Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון שלטי דם חוץ-תאיים שמקורם בטסיות דם כדי לפקח על נדידתם וקליטתם בגזירי סחוס המשמשים כמודל לדלקת מפרקים ניוונית.
Abstract
שלל חוץ-תאי (EVs) משמשים במחקרים שונים כדי להוכיח את הפוטנציאל שלהם כטיפול ללא תאים בשל המטען שלהם נגזר מהמקור הסלולרי שלהם, כגון טסיות דם ליסאט (PL). כאשר נעשה שימוש כטיפול, EVs צפויים להיכנס לתאי היעד ולחולל תגובה מאלה. במחקר זה, EVs שמקורו PL נחקרו כטיפול ללא תאים עבור דלקת מפרקים ניוונית (OA). לכן, נקבעה שיטה לסימון רכבים דרכים אלקטרוניים ולבחון את ספיגתם על מגרשי סחוס. כלי עבודה חשמליים שמקורם ב-PL מסומנים בצבע ליפופילי PKH26, נשטפים פעמיים דרך עמוד, ולאחר מכן נבדקים במודל OA מונע דלקת במבחנה למשך 5 שעות לאחר כימות חלקיקים על ידי ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA). לפי שעה, explants סחוס קבועים, paraffined, לחתוך 6 מקטעים מיקרומטר לעלות על שקופיות, ונצפו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. הדבר מאפשר אימות אם EVs להזין את תאי היעד (chondrocytes) במהלך תקופה זו ולנתח את ההשפעה הישירה שלהם.
Introduction
דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלה ניוונית מפרקית המרמזת על דלקת מתקדמת ובלתי הפיכה והרס של המטריצה החוץ תאית של הסחוס המפרקי1. למרות צורות שונות של דלקת פרקים יש טיפולים רבים2,3,4, אלה מוגבלים על ידי תופעות הלוואי שלהם ויעילות מוגבלת. טכניקות הנדסת רקמות באמצעות השתלת כונדרוציטים אוטולוגית מיושמות באופן שגרתי לטיפול רגנרטיבי של סחוס פצוע בפצעים סחוס מוקדם OA4. טיפולים מבוססי תאים מוגבלים בעיקר בשל המספר המוגבל של כונדרוציטים יציבים פנוטיפיקית או chondroprogenitors המסוגלים לתקן ביעילות את הסחוס3. לכן, פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות למניעת התקדמות המחלה וחידוש נגעים סחוס גדולים הוא בעל חשיבות עליונה.
שלל חוץ תאי (EVs) הוצעו כטיפול OA על ידי מחברים שונים5,6. רכבים יפים הם גופים membranous המופרשים על ידי רוב סוגי התאים, מעורבים איתות בין תאי, הוכחו להפעיל את ההשפעות הטיפוליות של תאי גזע7,8,9, שבגללם הם עוררו לאחרונה עניין ברפואה רגנרטיבית10. EVs נגזר תאים סטרומיים mesenchymal (MSCs) הם EVs הטיפולי העיקרי נחקר עבור OA, אם כי תאים אחרים הקשורים למפרקים שימשו כמקורות EV, למשל, chondroprogenitors או תאים חיסוניים11,12.
תרכיזי טסיות דם, כגון טסיות דם (PLs), משמשים כדי לשפר את ריפוי הפצע בפציעות שונות, כגון כיבים קרנית13,14,15 או התחדשות רקמתגיד 16, בגלל ההשערה כי רכיב EV של תרכיזי טסיות דם עשוי להיות אחראי על תופעות אלה17 . מחקרים מסוימים הקשורים למחלות הקשורות למפרקים משתמשים בטסיות דם אלקטרוניות (PL-EVs) כטיפול כדי לשפר מצבים אוסטיאוארטיטיקה. PL-EVs לשפר את התפשטות chondrocyte ונדידת תאים על ידי הפעלת Wnt / β-catenin מסלול18, קידום הביטוי של סמנים chondrogenic בכונדרוציטים osteoarthritic19, או מראה רמות גבוהות יותר של חלבונים כונדרוגניים ופחות חריגות tissular בארנבות osteoarthritic שטופלו PL-EVs18.
רכבים אופניים מכילים חלבונים, שומנים וחומצות גרעין המשוחררים לתא היעד, ומבססים תקשורת בין תאים, שהיא התכונה העיקרית הקשורה ליישומים הטיפוליים שלהם20. ההשפעות של רכבים הפעלה אלקטרוניים תלויות בתאים המגיעים אליהם ובשחרור המטען הבא. השפעה זו יכולה להיות מאושרת בעקיפין על ידי שינויים הנגרמים בתאים, כגון פעילות מטבולית או שינוי ביטוי גנים. עם זאת, שיטות אלה אינן מאפשרות הדמיה של האופן שבו EVs להגיע לתאים כדי להפעיל את הפונקציה שלהם. לכן, מאמר זה מציג שיטה לתייג את אלה PL נגזר רכבים רחפנים לשמש כטיפול עבור דלקת מונע סחוס explants. מיקרוסקופיה קונפוקלית שימשה לניטור ספיגת EV והתקדמות chondrocytes הנוכחי explants ב- time-lapse של 5 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: מגרשי סחוס התקבלו מהביובנק IdISBa (IB 1995/12 BIO) בהתאם להנחיות המוסדיות לאחר אישור אתי של הפרויקט על ידי ה- CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. הכנת טורים
- עקוב אחר עמודות שיווי משקל בהתאם להוראות היצרן או באופן הבא:
- הסר את מכסה העמודה ושיילו את העמודה. הסר את מאגר האחסון על ידי אלגנטיות.
- לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 2.5 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS). במהלך כל שטיפה, המתן עד שהעמודה תספוג את כל עוצמת הקול.
הערה: אל תיתן לעמודה להתייבש. - מכסים את העמודה עם המכסה לאחר הכביסה האחרונה ועד הכנת המדגם.
2. תיוג EV
הערה: פרוטוקול תיוג EV זה משתמש במדגם PL-EV שבודד בעבר על-ידי כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) עם תנאים שתוארו בעבר21,22. עם זאת, כל דגימת EV ממקור כלשהו עשויה לשמש עם פרוטוקול זה.
- מרכז את דגימת EV ואת השליטה (PBS) באמצעות צינור ריכוז.
- מקם את הדגימות בצינור ריכוז 15 מ"ל או 500 μL, בהתאם לנפח ההתחלתי של דגימת EV החל. צנטריפוגות הצינורות על פי הוראות היצרן עד לקבלת דגימה כמעט יבשה.
הערה: דגימת הבקרה נחוצה כדי לבדוק אם יש רקע צבע. למרות שיטה זו אינה דורשת כל נפח ראשוני ספציפי, יש לקחת בחשבון כי סביב 10% של חלקיקים יאבדו במהלך שלבי טיהור.
- מקם את הדגימות בצינור ריכוז 15 מ"ל או 500 μL, בהתאם לנפח ההתחלתי של דגימת EV החל. צנטריפוגות הצינורות על פי הוראות היצרן עד לקבלת דגימה כמעט יבשה.
- Resuspend הדגימות המרוכזות עם דגימות EV דילול C. Resuspend עם 200 μL וקבוצת הביקורת עם 100 μL ולהעביר אותם צינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל חדשים.
- להפריד את דגימת EV לשני aliquots של 100 μL. לסמן אחד עם צבע ולהשתמש בו כטיפול (PKH-PL-EV); להשאיר את השני לא מסומן אבל לעבד אותו (NTA-PL-EV) כמו מדגם EV ולהשתמש בו כדי לכמת את ריכוז EV על ידי NTA.
- הכן פתרון 2x צבע, וכתוצאה מכך 8 מיקרומטר PKH26 פתרון ב- C דילול.
- לערבב 1 μL של 1 mM PKH26 מקשר לכל 125 μL של דילול C במדגם. הכן אמצעי אחסון הדרוש להוספה לדגימות ביחס של 1:1.
- הוסיפו תמיסת צבע 2x לדגימות PKH-PL-EV ובקרה ביחס של 1:1 כדי להשיג ריכוז צבע 1x וריכוז PKH26 של 4 מיקרומטר. הוסף את אותו נפח של PBS לדגימת NTA-PL-EV. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 5% סרום בקר אלבומין-PBS פתרון הדגימות ביחס 1:1 ולהבטיח כי עוצמת הקול הסופי הוא ~ 400 μL.
הערה: שלב זה מאפשר הסרה של אינטראקציות צבע לא-מיניות או צבע לא מאוגד. - המשך להפריד את ה- EVs המסומנים מהצבע הלא מאוגד והאינטראקציות הלא-מדעיות של הצבע עם העמודה.
3. בידוד EV מתויג
- הסר את המכסה מהעמודה, הוסף 400 μL של המדגם (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV, או בקרה), ולהשליך את כל הנוזל eluted.
- המתן עד שהדוגמה תוזן בעמודה לחלוטין לפני שתמשיך לשלב הבא. מוסיפים 600 μL של PBS ומשליכים את כל הנוזלים הנבהים.
- המתן עד שה- PBS יכניס את העמודה במלואה לפני שתמשיך לשלב הבא. הוסף 600 μL של PBS ולאסוף שבריר של 600 μL ב 1.5. mL צינור צנטריפוגה (EVs או שליטה).
הערה: שלבים אלה נדרשים כדי להסיר את הצבע העודף מהדגימות. הפרדה נוספת לפי עמודה נדרשת כדי להשיג EVs טהור יותר. לפיכך, השלבים הבאים צריכים להתבצע בעמודה חדשה שישוות (שלב 4.1)או באותה עמודה לאחר שלב כביסה ראשוני (שלב 4.2). - הכן את העמודה לשלב הפרדת EV חדש כדי להשיג EVs טהור יותר. אם זוהי עמודה חדשה, חזור על שלבים 2.1. ו-2.2. אם זה אותו עמודה, לשטוף את העמודה עם 2.5 מ"ל של 20% איזופרופנול ולאחר מכן לחזור על שלבים 2.1 ו 2.2.
- הוסף 600 μL של EVs eluted בעבר שהושגו בשלב 2.5 לעמודה ולבטל את אמצעי האחסון הנבהר. המתן עד שהנוזל יכניס את העמודה במלואה לפני שתמשיך לשלב הבא.
- הוסף 400 μL של PBS והשלך את כל אמצעי האחסון הנבה. המתן עד שהנוזל יכניס את העמודה במלואה לפני שתמשיך לשלב הבא.
- הוסף 600 μL של PBS ולאסוף שבריר של 600 μL בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. השתמש בדגימות EVs ובקרה עבור ניתוחים נוספים או לאחסן אותם לילה ב 4 oC.
- אחסן את העמודות הנמצאות בשימוש עתידי.
- לשטוף את העמודה עם 25 מ"ל של 20% איזופרופנול ולהשליך את הנפח eluted. לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 2.5 מ"ל של PBS.
- הוסף את מאגר האחסון שהוסר בשלב 1.1.1 והמתן לכניסה של המאגר לעמודה. מכסים את העמודה במכסה ומאחסנים ב- 4 oC עד לשימוש הבא.
4. כימות EV
- הכן 1:1,000 דילול של מדגם NTA-PL-EV ואת מדגם PL-EV הראשוני כמתואר על ידי שני השלבים הבאים.
- הכן 1 מ"ל של 1:10 מדולל NTA-PL-EV ו 1 מ"ל של 1:10 PL-EV ראשוני מדולל עם PBS מסונן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
- הכן 1 מ"ל של דילול של 1:100 של הדגימות המדוללות הקודמות עם PBS מסונן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
- הזריקו את דגימת NTA-PL-EV המדוללת 1:1,000 או את דגימת PL-EV הראשונית באמצעות מזרק סטרילי למשאבת NTA. בצע את ההוראות וההמלצות של היצרן לריכוז חלקיקים וקביעת התפלגות גודל.
הערה: כמו ריכוז EV תלוי בנפח המתנע מדגם, ייתכן שיהיה צורך לקרוא דילול ביניים ולבצע התאמות כדי לקבל קביעת NTA נכונה.
5. EVs המשמש כטיפול עבור דלקת מונעת OA
- לשטוף את הסחוס פעמיים עם PBS excise אותו באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר 3 מ"מ בתנאים סטריליים.
הערה: בצע את ההליך מצעדים 5.1 עד 5.6 במכסה המנוע של תרבית התא. - מניחים את explants בצלחות תרבות 96-טוב עם בינוני DMEM-F12 בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 oC, 5% CO2, ו 80% לחות.
- כדי להקים מודל OA מונע דלקת, להשלים את המדיום תרבית התא עם 10 ננוגרם / מ"ל oncostatin M ו 2 ng/ mL גידול נמק גורם-אלפא (TNFα).
- לטפל explants עם 1 × 109 חלקיקים / גם של EVs מסומן (PKH-PL-EV) או שליטה במדיום תרבית התא בתוספת oncostatin M ו- TNFα.
הערה: למדוד את עוצמת הקול של המדגם המכיל 1 × 109 חלקיקים / טוב ולהשתמש באותו אמצעי אחסון עבור הפקד. - מוציאים את המדיום מלוחות תרבית התאים 96-well המכילים explants סחוס. הוסף 200 μL של המדיום תרבית התא המתואר בשלב 5.3 לכל באר.
הערה: אם הצלחות 96-באר היו במגע עם סרום בקר עוברי (FBS), לשטוף כל באר שלוש פעמים עם 200 μL של PBS כדי להסיר כל EVs מן FBS. - עצור את ההחמרה בזמנים שונים: 0, 1, 2, 3, 4 ו 5 שעות.
- לשטוף את בארות תרבית התא המכיל את explants הסחוס פעמיים עם 200 μL של PBS.
- הוסף 100 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) לרקמה כדי לתקן את זה עבור 3 שעות ב 4 oC.
הערה: שלבים הקשורים PFA צריך להתבצע במכסה המנוע אדים בעקבות המלצות גיליון נתוני בטיחות. - הסר PFA, להוסיף 100 μL של PBS, לאחסן את הרקמה הקבועה ב 4 °C (50 °F) ולעבד את הדגימות בתוך 48 שעות.
6. הכנה ודמיון מיקרוסקופי
הערה: הליך היסתולוגי זה מורכב התייבשות, הטמעת פרפין, וצעדי התייבשות. שלבים אלה עשויים להפחית את פלואורסצנטיות הצבע הכוללת (מגבלה המוזכרת בגליון הנתונים עבור PKH26). לכן, הליכים אחרים, כגון חתך קפוא, עשויים להתאים יותר להדמיה של EV על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- הטמע את הרקמות הקבועות בבלוקים פרפין. חותכים את הרקמה ל-6 חלקים בעובי 6 מיקרומטר.
- דפראפפיניט את מקטעי הרקמה.
הערה: כל השלבים באמצעות קסילן צריכים להתבצע במכסה אדים.- לטבול את מקטעי הרקמה קסילן במשך 30 דקות, 100% אתנול במשך 2 דקות, 96% אתנול במשך 2 דקות, 75% אתנול במשך 1 דקות, ולבסוף במים מזוקקים במשך 30 s.
- תחדירו את חלקי הרקמות.
- הכן 0.1% תמיסה נתרן ציטוט 0.1% כדי permeabilize הרקמה. מוסיפים טיפה של 20 μL לכל קטע רקמות ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף כל סעיף פעמיים עם 20 μL של PBS.
- בשקופית מיקרוסקופית, הוסף טיפה של מדיום הרכבה המכיל 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) עם מדיום הרכבה מימי לשימור פלואורסצנטיות. לכסות את השקופית המכילה 3 מקטעי רקמה מהשלב 6.3.1.
- לדגור על השקופיות בלילה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
- יש לאחסן ב-4 °C (75°F), מוגן מפני אור עד למיקרוסקופיה קונפוקלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה סכמטית לניטור תיוג וספיגה של EV מוצגת באיור 1. ריכוז החלקיקים וגודל EV שזוהו על ידי NTA בטבלה 1 מראים כי ריכוז EV פוחת במהלך התהליך עקב שלב הטיהור המבוצע פעמיים לאחר תיוג עם העמודה. עם זאת, הסכום המתקבל הוא בטווח האופטימלי של מספר החלקיקים לשימוש לטיפול. ריכוז חלקיקים זה משמש לחישוב הנפח של PKH-PL-EV ושליטה המשמשים לטיפול explants סחוס osteoarthritic.
לאחר explants הסחוס מטופלים עם רכבים אופן אלקטרוני או קבוצת הביקורת, הם קבועים לתקופות שונות: 0, 1, 2, 3, 4, ו 5 שעות. לאחר מכן, כל קבוצה מפוצצת, פרוסה ומוכנה למיקרוסקופיה קונפוקלית עם מדיום הרכבה המכיל DAPI. תמונות מייצגות עבור כל קבוצה בכל נקודת זמן מוצגות באיור 2, המציגות כיצד EVs נכנס לרקמה עד שהם מגיעים לצ'ונדרוציטים ומכניסים אותם לאורך זמן.
כפי שניתן לראות באיור 2, כלי הפעלה משומנים כבר ממוקמים סביב כונדרוציטים (מוצג בכחול עם כתמי DAPI) לאחר שעה אחת של דגירה (מוצג באדום עם צבע PKH26). ניתן לראות רקע מסוים עקב צבע שריד עבור קבוצת הביקורת, שאין לה EVs אך מעובדת בהתאם לאותו פרוטוקול כמו דגימת הרכב המסובב. תוצאות אלה מאשרות את הצלחת הפרוטוקול לתייג EVs, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לפקח על ההגירה שלהם דרך רקמות במבחנה, כפי שמוצג כאן, בניסויים in vivo.
איור 1: סקירה סכמטית עבור פרוטוקול תיוג EV וניטור ספיגה. קיצורים: PBS = תמיסת מלח חוצץ פוספט; EV = צעיפית חוץ-תאית; RT = טמפרטורת החדר; BSA = אלבומין סרום בקר; NTA = ניתוח מעקב חלקיקים; OA = דלקת מפרקים ניוונית; TNFα = גורם נמק הגידול-אלפא; PL = טסיות דם ליסאט; PFA = paraformaldehyde; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מייצגות של ספיגת EV בזמנים שונים. תמונות מייצגות קונפוקליות שצולמו לאחר 0, 1, 2, 3, 4 ו -5 שעות של explants סחוס osteoarthritic דגירה עם רכבים רחפנים עם PKH שכותרתו או עם קבוצת ביקורת. התמונות צולמו ב-400x. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: OA = דלקת מפרקים ניוונית; PL = טסיות דם ליסאט; EV = צעיעה חוץ-תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ריכוז (חלקיקים/מ"ל) | גודל חלקיקים (nm) | |
| PL-EVs (ראשוני) | 3.03 × 1011 | 134.0 |
| NTA-PL-EVs ללא PKH26 (לאחר הפרוטוקול) | 8.30 × 1010 | 132.0 |
טבלה 1: אפיון על ידי ניתוח מעקב חלקיקים. קיצורים: OA = דלקת מפרקים ניוונית; PL = טסיות דם ליסאט; EV = צעיפית חוץ-תאית; NTA = ניתוח מעקב חלקיקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיית EV מסייעת להבין תכונות EV, כגון מנגנוני השחרור והספיגה שלהם. ההדמיה שלהם מאפשרת ניטור של ההבחנה הביולוגית שלהם ואת אפיון המאפיינים הפרמקוקינטיים שלהם ככלי רכב תרופתיים. עם זאת, דימות EV ומעקב עשוי להיות קשה בשל הגדלים הקטנים שלהם, אם כי מכשירי הדמיה רבים וטכניקות תיוג פותחו כדי לעזור לחוקרים לפקח על EVs תחת במבחנה ובתנאי vivo 23,24,25.
קיימות שתי אפשרויות בעת מעקב אחר EVs על ידי מיקרוסקופיה אופטית: ביולומינציה והדמיה פלואורסצנטית. שניהם משמשים לזיהוי EVs בתוך ספקטרום האור הנראה (390-700 ננומטר). ביולומינציה היא סוג של כימותרפיה המיוצרת לאחר לוציפראז מזרז את חמצון המצע שלה. למרות אות זה דורש מצלמה אולטרה רגישה של התקן מצמיד טעינה (CCD) לזיהוי, יש לו יחס אות לרעש גבוה מכיוון שהאות אינו דורש מקור אור חיצוני26.
הדמיית פלואורסצנטיות משתמשת בחלבונים או בצבעים אורגניים הפולטים אותות לאחר עירור ממקור אור חיצוני. בהשוואה לביולומינציה, פלואורסצנטיות קלה יותר לזיהוי על ידי מצלמת CCD. יתר על כן, ביולומינציה, רעילות מצע ואת מחצית החיים של הביולומינציה של המצע צריך להיחשב למעקב בזמן אמת EV27,28.
לעומת זאת, נעשה שימוש בסימון חלבון פלואורסצנטי ואורגני עם רזולוציה מצוינת במיקרוסקופיה אופטית. למרות שעוצמת הפלואורסצנטיות תלויה ברמות הביטוי של חלבון EV, היעילות של תיוג EV בתחומים של ממברנה, ומקור האור העירור, צבעי פלואורסצנטיות מספקים אותות יציבים וחזקים להדמיית EV25. רוב צבעי הפלואורסצנט האורגניים שימשו בתחילה להדמיית קרום התא. צבעים אלה משלבים בדרך כלל פלואורופורים המתייגים את דו-שכבתי השומנים או חלבונים בעלי עניין על קורות חיים אלקטרוניים באמצעות קבוצות פונקציונליות שונות29.
משפחת צבע פלואורסצנטי אורגנית אחת היא משפחת צבע PKH ליפופילית המורכבת פלואורופורים עם קרבווציאנין ליפופילי העוגן לתוך bilayer השומנים עבור הדמיית פלואורסצנטיות30,31. צבעי PKH שימשו למחקרי במבחנה ובמחקרי ויוו מכיוון שמחצית החיים שלהם נעה בין 5 ל->100 ימים. לכן, ההתמדה של הצבע ב vivo עלול להוביל לתוצאות מטעות במחקרים של משך זמן קצר יותר מאשר מחצית החיים של הצבע. עם זאת, צבעי PKH שימושיים כמעקבים כדי להראות הגירת EV32.
PKH26 הוא חבר במשפחת פלואורופור ליפופילית PKH זו, נמצא בספקטרום האדום עם שיא של עירור ב 551 ננומטר ופליטה ב 567 ננומטר. זה עושה את זה תואם עם ערוצי זיהוי אחרים, כגון רודמין, phycoerythrin, או DAPI33, המאפשר זיהוי של, במקרה זה, את ההעברה של כלי עבודה מתקדמים מסומן PKH26 לכיוון chondrocytes מסומן DAPI. חשוב לציין כי למרות PL שימש כמקור EV כאן, פרוטוקול זה יכול לשמש עם EVs ממקורות אחרים ולמטרות אחרות, למשל, כדי לעקוב אחר התפלגות in vivo של EVs.
לפרוטוקול זה יש כמה מגבלות; לדוגמה, ישנם כמה חששות כי PKH26 מגדיל את גודל EV, אשר עשוי להשפיע על ספיגת הביולוגית שלהם ואת ספיגת התא. עם זאת, במקרים כאלה שבהם גודל EV הוגדל על ידי PKH26, הליך התיוג היה שונה מזה המתואר בפרוטוקול זה34. חוקרים אלה לא כללו את שלבי הכביסה והטיהור, ובכך הובילו לרמות גבוהות יותר של צבע חופשי, מה שעלול לגרום לגודל גדול יותר של EV. יתר על כן, הפרוטוקול הנוכחי מתגבר על בעיה זו על ידי ביצוע טיהור EV מקביל עם ובלי PKH26. זה מאפשר אפיון של מדגם EV ללא תווית, אשר עובד באופן זהה כמו אחד שכותרתו. לכן, כימות מטעה עקב חלקיקים מבלבלים שאינם מסומנים באופן לא-תקיף (ליפופרוטאין או מזהמים מדגם חלבון) או על ידי נוכחות של חלקיקים שאינם EV בתוך תערובת התיוג ניתן להימנע, כפי שהוכח בעבר35,36.
במאמר זה, שני מחזורים של טיהור בוצעו על ידי כרומטוגרפיה אי הכללת גודל באמצעות עמודות. הראשון עשוי להיות מוחלף על ידי צנטריפוגה הדרגתית סוכרוז. עם זאת, כל אוכלוסיות ה-EV נאספו באותו עליקוט מלוטש עם טור זה ולא היו כפופות לכוחות g גבוהים שנתקלו בצנטריפוגה במהירות גבוהה. עם זאת, הימנעות צנטריפוגה עלולה להוביל לתהליך איטי יותר, במיוחד אם יש צורך בשטיפת עמודות בין מחזורי ההפרדה. מגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא הצורך בריכוז מדגם לפני תחילת תהליך התיוג עקב אמצעי האחסון המוגבל של העמודה. ניתן להתגבר על מגבלה זו באמצעות עמודות עם קיבולת טעינה גבוהה יותר.
פרוטוקולים אחרים של תיוג EV מתארים את השימוש בצבעים שונים; עם זאת, השימוש שלהם בצעדי ultracentrifugation עלול לפגוע בשלמות EV37. הפרוטוקול המתואר כאן אפשר ניטור של הגירת EV וספיגה explants סחוס בקלות עם מיקרוסקופ קונפוקלי ללא כל פונקציה מסוימת. יתר על כן, זה עשוי להיות אקסטרפולציות לרקמות אחרות, דגימות שומנים או תנאים, כגון in vivo assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי המכון לסאלוד קרלוס השלישי, שר הכלכלה y Competitividad, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית ESF והקרן לפיתוח אזורי אירופי ERDF (MS16/00124; CP16/00124); על ידי PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, לפרש SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), ממומן על ידי מס תיירות בת קיימא של האיים הבלאריים; על ידי Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); על ידי תוכנית הפוסט-דוקטורט FOLIUM (FOLIUM 17/01) בתוך FUTURMed, ממומנת ב -50% על ידי מס התיירות בת קיימא של האיים הבלאריים וב -50% על ידי ESF; and by the Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
References
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
- Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
- Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
- Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
- Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
- Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
- El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
- Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
- Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, Suppl. 1 289-292 (2007).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
- Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
- Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
- Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
- Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
- de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
- Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
- Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
- Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
- Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).
