Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Маркировка внеклеточных везикул для мониторинга миграции и поглощения в хрящевых эксплантатах

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62780
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2,4, 1,2,4, 1,2, 1,2
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Cellomics Unit, Institut Universitari d'Investigació en Ciències de la Salut (IUNICS), Universitat de les Illes Balears, 4Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB)

Summary

Здесь мы представляем протокол для маркировки внеклеточных везикул, полученных из лизата тромбоцитов, для мониторинга их миграции и поглощения в хрящевых эксплантатах, используемых в качестве модели остеоартрита.

Abstract

Внеклеточные везикулы (EV) используются в различных исследованиях, чтобы доказать их потенциал в качестве бесклеточного лечения из-за их груза, полученного из их клеточного источника, такого как лизат тромбоцитов (PL). При использовании в качестве лечения ожидается, что EV попадут в клетки-мишени и вызовут ответ от них. В этом исследовании PL-производные EV были изучены как бесклеточное лечение остеоартрита (ОА). Таким образом, был создан метод маркировки электромобилей и проверки их поглощения на хрящевых эксплантатах. PL-производные EV маркируются липофильным красителем PKH26, дважды промывают через столбец, а затем тестируют в модели ОА in vitro, управляемой воспалением, в течение 5 ч после количественной оценки частиц анализом отслеживания наночастиц (NTA). Ежечасно экспланты хряща фиксируют, парафинируют, разрезают на участки по 6 мкм для крепления на слайдах и наблюдают под конфокальным микроскопом. Это позволяет проверить, попадают ли EV в клетки-мишени (хондроциты) в этот период и проанализировать их прямое действие.

Introduction

Остеоартроз (ОА) – суставное дегенеративное заболевание, подразумевающее прогрессирующее и необратимое воспаление и разрушение внеклеточного матрикса суставногохряща1. Хотя различные формы артрита имеют многочисленные методылечения 2,3,4,они ограничены своими побочными эффектами и ограниченной эффективностью. Методы тканевой инженерии с использованием аутологичной имплантации хондроцитов обычно применяются для регенеративного лечения поврежденного хряща при ранних поражениях хрящаОА4. Клеточная терапия ограничена в основном из-за ограниченного количества фенотипически стабильных хондроцитов или хондропрогениторов, способных эффективно восстанавливать хрящ3. Поэтому разработка новых терапевтических стратегий для предотвращения прогрессирования заболевания и регенерации крупных поражений хряща имеет первостепенное значение.

Внеклеточные везикулы (EV) были предложены в качестве лечения ОА разными авторами5,6. EV представляют собой мембранные тела, секретируемые большинством типов клеток, участвуют в межклеточной сигнализации и, как было показано, оказывают терапевтическое воздействие стволовых клеток7,8,9,из-за чего они недавно вызвали интерес к регенеративной медицине10. EV, полученные из мезенхимальных стромальных клеток (МСК), являются основными терапевтическими EV, исследуемыми для ОА, хотя другие связанные с суставами клетки использовались в качестве источников EV, например, хондропрогениторы или иммунные клетки11,12.

Концентраты тромбоцитов, такие как лизаты тромбоцитов (PL), используются для улучшения заживления ран при различных травмах, таких как язвы роговицы13,14,15 или при регенерации ткани сухожилия16,из-за гипотезы о том, что компонент EV концентратов тромбоцитов может быть ответственен за эти эффекты17 . Некоторые исследования, связанные с заболеваниями, связанными с суставами, используют тромбоцитарные EV (PL-EV) в качестве лечения для улучшения остеоартритных состояний. PL-EV улучшают пролиферацию хондроцитов и миграцию клеток, активируя Wnt/β-катениновыйпуть 18,способствуя экспрессии хондрогенных маркеров в остеоартритных хондроцитах19или показывая более высокие уровни хондрогенных белков и меньшее количество тиссулярных аномалий у остеоартритных кроликов, получавших PL-EV18.

EV содержат белки, липиды и нуклеиновые кислоты, которые высвобождаются в клетку-мишень, устанавливая межклеточную связь, что является основной особенностью, связанной с их терапевтическим применением20. Эффекты электромобилей зависят от их достижения клеток и последующего высвобождения груза. Этот эффект может быть косвенно подтвержден изменениями, вызванными в клетках, такими как метаболическая активность или модификация экспрессии генов. Однако эти методы не позволяют визуализировать то, как электромобили достигают клеток, чтобы выполнять свою функцию. Таким образом, в этой статье представлен метод маркировки этих PL-производных EV для использования в качестве лечения эксплантов хряща ОА, вызванных воспалением. Конфокальная микроскопия использовалась для мониторинга поглощения и прогрессирования EV к хондроцитам, присутствующим в эксплантатах, в течение 5 ч.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспланты хряща были получены из биобанка IdISBa (IB 1995/12 BIO) в соответствии с институциональными руководящими принципами после этического одобрения проекта CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Подготовка колонны

  1. Уравновешивайте колонны в соответствии с инструкциями производителя или следующим образом:
    1. Снимите колпачок столбца и уравновесьте его. Удалите буфер хранилища путем элюирования.
    2. Промыть колонну 3 раза 2,5 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Во время каждой стирки ждите, пока колонна впитает весь объем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не давайте колонке высохнуть.
    3. Накройте колонну колпачком после последней промывки и до пробоподготовки.

2. Маркировка электромобилей

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол маркировки EV использует образец PL-EV, ранее выделенный с помощью хроматографии исключения размера (SEC) с ранее описаннымиусловиями21,22. Тем не менее, любой образец EV из любого источника может быть использован с этим протоколом.

  1. Сконцентрируйте образец EV и контроль (PBS) с помощью концентрирующей трубки.
    1. Поместите образцы в концентрирующую трубку объемом 15 мл или 500 мкл в зависимости от начального объема исходного образца EV. Центрифугируйте пробирки в соответствии с инструкциями производителя до тех пор, пока не будет получен почти сухой образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольный образец необходим для проверки любого фона красителя. Хотя этот метод не требует какого-либо конкретного начального объема, следует учитывать, что около 10% частиц будет потеряно на этапах очистки.
  2. Повторно суспендировать концентрированные образцы с разбавителем C. Повторно суспендировать образцы EV с 200 мкл и контрольную группу со 100 мкл и перенести их в новые центрифужные трубки объемом 1,5 мл.
  3. Разделите образец EV на две аликвоты по 100 мкл. Отметьте одну красителем и используйте ее в качестве лечения (PKH-PL-EV); оставьте другой немаркированным, но обработайте его (NTA-PL-EV), как образец EV, и используйте его для количественной оценки концентрации EV по NTA.
  4. Готовят 2-кратный раствор красителя, в результате чего получается 8 мкМ раствора PKH26 в разбавителе С.
  5. Смешайте 1 мкл 1 мМ линкера PKH26 на 125 мкл разбавителя С в образце. Подготовьте объем, необходимый для добавления к образцам в соотношении 1:1.
  6. Добавьте 2-кратный раствор красителя в PKH-PL-EV и контрольные образцы в соотношении 1:1 для достижения 1-кратной концентрации красителя и концентрации PKH26 4 мкМ. Добавьте тот же объем PBS в образец NTA-PL-EV. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  7. Добавьте 5% раствор альбумина-PBS из бычьей сыворотки в образцы в соотношении 1:1 и убедитесь, что конечный объем составляет ~400 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет удалить неспецифические взаимодействия красителей или несвязанных красителей.
  8. Приступайте к отделению меченых электромобилей от несвязанного красителя и неспецифических взаимодействий красителя с колонкой.

3. Маркировка-EV изоляция

  1. Снимите колпачок с колонны, добавьте 400 мкл образца (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV или контрольный) и выбросьте всю элюированную жидкость.
  2. Подождите, пока образец полностью войдет в столбец, прежде чем переходить к следующему шагу. Добавьте 600 мкл PBS и выбросьте всю элюированную жидкость.
  3. Подождите, пока PBS полностью войдет в столбец, прежде чем переходить к следующему шагу. Добавьте 600 мкл PBS и соберите фракцию 600 мкл в 1,5. mL центрифужная трубка (EV или контроль).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги необходимы для удаления излишков красителя из образцов. Еще одно разделение по столбцам необходимо для получения более чистых электромобилей. Таким образом, следующие шаги должны быть выполнены в новой уравновешенной колонке (этап 4.1.) или той же колонке после начальной стадии промывки (стадия 4.2).
  4. Подготовьте столбец к новому этапу разделения электромобилей, чтобы получить более чистые электромобили. Если это новый столбец, повторите шаги 2.1. и 2.2. Если это одна и та же колонка, промыть колонну 2,5 мл 20% изопропанола, а затем повторить шаги 2.1 и 2.2.
  5. Добавьте в колонку 600 мкл ранее элюированных EV, полученных на этапе 2.5, и отбросьте элюированный объем. Подождите, пока жидкость полностью войдет в колонну, прежде чем переходить к следующему шагу.
  6. Добавьте 400 мкл PBS и отбросьте весь элюированный объем. Подождите, пока жидкость полностью войдет в колонну, прежде чем переходить к следующему шагу.
  7. Добавьте 600 мкл PBS и соберите фракцию 600 мкл в 1,5 мл центрифужной трубки. Используйте электромобили и контрольные образцы для дальнейшего анализа или храните их на ночь при температуре 4 oC.
  8. Сохраните использованные столбцы для дальнейшего использования.
    1. Вымойте колонку 25 мл 20% изопропанола и отбросьте элюированный объем. Промыть колонку 3 раза 2,5 мл PBS.
    2. Добавьте буфер хранилища, удаленный на шаге 1.1.1, и дождитесь, пока буфер войдет в столбец. Накройте колонну колпачком и храните при 4 oC до последующего использования.

4. Количественная оценка EV

  1. Подготовьте 1:1000 разбавлений образца NTA-PL-EV и исходного образца PL-EV, как описано следующими двумя шагами.
    1. Приготовьте 1 мл 1:10 разбавленного NTA-PL-EV и 1 мл 1:10 разбавленного исходного PL-EV с PBS, отфильтрованным через фильтр 0,2 мкм.
    2. Подготовьте 1 мл разбавления 1:100 предыдущих разбавленных образцов с PBS, отфильтрованным через фильтр 0,2 мкм.
  2. Введите 1:1000 разбавленный образец NTA-PL-EV или исходный образец PL-EV с помощью стерильного шприца в насос NTA. Следуйте инструкциям и рекомендациям производителя по определению концентрации частиц и распределения по размерам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку концентрация EV зависит от объема стартера образца, может потребоваться считывание промежуточных разрежений и внесение корректировок для получения правильного определения NTA.

5. Электромобили, используемые в качестве лечения ОА, вызванного воспалением

  1. Дважды промыть хрящ PBS и иссечь его с помощью биопсийного перфоратора диаметром 3 мм в стерильных условиях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуру с шагов с 5.1 по 5.6 в вытяжке клеточной культуры.
  2. Поместите экспланты в 96-луночные культуральные пластины со средой DMEM-F12, дополненной 1% пенициллин-стрептомицином при 37 oC, 5% CO2и влажности 80%.
    1. Чтобы установить модель ОА, основанную на воспалении, дополните среду клеточного культивирования 10 нг / мл онкостатина М и 2 нг / мл фактора некроза опухоли-альфа (TNFα).
  3. Обработайте экспланты 1 × 109 частиц / лунку меченых EV (PKH-PL-EV) или контрольный в среде клеточной культуры, дополненной онкостатином M и TNFα.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте объем образца, содержащего 1 × 109 частиц на лунку, и используйте тот же объем для контроля.
  4. Удалите среду из 96-луночных пластин для культивирования клеток, содержащих хрящевые экспланты. Добавляйте 200 мкл клеточной культуральной среды, описанной на стадии 5,3, в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если 96-луночные пластины контактировали с фетальной бычьей сывороткой (FBS), промыть каждую лунку три раза 200 мкл PBS, чтобы удалить любые EV из FBS.
  5. Прекращайте анализ in vitro в разное время: 0, 1, 2, 3, 4 и 5 ч.
  6. Промыть клетки культуры колодцами, содержащими экспланты хряща, дважды с 200 мкл PBS.
  7. Добавьте 100 мкл 4% параформальдегида (PFA) в ткань, чтобы зафиксировать его в течение 3 ч при 4 oC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы, связанные с ПФА, должны выполняться в вытяжном шкафу в соответствии с рекомендациями Паспорта безопасности.
  8. Удалите PFA, добавьте 100 мкл PBS, сохраните фиксированную ткань при 4 °C и обработайте образцы в течение 48 часов.

6. Подготовка и визуализация микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта гистологическая процедура состоит из обезвоживания, встраивания парафина и этапов регидратации. Эти шаги могут снизить общую флуоресценцию красителя (ограничение, упомянутое в техническом описании PKH26). Поэтому другие процедуры, такие как замороженное сечение, могут быть более подходящими для визуализации EV с помощью конфокальной микроскопии.

  1. Встраивайте неподвижные ткани в парафиновые блоки. Разрежьте ткань на участки толщиной 6 мкм.
  2. Депарафинизируют участки тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги с использованием ксилола должны выполняться в вытяжной вытяжке.
    1. Погружайте участки ткани в ксилол на 30 мин, 100% этанол на 2 мин, 96% этанол на 2 мин, 75% этанол на 1 мин и, наконец, в дистиллированную воду на 30 с.
  3. Пермеабилизируют участки тканей.
    1. Готовят 0,1% раствор тритона-0,1% цитрата натрия для пермеабилизации тканей. Добавьте каплю 20 мкл к каждому участку ткани и инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре. Дважды вымойте каждую секцию 20 мкл PBS.
  4. На микроскопический слайд добавьте каплю монтажной среды, содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) с водной монтажной средой для сохранения флуоресценции. Закройте слайд, содержащий 3 участка ткани из шага 6.3.1.
  5. Инкубируйте горки на ночь при комнатной температуре, защищенной от света.
  6. Хранить при температуре 4 °C, защищенном от света до конфокальной микроскопии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схематический обзор маркировки и мониторинга поглощения электромобилей показан на рисунке 1. Концентрация частиц и размер EV, обнаруженные NTA в таблице 1, показывают, что концентрация EV уменьшается во время процесса из-за стадии очистки, выполненной дважды после маркировки колонкой. Однако полученное количество находится в оптимальном диапазоне количества частиц для использования для лечения. Эта концентрация частиц используется для расчета объема PKH-PL-EV и контроля, которые используются для лечения остеоартритных эксплантов хряща.

После того, как экспланты хряща обрабатываются EV или контрольной группой, они фиксируются на разные периоды: 0, 1, 2, 3, 4 и 5 ч. Затем каждую группу парафинизируют, нарезают и готовят к конфокальной микроскопии монтажной средой, содержащей DAPI. Репрезентативные изображения для каждой группы в каждый момент времени представлены на рисунке 2,показывая, как EV входят в ткань, пока они не достигнут хондроцитов и не войдут в них с течением времени.

Как видно на рисунке 2,меченые EV уже локализованы вокруг хондроцитов (показаны синим цветом с окрашиванием DAPI) после 1 ч инкубации (показаны красным цветом с красителем PKH26). Некоторый фон из-за остаточного красителя может наблюдаться для контрольной группы, которая не имеет электромобилей, но обрабатывается по тому же протоколу, что и образец EV. Эти результаты подтверждают успех протокола маркировки электромобилей, который может быть использован для мониторинга их миграции через анализы in vitro в тканях, как показано здесь, и в экспериментах in vivo.

Figure 1
Рисунок 1:Схематический обзор протокола маркировки и мониторинга поглощения электромобилей. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; EV = внеклеточный везикул; RT = комнатная температура; BSA = бычий сывороточный альбумин; NTA = анализ отслеживания наночастиц; ОА = остеоартроз; TNFα = фактор некроза опухоли-альфа; PL = лизат тромбоцитов; PFA = параформальдегид; DAPI = 4′,6-диамидин-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Репрезентативные изображения поглощения электромобилей в разное время. Конфокальные репрезентативные изображения, полученные через 0, 1, 2, 3, 4 и 5 ч эксплантантов остеоартритного хряща, инкубированных с мечеными PKH EV или с контрольной группой. Снимки были сделаны в 400x. Шкала стержней = 50 мкм. Сокращения: ОА = остеоартроз; PL = лизат тромбоцитов; EV = внеклеточный везикул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Концентрация (частицы/мл) Размер частиц (нм)
PL-EV (начальные) 3.03 × 1011 134.0
NTA-PL-EV без PKH26 (после протокола) 8.30 × 1010 132.0

Таблица 1: Характеристика путем анализа отслеживания наночастиц. Сокращения: ОА = остеоартроз; PL = лизат тромбоцитов; EV = внеклеточный везикул; NTA = анализ отслеживания наночастиц.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Визуализация EV помогает понять свойства EV, такие как механизмы их высвобождения и поглощения. Их визуализация позволяет контролировать их биораспределение и характеризовать их фармакокинетические свойства как лекарственные средства. Тем не менее, визуализация и отслеживание электромобилей могут быть затруднены из-за их небольших размеров, хотя многие устройства визуализации и методы маркировки были разработаны, чтобы помочь исследователям контролировать электромобили в условиях in vitro и in vivo 23,24,25.

При отслеживании электромобилей с помощью оптической микроскопии существуют две возможности: биолюминесценция и флуоресцентная визуализация. Оба используются для обнаружения электромобилей в спектре видимого света (390-700 нм). Биолюминесценция — это тип хемилюминесценции, образующийся после того, как люцифераза катализирует окисление своего субстрата. Хотя этот сигнал требует сверхчувствительной камеры с зарядовой связью (ПЗС) для обнаружения, он имеет высокое отношение сигнал/шум, поскольку сигнал не требует внешнего источника света26.

Флуоресцентная визуализация использует белки или органические красители, которые излучают сигналы после возбуждения от внешнего источника света. По сравнению с биолюминесценцией, флуоресценцию легче обнаружить с помощью ПЗС-камеры. Кроме того, при биолюминесценции токсичность субстрата и период полураспада биолюминесценции субстрата должны учитываться для отслеживания EV в режиме реальноговремени 27,28.

Напротив, флуоресцентная маркировка на основе белка и органического красителя использовалась с отличным разрешением в оптической микроскопии. Хотя интенсивность флуоресценции зависит от уровней экспрессии белка EV, эффективности маркировки EV в мембранных доменах и источника света возбуждения, флуоресцентные красители обеспечивают стабильные и сильные сигналы для визуализации EV25. Большинство органических флуоресцентных красителей первоначально использовались для визуализации клеточных мембран. Эти красители обычно объединяют флуорофоры, которые маркируют липидный бислой или белки, представляющие интерес на ЭЛЕКТРОМОБИЛЯх, через различные функциональные группы29.

Одним из семейств органических флуоресцентных красителей является семейство липофильных красителей PKH, состоящее из флуорофоров с липофильным карбоцианином, который закрепляется в липидном бислое для флуоресцентной визуализации30,31. Красители PKH использовались для исследований in vitro и in vivo, поскольку их период полувыведения in vivo колеблется от 5 до >100 дней. Таким образом, стойкость красителя in vivo может привести к вводящим в заблуждение результатам в исследованиях более короткой продолжительности, чем период полураспада красителя. Тем не менее, красители PKH полезны в качестве индикаторов, чтобы показать миграцию EV32.

PKH26 является членом этого семейства липофильных флуорофоров PKH, обнаруженных в красном спектре с пиком возбуждения при 551 нм и излучением при 567 нм. Это делает его совместимым с другими каналами обнаружения, такими как родамин, фикоэритрин или DAPI33,что позволяет обнаруживать в этом случае миграцию EV, отмеченных PKH26, к хондроцитам, отмеченным DAPI. Важно отметить, что, хотя PL использовался здесь в качестве источника EV, этот протокол может использоваться с электромобилями из других источников и для других целей, например, для отслеживания маркированного распределения ev in vivo.

Этот протокол имеет некоторые ограничения; например, есть некоторые опасения, что PKH26 увеличивает размер EV, что может повлиять на их биораспределение и поглощение клеток. Однако в таких случаях, когда размер EV был увеличен PKH26, процедура маркировки отличалась от описанной в этомпротоколе 34. Эти исследователи не включили этапы промывки и очистки, что привело к более высоким уровням свободного красителя, что может привести к увеличению размера EV. Более того, настоящий протокол преодолевает эту проблему, выполняя параллельную очистку EV с PKH26 и без него. Это позволяет охарактеризовать немаркированный образец EV, который был обработан идентично маркированному образцу. Таким образом, можно избежать вводящей в заблуждение количественной оценки из-за смешивания неспецифически меченых частиц (липопротеинов или белковых загрязнителей образца) или из-за присутствия частиц, не являющихся EV, в маркировочной смеси, как было продемонстрированоранее 35,36.

В данной работе два цикла очистки были выполнены методом размерной эксклюзионной хроматографии с использованием колонок. Первый может быть заменен центрифугированием градиента сахарозы. Однако все популяции EV были собраны в одну и ту же элюированную аликвоту с этой колонкой и не подвергались воздействию высоких g-сил, встречающихся при высокоскоростном центрифугировании. Однако отказ от центрифугирования может привести к замедлению процесса, особенно если между циклами разделения требуется промывка колонн. Другим ограничением этого протокола является необходимость концентрации образца перед началом процесса маркировки из-за ограниченного объема колонны. Это препятствие может быть преодолено с помощью колонн с более высокой грузоподъемностью.

Другие протоколы маркировки ЭЛЕКТРОМОБИЛей описывают использование различных красителей; однако их использование ступеней ультрацентрифугирования может повредить целостность EV37. Протокол, описанный здесь, позволил легко контролировать миграцию и поглощение EV в хрящевых эксплантатах с помощью конфокального микроскопа без какой-либо конкретной функции. Кроме того, это может быть экстраполировано на другие ткани и липидные образцы или состояния, такие как анализ in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Это исследование финансировалось Институтом спасения Карлоса III, Министерством экономики и конкуренции, совместно финансируемым Европейским социальным фондом ESF и Европейским фондом регионального развития ERDF (MS16/00124; СР16/00124); ПРОГРАММОЙ JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), финансируемой за счет налога на устойчивый туризм Балеарских островов; Генеральным директором по расследованиям, Консультативным советом по расследованию, Управляющим Балеаром (FPI/2046/2017); постдокторской программой FOLIUM (FOLIUM 17/01) в рамках FUTURMed, финансируемой под 50% за счет налога на устойчивый туризм Балеарских островов и под 50% от ESF; и Комитетом по расследованию и расследованию Банковского фонда санга и безопасности Балеарских болезней (CDI21/03).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
1.5 mL Centrifuge tube SPL life sciences PLC60015
1 mL Syringe BD Plastipak BD 303174
2-Propanol (Isopropanol) Panreac AppliChem 1.310.901.211 Prepared at 20% with Milli-Q water
96-well culture plate SPL life sciences PLC30096
Absolute ethanol Pharmpur Scharlab ET0006005P Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water
Biopsy Punch with plunger 3 mm Scandidact MTP-33-32
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Prepared at 5% with PBS
Cartilage explants IdISBa Biobank
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega Pall MCP100C41
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega Pall OD003C33
Cover glass 24 x 60 mm Deltalab D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX medium Biowest L0092
Dulbecco's PBS (1x) Capricorn Scientific PBS-1A
Embedded paraffin tissue blocks IdISBa Biobank Fee for service
Exo-spin mini-HD columns Cell guidance systems EX05
Feather S35 Microtome Blade Feather 43037
Filtropur S 0.2 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F-6057
Oncostatin M Human Sigma-Aldrich O9635-10UG Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 8.18715.1000 Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Solution 100x Biowest L0022
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma-Aldrich MINI26 PKH26 and Dliuent C included
Sodium citrate dihydrate Scharlab SO019911000
Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
TNFα R&D systems 210-TA-005 Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water
Xylene Scharlab XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R Eppendorf 5428000210 F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300 Malvern NS300 Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual Microtome Thermo Scientific™ A78100101
TCS-SPE confocal microscope Leica Microsystems 5200000271

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
  2. Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
  3. Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
  4. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  5. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  6. Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
  8. Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
  9. Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
  10. Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
  11. D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
  12. Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
  13. El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
  14. Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
  15. Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, Suppl. 1 289-292 (2007).
  16. Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
  17. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
  18. Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
  19. Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
  20. Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
  21. Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
  22. de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  23. Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
  24. Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
  25. Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
  26. Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
  27. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
  28. Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
  29. Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
  30. Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
  31. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  32. Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
  33. Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
  34. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
  35. Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  36. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
  37. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).

Tags

Биоинженерия выпуск 176
Маркировка внеклеточных везикул для мониторинга миграции и поглощения в хрящевых эксплантатах
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Forteza-Genestra, M. A.,… More

Forteza-Genestra, M. A., Antich-Rosselló, M., Ortega, F. G., Ramis-Munar, G., Calvo, J., Gayà, A., Monjo, M., Ramis, J. M. Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (176), e62780, doi:10.3791/62780 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter