимость в генетически модифицированных клетках, позволяя исследователям избежать дорогостоящей и трудоемкой оптимизации красителя / метки, а также избежать вероятных эффектов фототоксичности, исходящих от флуоресцентной визуализации13,34.
Этот протокол подходит для изучения кинетики роста грибов, образующих гифы или псевдогифы. Кроме того, этот подход очень подходит для визуализации различных клеточных структур разных штаммов и на разных стадиях развития. На рисунке 8 и видео 2 мы представляем начальные стадии развития конидиофора A. nidulans (т.е. структур, несущих бесполазые споры). Следует, однако, отметить, что этот метод не является наиболее подходящим для визуализации образования конидиофоров, поскольку голодание углерода / азота и воздействие воздуха, необходимые для развития конидиофоров, не могут быть стандартизировано нашим подходом35.
Кроме того, этот протокол плохо подходит для отслеживания грибковых биопленок, которые подвержены вертикальному расширению, образуя плотную гетерогенную, поверхностно-ассоциированную колонию, состоящую из нитевидных гиф, псевдогифальных клеток, дрожжевых клеток и различных форм внеклеточного матрикса36. Другим ограничением метода является то, что, хотя безлимиковый микроскопический анализ представляет собой точный метод качественного и количественного анализа динамики прорастания/дифференцировки, ручная оценка таких данных занимает много времени, особенно при изучении многих штаммов и/или условий. Таким образом, данные высокопроизводительной покадровой визуализационной микроскопии должны анализироваться с помощью подходящего вычислительного программного обеспечения, позволяющего автоматизировать или полуавтоматический анализ изображений развития гифы и конидиальной прорастания37,38,39.
Таким образом, здесь мы представляем протокол для анализа кинетики роста грибков воспроизводимым и надежным способом без необходимости какого-либо предварительного опыта анализа изображений от пользователя. Этот протокол позволяет объективно и точно количественно оценить рост и дифференциацию грибков и обеспечивает дополнительный подход к визуализации для изучения жизненных циклов грибков и патогенности грибов37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана проектом «Греческая исследовательская инфраструктура для визуализации и мониторинга фундаментальных биологических процессов (BioImaging-GR)» (MIS 5002755), который реализуется в рамках акции «Укрепление научно-исследовательской и инновационной инфраструктуры», финансируемой Оперативной программой «Конкурентоспособность, предпринимательство и инновации» (NSRF 2014-2020) и софинансируемой Грецией и ЕС.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali - Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali - Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
References
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C.
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H.
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F.
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
