Summary
Hier presenteren we een protocol om van bloedplaatjes lysaat afgeleide extracellulaire blaasjes te labelen om hun migratie en opname in kraakbeenexplantaten te volgen die worden gebruikt als een model voor artrose.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV's) worden in verschillende onderzoeken gebruikt om hun potentieel als celvrije behandeling te bewijzen vanwege hun lading afgeleid van hun cellulaire bron, zoals bloedplaatjeslysaat (PL). Bij gebruik als behandeling wordt verwacht dat EV's de doelcellen binnendringen en een reactie hiervan bewerkstelligen. In dit onderzoek zijn PL-afgeleide EV's bestudeerd als een celvrije behandeling voor artrose (OA). Zo werd een methode opgezet om EV's te labelen en hun opname op kraakbeenexplantaten te testen. PL-afgeleide EV's worden gelabeld met de lipofiele kleurstof PKH26, tweemaal door een kolom gewassen en vervolgens getest in een in vitro ontstekingsgestuurd OA-model gedurende 5 uur na deeltjeskwantificering door nanodeeltjesvolganalyse (NTA). Elk uur worden kraakbeenexplantaten gefixeerd, geparaffined, in secties van 6 μm gesneden om op dia's te monteren en waargenomen onder een confocale microscoop. Dit maakt het mogelijk om te verifiëren of EV's tijdens deze periode de doelcellen (chondrocyten) binnendringen en hun directe effect analyseren.
Introduction
Artrose (OA) is een articulaire degeneratieve ziekte die een progressieve en onomkeerbare ontsteking en vernietiging van de extracellulaire matrix van het gewrichtskraakbeen impliceert1. Hoewel verschillende vormen van artritis tal van behandelingenhebben 2,3,4,worden deze beperkt door hun bijwerkingen en beperkte werkzaamheid. Tissue engineering technieken met behulp van autologe chondrocyten implantatie worden routinematig toegepast voor de regeneratieve behandeling van gewond kraakbeen in vroege OA kraakbeen laesies4. Celgebaseerde therapieën zijn voornamelijk beperkt vanwege het beperkte aantal fenotypisch stabiele chondrocyten of chondroprogenitors die in staat zijn om het kraakbeen effectief te repareren3. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën om ziekteprogressie te voorkomen en grote kraakbeenlaesies te regenereren van het grootste belang.
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn voorgesteld als een behandeling voor artrose door verschillende auteurs5,6. EV's zijn vliezige lichamen die door de meerderheid van de celtypen worden uitgescheiden, zijn betrokken bij intercellulaire signalering en er is aangetoond dat ze de therapeutische effecten van stamcellen uitoefenen7,8,9, waardoor ze onlangs interesse hebben gewekt in regeneratieve geneeskunde10. EV's afgeleid van mesenchymale stromale cellen (MSC's) zijn de belangrijkste therapeutische EV's die zijn onderzocht voor artrose, hoewel andere gewrichtsgerelateerde cellen zijn gebruikt als EV-bronnen, bijvoorbeeld chondroprogenitors of immuuncellen11,12.
Bloedplaatjesconcentraten, zoals bloedplaatjeslysaten (PR's), worden gebruikt om de wondgenezing bij verschillende verwondingen te verbeteren, zoals hoornvlieszweren13,14,15 of bij peesweefselregeneratie16, vanwege de hypothese dat de EV-component van bloedplaatjesconcentraten verantwoordelijk kan zijn voor deze effecten17 . Sommige studies met betrekking tot gewrichtsgerelateerde ziekten gebruiken van bloedplaatjes afgeleide EV's (PL-EV's) als een behandeling om artroseaandoeningen te verbeteren. PL-EV's verbeteren de proliferatie en celmigratie van chondrocyten door de Wnt/β-catenineroute18te activeren, de expressie van chondrogene markers in artrose chondrocyten19te bevorderen of hogere niveaus van chondrogene eiwitten en minder tissulaire afwijkingen te vertonen bij artrosekonijnen die worden behandeld met PL-EV's18.
EV's bevatten eiwitten, lipiden en nucleïnezuren die vrijkomen in de doelcel, waardoor cel-tot-cel communicatie tot stand wordt gebracht, wat het belangrijkste kenmerk is met betrekking tot hun therapeutische toepassingen20. De effecten van EV's zijn afhankelijk van hun bereikcellen en de daaropvolgende ladingafgifte. Dit effect kan indirect worden bevestigd door veranderingen in cellen, zoals metabole activiteit of genexpressiemodificatie. Deze methoden laten echter niet toe om te visualiseren hoe EV's cellen bereiken om hun functie uit te oefenen. Dit artikel presenteert dus een methode om deze PL-afgeleide EV's te labelen om te worden gebruikt als een behandeling voor ontstekingsgedreven OA-kraakbeenexplantaten. Confocale microscopie werd gebruikt om de EV-opname en progressie naar de chondrocyten in de explantaten te volgen in een time-lapse van 5 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Kraakbeenexplantaten werden verkregen van de IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) in overeenstemming met institutionele richtlijnen na ethische goedkeuring van het project door de CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Kolomvoorbereiding
- Kolommen in evenwicht brengen volgens de instructies van de fabrikant of als volgt:
- Verwijder de kolomkap en breng de kolom in evenwicht. Verwijder de opslagbuffer door elutie.
- Was de kolom 3 keer met 2,5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Wacht tijdens elke wasbeurt tot de kolom het hele volume absorbeert.
OPMERKING: Laat de kolom niet drogen. - Bedek de kolom met de dop na de laatste wasbeurt en tot de monstervoorbereiding.
2. EV-etikettering
OPMERKING: Dit EV-etiketteringsprotocol maakt gebruik van een PL-EV-monster dat eerder is geïsoleerd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) met eerder beschreven voorwaarden21,22. Elk EV-monster van elke bron kan echter met dit protocol worden gebruikt.
- Concentreer het EV-monster en de besturing (PBS) met behulp van een concentratiebuis.
- Plaats de monsters in een concentratiebuis van 15 ml of 500 μL, afhankelijk van het startvolume van het EV-monster. Centrifugeer de buizen volgens de instructies van de fabrikant totdat een bijna droog monster is verkregen.
OPMERKING: Het controlemonster is nodig om te controleren op een eventuele kleurstofachtergrond. Hoewel deze methode geen specifiek initieel volume vereist, moet er rekening mee worden gehouden dat ongeveer 10% van de deeltjes verloren gaat tijdens zuiveringsstappen.
- Plaats de monsters in een concentratiebuis van 15 ml of 500 μL, afhankelijk van het startvolume van het EV-monster. Centrifugeer de buizen volgens de instructies van de fabrikant totdat een bijna droog monster is verkregen.
- Resuspend de geconcentreerde monsters met verdunningsmiddel C. Resuspend EV-monsters met 200 μL en de controlegroep met 100 μL en breng ze over naar nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml.
- Scheid het EV-monster in twee aliquots van 100 μL. Markeer er een met kleurstof en gebruik het als behandeling (PKH-PL-EV); laat de andere ongemarkeerd, maar verwerk het (NTA-PL-EV) zoals het EV-monster en gebruik het om de EV-concentratie per NTA te kwantificeren.
- Bereid 2x kleurstofoplossing, resulterend in 8 μM PKH26-oplossing in verdunningsmiddel C.
- Meng 1 μL van 1 mM PKH26 linker per 125 μL verdunningsmiddel C in het monster. Bereid een volume voor dat nodig is om aan de monsters toe te voegen in een verhouding van 1:1.
- Voeg 2x kleurstofoplossing toe aan PKH-PL-EV en controleer monsters in een verhouding van 1:1 om 1x kleurstofconcentratie en 4 μM PKH26-concentratie te bereiken. Voeg hetzelfde volume PBS toe aan het NTA-PL-EV-monster. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 5% runderserum albumine-PBS-oplossing toe aan de monsters in een verhouding van 1:1 en zorg ervoor dat het uiteindelijke volume ~400 μL is.
OPMERKING: Met deze stap kunt u niet-specifieke kleurstofinteracties of ongebonden kleurstof verwijderen. - Ga verder met het scheiden van de gelabelde EV's van de ongebonden kleurstof en niet-specifieke interacties van de kleurstof met de kolom.
3. Gelabelde EV-isolatie
- Verwijder de dop van de kolom, voeg 400 μL van het monster toe (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV of control) en gooi alle geëlueerde vloeistof weg.
- Wacht tot het monster de kolom volledig heeft ingevoerd voordat u doorgaat naar de volgende stap. Voeg 600 μL PBS toe en gooi alle geëlueerde vloeistof weg.
- Wacht tot de PBS de kolom volledig heeft ingevoerd voordat u doorgaat naar de volgende stap. Voeg 600 μL PBS toe en verzamel een fractie van 600 μL in een 1,5. ml centrifugebuis (EV's of besturing).
OPMERKING: Deze stappen zijn nodig om de overtollige kleurstof uit de monsters te verwijderen. Een andere scheiding per kolom is nodig om zuiverdere EV's te verkrijgen. Daarom moeten de volgende stappen worden uitgevoerd in een nieuwe gebalanceerde kolom (stap 4.1.) of dezelfde kolom na een eerste wasstap (stap 4.2). - Bereid de kolom voor op een nieuwe EV-scheidingsstap om zuiverdere EV's te verkrijgen. Als het een nieuwe kolom is, herhaalt u stap 2.1. en 2.2. Als het dezelfde kolom is, wast u de kolom met 2,5 ml 20% isopropanol en herhaalt u stap 2.1 en 2.2.
- Voeg 600 μL eerder geëlueerde EV's verkregen in stap 2.5 toe aan de kolom en gooi het geëlueerde volume weg. Wacht tot de vloeistof de kolom volledig binnenkomt voordat u doorgaat naar de volgende stap.
- Voeg 400 μL PBS toe en gooi al het geëlueerde volume weg. Wacht tot de vloeistof de kolom volledig binnenkomt voordat u doorgaat naar de volgende stap.
- Voeg 600 μL PBS toe en verzamel een fractie van 600 μL in een centrifugebuis van 1,5 ml. Gebruik de EV's en controlemonsters voor verdere analyses of bewaar ze 's nachts bij 4 oC.
- Sla de gebruikte kolommen op voor toekomstig gebruik.
- Was de kolom met 25 ml 20% isopropanol en gooi het geëlueerde volume weg. Was de kolom 3 keer met 2,5 ml PBS.
- Voeg de opslagbuffer toe die in stap 1.1.1 is verwijderd en wacht tot de buffer de kolom binnenkomt. Bedek de kolom met de dop en bewaar bij 4 oC tot het volgende gebruik.
4. Ev-kwantificering
- Bereid 1:1.000 verdunningen van het NTA-PL-EV-monster en het eerste PL-EV-monster voor zoals beschreven in de volgende twee stappen.
- Bereid 1 ml 1:10 verdunde NTA-PL-EV en 1 ml 1:10 verdunde initiële PL-EV met PBS gefilterd door een filter van 0,2 μm.
- Bereid 1 ml van een verdunning van 1:100 van de vorige verdunde monsters met PBS gefilterd door een filter van 0,2 μm.
- Injecteer het 1:1.000 verdunde NTA-PL-EV-monster of het eerste PL-EV-monster met behulp van een steriele spuit in de NTA-pomp. Volg de instructies en aanbevelingen van de fabrikant voor de bepaling van de deeltjesconcentratie en de grootteverdeling.
OPMERKING: Aangezien de EV-concentratie afhankelijk is van het startvolume van het monster, kan het nodig zijn om tussentijdse verdunningen af te lezen en aanpassingen aan te brengen om een correcte NTA-bepaling te verkrijgen.
5. EV's gebruikt als een behandeling voor ontstekingsgestuurde artrose
- Was het kraakbeen tweemaal met PBS en snijd het onder steriele omstandigheden weg met een biopsiepons met een diameter van 3 mm.
OPMERKING: Voer de procedure uit van stap 5.1 tot en met 5.6 in een celkweekkap. - Plaats de explantaten in 96-well kweekplaten met DMEM-F12 medium aangevuld met 1% penicilline-streptomycine bij 37 oC, 5% CO2en 80% vochtigheid.
- Om een ontstekingsgestuurd OA-model vast te stellen, vult u het celkweekmedium aan met 10 ng / ml oncostatine M en 2 ng / ml tumornecrosefactor-alfa (TNFα).
- Behandel de explantaten met 1 × 109 deeltjes/put van gelabelde EV's (PKH-PL-EV) of controle in celkweekmedium aangevuld met oncostatine M en TNFα.
OPMERKING: Meet het volume van het monster dat 1 × 109 deeltjes/put bevat en gebruik hetzelfde volume voor de regeling. - Verwijder het medium van de 96-well celkweekplaten met kraakbeenexplantaten. Voeg 200 μL van het celkweekmedium beschreven in stap 5.3 toe aan elk putje.
OPMERKING: Als de 96-well platen in contact zijn geweest met foetaal runderserum (FBS), was dan elke put drie keer met 200 μL PBS om eventuele EV's uit de FBS te verwijderen. - Stop de in vitro test op verschillende tijdstippen: 0, 1, 2, 3, 4 en 5 uur.
- Was de celkweekputten met de kraakbeenexplantaten tweemaal met 200 μL PBS.
- Voeg 100 μL 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan het weefsel om het gedurende 3 uur bij 4 oC te fixeren.
OPMERKING: Stappen met PFA moeten worden uitgevoerd in een zuurkast volgens de aanbevelingen van het veiligheidsinformatieblad. - Verwijder de PFA, voeg 100 μL PBS toe, bewaar het vaste weefsel bij 4 °C en verwerk de monsters binnen 48 uur.
6. Microscopie voorbereiding en visualisatie
OPMERKING: Deze histologische procedure bestaat uit uitdroging, paraffine-inbedding en rehydratatiestappen. Deze stappen kunnen de algehele kleurstoffluorescentie verminderen (een beperking die wordt vermeld in het gegevensblad voor PKH26). Daarom kunnen andere procedures, zoals bevroren secties, meer geschikt zijn voor EV-visualisatie door confocale microscopie.
- Sluit de vaste weefsels in paraffineblokken in. Snijd het weefsel in 6 μm dikke delen.
- Deparaffiniseer de weefselsecties.
OPMERKING: Alle stappen met xyleen moeten worden uitgevoerd in een zuurkast.- Dompel de weefselsecties gedurende 30 minuten onder in xyleen, 100% ethanol gedurende 2 minuten, 96% ethanol gedurende 2 minuten, 75% ethanol gedurende 1 minuut en ten slotte in gedestilleerd water gedurende 30 s.
- Permeabiliseer de weefselsecties.
- Bereid een 0,1% Triton-0,1% natriumcitraatoplossing om het weefsel te permeabiliseren. Voeg een druppel van 20 μL toe aan elk weefselgedeelte en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was elke sectie tweemaal met 20 μL PBS.
- Voeg op een microscopisch kleine dia een druppel montagemedium toe met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) met een waterig montagemedium voor het behoud van de fluorescentie. Bedek de dia met 3 weefselsecties uit stap 6.3.1.
- Incubeer de dia's 's nachts bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Bewaren bij 4 °C, beschermd tegen licht tot confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematisch overzicht voor EV-etikettering en opnamemonitoring is weergegeven in figuur 1. De deeltjesconcentratie en EV-grootte gedetecteerd door NTA in tabel 1 laten zien dat de EV-concentratie tijdens het proces afneemt als gevolg van de zuiveringsstap die tweemaal wordt uitgevoerd na etikettering met de kolom. De verkregen hoeveelheid ligt echter in het optimale bereik van het aantal deeltjes dat voor de behandeling moet worden gebruikt. Deze deeltjesconcentratie wordt gebruikt om het volume PKH-PL-EV en de controle te berekenen die worden gebruikt om artrosekraakbeenexplantaten te behandelen.
Zodra de kraakbeenexplantaten zijn behandeld met EV's of de controlegroep, worden ze gefixeerd voor verschillende perioden: 0, 1, 2, 3, 4 en 5 uur. Elke groep wordt vervolgens geparaffiniseerd, gesneden en voorbereid voor confocale microscopie met een montagemedium dat DAPI bevat. Representatieve beelden voor elke groep op elk tijdstip worden weergegeven in figuur 2, die laten zien hoe EV's het weefsel binnenkomen totdat ze de chondrocyten bereiken en deze in de loop van de tijd binnengaan.
Zoals te zien is in figuur 2,zijn gelabelde EV's al gelokaliseerd rond chondrocyten (weergegeven in blauw met DAPI-kleuring) na 1 uur incubatie (weergegeven in rood met PKH26-kleurstof). Enige achtergrond als gevolg van restkleurstof kan worden waargenomen voor de controlegroep, die geen EV's heeft, maar wordt verwerkt volgens hetzelfde protocol als het EV-monster. Deze resultaten bevestigen het succes van het protocol om EV's te labelen, die kunnen worden gebruikt om hun migratie door weefsel te volgen in in vitro assays, zoals hier getoond, en in in vivo experimenten.
Figuur 1: Schematisch overzicht voor ev-etikettering en opnamebewakingsprotocol. Afkortingen: PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; EV = extracellulair blaasje; RT = kamertemperatuur; BSA = runderserumalbumine; NTA = nanodeeltjes tracking analyse; OA = artrose; TNFα = tumornecrosefactor-alfa; PL = lysaat van bloedplaatjes; PFA = paraformaldehyde; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve beelden van ev-opname op verschillende tijdstippen. Confocale representatieve beelden genomen na 0, 1, 2, 3, 4 en 5 uur van artrose kraakbeen explantaten geïncubeerd met PKH-gelabelde EV's of met een controlegroep. De foto's zijn gemaakt met 400x. Schaalbalken = 50 μm. Afkortingen: OA = artrose; PL = lysaat van bloedplaatjes; EV = extracellulair blaasje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Concentratie (deeltjes/ml) | Deeltjesgrootte (nm) | |
| PL-EV's (initieel) | 3,03 × 1011 | 134.0 |
| NTA-PL-EV's zonder PKH26 (na het protocol) | 8,30 × 1010 | 132.0 |
Tabel 1: Karakterisering door analyse van het volgen van nanodeeltjes. Afkortingen: OA = artrose; PL = lysaat van bloedplaatjes; EV = extracellulair blaasje; NTA = nanodeeltjes tracking analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV-beeldvorming helpt om EV-eigenschappen te begrijpen, zoals hun afgifte- en opnamemechanismen. Hun beeldvorming maakt het mogelijk om hun biodistributie te monitoren en hun farmacokinetische eigenschappen te karakteriseren als medicijnvoertuigen. EV-beeldvorming en -tracking kunnen echter moeilijk zijn vanwege hun kleine afmetingen, hoewel veel beeldvormingsapparaten en etiketteringstechnieken zijn ontwikkeld om onderzoekers te helpen EV's te volgen onder in vitro en in vivo omstandigheden23,24,25.
Er zijn twee mogelijkheden bij het volgen van EV's door optische microscopie: bioluminescentie en fluorescentiebeeldvorming. Beide worden gebruikt om EV's binnen het zichtbare lichtspectrum (390-700 nm) te detecteren. Bioluminescentie is een type chemiluminescentie dat wordt geproduceerd nadat een luciferase de oxidatie van zijn substraat katalyseert. Hoewel dit signaal een ultragevoelige charge-coupled device (CCD) camera vereist voor detectie, heeft het een hoge signaal-ruisverhouding omdat het signaal geen externe lichtbron nodig heeft26.
Fluorescentiebeeldvorming maakt gebruik van eiwitten of organische kleurstoffen die signalen uitzenden na excitatie van een externe lichtbron. In vergelijking met bioluminescentie is fluorescentie gemakkelijker te detecteren door een CCD-camera. Bovendien moeten bij bioluminescentie de substraattoxiciteit en de halfwaardetijd van de bioluminescentie van het substraat worden overwogen voor real-time EV-tracking27,28.
Daarentegen zijn fluorescerende etikettering op basis van eiwitten en organische kleurstoffen gebruikt met een uitstekende resolutie in optische microscopie. Hoewel de fluorescentie-intensiteit afhankelijk is van ev-eiwitexpressieniveaus, de efficiëntie van EV-etikettering op membraandomeinen en de excitatielichtbron, bieden fluorescentiekleurstoffen stabiele en sterke signalen voor EV-beeldvorming25. De meeste organische fluorescerende kleurstoffen werden aanvankelijk gebruikt voor celmembraanbeeldvorming. Deze kleurstoffen combineren over het algemeen fluoroforen die de lipide bilayer of eiwitten van belang op EV's labelen via verschillende functionele groepen29.
Een organische fluorescerende kleurstoffamilie is de lipofiele PKH-kleurstoffamilie bestaande uit fluoroforen met een lipofiele carbocyanine die zich verankert in de lipide bilaag voor fluorescentiebeeldvorming30,31. PKH-kleurstoffen zijn gebruikt voor in vitro en in vivo studies omdat hun in vivo halfwaardetijd varieert van 5 tot >100 dagen. De persistentie van de kleurstof in vivo kan dus leiden tot misleidende resultaten in studies met een kortere duur dan de halfwaardetijd van de kleurstof. PKH-kleurstoffen zijn echter nuttig als tracers om EV-migratie32weer te geven.
PKH26 is een lid van deze PKH lipofiele fluorofoorfamilie, gevonden in het rode spectrum met een piek van excitatie bij 551 nm en emissie bij 567 nm. Dit maakt het compatibel met andere detectiekanalen, zoals rhodamine, fycoerythrin of DAPI33, waardoor de detectie mogelijk is van, in dit geval, de migratie van EV's gemarkeerd met PKH26 naar chondrocyten gemarkeerd met DAPI. Het is belangrijk op te merken dat hoewel PL hier als EV-bron werd gebruikt, dit protocol kan worden gebruikt met EV's uit andere bronnen en voor andere doeleinden, bijvoorbeeld om de in vivo distributie van EV's te volgen.
Dit protocol heeft enkele beperkingen; er zijn bijvoorbeeld enkele zorgen dat PKH26 de EV-grootte verhoogt, wat van invloed kan zijn op hun biodistributie en cellulaire opname. In dergelijke gevallen waarin de EV-grootte met PKH26 werd vergroot, verschilde de etiketteringsprocedure echter van die beschreven in dit protocol34. Deze onderzoekers hebben de was- en zuiveringsstappen niet opgenomen, wat leidt tot hogere niveaus van vrije kleurstof, wat de grotere EV-grootte zou kunnen veroorzaken. Bovendien overwint het huidige protocol dit probleem door een parallelle EV-zuivering uit te voeren met en zonder PKH26. Dit maakt de karakterisering van een niet-gelabeld EV-monster mogelijk, dat identiek is verwerkt als het gelabelde monster. Zo kan een misleidende kwantificering als gevolg van verstorende niet-specifiek gelabelde deeltjes (lipoproteïne- of eiwitmonsterverontreinigingen) of door de aanwezigheid van niet-EV-deeltjes in het etiketteringsmengsel worden vermeden, zoals eerder is aangetoond35,36.
In dit artikel werden twee zuiveringscycli uitgevoerd door grootte-uitsluitingschromatografie met behulp van kolommen. De eerste kan worden vervangen door sucrose gradiënt centrifugering. Alle EV-populaties werden echter verzameld in dezelfde eluted aliquot met deze kolom en niet onderworpen aan hoge g-krachten die werden aangetroffen bij snelle centrifugatie. Het vermijden van centrifugatie kan echter leiden tot een langzamer proces, vooral als kolomwassingen nodig zijn tussen scheidingscycli. Een andere beperking van dit protocol is de behoefte aan monsterconcentratie voordat het etiketteringsproces wordt gestart vanwege het beperkte volume van de kolom. Deze handicap kan worden overwonnen door kolommen met een hoger laadvermogen te gebruiken.
Andere EV-etiketteringsprotocollen beschrijven het gebruik van verschillende kleurstoffen; het gebruik van ultracentrifugatiestappen kan echter de ev-integriteit schaden37. Het hier beschreven protocol heeft het mogelijk gemaakt om ev-migratie en opname in kraakbeenexplantaten eenvoudig te monitoren met een confocale microscoop zonder specifieke functie. Bovendien kan dit worden geëxtrapoleerd naar andere weefsels en lipidemonsters of aandoeningen, zoals een in vivo test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medegefinancierd door het ESF Europees Sociaal Fonds en het EFRO Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (MS16/00124; CP16/00124); door het PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), gefinancierd door de duurzame toeristenbelasting van de Balearen; van de Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); door het POSTDOCTORALE PROGRAMMA FOLIUM (FOLIUM 17/01) binnen de FUTURMed, gefinancierd voor 50% door de belasting op duurzaam toerisme van de Balearen en voor 50% door het ESF; en door de Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
References
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
- Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
- Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
- Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
- Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
- Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
- El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
- Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
- Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, Suppl. 1 289-292 (2007).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
- Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
- Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
- Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
- Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
- de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
- Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
- Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
- Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
- Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).
