Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att märka trombocyt lysate-härledda extracellulära vesicles för att övervaka deras migration och upptag i brosk explanter som används som en modell för artros.
Abstract
Extracellulära blåsor (EVs) används i olika studier för att bevisa deras potential som cellfri behandling på grund av deras last som härrör från deras cellulära källa, såsom trombocyt lysate (PL). Vid användning som behandling förväntas EVs komma in i målcellerna och påverka ett svar från dessa. I denna forskning har PL-härledda EVs studerats som en cellfri behandling för artros (OA). Således inrättades en metod för att märka elfordon och testa deras upptag på broskexplanter. PL-härledda EVs är märkta med lipofil färgämneT PKH26, tvättas två gånger genom en kolumn och testas sedan i en in vitro inflammation-driven OA-modell i 5 h efter partikelkvantifiering genom nanopartikelspårningsanalys (NTA). Varje timme fixeras brosk explanter, paraffineras, skärs i 6 μm sektioner för att montera på diabilder och observeras under ett konfokalt mikroskop. Detta gör det möjligt att kontrollera om EVs kommer in i målcellerna (kondrocyter) under denna period och analysera deras direkta effekt.
Introduction
Artros (OA) är en artikulär degenerativ sjukdom som innebär en progressiv och irreversibel inflammation och förstörelse av den extracellulära matrisen i ledbrosket1. Även om olika former av artrit har många behandlingar2,3,4, dessa begränsas av deras biverkningar och begränsad effekt. Vävnadsteknik tekniker med autolog chondrocyte implantation tillämpas rutinmässigt för regenerativ behandling av skadade brosk i tidiga OA broskskador4. Cellbaserade terapier är begränsade främst på grund av det begränsade antalet fenotypiskt stabila kondrocyter eller kondroprogenitorer som effektivt kan reparera brosket3. Därför är utvecklingen av nya terapeutiska strategier för att förhindra sjukdomsprogression och regenerera stora broskskador av största vikt.
Extracellulära blåsor (EVs) har föreslagits som en behandling för OA av olika författare5,6. EVs är membranösa kroppar som utsöndras av majoriteten av celltyperna, är involverade i intercellulär signalering och har visat sig utöva stamcellers terapeutiska effekter7,8,9, på grund av vilka de nyligen har väckt intresse för regenerativ medicin10. EVs som härrör från mesenkymala stromalceller (MSCs) är de viktigaste terapeutiska EVs som undersökts för OA, även om andra ledrelaterade celler har använts som EV-källor, t.ex. kondroprogenitorer eller immunceller11,12.
Trombocytkoncentrat, såsom trombocytlysst (PLs), används för att förbättra sårläkning vid olika skador, såsom hornhinnans sår13,14,15 eller i senvävnadsregenerering16, på grund av hypotesen att EV-komponenten i trombocytkoncentrat kan vara ansvarig för dessa effekter17 . Vissa studier relaterade till ledrelaterade sjukdomar använder trombocyt-härledda EVs (PL-EVs) som en behandling för att lindra osteoarthritic villkor. PL-EVs förbättrar kondrocytproliferation och cellmigration genom att aktivera Wnt/β-cateninväg18, främja uttrycket av kondrogena markörer hos osteoarthritic chondrocytes19, eller visa högre nivåer av konnogena proteiner och färre tissular avvikelser hos osteoarthritic kaniner behandlade med PL-EVs18.
EVs innehåller proteiner, lipider och nukleinsyror som frigörs till målcellen, vilket upprättar kommunikation från cell till cell, vilket är huvudfunktionen relaterad till deras terapeutiska tillämpningar20. Effekterna av elfordon beror på deras framt nå celler och efterföljande lastutsättning. Denna effekt kan bekräftas indirekt av förändringar som orsakas i celler, såsom metabolisk aktivitet eller genuttrycksmodifiering. Dessa metoder tillåter dock inte visualisering av hur EVs når celler för att utöva sin funktion. Detta dokument presenterar således en metod för att märka dessa PL-härledda EVs som ska användas som en behandling för inflammationsdrivna OA brosk explanter. Konfokal mikroskopi användes för att övervaka EV upptag och progression till de kondrocyter som finns i explants i en tidsförlopp av 5 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Broskexplanter erhölls från IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) i enlighet med institutionella riktlinjer efter etiskt godkännande av projektet av CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Förberedelse av kolonn
- Ekvilibrate kolumner enligt tillverkarens instruktioner eller enligt följande:
- Ta bort kolumnlocket och balansera kolumnen. Ta bort lagringsbufferten genom elution.
- Tvätta kolonnen 3 gånger med 2,5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Under varje tvätt, vänta tills kolonnen absorberar hela volymen.
OBS: Låt inte kolonnen torka. - Täck kolonnen med locket efter den sista tvätten och tills provberedningen.
2. EV-märkning
OBS: Detta EV-märkningsprotokoll använder ett PL-EV-prov som tidigare isolerats av storleksuteslutningskromatografi (SEC) med tidigare beskrivna villkor21,22. Alla EV-prover från vilken källa som helst får dock användas med detta protokoll.
- Koncentrera EV-provet och kontrollen (PBS) med hjälp av ett koncentrerande rör.
- Placera proverna i ett koncentrationsrör på 15 ml eller 500 μL, beroende på startampan för ev-provet. Centrifugera rören enligt tillverkarens instruktioner tills ett nästan torrt prov erhålls.
OBS: Kontrollprovet är nödvändigt för att kontrollera om det finns någon färgbakgrund. Även om denna metod inte kräver någon specifik initial volym, bör det övervägas att cirka 10% av partiklarna kommer att gå förlorade under reningssteg.
- Placera proverna i ett koncentrationsrör på 15 ml eller 500 μL, beroende på startampan för ev-provet. Centrifugera rören enligt tillverkarens instruktioner tills ett nästan torrt prov erhålls.
- Återanvänd de koncentrerade proverna med spädningsprover C. Resuspend EV med 200 μL och kontrollgruppen med 100 μL och överför dem till nya 1,5 ml centrifugrör.
- Separera EV-provet i två alikvoter på 100 μL. Markera ett med färgämne och använd det som behandling (PKH-PL-EV). lämna den andra omärkt men bearbeta den (NTA-PL-EV) som EV-provet och använd det för att kvantifiera EV-koncentrationen med NTA.
- Förbered 2x färglösning, vilket resulterar i 8 μM PKH26-lösning i spädnings C.
- Blanda 1 μL PKH26-länkare per 125 μL spädning C i provet. Förbered en volym som krävs för att lägga till i proverna i ett 1:1-förhållande.
- Tillsätt 2x färglösning till PKH-PL-EV och kontrollprover i ett 1:1-förhållande för att uppnå 1x färgkoncentration och 4 μM PKH26-koncentration. Lägg till samma volym PBS i NTA-PL-EV-provet. Inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 5% bovin serum albumin-PBS lösning till proverna i ett 1:1 förhållande och se till att den slutliga volymen är ~ 400 μL.
OBS: Detta steg gör det möjligt att ta bort ospecificerade färginteraktioner eller obundet färgämne. - Fortsätt att separera de märkta EVs från det obundna färgämnet och ospecificerade interaktioner av färgämnet med kolonnen.
3. Isolering av etiketterad EV
- Ta bort locket från kolonnen, tillsätt 400 μL av provet (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV eller kontroll) och kassera all elisad vätska.
- Vänta tills exemplet kommer in i kolumnen helt innan du fortsätter till nästa steg. Tillsätt 600 μL PBS och kassera all eltad vätska.
- Vänta tills PBS kommer in i kolumnen helt innan du fortsätter till nästa steg. Tillsätt 600 μL PBS och samla in en bråkdel av 600 μL i en 1,5. ml centrifugrör (EVs eller kontroll).
OBS: Dessa steg behövs för att avlägsna överskottsfärgen från proverna. En annan separation efter kolumn behövs för att få renare EVs. Följande steg bör därför utföras i en ny ekvilibrerad kolumn (steg 4.1) eller samma kolumn efter ett första tvättsteg (steg 4.2). - Förbered kolumnen för ett nytt EV-separationssteg för att få renare EVs. Om det är en ny kolumn upprepar du steg 2.1. och 2.2. Om det är samma kolumn, tvätta kolonnen med 2,5 ml 20% isopropanol och upprepa sedan steg 2.1 och 2.2.
- Tillsätt 600 μL tidigare eluterade ELV som erhållits i steg 2.5 i kolonnen och kassera den eliserade volymen. Vänta tills vätskan kommer in i kolonnen helt innan du fortsätter till nästa steg.
- Tillsätt 400 μL PBS och kassera all elterad volym. Vänta tills vätskan kommer in i kolonnen helt innan du fortsätter till nästa steg.
- Tillsätt 600 μL PBS och samla in en bråkdel av 600 μL i ett 1,5 ml centrifugrör. Använd EL-fordonen och kontrollproverna för ytterligare analyser eller förvara dem över natten vid 4 oC.
- Lagra de använda kolumnerna för framtida användning.
- Tvätta kolonnen med 25 ml 20% isopropanol och kassera den eliserade volymen. Tvätta kolonnen 3 gånger med 2,5 ml PBS.
- Lägg till lagringsbufferten som tagits bort i steg 1.1.1 och vänta tills bufferten kommer in i kolumnen. Täck kolonnen med locket och förvara vid 4 oC tills efterföljande användning.
4. Kvantifiering av EV
- Förbered 1:1 000 utspädningar av NTA-PL-EV-provet och det ursprungliga PL-EV-provet enligt beskrivningen i följande två steg.
- Förbered 1 ml 1:10 utspädd NTA-PL-EV och 1 ml 1:10 utspädd initial PL-EV med PBS filtrerad genom ett 0,2 μm filter.
- Förbered 1 ml av en utspädning på 1:100 av de tidigare utspädda proverna med PBS filtrerat genom ett 0,2 μm-filter.
- Injicera 1:1 000 utspädd NTA-PL-EV-prov eller det första PL-EV-provet med en steril spruta i NTA-pumpen. Följ tillverkarens anvisningar och rekommendationer för partikelkoncentration och storleksfördelningsbestämning.
OBS: Eftersom EV-koncentrationen beror på provstartvolymen kan det vara nödvändigt att avläsa mellanliggande utspädningar och göra justeringar för att erhålla en korrekt NTA-bestämning.
5. EVs som används som behandling för inflammationsdriven OA
- Tvätta brosket två gånger med PBS och punktskatta det med en biopsistans med 3 mm diameter under sterila förhållanden.
OBS: Utför proceduren från steg 5.1 till 5.6 i en cellodlingshuv. - Placera explanterna i 96-väl odlingsplattor med DMEM-F12 medium kompletterat med 1% penicillin-streptomycin vid 37 oC, 5% CO2och 80% fuktighet.
- För att upprätta en inflammationsdriven OA-modell, komplettera cellodlingsmediet med 10 ng/mL oncostatin M och 2 ng/mL tumörnekrosfaktor-alfa (TNFα).
- Behandla explanterna med 1 × 109 partiklar/brunn med märkta EVs (PKH-PL-EV) eller kontroll i cellodlingsmedium kompletterat med onkostatin M och TNFα.
OBS: Mät volymen på provet som innehåller 1 × 109 partiklar/brunn och använd samma volym för kontrollen. - Ta bort mediet från 96-brunnscellsodlingsplattorna som innehåller broskexplanter. Tillsätt 200 μL av det cellodlingsmedium som beskrivs i steg 5,3 till varje brunn.
OBS: Om 96-brunnsplattorna har varit i kontakt med fetala bovinserum (FBS), tvätta varje brunn tre gånger med 200 μL PBS för att ta bort eventuella EVs från FBS. - Stoppa in vitro-analysen vid olika tidpunkter: 0, 1, 2, 3, 4 och 5 h.
- Tvätta cellodlingsbrunnarna som innehåller broskexplanterna två gånger med 200 μL PBS.
- Tillsätt 100 μL 4% paraformaldehyd (PFA) till vävnaden för att fixera den i 3 h vid 4 oC.
OBS: Steg som involverar PFA bör utföras i en rökhuv enligt rekommendationerna i säkerhetsdatabladet. - Ta bort PFA, tillsätt 100 μL PBS, förvara den fasta vävnaden vid 4 °C och bearbeta proverna inom 48 timmar.
6. Förberedelse och visualisering av mikroskopi
OBS: Detta histologiska förfarande består av uttorkning, paraffin inbäddning och rehydrering steg. Dessa steg kan minska den totala färgfluorescensen (en begränsning som nämns i databladet för PKH26). Därför kan andra procedurer, såsom frysta sektionering, vara mer lämpade för EV-visualisering genom konfokal mikroskopi.
- Bädda in de fasta vävnaderna i paraffinblock. Skär vävnaden i 6 μm tjocka sektioner.
- Deparaffinisera vävnadssektionerna.
OBS: Alla steg med xylen ska utföras i en rökhuv.- Sänk ner vävnadssektionerna i xylen i 30 minuter, 100% etanol i 2 min, 96% etanol i 2 min, 75% etanol i 1 min och slutligen i destillerat vatten i 30 s.
- Permeabilisera vävnadssektionerna.
- Förbered en 0,1% Triton-0,1% natriumcitratlösning för att permeabilisera vävnaden. Tillsätt en droppe på 20 μL till varje vävnadssektion och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta varje sektion två gånger med 20 μL PBS.
- På en mikroskopisk bild, tillsätt en droppe monteringsmedium som innehåller 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) med ett vattenhaltigt monteringsmedium för att bevara fluorescens. Täck bilden som innehåller 3 vävnadssektioner från steg 6.3.1.
- Inkubera rutschkanorna över natten vid rumstemperatur, skyddade mot ljus.
- Förvara vid 4 °C, skyddad mot ljus tills den är konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk översikt över ev-märkning och upptagsövervakning visas i figur 1. Partikelkoncentrationen och EV-storleken som detekteras av NTA i tabell 1 visar att EV-koncentrationen minskar under processen på grund av reningssteget som utförs två gånger efter märkning med kolonnen. Den erhållna mängden ligger dock i det optimala intervallet av antalet partiklar som ska användas för behandling. Denna partikelkoncentration används för att beräkna volymen PKH-PL-EV och kontroll som används för att behandla osteoarthritic brosk explanter.
När broskexplanterna har behandlats med EVs eller kontrollgruppen fixeras de för olika perioder: 0, 1, 2, 3, 4 och 5 h. Varje grupp paraffiniseras, skivas och bereds för konfokal mikroskopi med ett monteringsmedium som innehåller DAPI. Representativa bilder för varje grupp vid varje tidpunkt presenteras i figur 2, som visar hur EVs kommer in i vävnaden tills de når kondrocyterna och anger dem över tiden.
Som framgår av figur 2är märkta EVs redan lokaliserade kring kondrocyter (visas i blått med DAPI-färgning) efter 1 timme inkubation (visas i rött med PKH26-färgämne). Viss bakgrund på grund av restfärg kan observeras för kontrollgruppen, som inte har EVs men bearbetas enligt samma protokoll som EV-provet. Dessa resultat bekräftar framgången för protokollet för att märka EVs, som kan användas för att övervaka deras migrering genom vävnad i in vitro-analyser, som visas här, och i in vivo-experiment.
Bild 1: Schematisk översikt för EV-märknings- och upptagsövervakningsprotokoll. Förkortningar: PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning; EV = extracellulär vesikel; RT = rumstemperatur; BSA = albumin för bovint serum; NTA = analys av nanopartiklar; OA = artros; TNFα = tumörnekrosfaktor-alfa; PL = trombocyt lysate; PFA = paraformaldehyd; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Representativa bilder av EV-upptag vid olika tidpunkter. Konfokala representativa bilder tagna efter 0, 1, 2, 3, 4 och 5 h osteoarthritic brosk explanter inkuberas med PKH-märkta EVs eller med en kontrollgrupp. Bilderna togs vid 400x. Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: OA = artros; PL = trombocyt lysate; EV = extracellulär vesikel. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Koncentration (partiklar/ml) | Partikelstorlek (nm) | |
| PL-EVs (initial) | 3.03 × 1011 | 134.0 |
| NTA-PL-EVs utan PKH26 (efter protokollet) | 8.30 × 1010 | 132.0 |
Tabell 1: Karakterisering genom nanopartikelspårningsanalys. Förkortningar: OA = artros; PL = trombocyt lysate; EV = extracellulär vesikel; NTA = analys av nanopartiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV-avbildning hjälper till att förstå EV-egenskaper, till exempel deras frisättnings- och upptagningsmekanismer. Deras avbildning gör det möjligt att övervaka deras biodistribution och karakteriseringen av deras farmakokinetiska egenskaper som läkemedelsfordon. Ev-avbildning och spårning kan dock vara svårt på grund av deras små storlekar, även om många bildenheter och märkningstekniker har utvecklats för att hjälpa forskare att övervaka EVs under in vitro- och in vivo-förhållanden 23,24,25.
Det finns två möjligheter när man spårar EVs med optisk mikroskopi: bioluminescens och fluorescensavbildning. Båda används för att upptäcka EVs inom det synliga ljusspektrumet (390-700 nm). Bioluminescens är en typ av chemiluminescens som produceras efter att en luciferas katalyserar oxidationen av dess substrat. Även om denna signal kräver en ultrakänslig ccd-kamera (Charge-Coupled) för detektering, har den ett högt signal-till-brus-förhållande eftersom signalen inte kräver en extern ljuskälla26.
Fluorescensavbildning använder proteiner eller organiska färgämnen som avger signaler efter excitation från en extern ljuskälla. Jämfört med bioluminescens är fluorescens lättare att upptäcka med en CCD-kamera. Dessutom bör substrattoxicitet och halveringstid för substratets bioluminescens beaktas för ev-spårning i realtid27,28.
Däremot har fluorescerande protein- och organisk färgbaserad märkning använts med utmärkt upplösning i optisk mikroskopi. Även om fluorescensintensiteten beror på EV-proteinuttrycksnivåer, effektiviteten hos EV-märkning vid membrandomäner och excitationsljuskällan, ger fluorescensfärger stabila och starka signaler för EV-avbildning25. De flesta organiska fluorescerande färgämnen användes ursprungligen för cellmembran imaging. Dessa färgämnen kombinerar i allmänhet fluoroforer som märker lipidbilayer eller proteiner av intresse på EVs via olika funktionella grupper29.
En organisk fluorescerande färgämne familj är lipophilic PKH färgämne familjen bestående av fluoroforer med en lipofil karbacyyanin som förankrar i lipidbilayer för fluorescens imaging30,31. PKH-färgämnen har använts för in vitro- och in vivo-studier eftersom deras in vivo-halveringstid sträcker sig från 5 till >100 dagar. Således kan färgämnets persistens in vivo leda till vilseledande resultat i studier med kortare varaktighet än färgämnets halveringstid. PKH-färgämnen är dock användbara som spårare för att visa EV-migrering32.
PKH26 är en medlem av denna PKH lipophilic fluorophore familj, finns i det röda spektrumet med en topp av excitation vid 551 nm och utsläpp vid 567 nm. Detta gör det kompatibelt med andra detektionskanaler, såsom rhodamin, fykolythrin eller DAPI33, vilket gör det möjligt att upptäcka, i detta fall, migrering av EVs markerade med PKH26 mot kondrocyter markerade med DAPI. Det är viktigt att notera att även om PL användes som en EV-källa här, kan detta protokoll användas med EL från andra källor och för andra ändamål, till exempel för att spåra märkt in vivo-distribution av EL-fordon.
Detta protokoll har vissa begränsningar; Det finns till exempel vissa farhågor om att PKH26 ökar EV-storleken, vilket kan påverka deras biodistribution och cellulära upptag. I sådana fall där EV-storleken ökades med PKH26 skilde sig märkningsförfarandet dock från det som beskrivs i detta protokoll34. Dessa forskare inkluderade inte tvätt- och reningsstegen, vilket ledde till högre nivåer av fritt färgämne, vilket kan orsaka den större EV-storleken. Dessutom övervinner det nuvarande protokollet detta problem genom att utföra en parallell EV-rening med och utan PKH26. Detta gör det möjligt att karakterisera ett omärkt EV-exempel, som bearbetades identiskt som det märkta. En vilseledande kvantifiering på grund av sammanblandning av ospecificerade partiklar (lipoprotein- eller proteinprover) eller genom förekomst av icke-EV-partiklar i märkningsblandningen kan därför undvikas, vilket tidigare visats35,36.
I detta dokument utfördes två cykler av rening av storlek exkludering kromatografi med hjälp av kolumner. Den första kan ersättas med sackaroscenscencentreringen. Alla EV populationer samlades dock i samma eluted alikvot med denna kolumn och inte utsätts för höga g krafter som påträffas i höghastighets centrifugering. Att undvika centrifugering kan dock leda till en långsammare process, särskilt om kolonntvättar behövs mellan separationscyklerna. En annan begränsning av detta protokoll är behovet av provkoncentration innan märkningsprocessen startas på grund av kolumnens begränsade volym. Detta handikapp kan övervinnas genom att använda kolumner med högre lastkapacitet.
Andra EV-märkningsprotokoll beskriver användningen av olika färgämnen; Deras användning av ultracentrifugationssteg kan dock skada EV-integriteten37. Protokollet som beskrivs här har gjort det möjligt att övervaka EV-migrering och upptag i brosk explanter lätt med ett konfokalmikroskop utan någon särskild funktion. Dessutom kan detta extrapoleras till andra vävnader och lipidprover eller tillstånd, såsom en in vivo-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medfinansierad av ESF:s socialfond och Erufs Europeiska regionala utvecklingsfond (MS16/00124; CP16/00124); av PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansierad genom balearernas hållbara turistskatt; av Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), av FOLIUM:s postdoktoralprogram (FOLIUM 17/01) inom FUTURMed, finansierat till 50 % genom balearernas hållbara turistskatt och till 50 % av ESF, och av Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
References
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
- Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
- Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
- Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
- Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
- Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
- El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
- Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
- Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, Suppl. 1 289-292 (2007).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
- Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
- Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
- Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
- Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
- de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
- Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
- Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
- Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
- Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).
