Summary
Burada, osteoartrit için model olarak kullanılan kıkırdak eksplantlarında göçlerini ve alımlarını izlemek için trombositten türetilmiş hücre dışı veziklikleri etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Hücre dışı veziklinler (EV'ler), trombosit lisat (PL) gibi hücresel kaynaklarından elde edilen kargoları nedeniyle hücresiz bir tedavi olarak potansiyellerini kanıtlamak için farklı çalışmalarda kullanılır. Tedavi olarak kullanıldığında, EV'lerin hedef hücrelere girmesi ve bunlardan bir yanıt etkilemesi beklenir. Bu araştırmada PL türevli EV'ler osteoartrit (OA) için hücresiz bir tedavi olarak incelenmiştir. Böylece, EV'leri etiketlemek ve kıkırdak eksplantları üzerinde alımlarını test etmek için bir yöntem kuruldu. PL türevli EV'ler lipofilik boya PKH26 ile etiketlenir, bir sütundan iki kez yıkanır ve daha sonra nanopartikül izleme analizi (NTA) ile parçacık nicelesinden sonra 5 saat boyunca in vitro inflamasyon tahrikli bir OA modelinde test edilir. Saatlik olarak, kıkırdak eksplantları sabitlenir, parafinlenir, slaytlara monte etmek için 6 μm bölümlere kesilir ve konfokal mikroskop altında gözlemlenir. Bu, EV'lerin bu süre zarfında hedef hücrelere (kondrositler) girip girmediğinin doğrulanmasına ve doğrudan etkilerinin analiz edilip edilmediğinin doğrulanmasına olanak tanır.
Introduction
Osteoartrit (OA), eklem kıkırdaklının hücre dışı matrisinin ilerleyici ve geri dönüşü olmayan bir iltihaplanma ve yok edilmesi anlamına gelen eklem dejeneratif bir hastalıktır1. Çeşitli artrit formları çok sayıda tedaviye sahip olmasına rağmen2,3,4, bunlar yan etkileri ve sınırlı etkinliği ile kısıtlanır. Erken OA kıkırdak lezyonlarında yaralı kıkırdağın rejeneratif tedavisi için otolog kondrosit implantasyonu kullanılarak doku mühendisliği teknikleri rutin olarak uygulanmaktadır4. Hücre bazlı tedaviler esas olarak kıkırdağı etkili bir şekilde onarabilen fenotipik olarak stabil kondrositlerin veya kondroprogogenitatörlerin sınırlı sayıda nedeniyle kısıtlanır3. Bu nedenle, hastalığın ilerlemesini önlemek ve büyük kıkırdak lezyonlarını yenilemek için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi son derece önemlidir.
Hücre dışı veziklinler (EV' ler) farklı yazarlar tarafından OA için bir tedavi olarak önerilmiştir5,6. EV'ler hücre tiplerinin çoğunluğu tarafından salgılanan membranöz cisimlerdir, hücreler arası sinyalizasyonda yer almaktadır ve kök hücrelerin terapötik etkilerini7,8,9, son zamanlarda rejeneratif tıbba ilgi uyandırdıkları gösterilmiştir10. Mezenkimal stromal hücrelerden (MSC) elde edilen EV'ler, OA için araştırılan ana terapötik EV'lerdir, ancak diğer eklemle ilişkili hücreler EV kaynakları olarak kullanılmıştır, örneğin, kondroprogenitörler veya bağışıklık hücreleri11,12.
Trombosit lizazları (PL' ler) gibi trombosit konsantreleri, kornea ülserleri13 , 14,15veya tendon dokusu rejenerasyon16 gibi farklı yaralanmalarda yara iyileşmesini arttırmak için kullanılır, çünkü trombosit konsantrelerinin EV bileşeninin bu etkilerden sorumlu olabileceği hipotezi nedeniyle17 . Eklemle ilgili hastalıklarla ilgili bazı çalışmalar osteoartrit koşullarını iyileştirmek için tedavi olarak trombosit türevli EV'ler (PL-EV' ler) kullanmaktadır. PL-EV'ler, osteoarthride kondrojenik belirteçlerin ekspresyonunu teşvik eden Wnt/β-catenin yolu18'ietkinleştirerek kondrosit çoğalmasını ve hücre göçünü iyileştirir veya PL-EV'lerle tedavi edilen osteoartritli tavşanlarda daha yüksek kondrojenik protein seviyeleri ve daha az tissular anormallik gösteren19.
EV'ler, hedef hücreye serbest bırakılan proteinler, lipitler ve nükleik asitler içerir ve terapötik uygulamalarıyla ilgili ana özellik olan hücreden hücreye iletişim kurar20. EV'lerin etkileri, hücrelere ulaşmalarına ve daha sonra kargo salınımlarına bağlıdır. Bu etki, metabolik aktivite veya gen ekspresyon modifikasyonu gibi hücrelerde neden olduğu değişikliklerle dolaylı olarak doğrulanabilir. Bununla birlikte, bu yöntemler, EV'lerin işlevlerini uygulamak için hücrelere nasıl ulaştığının görselleştirilmesine izin vermez. Bu nedenle, bu makale, iltihaplı OA kıkırdak eksplantları için bir tedavi olarak kullanılacak bu PL türevi EV'leri etiketlemek için bir yöntem sürmektedir. Konfokal mikroskopi, EV alımını ve eksplantlarda bulunan kondrositlere ilerlemeyi 5 saatlik bir zaman atlamalı olarak izlemek için kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Projenin CEI-IB (IB 3656118 PI) tarafından etik olarak onaylanmasından sonra kurumsal yönergelere uygun olarak IdISBa Biobank'tan (IB 1995/12 BIO) kıkırdak eksplantları alınmıştır.
1. Sütun hazırlama
- Üreticinin talimatlarını izleyerek veya aşağıdaki gibi sütunları dengele:
- Sütun kapağını çıkarın ve sütunu dengeleyin. Depolama arabelleği elution ile çıkarın.
- Kolonu 2,5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kez yıkayın. Her yıkama sırasında, sütunun tüm birimi emmesini bekleyin.
NOT: Sütunun kurumasına izin vermeyin. - Son yıkamadan sonra ve numune hazırlığına kadar sütunu kapakla örtün.
2. EV etiketleme
NOT: Bu EV etiketleme protokolü, daha önce boyut dışlama kromatografisi (SEC) tarafından yalıtılmış, daha önce açıklanan koşullar21,22olan bir PL-EV örneği kullanır. Ancak, herhangi bir kaynaktan herhangi bir EV örneği bu iletişim kuralıyla kullanılabilir.
- EV örneğini ve kontrolü (PBS) konsantre bir tüp kullanarak konsantre edin.
- Numuneleri, EV numunesinin başlangıç hacmine bağlı olarak 15 mL veya 500 μL konsantre tüpüne yerleştirin. Neredeyse kuru bir numune elde edilene kadar tüpleri üreticinin talimatlarına göre santrifüjlayın.
NOT: Kontrol örneği herhangi bir boya arka planını kontrol etmek için gereklidir. Bu yöntem belirli bir başlangıç hacmi gerektirmemese de, arıtma adımları sırasında parçacıkların yaklaşık% 10'unun kaybedileceği düşünülmelidir.
- Numuneleri, EV numunesinin başlangıç hacmine bağlı olarak 15 mL veya 500 μL konsantre tüpüne yerleştirin. Neredeyse kuru bir numune elde edilene kadar tüpleri üreticinin talimatlarına göre santrifüjlayın.
- Konsantre numuneleri 200 μL'lik seyreltici C. Resuspend EV numuneleri ve 100 μL'lik kontrol grubu ile yeniden satınlayın ve yeni 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın.
- EV örneğini 100 μL'lik iki aliquot'a ayırın, birini boya ile işaretleyin ve tedavi olarak kullanın (PKH-PL-EV); diğerini işaretsiz bırakın, ancak EV örneği gibi işleyin (NTA-PL-EV) ve EV konsantrasyonu NTA ile ölçmek için kullanın.
- Seyreltici C'de 8 μM PKH26 çözeltisi ile sonuçlanan 2x boya çözeltisi hazırlayın.
- Numunede 125 μL seyreltici C başına 1 μL 1 mM PKH26 bağlayıcıyı karıştırın. Örneklere 1:1 oranında eklemek için gereken bir birim hazırlayın.
- PKH-PL-EV'ye 2x boya çözeltisi ekleyin ve 1x boya konsantrasyonu ve 4 μM PKH26 konsantrasyonu elde etmek için numuneleri 1:1 oranında kontrol edin. NTA-PL-EV örneğine aynı miktarda PBS ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
- Numunelere %5 sığır serum albümin-PBS solüsyonunun 1:1 oranında eklenmesini sağlayın ve son hacmin ~400 μL olduğundan emin olun.
NOT: Bu adım, spesifik olmayan boya etkileşimlerinin veya ilişkisiz boyaların kaldırılmasını sağlar. - Etiketli EV'leri, boyanın sütunla ilişkisiz boyasından ve spesifik olmayan etkileşimlerinden ayırmaya devam edin.
3. Etiketli-EV yalıtımı
- Kapağı sütundan çıkarın, numunenin 400 μL'sini ekleyin (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV veya kontrol) ve elde edilen tüm sıvıyı atın.
- Sonraki adıma geçmeden önce örneğin sütunu tamamen girmesini bekleyin. 600 μL PBS ekleyin ve tüm eluted sıvıyı atın.
- Bir sonraki adıma geçmeden önce PBS'nin sütunu tamamen girmesini bekleyin. 600 μL PBS ekleyin ve 1,5'te 600 μL'lik bir fraksiyon toplayın. mL santrifüj tüpü (EV'ler veya kontrol).
NOT: Fazla boyayı numunelerden çıkarmak için bu adımlar gereklidir. Daha saf EV'ler elde etmek için sütuna göre başka bir ayırma gereklidir. Bu nedenle, aşağıdaki adımlar yeni bir eşkenel sütunda (adım 4.1.) veya ilk yıkama adımından sonra aynı sütunda (adım 4.2) gerçekleştirilmelidir. - Daha saf EV'ler elde etmek için sütunu yeni bir EV ayırma adımına hazırlayın. Yeni bir sütunsa, 2.1 adımlarını yineleyin. ve 2.2. Aynı sütunsa, sütunu % 20 izopropanol 2,5 mL ile yıkayın ve ardından 2.1 ve 2.2 adımlarını tekrarlayın.
- Sütuna 2,5 adımda elde edilen daha önce elflenmiş 600 μL EV ekleyin ve elde edilen birimi atın. Bir sonraki adıma geçmeden önce sıvının sütuna tamamen girmesini bekleyin.
- 400 μL PBS ekleyin ve tüm zorlanmış birimi atın. Bir sonraki adıma geçmeden önce sıvının sütuna tamamen girmesini bekleyin.
- 600 μL PBS ekleyin ve 1,5 mL santrifüj tüpünde 600 μL'lik bir fraksiyon toplayın. Daha fazla analiz için EV'leri ve kontrol örneklerini kullanın veya gece boyunca 4 oC'de saklayın.
- Kullanılan sütunları ileride kullanılmak üzere depolayın.
- Sütunu % 20 izopropanolden 25 mL ile yıkayın ve elde edilen hacmi atın. Sütunu 2,5 mL PBS ile 3 kez yıkayın.
- 1.1.1 adımında kaldırılan depolama arabelleği ekleyin ve arabelleğin sütuna girmesini bekleyin. Sütunu kapakla örtün ve sonraki kullanıma kadar 4 oC'de saklayın.
4. EV nicelemesi
- Aşağıdaki iki adımda açıklandığı gibi NTA-PL-EV örneğinin ve ilk PL-EV örneğinin 1:1.000 seyreltmesini hazırlayın.
- 0,2 μm filtreden süzülmüş PBS ile 1:10 seyreltilmiş NTA-PL-EV'nin 1 mL'si ve 1:10 seyreltilmiş ilk PL-EV'nin 1 mL'si hazırlayın.
- 0,2 μm filtreden süzülen PBS ile önceki seyreltilmiş numunelerin 1:100 seyreltilmesinin 1 mL'sini hazırlayın.
- 1:1.000 seyreltilmiş NTA-PL-EV örneğini veya ilk PL-EV örneğini steril bir şırınna kullanarak NTA pompasına enjekte edin. Parçacık konsantrasyonu ve boyut dağılımı belirleme için üreticinin talimatlarını ve önerilerini izleyin.
NOT: EV konsantrasyonu numune marş hacmine bağlı olduğundan, doğru bir NTA tayini elde etmek için ara seyreltmeleri okumak ve ayarlamalar yapmak gerekebilir.
5. İltihaplı OA için tedavi olarak kullanılan EV'ler
- Kıkırdağı PBS ile iki kez yıkayın ve steril koşullar altında 3 mm çapında biyopsi zımbası kullanarak kesin.
NOT: Hücre kültürü başlığındaki 5.1 ile 5.6 adımlarındaki yordamı gerçekleştirin. - Eksplantları 37 oC'de%1 penisilin-streptomisin, %5 CO 2 ve %80 nem ile desteklenmiş DMEM-F12 ortamına sahip96kuyu kültür plakasına yerleştirin.
- İnflamasyon odaklı bir OA modeli oluşturmak için hücre kültürü ortamını 10 ng/mL onkostatin M ve 2 ng/mL tümör nekroz faktörü-alfa (TNFα) ile destekleyin.
- Eksplantları 1 × 109 partikül/etiketli EV kuyusu (PKH-PL-EV) ile tedavi edin veya onkostatin M ve TNFα ile desteklenmiş hücre kültürü ortamında kontrol edin.
NOT: 1 × 109 parçacık/kuyu içeren numunenin hacmini ölçün ve kontrol için aynı hacmi kullanın. - Ortamı kıkırdak eksplantları içeren 96 kuyu hücre kültürü plakalarından çıkarın. Her kuyuya 5,3 adımda açıklanan hücre kültürü ortamının 200 μL'lik kısmını ekleyin.
NOT: 96 kuyu plakaları fetal sığır serumu (FBS) ile temas etmişse, FBS'den EV'leri çıkarmak için her birini 200 μL PBS ile üç kez yıkayın. - Tüp bebek testini farklı zamanlarda durdurun: 0, 1, 2, 3, 4 ve 5 saat.
- Kıkırdak eksplantlarını içeren hücre kültürü kuyularını 200 μL PBS ile iki kez yıkayın.
- 4 oC'de 3 saat sabitlemek için dokuya 100 μL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin.
NOT: PFA ile ilgili adımlar, Güvenlik Veri Sayfası önerilerini izleyerek duman kaputunda gerçekleştirilmelidir. - PFA'yı çıkarın, 100 μL PBS ekleyin, sabit dokuyu 4 °C'de saklayın ve numuneleri 48 saat içinde işleyin.
6. Mikroskopi hazırlama ve görselleştirme
NOT: Bu histolojik işlem dehidrasyon, parafin gömme ve rehidrasyon adımlarından oluşur. Bu adımlar genel boya floresanını azaltabilir (PKH26 veri sayfası'nda belirtilen bir sınırlama). Bu nedenle, dondurulmuş kesitleme gibi diğer prosedürler konfokal mikroskopi ile EV görselleştirme için daha uygun olabilir.
- Sabit dokuları parafin bloklarına gömün. Dokuyu 6 μm kalınlığında bölümlere kesin.
- Doku bölümlerinin deparaffinize.
NOT: Ksilen kullanan tüm adımlar duman kaputunda yapılmalıdır.- Doku bölümlerini 30 dakika ksilen, 2 dakika için% 100 etanol, 2 dakika için% 96 etanol, 1 dakika için% 75 etanol ve son olarak 30 s damıtılmış suya daldır.
- Doku bölümlerini permeabilize edin.
- Dokuya nüfuz etmek için % 0.1 Triton-% 0.1 sodyum sitrat çözeltisi hazırlayın. Her doku bölümüne 20 μL'lik bir damla ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır. Her bölümü 20 μL PBS ile iki kez yıkayın.
- Mikroskobik bir slaytta, floresan korumak için sulu bir montaj ortamı ile 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) içeren bir damla montaj ortamı ekleyin. Adım 6.3.1'den itibaren 3 doku bölümü içeren slaydı örtün.
- Slaytları oda sıcaklığında gece boyunca inkübte edin, ışıktan kornun.
- Konfokal mikroskopiye kadar ışıktan korunarak 4 °C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'de EV etiketleme ve alım izleme için şematik bir genel bakış görüntülenir. Tablo 1'de NTA tarafından tespit edilen parçacık konsantrasyonu ve EV boyutu, sütunla etiketlendikten sonra iki kez gerçekleştirilen saflaştırma adımı nedeniyle ev konsantrasyonunun işlem sırasında azaldığını göstermektedir. Bununla birlikte, elde edilen miktar, tedavi için kullanılacak partikül sayısının en uygun aralığındadır. Bu parçacık konsantrasyonu, osteoartrit kıkırdak eksplantlarını tedavi etmek için kullanılan PKH-PL-EV ve kontrol hacmini hesaplamak için kullanılır.
Kıkırdak eksplantları EV'ler veya kontrol grubu ile tedavi edildikten sonra, farklı süreler için sabitlenir: 0, 1, 2, 3, 4 ve 5 saat. Her grup daha sonra parafinize edilir, dilimlendi ve DAPI içeren bir montaj ortamı ile konfokal mikroskopi için hazırlanır. Her zaman noktasındaki her grup için temsili görüntüler Şekil 2'de sunulmuştur, EV'lerin kondrositlere ulaşana ve zaman içinde girene kadar dokuya nasıl girdiğini gösterir.
Şekil 2'degörüldüğü gibi, etiketli EV'ler 1 saat inkübasyondan sonra (PKH26 boyası ile kırmızı renkte gösterilmiştir) kondrositlerin etrafında (DAPI boyama ile mavi renkte gösterilmiştir) lokalizedir. EV'leri olmayan ancak EV örneğiyle aynı protokolden sonra işlenen kontrol grubu için kalıntı boyası nedeniyle bazı arka planlar gözlemlenebilir. Bu sonuçlar, burada gösterildiği gibi in vitro tahlillerde ve in vivo deneylerde doku yoluyla göçlerini izlemek için kullanılabilecek EV'leri etiketleme protokolünün başarısını doğrulamaktedir.
Şekil 1: EV etiketleme ve alım izleme protokolü için şematik genel bakış. Kısaltmalar: PBS = fosfat tamponlu salin; EV = hücre dışı veziklin; RT = oda sıcaklığı; BSA = sığır serum albümin; NTA = nanopartikül izleme analizi; OA = osteoartrit; TNFα = tümör nekroz faktörü-alfa; PL = trombosit lisat; PFA = paraformaldehit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ev alımının farklı zamanlarda temsili görüntüleri. PKH etiketli EV'lerle veya bir kontrol grubuyla inkübe edilen 0, 1, 2, 3, 4 ve 5 saatlik osteoartrit kıkırdak eksplantlarından sonra çekilen konfokal temsili görüntüler. Görüntüler 400x'te çekildi. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: OA = osteoartrit; PL = trombosit lisat; EV = hücre dışı veziklin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Konsantrasyon (parçacıklar/mL) | Parçacık boyutu (nm) | |
| PL-EV'ler (başlangıç) | 3.03 × 1011 | 134.0 |
| PKH26 içermeyen NTA-PL-EV'ler (protokolden sonra) | 8.30 × 1010 | 132.0 |
Tablo 1: Nanopartikül izleme analizi ile karakterizasyon. Kısaltmalar: OA = osteoartrit; PL = trombosit lisat; EV = hücre dışı veziklin; NTA = nanopartikül izleme analizi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV görüntüleme, serbest bırakma ve alma mekanizmaları gibi EV özelliklerinin anlaşılmasına yardımcı olur. Görüntülemeleri, biyodistribasyonlarının izlenmesini ve farmakokinetik özelliklerinin ilaç araçları olarak nitelendirilmesini sağlar. Bununla birlikte, EV görüntüleme ve izleme küçük boyutları nedeniyle zor olabilir, ancak araştırmacıların TÜP BEBEK ve in vivo koşullarda EV'leri izlemelerine yardımcı olmak için birçok görüntüleme cihazı ve etiketleme tekniği geliştirilmiştir23,24,25.
EV'leri optik mikroskopi ile takip ederken iki olasılık vardır: biyolüminesans ve floresan görüntüleme. Her ikisi de görünür ışık spektrumu (390-700 nm) içindeki EV'leri tespit etmek için kullanılır. Biyolüminesans, bir luciferazın substratının oksidasyonunu katalize etmesinden sonra üretilen bir chemiluminescence türüdür. Bu sinyal algılama için ultra duyarlı bir şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera gerektirse de, sinyal harici bir ışık kaynağı gerektirmediği için yüksek sinyal-gürültü oranına sahiptir26.
Floresan görüntüleme, harici bir ışık kaynağından çıkarıldıktan sonra sinyal yayan proteinler veya organik boyalar kullanır. Biyolüminesans ile karşılaştırıldığında, floresan ccd kamera ile tespit etmek daha kolaydır. Ayrıca, biyolüminesansta, substrat toksisitesi ve substratın biyolüminesansının yarı ömrü gerçek zamanlı EV izleme için düşünülmelidir27,28.
Buna karşılık, floresan protein ve organik boya bazlı etiketleme optik mikroskopide mükemmel çözünürlükte kullanılmıştır. Floresan yoğunluğu EV protein ekspresyon seviyelerine, membran etki alanlarında EV etiketlemenin verimliliğine ve uyarılma ışık kaynağına bağlı olsa da, floresan boyalar EV görüntüleme için kararlı ve güçlü sinyaller sağlar25. Organik floresan boyaların çoğu başlangıçta hücre zarı görüntüleme için kullanılmıştır. Bu boyalar genellikle lipid bilayer veya FARKLı fonksiyonel gruplar aracılığıyla EV'lerde ilgi çekici proteinleri etiketleyen floroforları birleştirir29.
Organik floresan boya ailesinden biri, floresan görüntüleme için lipid bilayer'e demirleyen lipofilik karbosiyanine sahip floroforlardan oluşan lipofilik PKH boya ailesidir30,31. PKH boyaları in vitro ve in vivo çalışmalar için kullanılmaktadır, çünkü in vivo yarı ömürleri 5 ila >100 gün arasında değişmektedir. Bu nedenle, boya in vivo'nun kalıcılığı, boyanın yarı ömründen daha kısa süreli çalışmalarda yanıltıcı sonuçlara yol açabilir. Bununla birlikte, PKH boyaları EV geçiş32'yi göstermek için izleyici olarak yararlıdır.
PKH26, kırmızı spektrumda 551 nm'de heyecan ve 567 nm emisyon zirvesi ile bulunan bu PKH lipofilik florofor ailesinin bir üyesidir. Bu, rhodamine, fitoerythrin veya DAPI33gibi diğer algılama kanallarıyla uyumlu hale getirir, bu durumda PKH26 ile işaretlenmiş EV'lerin DAPI ile işaretlenmiş kondrositlere doğru geçişine izin verir. PL'nin burada bir EV kaynağı olarak kullanılmasına rağmen, bu protokolün diğer kaynaklardan gelen EV'lerle ve örneğin EV'lerin in vivo dağılımını izlemek için başka amaçlar için kullanılabileceğini belirtmek önemlidir.
Bu protokolün bazı sınırlamaları vardır; örneğin, PKH26'nın EV boyutunu artırdığına dair bazı endişeler vardır, bu da biyodistribution ve hücresel alımlarını etkileyebilir. Ancak, EV boyutunun PKH26 tarafından artırıldığı bu gibi durumlarda, etiketleme prosedürü bu protokolde açıklanandan farklıydı34. Bu araştırmacılar yıkama ve arınma adımlarını içermedi, böylece daha büyük EV boyutuna neden olabilecek daha yüksek serbest boya seviyelerine yol açtı. Ayrıca, mevcut protokol PKH26 ile ve PKH26 olmadan paralel bir EV saflaştırması gerçekleştirerek bu sorunun üstesinden gelir. Bu, etiketli olanla aynı şekilde işlenen etiketsiz bir EV örneğinin karakterizasyonuna izin verir. Bu nedenle, daha önce gösterildiği gibi, şaşırtıcı nonspesifik olarak etiketlenmiş parçacıklar (lipoprotein veya protein numune kirleticileri) veya etiketleme karışımı içinde EV olmayanparçacıkların varlığı nedeniyle yanıltıcı bir nicelemeönlenebilir.
Bu yazıda sütunlar kullanılarak boyut dışlama kromatografisi ile iki saflaştırma döngüsü gerçeklenmiştir. İlki sakkaroz gradyan santrifüjleme ile değiştirilebilir. Bununla birlikte, tüm EV popülasyonları bu sütunla aynı eluted aliquot'ta toplandı ve yüksek hızlı santrifüjlemede karşılaşılan yüksek g kuvvetlerine maruz kalmadı. Bununla birlikte, santrifüjlemeden kaçınmak, özellikle ayırma döngüleri arasında kolon yıkamaları gerekiyorsa, daha yavaş bir işleme yol açabilir. Bu protokolün bir başka sınırlaması, sütunun sınırlı hacmi nedeniyle etiketleme işlemine başlamadan önce örnek konsantrasyonu ihtiyacıdır. Bu handikap, daha yüksek yükleme kapasitesine sahip sütunlar kullanılarak aşılabilir.
Diğer EV etiketleme protokolleri farklı boyaların kullanımını açıklar; ancak, ultracentrifugation adımlarını kullanmaları EV bütünlüğüne zarar verebilir37. Burada açıklanan protokol, belirli bir işleve sahip olmadan konfokal mikroskop ile ev göçünün ve kıkırdak eksplantlarında alımın kolayca izlenmesine izin verdi. Ayrıca, bu diğer dokulara ve lipidik örneklere veya in vivo test gibi koşullara tahmin edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma, ESF Avrupa Sosyal Fonu ve ERDF Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (MS16/00124) tarafından ortaklaşa finanse edilen Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad tarafından finanse edildi; CP16/00124); Balear Adaları'nın sürdürülebilir turizm vergisi tarafından finanse edilen PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18) tarafından; Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); FUTURMed bünyesindeki FOLIUM doktora sonrası programı (FOLIUM 17/01) tarafından, Balear Adaları'nın sürdürülebilir turizm vergisi ile% 50 ve ESF tarafından% 50 oranında finanse edilir; ve Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03) tarafından.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
References
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
- Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
- Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
- Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
- Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
- Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
- El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
- Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
- Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, Suppl. 1 289-292 (2007).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
- Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
- Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
- Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
- Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
- de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
- Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
- Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
- Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
- Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).
