Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62780
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2,4, 1,2,4, 1,2, 1,2
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Cellomics Unit, Institut Universitari d'Investigació en Ciències de la Salut (IUNICS), Universitat de les Illes Balears, 4Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB)

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لتسمية الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الصفائح الدموية لرصد هجرتها وامتصاصها في النباتات الخارجية الغضاريف المستخدمة كنموذج لهشاشة العظام.

Abstract

تستخدم الحويصلات خارج الخلية (EVs) في دراسات مختلفة لإثبات إمكاناتها كعلاج خال من الخلايا بسبب حمولتها المستمدة من مصدرها الخلوي ، مثل lysate الصفائح الدموية (PL). عند استخدامها كعلاج، من المتوقع أن تدخل المركبات الكهربائية الخلايا المستهدفة وتؤثر على استجابة من هذه. في هذا البحث، تمت دراسة المركبات الكهربائية المشتقة من PL كعلاج خال من الخلايا لهشاشة العظام (OA). وهكذا، تم إعداد طريقة لتسمية المركبات الكهربائية واختبار امتصاصها على النباتات الغضاريف. وصفت المركبات الكهربائية المشتقة PL مع صبغة الدهون PKH26، وغسلها مرتين من خلال عمود، ومن ثم اختبارها في نموذج الزراعة العضوية في المختبر يحركها الالتهاب لمدة 5 ساعة بعد تحديد كمية الجسيمات عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). كل ساعة، يتم إصلاح النباتات الغضاريف، paraffined، مقطعة إلى أقسام 6 ميكرومتر لتركيب على الشرائح، ولاحظ تحت المجهر confocal. وهذا يسمح بالتحقق مما إذا كانت المركبات الكهربائية تدخل الخلايا المستهدفة (chondrocytes) خلال هذه الفترة وتحلل تأثيرها المباشر.

Introduction

هشاشة العظام (OA) هو مرض تنكسي مفصلي ينطوي على التهاب تدريجي ولا رجعة فيه وتدمير المصفوفة خارج الخلية للغضاريف المفصلية1. على الرغم من أن أشكال مختلفة من التهاب المفاصل لديها العديد من العلاجات2,3,4, هذه مقيدة بآثارها الجانبية وفعالية محدودة. تقنيات هندسة الأنسجة باستخدام زرع chondrocyte الذاتية يتم تطبيقها بشكل روتيني للعلاج التجديدي للغضاريف المصابة في آفات غضروف الزراعة العضوية في وقت مبكر4. تقتصر العلاجات المستندة إلى الخلايا بشكل رئيسي بسبب العدد المحدود من الخلايا الشوندروجينية المستقرة أو المتجانسات القادرة على إصلاح الغضاريف3بشكل فعال. لذلك ، فإن وضع استراتيجيات علاجية جديدة لمنع تطور المرض وتجديد آفات الغضاريف الكبيرة له أهمية قصوى.

الحويصلات خارج الخلية (EVs) وقد اقترح كعلاج لOA من قبل مؤلفين مختلفين5,6. المركبات الكهربائية هي أجسام ممبرانية تفرزها غالبية أنواع الخلايا ، وتشارك في الإشارات بين الخلايا ، وقد ثبت أنها تمارس الآثار العلاجية للخلايا الجذعية7،8،9، والتي أثارت مؤخرا اهتماما بالطب التجديدي10. المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا النجمية المتوسطة (MSCs) هي المركبات الكهربائية العلاجية الرئيسية التي تم التحقيق فيها ل OA ، على الرغم من استخدام الخلايا الأخرى ذات الصلة بالمفاصل كمصادر EV ، على سبيل المثال ، chondroprogenitors أو الخلايا المناعية11،12.

وتستخدم تركيزات الصفائح الدموية، مثل lysates الصفائح الدموية (PLs)، لتعزيز التئام الجروح في إصابات مختلفة، مثل قرحة القرنية13،14،15 أو في تجديد أنسجة الأوتار16،بسبب فرضية أن مكون EV من مركزات الصفائح الدموية قد تكون مسؤولة عن هذه الآثار17 . تستخدم بعض الدراسات المتعلقة بالأمراض المرتبطة بالمفاصل المركبات الكهربائية المشتقة من الصفائح الدموية (PL-EVs) كعلاج لتحسين حالات هشاشة العظام. PL-EVs تحسين انتشار chondrocyte وهجرة الخلايا عن طريق تفعيل Wnt / β-catenin المسار18, تعزيز التعبير عن علامات الشوندروجيني في chondrocytes هشاشة العظام19, أو تظهر مستويات أعلى من البروتينات الشوندروجينية وتشوهات أقل تيسي في الأرانب هشاشة العظام تعامل مع PL-EVs18.

تحتوي المركبات الكهربائية على البروتينات والدهون والأحماض النووية التي يتم تحريرها إلى الخلية المستهدفة ، مما يؤسس للاتصال من خلية إلى خلية ، وهي الميزة الرئيسية المتعلقة بتطبيقاتها العلاجية20. تعتمد آثار المركبات الكهربائية على وصولها إلى الخلايا وإطلاق الشحنات اللاحقة. يمكن تأكيد هذا التأثير بشكل غير مباشر من خلال التغيرات التي تحدث في الخلايا، مثل النشاط الأيضي أو تعديل التعبير الجيني. ومع ذلك، لا تسمح هذه الطرق تصور كيفية وصول المركبات الكهربائية إلى الخلايا لممارسة وظيفتها. وهكذا، تقدم هذه الورقة طريقة لتسمية هذه المركبات الكهربائية المشتقة من PL لاستخدامها كعلاج لنباتات غضروف الزراعة العضوية التي يحركها الالتهاب. تم استخدام المجهر Confocal لرصد امتصاص EV والتقدم إلى chondrocytes موجودة في explants في الفاصل الزمني من 5 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم الحصول على نباتات الغضروف من البنك الحيوي IdISBa (IB 1995/12 BIO) وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية بعد الموافقة الأخلاقية للمشروع من قبل CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. إعداد العمود

  1. أعمدة متساوية تتبع إرشادات الشركة المصنعة أو كما يلي:
    1. قم بإزالة غطاء العمود وتوازن العمود. قم بإزالة المخزن المؤقت للتخزين بواسطة الوضوء.
    2. اغسل العمود 3 مرات مع 2.5 مل من المالحة المخزنة بالفوسفات (PBS). أثناء كل غسل، انتظر حتى يمتص العمود الحجم بالكامل.
      ملاحظة: لا تدع العمود الجاف.
    3. قم بتغطية العمود بالغطاء بعد الغسيل الأخير وحتى إعداد العينة.

2. EV وضع العلامات

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول وضع العلامات EV عينة PL-EV معزولة مسبقا عن طريق اللونيات استبعاد الحجم (SEC) مع الشروط الموضحة سابقا21,22. ومع ذلك، قد يتم استخدام أي نموذج EV من أي مصدر مع هذا البروتوكول.

  1. ركز عينة EV والتحكم (PBS) باستخدام أنبوب التركيز.
    1. ضع العينات في أنبوب تركيز 15 مل أو 500 ميكرولتر، اعتمادا على حجم بدء تشغيل عينة EV. طرد الأنابيب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة حتى يتم الحصول على عينة شبه جافة.
      ملاحظة: عينة عنصر التحكم ضروري للتحقق من أي خلفية صبغ. على الرغم من أن هذه الطريقة لا تتطلب أي حجم أولي محدد ، إلا أنه ينبغي النظر إلى أن حوالي 10٪ من الجسيمات ستفقد أثناء خطوات التنقية.
  2. إعادة تشغيل العينات المركزة مع عينات EV C. Resuspend مع 200 ميكرولتر ومجموعة التحكم مع 100 ميكرولتر ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل جديدة.
  3. فصل عينة EV إلى اثنين من aliquots من 100 ميكرولتر. مارك واحد مع صبغ واستخدامها كعلاج (PKH-PL-EV); ترك أخرى غير ملحوظ ولكن معالجته (NTA-PL-EV) مثل عينة EV واستخدامه لتحديد تركيز EV بواسطة NTA.
  4. إعداد محلول صبغ 2x، مما أدى إلى 8 ميكرومتر PKH26 الحل في C diluent.
  5. مزيج 1 ميكرولتر من 1 mM PKH26 رابط لكل 125 ميكرولتر من درجة C في العينة. إعداد وحدة تخزين مطلوبة لإضافتها إلى العينات بنسبة 1:1.
  6. إضافة محلول صبغ 2X إلى PKH-PL-EV وعينات التحكم في نسبة 1:1 لتحقيق تركيز صبغة 1x وتركيز 4 μM PKH26. إضافة نفس حجم برنامج تلفزيوني إلى عينة NTA-PL-EV. حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. إضافة 5٪ مصل البقر الألبومين-PBS الحل للعينات في نسبة 1:1 وضمان أن الحجم النهائي هو ~ 400 ميكرولتر.
    ملاحظة: تسمح هذه الخطوة بإزالة التفاعلات الصبغية غير المحددة أو الصبغة غير المنضمة.
  8. تابع فصل المركبات الكهربائية المسماة عن الصبغة غير المنضمة والتفاعلات غير المحددة للصبغة مع العمود.

3. وصفت EV العزلة

  1. قم بإزالة الغطاء من العمود، وأضف 400 ميكرولتر من العينة (PKH-PL-EV أو NTA-PL-EV أو التحكم)، وتجاهل جميع السائل المفرغ.
  2. انتظر حتى تدخل العينة العمود تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتجاهل جميع السائل الملوت.
  3. انتظر برنامج تلفزيوني لإدخال العمود تماما قبل المتابعة إلى الخطوة التالية. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وجمع جزء من 600 ميكرولتر في 1.5. mL أنبوب الطرد المركزي (EVs أو التحكم).
    ملاحظة: هذه الخطوات مطلوبة لإزالة الصبغة الزائدة من العينات. هناك حاجة إلى فصل آخر حسب العمود للحصول على أنقى المركبات الكهربائية. وهكذا، يجب تنفيذ الخطوات التالية في عمود جديد متساوية (الخطوة 4.1.) أو العمود نفسه بعد خطوة غسل أولية (الخطوة 4.2).
  4. قم بإعداد العمود لخطوة فصل EV جديدة للحصول على المركبات الكهربائية أنقى. إذا كان عمود جديد كرر الخطوات 2.1. و2.2. إذا كان نفس العمود، اغسل العمود ب 2.5 مل من 20٪ ايزوبروبانول ثم كرر الخطوتين 2.1 و2.2.
  5. إضافة 600 ميكرولتر من EVs التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.5 إلى العمود وتجاهل وحدة التخزين eluted. انتظر حتى يدخل السائل العمود تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  6. إضافة 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وتجاهل جميع حجم eluted. انتظر حتى يدخل السائل العمود تماما قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  7. إضافة 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وجمع جزء من 600 ميكرولتر في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. استخدم المركبات الكهربائية وعينات التحكم لإجراء مزيد من التحليلات أو تخزينها بين عشية وضحاها عند 4 oC.
  8. تخزين الأعمدة المستخدمة للاستخدام في المستقبل.
    1. غسل العمود مع 25 مل من 20٪ isopropanol وتجاهل حجم eluted. غسل العمود 3 مرات مع 2.5 مل من برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة المخزن المؤقت التخزين إزالة في الخطوة 1.1.1 وانتظر المخزن المؤقت لإدخال العمود. قم بتغطية العمود بالغطاء وتخزينه عند 4 oC حتى الاستخدام اللاحق.

4. EV القياس الكمي

  1. إعداد 1:1,000 تخفيف عينة NTA-PL-EV وعينة PL-EV الأولية كما هو موضح في الخطوتين التاليتين.
    1. إعداد 1 مل من 1:10 المخفف NTA-PL-EV و 1 مل من 1:10 المخفف الأولي PL-EV مع برنامج تلفزيوني تصفيتها من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
    2. إعداد 1 مل من تخفيف 1:100 من العينات المخففة السابقة مع برنامج تلفزيوني تصفيتها من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
  2. حقن 1:1,000 المخفف NTA-PL-EV عينة أو عينة PL-EV الأولية باستخدام حقنة معقمة في مضخة NTA. اتبع إرشادات الشركة المصنعة وتوصياتها لتركيز الجسيمات وتحديد توزيع الحجم.
    ملاحظة: بما أن تركيز EV يعتمد على حجم بداية العينة، فقد يكون من الضروري قراءة المخففات المتوسطة وإجراء تعديلات للحصول على تحديد NTA الصحيح.

5. المركبات الكهربائية المستخدمة كعلاج لالتهاب الزراعة العضوية يحركها

  1. غسل الغضروف مرتين مع برنامج تلفزيوني والمكوس باستخدام لكمة خزعة قطرها 3 ملم في ظل ظروف معقمة.
    ملاحظة: تنفيذ الإجراء من الخطوات 5.1 إلى 5.6 في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية.
  2. وضع explants في لوحات ثقافة 96 جيدا مع DMEM-F12 المتوسطة تكملها مع 1٪ البنسلين-streptomycin في 37 oC، 5٪ CO2،والرطوبة 80٪.
    1. لإنشاء نموذج الزراعة العضوية يحركها الالتهاب، تكملة المتوسطة ثقافة الخلية مع 10 نانوغرام / مل أونكوستاتين M و 2 نانوغرام / مل عامل نخر الورم ألفا (TNFα).
  3. علاج explants مع 1 × 109 جزيئات / بئر من المركبات الكهربائية المسماة (PKH-PL-EV) أو التحكم في زراعة الخلايا المتوسطة تكملها oncostatin M و TNFα.
    ملاحظة: قياس حجم العينة التي تحتوي على 1 × 109 جزيئات / جيدا واستخدام نفس حجم التحكم.
  4. إزالة المتوسطة من لوحات ثقافة الخلية 96 جيدا التي تحتوي على explants الغضاريف. إضافة 200 ميكرولتر من الخلايا الثقافة المتوسطة الموصوفة في الخطوة 5.3 إلى كل بئر.
    ملاحظة: إذا كانت اللوحات المكونة من 96 بئرا على اتصال بمصل الأبقار الجنيني (FBS)، فاغسل كل بئر ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإزالة أي مركبات كهربائية من FBS.
  5. أوقف الفحص في المختبر في أوقات مختلفة: 0 و1 و2 و3 و4 و5 ساعة.
  6. غسل آبار ثقافة الخلية التي تحتوي على explants الغضاريف مرتين مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) إلى الأنسجة لإصلاحه لمدة 3 ساعة في 4 oC.
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التي تتضمن PFA في غطاء الدخان باتباع توصيات ورقة بيانات الأمان.
  8. إزالة PFA، إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وتخزين الأنسجة الثابتة في 4 درجة مئوية، ومعالجة العينات في غضون 48 ساعة.

6. إعداد المجهر والتصور

ملاحظة: يتكون هذا الإجراء النسيجي من الجفاف، وتضمين البارافين، وخطوات الإماهة. قد تقلل هذه الخطوات من تفلور الصبغة بشكل عام (وهو قيد مذكور في ورقة البيانات ل PKH26). لذلك ، قد تكون الإجراءات الأخرى ، مثل تقسيم المجمدة ، أكثر ملاءمة للتصور EV عن طريق المجهر confocal.

  1. تضمين الأنسجة الثابتة في كتل البارافين. قطع الأنسجة إلى 6 أجزاء ميكرومتر سميكة.
  2. إزالة الأنسجة من الأقسام.
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات باستخدام xylene في غطاء محرك السيارة fume.
    1. تزج أقسام الأنسجة في xylene لمدة 30 دقيقة، 100٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة، 96٪ الإيثانول لمدة 2 دقيقة، 75٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة، وأخيرا في الماء المقطر لمدة 30 s.
  3. Permeabilize أقسام الأنسجة.
    1. إعداد 0.1٪ تريتون-0.1٪ محلول سيترات الصوديوم لبيرميابيليز الأنسجة. أضف قطرة 20 ميكرولتر إلى كل قسم من أقسام الأنسجة واحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل كل قسم مرتين مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
  4. على الشريحة المجهرية، إضافة قطرة من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) مع وسط تصاعد مائي للحفاظ على مضان. قم بتغطية الشريحة التي تحتوي على 3 أقسام نسيجية من الخطوة 6.3.1.
  5. احتضان الشرائح بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
  6. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، محمي من الضوء حتى الفحص المجهري البؤري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم عرض نظرة عامة تخطيطية ل EV وضع العلامات ومراقبة امتصاص في الشكل 1. يظهر تركيز الجسيمات وحجم EV الذي اكتشفه NTA في الجدول 1 أن تركيز EV ينخفض أثناء العملية بسبب خطوة التنقية التي أجريت مرتين بعد وضع العلامات مع العمود. ومع ذلك، فإن الكمية التي تم الحصول عليها هي في النطاق الأمثل لعدد الجسيمات لاستخدامها في العلاج. يتم استخدام هذا التركيز الجسيمات لحساب حجم PKH-PL-EV والتحكم التي تستخدم لعلاج النباتات الخارجية الغضاريف المفاصل.

بمجرد معالجة النباتات الغضاريف مع المركبات الكهربائية أو مجموعة التحكم، يتم إصلاحها لفترات مختلفة: 0، 1، 2، 3، 4، و 5 ساعة. ثم يتم paraffinized كل مجموعة، شرائح، وإعدادها للمجهر confocal مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI. يتم عرض الصور التمثيلية لكل مجموعة في كل نقطة زمنية في الشكل 2، والتي تبين كيف تدخل المركبات الكهربائية الأنسجة حتى تصل إلى chondrocytes وتدخلها بمرور الوقت.

كما رأينا في الشكل 2، يتم بالفعل توطين المركبات الكهربائية المسماة حول chondrocytes (تظهر باللون الأزرق مع تلطيخ DAPI) بعد 1 ساعة من الحضانة (تظهر باللون الأحمر مع صبغة PKH26). يمكن ملاحظة بعض الخلفية بسبب صبغة بقايا لمجموعة التحكم، والتي ليس لديها المركبات الكهربائية ولكن تتم معالجتها باتباع نفس البروتوكول كعينة EV. تؤكد هذه النتائج نجاح البروتوكول لتسمية المركبات الكهربائية، والتي يمكن استخدامها لرصد هجرتها من خلال الأنسجة في المقايسات المختبرية، كما هو موضح هنا، وفي تجارب الجسم الحي.

Figure 1
الشكل 1:نظرة عامة تخطيطية لبروتوكول مراقبة وضع العلامات على EV والإقبال عليها. الاختصارات: PBS = ملحي عازل بالفوسفات؛ EV = الحويكل خارج الخلية; RT = درجة حرارة الغرفة. BSA = ألبوم مصل البقر; NTA = تحليل تتبع الجسيمات النانوية؛ OA = هشاشة العظام; TNFα = عامل نخر الورم ألفا; PL = الصفائح الدموية lysate; PFA = بارافورمالديهايد; DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صور تمثيلية لامتصاص EV في أوقات مختلفة. صور ممثل Confocal التي اتخذت بعد 0, 1, 2, 3, 4, و 5 ح من explants الغضاريف المفاصل المحتضنة مع المركبات الكهربائية PKH المسمى أو مع مجموعة مراقبة. تم التقاط الصور في 400x. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. المختصرات: OA = هشاشة العظام; PL = الصفائح الدموية lysate; EV = الحويكل خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التركيز (الجسيمات/مل) حجم الجسيمات (نانومتر)
PL-EVs (أولي) 3.03 × 1011 134.0
NTA-PL-EVs بدون PKH26 (بعد البروتوكول) 8.30 × 1010 132.0

الجدول 1: التوصيف حسب تحليل تتبع الجسيمات النانوية. المختصرات: OA = هشاشة العظام; PL = الصفائح الدموية lysate; EV = الحويكل خارج الخلية; NTA = تحليل تتبع الجسيمات النانوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يساعد التصوير EV على فهم خصائص EV، مثل آليات إطلاقها واستيعابها. يسمح تصويرهم بمراقبة التوزيع الحيوي وتوصيف خصائصهم الدوائية كمركبات دوائية. ومع ذلك، قد يكون التصوير EV وتتبع صعبة نظرا لأحجامها الصغيرة، على الرغم من أن العديد من أجهزة التصوير وتقنيات وضع العلامات قد وضعت لمساعدة الباحثين مراقبة المركبات الكهربائية تحت في المختبر وفي ظروف الجسم الحي 23،24،25.

هناك احتمالان عند تتبع المركبات الكهربائية عن طريق المجهر البصري: الإضاءة الحيوية والتصوير الفلوري. وتستخدم كل من للكشف عن المركبات الكهربائية داخل طيف الضوء المرئي (390-700 نانومتر). الإضاءة الحيوية هو نوع من chemiluminescence المنتجة بعد لوسيفيراز يحفز أكسدة ركيزته. على الرغم من أن هذه الإشارة تتطلب كاميرا جهاز فائق الحساسية مقترنة بالشحن (CCD) للكشف عنها ، إلا أنها تحتوي على نسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء حيث أن الإشارة لا تتطلب مصدر ضوء خارجي26.

يستخدم التصوير الفلوري البروتينات أو الأصباغ العضوية التي تنبعث منها إشارات بعد الإثارة من مصدر ضوء خارجي. بالمقارنة مع الإضاءة الحيوية ، من الأسهل اكتشاف الفلورسينس بواسطة كاميرا CCD. وعلاوة على ذلك، في الإضاءة الحيوية، وينبغي النظر في سمية الركيزة ونصف العمر من الإضاءة الحيوية للركيزة لتتبع EV في الوقت الحقيقي27،28.

وعلى النقيض من ذلك، تم استخدام الوسم الفلوري القائم على البروتين والعضوية بالصبغة بدقة ممتازة في المجهر البصري. على الرغم من أن كثافة الفلورية تعتمد على مستويات التعبير عن البروتين EV ، وكفاءة وضع العلامات EV في مجالات الغشاء ، ومصدر ضوء الإثارة ، توفر الأصباغ الفلورية إشارات مستقرة وقوية للتصوير EV25. استخدمت معظم الأصباغ الفلورية العضوية في البداية لتصوير غشاء الخلية. هذه الأصباغ عموما الجمع بين الفلوروفوريس التي تسمية ثنائي الطبقة الدهنية أو البروتينات ذات الفائدة على المركبات الكهربائية عن طريق مجموعات وظيفية مختلفة29.

عائلة واحدة صبغ الفلورسنت العضوية هي عائلة صبغ PKH lipophilic تتكون من الفلوروفورس مع carbocyanine lipophilic أن المراسي في طبقة ثنائية الدهون للتصوير الفلوري30،31. وقد استخدمت الأصباغ PKH في المختبر وفي دراسات الجسم الحي كما في الجسم الحي نصف العمر يتراوح من 5 إلى >100 يوما. وبالتالي ، فإن استمرار الصبغة في الجسم الحي قد يؤدي إلى نتائج مضللة في دراسات أقصر مدة من نصف عمر الصبغة. ومع ذلك، الأصباغ PKH مفيدة كما التتبع لإظهار EV الهجرة32.

PKH26 هو عضو في هذه الأسرة الفلورية الفلوروفورية PKH، وجدت في الطيف الأحمر مع ذروة الإثارة في 551 نانومتر والانبعاثات في 567 نانومتر. وهذا يجعلها متوافقة مع قنوات الكشف الأخرى، مثل رودامين، فيكوريثرين، أو DAPI33،مما يسمح للكشف، في هذه الحالة، هجرة المركبات الكهربائية ملحوظ مع PKH26 نحو chondrocytes ملحوظ مع DAPI. من المهم ملاحظة أنه على الرغم من استخدام PL كمصدر EV هنا ، يمكن استخدام هذا البروتوكول مع المركبات الكهربائية من مصادر أخرى ولأغراض أخرى ، على سبيل المثال ، لتتبع التوزيع في الجسم الحي للمركبات الكهربائية.

هذا البروتوكول له بعض القيود; على سبيل المثال ، هناك بعض المخاوف من أن PKH26 يزيد من حجم EV ، مما قد يؤثر على التوزيع الحيوي وامتصاص الخلوية. ومع ذلك، في مثل هذه الحالات حيث تم زيادة حجم EV بواسطة PKH26، كان إجراء وضع العلامات مختلفا عن ذلك الموصوف في هذا البروتوكول34. لم يتضمن هؤلاء الباحثون خطوات الغسيل والتنقية ، مما أدى إلى مستويات أعلى من الصبغة الحرة ، والتي يمكن أن تسبب حجم EV أكبر. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول يتغلب على هذه المشكلة من خلال تنفيذ تنقية EV موازية مع وبدون PKH26. وهذا يسمح بوصف عينة EV غير المسماة، والتي تمت معالجتها بشكل مماثل للعينة المسماة. وهكذا، يمكن تجنب القياس الكمي المضلل بسبب الجسيمات غير المحددة العلامات المحيرة (البروتين الدهني أو ملوثات عينة البروتين) أو بسبب وجود جزيئات غير EV داخل خليط وضع العلامات، كما هو موضح سابقا35،36.

في هذه الورقة، تم تنفيذ دورتين من تنقية عن طريق الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم باستخدام الأعمدة. ويمكن استبدال أول واحد عن طريق الطرد المركزي التدرج السكروز. ومع ذلك، تم جمع جميع السكان EV في نفس aliquot eluted مع هذا العمود وليس عرضة لقوات ز عالية واجهت في الطرد المركزي عالية السرعة. ومع ذلك، قد يؤدي تجنب الطرد المركزي إلى عملية أبطأ، خاصة إذا كانت هناك حاجة إلى غسل العمود بين دورات الفصل. وهناك قيد آخر لهذا البروتوكول هو الحاجة إلى تركيز العينة قبل بدء عملية وضع العلامات بسبب الحجم المحدود للعمود. يمكن التغلب على هذا العائق باستخدام أعمدة ذات قدرة تحميل أعلى.

تصف بروتوكولات وضع العلامات EV الأخرى استخدام الأصباغ المختلفة؛ ومع ذلك ، فإن استخدامها لخطوات الطرد المركزي الفائق قد يضر سلامة EV37. وقد سمح البروتوكول الموصوف هنا بمراقبة هجرة EV والإقبال على النباتات الغضاريف بسهولة باستخدام مجهر كونفوجكال دون أي وظيفة معينة. وعلاوة على ذلك، قد يتم استقراء هذا إلى الأنسجة الأخرى وعينات الدهون أو الشروط، مثل في فحص الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد مول هذا البحث معهد سالود كارلوس الثالث، الوزير الاقتصادي، الذي شارك في تمويله الصندوق الاجتماعي الأوروبي وصندوق التنمية الإقليمية الأوروبي التابع للصندوق الأوروبي للتنمية الاقتصادية (MS16/00124؛ CP16/00124); بواسطة PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS، construyendo SALUD، جينيراندو فالور (JUNIOR01/18)، بتمويل من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار؛ من قبل Direcció العام d'Investigació، كونسيليريا دي إنفيستيغاسيو، الحكم بالار (FPI/2046/2017)؛ من برنامج FOLIUM ما بعد الدكتوراه (FOLIUM 17/01) ضمن FUTURMed ، الممول بنسبة 50٪ من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار و 50٪ من قبل ESF ؛ ومن قبل لجنة دوسينسيا إي إنفيستياسيو دي لا فونداسيو بانك دي سانغ إي تيكسيتس دي ليه إيلي بالار (CDI21/03).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
1.5 mL Centrifuge tube SPL life sciences PLC60015
1 mL Syringe BD Plastipak BD 303174
2-Propanol (Isopropanol) Panreac AppliChem 1.310.901.211 Prepared at 20% with Milli-Q water
96-well culture plate SPL life sciences PLC30096
Absolute ethanol Pharmpur Scharlab ET0006005P Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water
Biopsy Punch with plunger 3 mm Scandidact MTP-33-32
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030 Prepared at 5% with PBS
Cartilage explants IdISBa Biobank
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega Pall MCP100C41
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega Pall OD003C33
Cover glass 24 x 60 mm Deltalab D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX medium Biowest L0092
Dulbecco's PBS (1x) Capricorn Scientific PBS-1A
Embedded paraffin tissue blocks IdISBa Biobank Fee for service
Exo-spin mini-HD columns Cell guidance systems EX05
Feather S35 Microtome Blade Feather 43037
Filtropur S 0.2 µm syringe filter Sarstedt 83.1826.001
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F-6057
Oncostatin M Human Sigma-Aldrich O9635-10UG Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 8.18715.1000 Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Solution 100x Biowest L0022
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma-Aldrich MINI26 PKH26 and Dliuent C included
Sodium citrate dihydrate Scharlab SO019911000
Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Scientific J1800AMNZ
TNFα R&D systems 210-TA-005 Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water
Xylene Scharlab XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R Eppendorf 5428000210 F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300 Malvern NS300 Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual Microtome Thermo Scientific™ A78100101
TCS-SPE confocal microscope Leica Microsystems 5200000271

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
  2. Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
  3. Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
  4. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  5. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  6. Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
  8. Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
  9. Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
  10. Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
  11. D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
  12. Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
  13. El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
  14. Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
  15. Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, Suppl. 1 289-292 (2007).
  16. Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
  17. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
  18. Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
  19. Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
  20. Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
  21. Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
  22. de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  23. Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
  24. Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
  25. Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
  26. Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
  27. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
  28. Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
  29. Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
  30. Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
  31. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  32. Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
  33. Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
  34. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
  35. Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  36. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
  37. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 176،
وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Forteza-Genestra, M. A.,… More

Forteza-Genestra, M. A., Antich-Rosselló, M., Ortega, F. G., Ramis-Munar, G., Calvo, J., Gayà, A., Monjo, M., Ramis, J. M. Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (176), e62780, doi:10.3791/62780 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter