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Bioengineering

Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62780
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2,4, 1,2,4, 1,2, 1,2
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Cellomics Unit, Institut Universitari d'Investigació en Ciències de la Salut (IUNICS), Universitat de les Illes Balears, 4Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB)

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les vésicules extracellulaires dérivées du lysat plaquettaire afin de surveiller leur migration et leur absorption dans les explants cartilagineux utilisés comme modèle pour l’arthrose.

Abstract

Les vésicules extracellulaires (VE) sont utilisées dans différentes études pour prouver leur potentiel en tant que traitement sans cellules en raison de leur cargaison dérivée de leur source cellulaire, comme le lysat plaquettaire (PL). Lorsqu’ils sont utilisés comme traitement, on s’attend à ce que les VE pénètrent dans les cellules cibles et y répondent. Dans cette recherche, les VE dérivés de PL ont été étudiés comme traitement sans cellules pour l’arthrose (OA). Ainsi, une méthode a été mise en place pour étiqueter les VE et tester leur absorption sur les explants cartilagineux. Les VE dérivés de PL sont marqués avec le colorant lipophile PKH26, lavés deux fois à travers une colonne, puis testés dans un modèle d’arthrose in vitro induit par l’inflammation pendant 5 h après quantification des particules par analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Toutes les heures, les explants de cartilage sont fixés, paraffinés, coupés en sections de 6 μm pour être montés sur des lames et observés au microscope confocal. Cela permet de vérifier si les VE pénètrent dans les cellules cibles (chondrocytes) pendant cette période et d’analyser leur effet direct.

Introduction

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative articulaire qui implique une inflammation progressive et irréversible et la destruction de la matrice extracellulaire du cartilage articulaire1. Bien que diverses formes d’arthrite aient de nombreux traitements2,3,4, ceux-ci sont limités par leurs effets secondaires et leur efficacité limitée. Les techniques d’ingénierie tissulaire utilisant l’implantation de chondrocytes autologues sont couramment appliquées pour le traitement régénératif du cartilage blessé dans les lésions cartilagineuses précocesde l’arthrose 4. Les thérapies cellulaires sont limitées principalement en raison du nombre limité de chondrocytes phénotypiquement stables ou de chondroprogenitors capables de réparer efficacement le cartilage3. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir la progression de la maladie et régénérer les grandes lésions cartilagineuses est d’une importance capitale.

Les vésicules extracellulaires (VE) ont été suggérées comme traitement de l’arthrose par différents auteurs5,6. Les VE sont des corps membraneux sécrétés par la majorité des types de cellules, sont impliqués dans la signalisation intercellulaire et il a été démontré qu’ils exercent les effets thérapeutiques des cellules souches7,8,9, en raison desquels ils ont récemment suscité un intérêt pour la médecine régénérative10. Les VE dérivés de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont les principaux VE thérapeutiques étudiés pour l’arthrose, bien que d’autres cellules liées aux articulations aient été utilisées comme sources de VE, par exemple, les chondroprogeniteurs ou les cellules immunitaires11,12.

Les concentrés de plaquettes, tels que les lysats plaquettaires (PL), sont utilisés pour améliorer la cicatrisation des plaies dans différentes blessures, telles que les ulcères cornéens13,14,15 ou dans la régénération du tissu tendineux16, en raison de l’hypothèse que le composant EV des concentrés plaquettaires peut être responsable de ces effets17 . Certaines études liées aux maladies articulaires utilisent des VE d’origine plaquettaire (PL-VE) comme traitement pour améliorer les conditions arthrosiques. Les PL-EV améliorent la prolifération des chondrocytes et la migration cellulaire en activant la voie Wnt/β-caténine18,favorisant l’expression de marqueurs chondrogènes dans les chondrocytes arthrosiques19,ou montrant des niveaux plus élevés de protéines chondrogènes et moins d’anomalies tissulaires chez les lapins arthrosiques traités par PL-VE18.

Les VE contiennent des protéines, des lipides et des acides nucléiques qui sont libérés dans la cellule cible, établissant une communication de cellule à cellule, qui est la principale caractéristique liée à leurs applications thérapeutiques20. Les effets des véhicules électriques dépendent de leurs cellules d’atteinte et du rejet ultérieur de la cargaison. Cet effet peut être confirmé indirectement par des changements causés dans les cellules, tels que l’activité métabolique ou la modification de l’expression des gènes. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de visualiser comment les VE atteignent les cellules pour exercer leur fonction. Ainsi, cet article présente une méthode pour étiqueter ces VE dérivés de PL à utiliser comme traitement pour les explants de cartilage OA induits par l’inflammation. La microscopie confocale a été utilisée pour surveiller l’absorption et la progression de la VE vers les chondrocytes présents dans les explants en un laps de temps de 5 h.

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Protocol

NOTE: Les explants de cartilage ont été obtenus auprès de la biobanque IdISBa (IB 1995/12 BIO) conformément aux directives institutionnelles après approbation éthique du projet par le CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Préparation des colonnes

  1. Équilibrez les colonnes en suivant les instructions du fabricant ou comme suit :
    1. Retirez le capuchon de colonne et équilibrez la colonne. Retirez le tampon de stockage par élution.
    2. Lavez la colonne 3 fois avec 2,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Lors de chaque lavage, attendez que la colonne absorbe tout le volume.
      REMARQUE: Ne laissez pas la colonne sécher.
    3. Couvrir la colonne avec le bouchon après le dernier lavage et jusqu’à la préparation de l’échantillon.

2. Étiquetage des véhicules électriques

REMARQUE: Ce protocole d’étiquetage EV utilise un échantillon PL-EV précédemment isolé par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) avec des conditions précédemmentdécrites21,22. Cependant, tout échantillon EV provenant de n’importe quelle source peut être utilisé avec ce protocole.

  1. Concentrez l’échantillon EV et le contrôle (PBS) à l’aide d’un tube de concentration.
    1. Placez les échantillons dans un tube de concentration de 15 mL ou 500 μL, selon le volume de départ de l’échantillon EV de départ. Centrifugez les tubes selon les instructions du fabricant jusqu’à l’obtention d’un échantillon presque sec.
      REMARQUE: L’échantillon de contrôle est nécessaire pour vérifier tout fond de colorant. Bien que cette méthode ne nécessite aucun volume initial spécifique, il faut considérer qu’environ 10% des particules seront perdues lors des étapes de purification.
  2. Remettre en suspension les échantillons concentrés avec le diluant C. Remettre en suspension les échantillons EV avec 200 μL et le groupe témoin avec 100 μL et les transférer dans de nouveaux tubes centrifuges de 1,5 mL.
  3. Séparer l’échantillon EV en deux aliquotes de 100 μL. Marquez-en un avec un colorant et utilisez-le comme traitement (PKH-PL-EV); laissez l’autre non marqué, mais traitez-le (NTA-PL-EV) comme l’échantillon de VE et utilisez-le pour quantifier la concentration de VE par NTA.
  4. Préparer 2x solution de colorant, résultant en une solution de PKH26 de 8 μM dans le diluant C.
  5. Mélanger 1 μL de 1 mM de liant PKH26 par 125 μL de diluant C dans l’échantillon. Préparez un volume à ajouter aux échantillons dans un rapport de 1:1.
  6. Ajouter 2x solution de colorant à PKH-PL-EV et contrôler les échantillons dans un rapport de 1:1 pour obtenir une concentration de colorant de 1x et une concentration de PKH26 de 4 μM. Ajoutez le même volume de PBS à l’échantillon NTA-PL-EV. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
  7. Ajouter la solution d’albumine-PBS sérique bovine à 5 % aux échantillons dans un rapport de 1:1 et s’assurer que le volume final est d’environ 400 μL.
    REMARQUE: Cette étape permet d’éliminer les interactions de colorant non spécifiques ou de colorant non lié.
  8. Procédez à la séparation des VÉHICULES étiquetés du colorant non lié et des interactions non spécifiques du colorant avec la colonne.

3. Isolation des véhicules électriques étiquetés

  1. Retirez le bouchon de la colonne, ajoutez 400 μL de l’échantillon (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV ou témoin) et jetez tout liquide élué.
  2. Attendez que l’exemple entre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante. Ajouter 600 μL de PBS et jeter tout le liquide élué.
  3. Attendez que le PBS entre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante. Ajouter 600 μL de PBS et recueillir une fraction de 600 μL dans un 1,5. Tube de centrifugeuse mL (VE ou contrôle).
    REMARQUE: Ces étapes sont nécessaires pour éliminer l’excès de colorant des échantillons. Une autre séparation par colonne est nécessaire pour obtenir des VÉHICULES plus purs. Ainsi, les étapes suivantes doivent être effectuées dans une nouvelle colonne équilibrée (étape 4.1.) ou dans la même colonne après une étape de lavage initiale (étape 4.2).
  4. Préparez la colonne pour une nouvelle étape de séparation des VE afin d’obtenir des VE plus purs. S’il s’agit d’une nouvelle colonne, répétez les étapes 2.1. et 2.2. S’il s’agit de la même colonne, lavez la colonne avec 2,5 mL d’isopropanol à 20 %, puis répétez les étapes 2.1 et 2.2.
  5. Ajouter 600 μL de VÉHICULES électriques préalablement élués obtenus à l’étape 2.5 à la colonne et jeter le volume élué. Attendez que le liquide pénètre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante.
  6. Ajouter 400 μL de PBS et jeter tout le volume élué. Attendez que le liquide pénètre complètement dans la colonne avant de passer à l’étape suivante.
  7. Ajouter 600 μL de PBS et recueillir une fraction de 600 μL dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Utilisez les véhicules électriques et les échantillons de contrôle pour d’autres analyses ou stockez-les pendant la nuit à 4 oC.
  8. Stockez les colonnes utilisées pour une utilisation ultérieure.
    1. Laver la colonne avec 25 mL d’isopropanol à 20 % et jeter le volume élué. Lavez la colonne 3 fois avec 2,5 mL de PBS.
    2. Ajoutez la mémoire tampon de stockage supprimée à l’étape 1.1.1 et attendez que la mémoire tampon entre dans la colonne. Couvrir la colonne avec le bouchon et conserver à 4 oC jusqu’à utilisation ultérieure.

4. Quantification des VE

  1. Préparer les dilutions 1:1 000 de l’échantillon NTA-PL-EV et de l’échantillon PL-EV initial comme décrit dans les deux étapes suivantes.
    1. Préparer 1 mL de NTA-PL-EV dilué à 1:10 et 1 mL de PL-EV initial dilué à 1:10 avec du PBS filtré à travers un filtre de 0,2 μm.
    2. Préparer 1 mL d’une dilution à 1:100 des échantillons dilués précédents avec du PBS filtré à travers un filtre de 0,2 μm.
  2. Injecter l’échantillon NTA-PL-EV dilué au 1:1 000 ou l’échantillon PL-EV initial à l’aide d’une seringue stérile dans la pompe NTA. Suivez les instructions et les recommandations du fabricant pour la détermination de la concentration des particules et de la distribution granulométrique.
    REMARQUE: Comme la concentration de VE dépend du volume de démarrage de l’échantillon, il peut être nécessaire de lire les dilutions intermédiaires et de faire des ajustements pour obtenir une détermination correcte de la NTA.

5. Ve électriques utilisés comme traitement de l’arthrose induite par l’inflammation

  1. Lavez le cartilage deux fois avec du PBS et excisez-le à l’aide d’un poinçon de biopsie de 3 mm de diamètre dans des conditions stériles.
    REMARQUE: Effectuez la procédure des étapes 5.1 à 5.6 dans une culture cellulaire.
  2. Placer les explantes dans des plaques de culture de 96 puits avec un milieu DMEM-F12 complété par 1% de pénicilline-streptomycine à 37 oC, 5% de CO2et 80% d’humidité.
    1. Pour établir un modèle d’arthrose induite par l’inflammation, complétez le milieu de culture cellulaire avec 10 ng / mL d’oncostatine M et 2 ng / mL de facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα).
  3. Traiter les explants avec 1 × 109 particules/puits de VE marqués (PKH-PL-EV) ou contrôler dans un milieu de culture cellulaire complété par de l’oncostatine M et du TNFα.
    REMARQUE: Mesurer le volume de l’échantillon contenant 1 × 109 particules / puits et utiliser le même volume pour le contrôle.
  4. Retirez le milieu des plaques de culture cellulaire à 96 puits contenant des explants de cartilage. Ajouter 200 μL du milieu de culture cellulaire décrit à l’étape 5.3 à chaque puits.
    REMARQUE: Si les plaques de 96 puits ont été en contact avec du sérum bovin fœtal (FBS), lavez chaque puits trois fois avec 200 μL de PBS pour retirer tout VE du FBS.
  5. Arrêtez le test in vitro à différents moments: 0, 1, 2, 3, 4 et 5 h.
  6. Lavez deux fois les puits de culture cellulaire contenant les explantations cartilagineuses avec 200 μL de PBS.
  7. Ajouter 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans le tissu pour le fixer pendant 3 h à 4 oC.
    REMARQUE : Les étapes impliquant des PFA doivent être effectuées dans une hotte aspirante conformément aux recommandations de la fiche de données de sécurité.
  8. Retirer le PFA, ajouter 100 μL de PBS, conserver le tissu fixe à 4 °C et traiter les échantillons dans les 48 h.

6. Préparation et visualisation de la microscopie

REMARQUE: Cette procédure histologique consiste en des étapes de déshydratation, d’incorporation de paraffine et de réhydratation. Ces étapes peuvent réduire la fluorescence globale des colorants (une limitation mentionnée dans la fiche technique du PKH26). Par conséquent, d’autres procédures, telles que le sectionnement congelé, peuvent être plus appropriées pour la visualisation EV par microscopie confocale.

  1. Incorporez les tissus fixes dans des blocs de paraffine. Coupez le tissu en sections de 6 μm d’épaisseur.
  2. Déparaffiniser les sections tissulaires.
    REMARQUE: Toutes les étapes utilisant du xylène doivent être effectuées dans une hotte.
    1. Immerger les coupes de tissus dans du xylène pendant 30 min, 100% d’éthanol pendant 2 min, 96% d’éthanol pendant 2 min, 75% d’éthanol pendant 1 min, et enfin dans de l’eau distillée pendant 30 s.
  3. Perméabiliser les coupes tissulaires.
    1. Préparer une solution de citrate de sodium à 0,1 % de Triton-0,1 % pour perméabiliser le tissu. Ajouter une goutte de 20 μL à chaque section de tissu et incuber pendant 10 min à température ambiante. Lavez chaque section deux fois avec 20 μL de PBS.
  4. Sur une lame microscopique, ajouter une goutte de milieu de montage contenant du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) avec un milieu de montage aqueux pour préserver la fluorescence. Couvrez la lame contenant 3 coupes de tissu de l’étape 6.3.1.
  5. Incuber les toboggans pendant la nuit à température ambiante, à l’abri de la lumière.
  6. Conserver à 4 °C, à l’abri de la lumière jusqu’à la microscopie confocale.

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Representative Results

Une vue d’ensemble schématique de l’étiquetage des véhicules électriques et de la surveillance de l’absorption est illustrée à la figure 1. La concentration de particules et la taille des VE détectées par la NTA dans le tableau 1 montrent que la concentration de VE diminue au cours du processus en raison de l’étape de purification effectuée deux fois après l’étiquetage avec la colonne. Cependant, la quantité obtenue se situe dans la plage optimale du nombre de particules à utiliser pour le traitement. Cette concentration de particules est utilisée pour calculer le volume de PKH-PL-EV et le contrôle qui sont utilisés pour traiter les explants de cartilage arthrosique.

Une fois que les explants cartilagineux sont traités avec des VE ou le groupe témoin, ils sont fixés pour différentes périodes: 0, 1, 2, 3, 4 et 5 h. Chaque groupe est ensuite paraffinisé, tranché et préparé pour la microscopie confocale avec un support de montage contenant du DAPI. Des images représentatives pour chaque groupe à chaque point temporel sont présentées à la figure 2, montrant comment les VE pénètrent dans le tissu jusqu’à ce qu’ils atteignent les chondrocytes et y pénètrent au fil du temps.

Comme le montre la figure 2,les VE marqués sont déjà localisés autour des chondrocytes (représentés en bleu avec coloration DAPI) après 1 h d’incubation (en rouge avec le colorant PKH26). Un certain fond dû aux restes de colorant peut être observé pour le groupe témoin, qui n’a pas de VE mais qui est traité selon le même protocole que l’échantillon EV. Ces résultats confirment le succès du protocole d’étiquetage des VE, qui peut être utilisé pour surveiller leur migration à travers les tissus dans des essais in vitro, comme indiqué ici, et dans des expériences in vivo.

Figure 1
Figure 1: Vue d’ensemble schématique du protocole d’étiquetage et de surveillance de l’adoption des VÉHICULES. Abréviations : PBS = solution saline tamponnée au phosphate; EV = vésicule extracellulaire; RT = température ambiante; BSA = albumine sérique bovine; NTA = analyse de suivi des nanoparticules; OA = arthrose; TNFα = facteur de nécrose tumorale-alpha; PL = lysat plaquettaire; PFA = paraformaldéhyde; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Images représentatives de l’absorption des VE à différents moments. Images confocales représentatives prises après 0, 1, 2, 3, 4 et 5 h d’explantations de cartilage arthrosique incubées avec des VE marqués PKH ou avec un groupe témoin. Les images ont été prises à 400x. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : OA = arthrose; PL = lysat plaquettaire; EV = vésicule extracellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Concentration (particules/mL) Taille des particules (nm)
PL-EV (initiale) 3,03 × 1011 134.0
NTA-PL-EV sans PKH26 (après le protocole) 8 h 30 × 1010 132.0

Tableau 1 : Caractérisation par analyse de suivi des nanoparticules. Abréviations : OA = arthrose; PL = lysat plaquettaire; EV = vésicule extracellulaire; NTA = analyse de suivi des nanoparticules.

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Discussion

L’imagerie des VE aide à comprendre les propriétés des VE, telles que leurs mécanismes de libération et d’absorption. Leur imagerie permet le suivi de leur biodistribution et la caractérisation de leurs propriétés pharmacocinétiques en tant que véhicules médicamenteux. Cependant, l’imagerie et le suivi des VE peuvent être difficiles en raison de leur petite taille, bien que de nombreux dispositifs d’imagerie et techniques d’étiquetage aient été développés pour aider les chercheurs à surveiller les VE dans des conditions in vitro et in vivo 23,24,25.

Deux possibilités existent lors du suivi des VE par microscopie optique : la bioluminescence et l’imagerie par fluorescence. Les deux sont utilisés pour détecter les véhicules électriques dans le spectre de la lumière visible (390-700 nm). La bioluminescence est un type de chimiluminescence produite après qu’une luciférase catalyse l’oxydation de son substrat. Bien que ce signal nécessite une caméra CCD (Charge-Coupled Device) ultrasensible pour la détection, il a un rapport signal/bruit élevé car le signal ne nécessite pas de source lumineuse externe26.

L’imagerie par fluorescence utilise des protéines ou des colorants organiques qui émettent des signaux après excitation à partir d’une source de lumière externe. Par rapport à la bioluminescence, la fluorescence est plus facile à détecter par une caméra CCD. De plus, en bioluminescence, la toxicité du substrat et la demi-vie de la bioluminescence du substrat doivent être prises en compte pour le suivi en temps réel desVÉHICULES électriques 27,28.

En revanche, le marquage à base de protéines fluorescentes et de colorants organiques a été utilisé avec une excellente résolution en microscopie optique. Bien que l’intensité de fluorescence dépende des niveaux d’expression des protéines EV, de l’efficacité du marquage EV dans les domaines membranaires et de la source lumineuse d’excitation, les colorants de fluorescence fournissent des signaux stables et forts pour l’imagerie EV25. La plupart des colorants fluorescents organiques ont d’abord été utilisés pour l’imagerie de la membrane cellulaire. Ces colorants combinent généralement des fluorophores qui marquent la bicouche lipidique ou les protéines d’intérêt sur les VE via différents groupes fonctionnels29.

Une famille de colorants fluorescents organiques est la famille de colorants PKH lipophiles composée de fluorophores avec une carbocyanine lipophile qui s’ancre dans la bicouche lipidique pour l’imagerie par fluorescence30,31. Les colorants PKH ont été utilisés pour des études in vitro et in vivo car leur demi-vie in vivo varie de 5 à > 100 jours. Ainsi, la persistance du colorant in vivo peut conduire à des résultats trompeurs dans des études de durée plus courte que la demi-vie du colorant. Cependant, les colorants PKH sont utiles comme traceurs pour montrer la migration EV32.

PKH26 est un membre de cette famille de fluorophores lipophiles PKH, présent dans le spectre rouge avec un pic d’excitation à 551 nm et une émission à 567 nm. Cela le rend compatible avec d’autres canaux de détection, tels que la rhodamine, la phycoérythrine ou le DAPI33,permettant la détection, dans ce cas, de la migration des VE marqués de PKH26 vers des chondrocytes marqués de DAPI. Il est important de noter que bien que PL ait été utilisé comme source de VE ici, ce protocole peut être utilisé avec des VE provenant d’autres sources et à d’autres fins, par exemple, pour suivre la distribution in vivo des VE étiquetés.

Ce protocole comporte certaines limites; par exemple, on craint que le PKH26 augmente la taille des VE, ce qui peut affecter leur biodistribution et leur absorption cellulaire. Toutefois, dans les cas où la taille des VÉHICULES a été augmentée de PKH26, la procédure d’étiquetage était différente de celle décrite dans le présent protocole34. Ces chercheurs n’ont pas inclus les étapes de lavage et de purification, conduisant ainsi à des niveaux plus élevés de colorant libre, ce qui pourrait entraîner une plus grande taille de VE. De plus, le protocole actuel surmonte ce problème en effectuant une purification EV parallèle avec et sans PKH26. Cela permet de caractériser un échantillon EV non étiqueté, qui a été traité de manière identique à celle étiquetée. Ainsi, une quantification trompeuse due à des particules confondantes non spécifiquement marquées (lipoprotéines ou contaminants d’échantillons de protéines) ou par la présence de particules non EV dans le mélange de marquage peut être évitée, comme démontré précédemment35,36.

Dans cet article, deux cycles de purification ont été effectués par chromatographie d’exclusion de taille à l’aide de colonnes. La première peut être remplacée par une centrifugation par gradient de saccharose. Cependant, toutes les populations de VE ont été rassemblées dans la même aliquote éluée avec cette colonne et n’ont pas été soumises à des forces g élevées rencontrées dans la centrifugation à grande vitesse. Cependant, éviter la centrifugation peut entraîner un processus plus lent, en particulier si des lavages de colonne sont nécessaires entre les cycles de séparation. Une autre limitation de ce protocole est la nécessité d’une concentration de l’échantillon avant de commencer le processus d’étiquetage en raison du volume limité de la colonne. Ce handicap peut être surmonté en utilisant des colonnes avec une capacité de charge plus élevée.

D’autres protocoles d’étiquetage des VÉHICULES électriques décrivent l’utilisation de différents colorants; cependant, leur utilisation d’étapes d’ultracentrifugation peut nuire à l’intégrité desVÉHICULES ÉLECTRIQUES 37. Le protocole décrit ici a permis de surveiller facilement la migration et l’absorption des VE dans les explants cartilagineux avec un microscope confocal sans fonction particulière. En outre, cela peut être extrapolé à d’autres tissus et échantillons ou conditions lipidiques, tels qu’un essai in vivo.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par l’Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinancée par le Fonds social européen du FSE et le Fonds européen de développement régional du FEDER (MS16/00124; CP16/00124); par le PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financé par la taxe de tourisme durable des îles Baléares; par la Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); par le programme postdoctoral FOLIUM (FOLIUM 17/01) dans le cadre du FUTURMed, financé à 50% par la taxe de tourisme durable des îles Baléares et à 50% par le FSE; et par la Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
1.5 mL Centrifuge tube SPL life sciences PLC60015
1 mL Syringe BD Plastipak BD 303174
2-Propanol (Isopropanol) Panreac AppliChem 1.310.901.211 Prepared at 20% with Milli-Q water
96-well culture plate SPL life sciences PLC30096
Absolute ethanol Pharmpur Scharlab ET0006005P Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water
Biopsy Punch with plunger 3 mm Scandidact MTP-33-32
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Prepared at 5% with PBS
Cartilage explants IdISBa Biobank
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega Pall MCP100C41
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega Pall OD003C33
Cover glass 24 x 60 mm Deltalab D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX medium Biowest L0092
Dulbecco's PBS (1x) Capricorn Scientific PBS-1A
Embedded paraffin tissue blocks IdISBa Biobank Fee for service
Exo-spin mini-HD columns Cell guidance systems EX05
Feather S35 Microtome Blade Feather 43037
Filtropur S 0.2 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F-6057
Oncostatin M Human Sigma-Aldrich O9635-10UG Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 8.18715.1000 Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Solution 100x Biowest L0022
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma-Aldrich MINI26 PKH26 and Dliuent C included
Sodium citrate dihydrate Scharlab SO019911000
Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
TNFα R&D systems 210-TA-005 Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water
Xylene Scharlab XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R Eppendorf 5428000210 F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300 Malvern NS300 Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual Microtome Thermo Scientific™ A78100101
TCS-SPE confocal microscope Leica Microsystems 5200000271

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioingénierie numéro 176
Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux
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Forteza-Genestra, M. A.,… More

Forteza-Genestra, M. A., Antich-Rosselló, M., Ortega, F. G., Ramis-Munar, G., Calvo, J., Gayà, A., Monjo, M., Ramis, J. M. Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (176), e62780, doi:10.3791/62780 (2021).

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