Summary
Her presenterer vi en protokoll for å merke blodplater lysate-avledede ekstracellulære vesikler for å overvåke deres migrasjon og opptak i bruskutløp som brukes som modell for slitasjegikt.
Abstract
Ekstracellulære vesicles (ELBILER) brukes i forskjellige studier for å bevise sitt potensial som en cellefri behandling på grunn av deres last avledet fra deres cellulære kilde, for eksempel blodplatelysat (PL). Når elbiler brukes som behandling, forventes det at de kommer inn i målcellene og påvirker et svar fra disse. I denne forskningen har PL-avledede elbiler blitt studert som en cellefri behandling for slitasjegikt (OA). Dermed ble det satt opp en metode for å merke elbiler og teste opptaket på bruskutløp. PL-avledede elbiler er merket med det lipofile fargestoffet PKH26, vaskes to ganger gjennom en kolonne, og testes deretter i en in vitro-betennelsesdrevet OA-modell i 5 timer etter partikkel kvantifisering ved nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). Hver time er bruskutløp faste, paraffinerte, kuttet i 6 μm seksjoner for å montere på lysbilder, og observeres under et konfokalt mikroskop. Dette gjør det mulig å verifisere om elbiler kommer inn i målcellene (kondrocytter) i denne perioden og analyserer deres direkte effekt.
Introduction
Artikulær degenerativ sykdom som innebærer en progressiv og irreversibel betennelse og ødeleggelse av den ekstracellulære matrisen til leddbrusk1. Selv om ulike former for leddgikt har mange behandlinger2,3,4, disse er begrenset av deres bivirkninger og begrenset effekt. Vevsteknikksteknikker ved hjelp av autolog kondrocyttimplantasjon brukes rutinemessig til regenerativ behandling av skadet brusk i tidlig OA brusk lesjoner4. Cellebaserte terapier er begrenset hovedsakelig på grunn av det begrensede antallet fenotypisk stabile kondrocytter eller kondroprogenitorer som er i stand til effektivt å reparere brusk3. Derfor er utviklingen av nye terapeutiske strategier for å forhindre sykdomsprogresjon og regenerere store bruskskader av avgjørende betydning.
Ekstracellulære vesicles (ELBILER) har blitt foreslått som en behandling for OA av forskjellige forfattere5,6. Elbiler er membranøse organer utskilt av de fleste celletyper, er involvert i intercellulær signalering, og har vist seg å utøve stamcellers terapeutiske effekter7,8,9, som de nylig har fremkalt interesse for regenerativ medisin10. ELBILER avledet fra mesenchymale stromale celler (MSCer) er de viktigste terapeutiske ELBIL-ene som undersøkes for OA, selv om andre leddrelaterte celler har blitt brukt som EV-kilder, for eksempel kondroprogenitorer eller immunceller11,12.
Blodplatekonsentrater, som blodplatelysater (PLs), brukes til å forbedre sårheling i forskjellige skader, for eksempel hornhinnensår13,14,15 eller i regenerering av senervev16, på grunn av hypotesen om at EV-komponenten av blodplatekonsentrater kan være ansvarlig for disse effektene17 . Noen studier relatert til leddrelaterte sykdommer bruker blodplaterette-avledede elbiler (PL-elbiler) som behandling for å forbedre osteoarthritiske tilstander. PL-ELBILER forbedrer kondrocyttproliferasjon og cellemigrasjon ved å aktivere Wnt / β-catenin-banen18, fremme uttrykket av kondrogene markører i osteoarthritic kondrocytter19, eller vise høyere nivåer av kondrogene proteiner og færre tissulære abnormiteter hos osteoarthritic kaniner behandlet med PL-EVs18.
Elbiler inneholder proteiner, lipider og nukleinsyrer som frigjøres til målcellen, og etablerer celle-til-celle-kommunikasjon, som er hovedfunksjonen relatert til deres terapeutiske applikasjoner20. Effektene av elbiler avhenger av deres rekkeviddeceller og påfølgende lastfrigjøring. Denne effekten kan bekreftes indirekte av endringer forårsaket i celler, for eksempel metabolsk aktivitet eller genuttrykksmodifisering. Disse metodene tillater imidlertid ikke visualisering av hvordan elbiler når celler for å utøve sin funksjon. Dermed presenterer dette papiret en metode for å merke disse PL-avledede ELBIL-ene som skal brukes som behandling for betennelsesdrevne OA-bruskutløp. Konfokal mikroskopi ble brukt til å overvåke EV-opptak og progresjon til kondrocyttene som er tilstede i eksplantene i et tidsforløp på 5 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Bruskutløp ble hentet fra IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) i samsvar med institusjonelle retningslinjer etter etisk godkjenning av prosjektet av CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Kolonne forberedelse
- Likevektskolonner etter produsentens instruksjoner eller som følger:
- Fjern kolonnehetten og likevekt kolonnen. Fjern lagringsbufferen ved elution.
- Vask kolonnen 3 ganger med 2,5 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Under hver vask, vent til kolonnen absorberer hele volumet.
MERK: Ikke la søylen tørke. - Dekk kolonnen med hetten etter siste vask og til prøvepreparering.
2. EV-merking
MERK: Denne EV-merkingsprotokollen bruker en PL-EV-prøve som tidligere var isolert av størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) med tidligere beskrevne betingelser21,22. Alle EV-prøver fra en hvilken som helst kilde kan imidlertid brukes med denne protokollen.
- Konsentrer EV-prøven og kontrollen (PBS) ved hjelp av et konsentrerende rør.
- Plasser prøvene i et konsentrerende rør på 15 ml eller 500 μL, avhengig av startvolumet til EV-prøven. Sentrifuger rørene i henhold til produsentens instruksjoner til en nesten tørr prøve er oppnådd.
MERK: Kontrollprøven er nødvendig for å se etter fargebakgrunn. Selv om denne metoden ikke krever noe spesifikt innledende volum, bør det vurderes at rundt 10% av partiklene vil gå tapt under rensetrinn.
- Plasser prøvene i et konsentrerende rør på 15 ml eller 500 μL, avhengig av startvolumet til EV-prøven. Sentrifuger rørene i henhold til produsentens instruksjoner til en nesten tørr prøve er oppnådd.
- Resuspend de konsentrerte prøvene med fortynningsmiddel C. Resuspend EV-prøver med 200 μL og kontrollgruppen med 100 μL og overfør dem til nye 1,5 ml sentrifugerør.
- Del EV-prøven i to aliquots på 100 μL. Merk en med fargestoff og bruk den som behandling (PKH-PL-EV); la den andre umerket, men behandle den (NTA-PL-EV) som EV-prøven og bruk den til å kvantifisere EV-konsentrasjonen av NTA.
- Forbered 2x fargestoffløsning, noe som resulterer i 8 μM PKH26-oppløsning i fortynnings C.
- Bland 1 μL 1 mM PKH26 linker per 125 μL fortynnings C i prøven. Klargjør et volum som kreves for å legge til prøvene i et 1:1-forhold.
- Tilsett 2x fargestoffløsning til PKH-PL-EV og kontroller prøver i et 1:1-forhold for å oppnå 1x fargekonsentrasjon og 4 μM PKH26 konsentrasjon. Legg til samme volum PBS i NTA-PL-EV-prøven. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Tilsett 5% bovint serumalbumin-PBS-løsning i prøvene i et 1: 1-forhold og sørg for at det endelige volumet er ~ 400 μL.
MERK: Dette trinnet tillater fjerning av ikke-spesifikke fargeinteraksjoner eller ubundet fargestoff. - Fortsett å skille de merkede ELBILene fra det ubundne fargestoffet og ikke-spesifikke interaksjoner av fargestoffet med kolonnen.
3. Merket-EV-isolasjon
- Fjern hetten fra kolonnen, tilsett 400 μL av prøven (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV eller kontroll), og kast all unuted væske.
- Vent til eksemplet går helt inn i kolonnen før du går videre til neste trinn. Tilsett 600 μL PBS og kast all unndratt væske.
- Vent til PBS-en går helt inn i kolonnen før du går videre til neste trinn. Tilsett 600 μL PBS og samle en brøkdel av 600 μL i en 1,5. mL sentrifugerør (elbiler eller kontroll).
MERK: Disse trinnene er nødvendige for å fjerne overflødig fargestoff fra prøvene. En annen separasjon etter kolonne er nødvendig for å få renere elbiler. Dermed bør følgende trinn utføres i en ny likevektskolonne (trinn 4.1.) eller samme kolonne etter et innledende vasketrinn (trinn 4.2). - Klargjør kolonnen for et nytt EV-separasjonstrinn for å få renere elbiler. Hvis det er en ny kolonne, gjentar du trinn 2.1. og 2.2. Hvis det er samme kolonne, vask kolonnen med 2,5 ml 20% isopropanol og gjenta deretter trinn 2.1 og 2.2.
- Tilsett 600 μL tidligere eluterte elbiler oppnådd i trinn 2.5 i kolonnen og kast det eluterte volumet. Vent til væsken kommer helt inn i kolonnen før du går videre til neste trinn.
- Tilsett 400 μL PBS og kast alt eluted volum. Vent til væsken kommer helt inn i kolonnen før du går videre til neste trinn.
- Tilsett 600 μL PBS og samle en brøkdel av 600 μL i et 1,5 ml sentrifugerør. Bruk elbilene og kontrollprøvene til videre analyser eller lagre dem over natten ved 4 oC.
- Lagre de brukte kolonnene for fremtidig bruk.
- Vask kolonnen med 25 ml 20% isopropanol og kast det eluterte volumet. Vask kolonnen 3 ganger med 2,5 ml PBS.
- Legg til lagringsbufferen som ble fjernet i trinn 1.1.1, og vent til bufferen kommer inn i kolonnen. Dekk kolonnen med hetten og oppbevar den ved 4 oC til etterfølgende bruk.
4. EV-kvantifisering
- Forbered 1:1000 fortynning av NTA-PL-EV-prøven og den første PL-EV-prøven som beskrevet i følgende to trinn.
- Forbered 1 ml 1:10 fortynnet NTA-PL-EV og 1 ml 1:10 fortynnet første PL-EV med PBS filtrert gjennom et 0,2 μm filter.
- Forbered 1 ml av en 1:100 fortynning av de tidligere fortynnede prøvene med PBS filtrert gjennom et 0,2 μm filter.
- Injiser den fortynnede NTA-PL-EV-prøven på 1:1000 eller den første PL-EV-prøven ved hjelp av en steril sprøyte i NTA-pumpen. Følg produsentens instruksjoner og anbefalinger for partikkelkonsentrasjon og størrelsesfordelingsbestemmelse.
MERK: Ettersom EV-konsentrasjonen avhenger av prøvestartervolumet, kan det være nødvendig å lese mellomliggende fortynninger og gjøre justeringer for å oppnå riktig NTA-bestemmelse.
5. Elbiler brukt som behandling for betennelsesdrevet OA
- Vask brusk to ganger med PBS og sluk den ved hjelp av en biopsistans med 3 mm diameter under sterile forhold.
MERK: Utfør prosedyren fra trinn 5.1 til 5.6 i en cellekulturhette. - Plasser utløpene i 96-brønns kulturplater med DMEM-F12 medium supplert med 1% penicillin-streptomycin ved 37 oC, 5% CO2og 80% fuktighet.
- For å etablere en betennelsesdrevet OA-modell, supplere cellekulturmediet med 10 ng/ml oncostatin M og 2 ng/ml tumornekrosefaktor-alfa (TNFα).
- Behandle utløpene med 1 × 109 partikler/brønn av merkede elbiler (PKH-PL-EV) eller kontroll i cellekulturmedium supplert med oncostatin M og TNFα.
MERK: Mål volumet på prøven som inneholder 1 × 109 partikler/brønn, og bruk samme volum for kontrollen. - Fjern mediet fra de 96-brønns cellekulturplatene som inneholder bruskutløp. Tilsett 200 μL av cellekulturmediet som er beskrevet i trinn 5.3 til hver brønn.
MERK: Hvis 96-brønnsplatene har vært i kontakt med foster bovint serum (FBS), vask hver brønn tre ganger med 200 μL PBS for å fjerne elbiler fra FBS. - Stopp in vitro-analysen på forskjellige tidspunkter: 0, 1, 2, 3, 4 og 5 timer.
- Vask cellekulturbrønnene som inneholder brusk utviser to ganger med 200 μL PBS.
- Tilsett 100 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i vevet for å fikse det i 3 timer ved 4 oC.
MERK: Trinn som involverer PFA, bør utføres i en avtrekkshette etter anbefalingene fra Sikkerhetsdatabladet. - Fjern PFA, tilsett 100 μL PBS, oppbevar det faste vevet ved 4 °C, og behandle prøvene innen 48 timer.
6. Mikroskopi forberedelse og visualisering
MERK: Denne histologiske prosedyren består av dehydrering, parafininnbygging og rehydreringstrinn. Disse trinnene kan redusere total fluorescens (en begrensning som er nevnt i dataarket for PKH26). Derfor kan andre prosedyrer, for eksempel frossen seksjonering, være mer egnet for EV-visualisering ved konfølende mikroskopi.
- Bygg inn det faste vevet i parafinblokker. Skjær vevet i 6 μm tykke seksjoner.
- Deparaffiner vevsdelene.
MERK: Alle trinn med xylen skal utføres i en avtrekkshette.- Senk vevsseksjonene i xylen i 30 min, 100% etanol i 2 min, 96% etanol i 2 min, 75% etanol i 1 min, og til slutt i destillert vann i 30 s.
- Permeabiliser vevsdelene.
- Forbered en 0,1% Triton-0,1% natriumsitratoppløsning for å permeabilisere vevet. Tilsett en 20 μL dråpe til hver vevsseksjon og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Vask hver seksjon to ganger med 20 μL PBS.
- På en mikroskopisk lysbilde legger du til en dråpe monteringsmedium som inneholder 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) med et vandig monteringsmedium for å bevare fluorescens. Dekk lysbildet som inneholder 3 vevsseksjoner fra trinn 6.3.1.
- Inkuber lysbildene over natten ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
- Oppbevars ved 4 °C, beskyttet mot lys til konfektmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk oversikt over EV-merking og opptaksovervåking vises i figur 1. Partikkelkonsentrasjonen og EV-størrelsen som NTA har oppdaget i tabell 1, viser at EV-konsentrasjonen reduseres under prosessen på grunn av rensetrinnet som utføres to ganger etter merking med kolonnen. Mengden oppnådd er imidlertid i det optimale spekteret av antall partikler som skal brukes til behandling. Denne partikkelkonsentrasjonen brukes til å beregne volumet av PKH-PL-EV og kontroll som brukes til å behandle osteoarthritic brusk explants.
Når bruskutløpene behandles med elbiler eller kontrollgruppen, er de festet i forskjellige perioder: 0, 1, 2, 3, 4 og 5 timer. Hver gruppe blir deretter paraffinert, skiver og forberedt for konfokal mikroskopi med et monteringsmedium som inneholder DAPI. Representative bilder for hver gruppe på hvert tidspunkt presenteres i figur 2, som viser hvordan elbiler kommer inn i vevet til de når kondrocyttene og skriver dem inn over tid.
Som vist i figur 2, er merkede elbiler allerede lokalisert rundt kondrocytter (vist i blått med DAPI-farging) etter 1 t inkubasjon (vist i rødt med PKH26-fargestoff). Noe bakgrunn på grunn av restfarge kan observeres for kontrollgruppen, som ikke har elbiler, men behandles etter samme protokoll som EV-prøven. Disse resultatene bekrefter suksessen til protokollen for å merke elbiler, som kan brukes til å overvåke migreringen gjennom vev i in vitro-analyser, som vist her, og i in vivo-eksperimenter.
Figur 1: Skjematisk oversikt for EV-merking og opptaksovervåkingsprotokoll. Forkortelser: PBS = fosfatbufret saltvann; EV = ekstracellulær vesicle; RT = romtemperatur; BSA = bovint serumalbumin; NTA = nanopartikkelsporingsanalyse; OA = slitasjegikt; TNFα = tumornekrose faktor-alfa; PL = blodplate lysat; PFA = paraformaldehyd; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder av EV-opptak til forskjellige tider. Konfokale representative bilder tatt etter 0, 1, 2, 3, 4 og 5 timer osteoarthritic brusk utviser inkubering med PKH-merkede elbiler eller med en kontrollgruppe. Bilder ble tatt på 400x. Skalastenger = 50 μm. Forkortelser: OA = slitasjegikt; PL = blodplate lysat; EV = ekstracellulær vesicle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Konsentrasjon (partikler/ml) | Partikkelstørrelse (nm) | |
| PL-elbiler (innledende) | 3.03 × 1011 | 134.0 |
| NTA-PL-elbiler uten PKH26 (etter protokollen) | 8.30 × 1010 | 132.0 |
Tabell 1: Karakterisering ved nanopartikkelsporingsanalyse. Forkortelser: OA = slitasjegikt; PL = blodplate lysat; EV = ekstracellulær vesicle; NTA = nanopartikkelsporingsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV-avbildning bidrar til å forstå EV-egenskaper, for eksempel frigjørings- og opptaksmekanismer. Deres bildebehandling tillater overvåking av deres biodistribusjon og karakterisering av deres farmakokinetiske egenskaper som narkotikakjøretøy. Imidlertid kan EV-bildebehandling og sporing være vanskelig på grunn av deres små størrelser, selv om mange bildeenheter og merkingsteknikker er utviklet for å hjelpe forskere med å overvåke ELBILER under in vitro- og in vivo-forhold 23,24,25.
Det finnes to muligheter ved sporing av elbiler ved optisk mikroskopi: bioluminescens og fluorescensavbildning. Begge brukes til å oppdage elbiler innenfor det synlige lysspekteret (390-700 nm). Bioluminescens er en type chemiluminescens produsert etter en luciferase katalyserer oksidasjonen av substratet. Selv om dette signalet krever et ultrasensitivt lade koblet enhetskamera (CCD) for deteksjon, har det et høyt signal-til-støy-forhold, da signalet ikke krever en ekstern lyskilde26.
Fluorescensavbildning bruker proteiner eller organiske fargestoffer som avgir signaler etter eksitasjon fra en ekstern lyskilde. Sammenlignet med bioluminescens er fluorescens lettere å oppdage av et CCD-kamera. Videre, i bioluminescens, substrat toksisitet og halveringstid av substratets bioluminescens bør vurderes for sanntid EV sporing27,28.
Derimot har fluorescerende protein- og organisk fargebasert merking blitt brukt med utmerket oppløsning i optisk mikroskopi. Selv om fluorescensintensiteten avhenger av EV-proteinuttrykksnivåer, effektiviteten til EV-merking ved membrandomener og eksitasjonslyskilden, gir fluorescensfargestoffer stabile og sterke signaler for EV-avbildning25. De fleste organiske fluorescerende fargestoffer ble opprinnelig brukt til cellemembranavbildning. Disse fargestoffene kombinerer vanligvis fluoroforer som merker lipidbilayeren eller proteiner av interesse på elbiler via forskjellige funksjonelle grupper29.
En organisk fluorescerende fargestofffamilie er den lipofile PKH-fargefamilien som består av fluoroforer med en lipofil karbocyanin som forankrer inn i lipidbilayeren for fluorescensavbildning30,31. PKH fargestoffer har blitt brukt til in vitro og in vivo studier som deres in vivo halveringstid varierer fra 5 til >100 dager. Dermed kan utholdenheten til fargestoffet in vivo føre til villedende resultater i studier med kortere varighet enn halveringstiden til fargestoffet. Imidlertid er PKH-fargestoffer nyttige som sporstoffer for å vise EV-migrasjon32.
PKH26 er medlem av denne PKH lipofile fluoroforfamilien, funnet i det røde spekteret med en topp av eksitasjon ved 551 nm og utslipp ved 567 nm. Dette gjør den kompatibel med andre deteksjonskanaler, for eksempel rhodamin, phycoerythrin eller DAPI33, slik at deteksjon av, i dette tilfellet, migrering av elbiler merket med PKH26 mot kondrocytter merket med DAPI. Det er viktig å merke seg at selv om PL ble brukt som EV-kilde her, kan denne protokollen brukes med elbiler fra andre kilder og til andre formål, for eksempel for å spore merket in vivo-distribusjonen av elbiler.
Denne protokollen har noen begrensninger. For eksempel er det noen bekymringer for at PKH26 øker EV-størrelsen, noe som kan påvirke deres biodistribusjon og cellulære opptak. Men i slike tilfeller der EV-størrelsen ble økt av PKH26, var merkingsprosedyren forskjellig fra det som er beskrevet i denne protokollen34. Disse forskerne inkluderte ikke vaske- og rensetrinnene, noe som førte til høyere nivåer av fritt fargestoff, noe som kunne føre til større EV-størrelse. Videre overvinner den nåværende protokollen dette problemet ved å utføre en parallell EV-rensing med og uten PKH26. Dette gjør det mulig å karakterisere en EV-prøve uten etikett, som ble behandlet identisk som den merkede. Dermed kan en misvisende kvantifisering på grunn av forvirrende ikke-spesifikke merkede partikler (lipoprotein eller proteinprøveforurensninger) eller ved tilstedeværelse av ikke-EV-partikler i etikettblandingen unngås, som vist tidligere35,36.
I dette dokumentet ble to sykluser med rensing utført av størrelsesekskluderingskromatografi ved hjelp av kolonner. Den første kan erstattes av sukrose gradient sentrifugering. Imidlertid ble alle EV-populasjoner samlet inn i samme rømte aliquot med denne kolonnen og ikke utsatt for høye g-krefter som ble påtruffet i høyhastighets sentrifugering. Å unngå sentrifugering kan imidlertid føre til en langsommere prosess, spesielt hvis kolonnevask er nødvendig mellom separasjonssykluser. En annen begrensning i denne protokollen er behovet for prøvekonsentrasjon før du starter merkingsprosessen på grunn av det begrensede volumet av kolonnen. Dette handikapet kan overvinnes ved å bruke kolonner med høyere lastekapasitet.
Andre EV-merkingsprotokoller beskriver bruken av forskjellige fargestoffer; Bruken av ultracentrifugation-trinn kan imidlertid skade EV-integriteten37. Protokollen beskrevet her har tillatt overvåking av EV migrasjon og opptak i brusk utviser lett med et konfokalt mikroskop uten noen spesiell funksjon. Videre kan dette ekstrapoleres til andre vev og lipidprøver eller tilstander, for eksempel en in vivo-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, finansiert av ESF European Social Fund og ERDF European Regional Development Fund (MS16/00124; CP16/00124); av PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansiert av den bærekraftige turistskatten på Balearene; av Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); av FOLIUM postdoktorprogram (FOLIUM 17/01) innenfor FUTURMed, finansiert til 50% av den bærekraftige turistskatten på Balearene og på 50% av ESF; og av Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL Syringe BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Prepared at 20% with Milli-Q water |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolute ethanol Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water |
| Biopsy Punch with plunger 3 mm | Scandidact | MTP-33-32 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Prepared at 5% with PBS |
| Cartilage explants | IdISBa Biobank | ||
| Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| Cover glass 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Embedded paraffin tissue blocks | IdISBa Biobank | Fee for service | |
| Exo-spin mini-HD columns | Cell guidance systems | EX05 | |
| Feather S35 Microtome Blade | Feather | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 and Dliuent C included |
| Sodium citrate dihydrate | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D systems | 210-TA-005 | Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| Equipment | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| NanoSight NS300 | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Shandon Finesse 325 Manual Microtome | Thermo Scientific™ | A78100101 | |
| TCS-SPE confocal microscope | Leica Microsystems | 5200000271 |
References
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
- Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
- Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
- Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
- Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
- Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
- El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
- Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
- Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, Suppl. 1 289-292 (2007).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
- Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
- Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
- Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
- Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
- de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
- Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
- Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
- Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
- Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
- Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).
