Summary
Настоящий протокол описывает выделение и культивирование пероральных кератиноцитов, полученных из неба взрослой мыши. Также сообщается о методе оценки с использованием иммуноокрашивания.
Abstract
В течение многих лет большинство исследований с участием кератиноцитов проводились с использованием эпидермальных кератиноцитов кожи человека и мыши. В последнее время оральные кератиноциты привлекают внимание из-за своей уникальной функции и характеристик. Они поддерживают гомеостаз орального эпителия и служат ресурсами для применения в регенеративной терапии. Тем не менее, исследования in vitro, в которых используются пероральные первичные кератиноциты взрослых мышей, были ограничены из-за отсутствия эффективного и хорошо зарекомендовавшего себя протокола культивирования. Здесь пероральные первичные кератиноциты были выделены из тканей неба взрослых мышей и культивированы в коммерческой среде с низким содержанием кальция, дополненной хелексед-сывороткой. В этих условиях кератиноциты поддерживались в пролиферативном или похожем на стволовые клетки состоянии, а их дифференцировка ингибировалась даже после увеличения проходов. Анализ экспрессии маркеров показал, что культивируемые оральные кератиноциты экспрессировали базальноклеточные маркеры p63, K14 и α6-интегрин и были отрицательными для маркера дифференцировки K13 и маркера фибробластов PDGFRα. Этот метод продуцировал жизнеспособные и культивируемые клетки, пригодные для последующих применений при изучении функций оральных эпителиальных стволовых клеток in vitro.
Introduction
Оральный эпителий служит первым барьером в защите организма от стрессов окружающей среды, включая химические или физические повреждения и бактериальные и вирусные инфекции1,2. Слизистая оболочка полости рта содержит внешний слой стратифицированного плоского эпителия, который состоит из кератиноцитов и подлежащей соединительной ткани, называемой lamina propria, которая в основном состоит из фибробластов и внеклеточного матрикса. Слизистая оболочка полости рта мыши может быть широко разделена на три подтипа: жевательная (твердое небо и десна), специализированная (дорсальный язык) и слизистая оболочка (слизистая оболочка щечки, вентральный язык, мягкое небо, губы) слизистая2,3 (рисунок 1А). Оральный эпителий ороговеет в жевательной и специализированной слизистой оболочке и не ороговерит в слизистой оболочке. Несмотря на свое анатомическое расположение, эпителий полости рта похож на эпидермис кожи тем, что состоит из плотно упакованных эпителиальных клеток с различной степенью дифференцировки: базальных слоев, содержащих недифференцированные клетки; остистые, зернистые и ороговевшие слои, которые образуют ороговевший эпителий, или промежуточные и поверхностные слои, которые образуют неорогованный эпителий4. Трансгенные мышиные модели облегчили изучение клеточных и молекулярных особенностей оральных эпителиальных стволовых клеток в небе, слизистой оболочке щеки, языке и десне5,6,7,8,9,10,11. Однако в большинстве этих исследований в основном использовались эксперименты на мышах in vivo. Системы клеточных культур обычно не использовались из-за отсутствия установленных и эффективных протоколов.
Система культур in vitro может быть использована для молекулярного и биохимического анализа регуляторов стволовых клеток, клеточных анализов и скрининга лекарств. В настоящее время разработаны протоколы культивирования первичных кератиноцитов эпидермиса кожи, в которых базальные кератиноциты могут быть успешно выделены и культивированы в клинических и исследовательских целях12,13,14,15. В 1980 году Hennings et al. показали, что низкая концентрация кальция (< 0,09 мМ Ca2+) в культуральной среде способствовала пролиферации и поддерживала клетки в недифференцированном состоянии. Более высокий уровень кальция способствовал дифференцировке клеток и снижению пролиферации16. Впоследствии были разработаны и широко применены методологии культивирования неонатальных и взрослых мышиных эпидермальных кератиноцитов, которые широко применяются к многочисленным моделям мышей с различной генетической подоплекой для исследований in vitro17,18,19. Хотя кожа и оральный эпителий имеют общие характеристики, они также демонстрируют внутренние различия, например, в их статусе ороговения, скорости оборота, экспрессии генов и способности заживления ран3,11,20,21,22,23,24,25,26.
Хотя культура пероральных кератиноцитов человека была успешно выполнена27,28,29, публикации о культуре пероральных кератиноцитов мыши30,31,32 ограничены из-за небольшого размера ткани-мишени и отличительных характеристик клеток по сравнению с эпидермальными кератиноцитами кожи. Этот протокол описывает методы выделения и долгосрочного культивирования первичных пероральных кератиноцитов мыши.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по экспериментам на животных в Университете Кумамото и Университете Цукуба.
1. Подготовка реагентов и питательных сред
- Готовят 40 мл кератиноцитарной культуральной среды, содержащей 60 мкМ кальция и 600 мкл антибиотико-антимикотического раствора. Готовят 20 мл 0,025% трипсина и 400 мкл антибиотико-антимикотического раствора.
- Раствор для ингибирования трипсина разморозить при комнатной температуре и держать при температуре 4 °C до использования на этапе 4.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляционный реагент подготовлен для выделения тканей пяти мышей.
- Раствор для ингибирования трипсина разморозить при комнатной температуре и держать при температуре 4 °C до использования на этапе 4.1.
- Для приготовления питательной среды берут 500 мл среды и добавляют 5 мл раствора добавки для роста (см. Таблицу материалов) (далее именуемую полной средой) и 20% истощенной кальцием хелекседо-фетальной бычьей сыворотки (FBS)33 (далее именуемой chelexed-FBS).
2. Рассечение ткани неба у взрослой мыши
- Принесите в жертву взрослую мышь C57BL/6J (самца или самку) при вывихе шейки матки в соответствии с правилами учреждения, касающимися благополучия животных.
- Удалите волосы вокруг рта бритвой. С помощью ножниц срежьте от щеки по направлению к челюсти, с обеих сторон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь должна быть обезболена перед жертвоприношением. Используется анестезирующая смесь медетомидина, мидазолама и буторфанола (см. Таблицу материалов).
- Удалите волосы вокруг рта бритвой. С помощью ножниц срежьте от щеки по направлению к челюсти, с обеих сторон.
- Используйте щипцы, чтобы широко открыть рот и впитать любую кровь с помощью ватного тампона. Для дезинфекции неба протрите внутреннюю часть рта вактивным тампоном, содержащим 10% повидона-йода.
- Чтобы собрать неб мыши, сначала используйте хирургическое лезвие скальпеля, чтобы сделать краевой разрез полной толщины вдоль небной стороны верхнечелюстных зубов. Затем тщательно рассекните все небо с помощью распатория.
ПРИМЕЧАНИЕ: Распаториум - это инструмент, используемый для поднятия слизисто-сосального лоскута (см. Таблицу материалов) (рисунок 1B). - Быстро переносят ткани неба в пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл полной среды + антибиотико-антимикотический раствор. Держите ткани на льду до готовности к инкубации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора у нескольких мышей ткани неба могут храниться на льду до 4 ч.
3. Предварительная обработка тканей неба
- В ламинарной проточной вытяжке переложить ткани в 60-миллиметровую посуду, содержащую 4 мл полной среды + антибиотико-антимикотический раствор.
- Используя короткие, тупые щипцы и лезвие скальпеля, аккуратно удалите любую кровь из тканей. Промывайте салфетки 10 раз в полной среде.
- Переложить ткани на 35 мм посуду, содержащую 4 мл 0,025% трипсина + антибиотико-антимикотический раствор, эпителиальной поверхностью вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителиальная поверхность, которая изгибается внутрь, должна быть пропитана раствором трипсина; ламина проприя должна быть обращена вверх. Ткань должна быть максимально сплющена, чтобы быть полностью инкубированной в растворе трипсина. - Инкубировать ткани в 0,025% трипсина в течение ~16 ч при комнатной температуре в культуральной вытяжке.
4. Сбор и культивирование первичных клеток
- Используя одну пару тупых щипцов, удаляют ткань из раствора трипсина (в чашке 35 мм) и перекладывают в раствор ингибитора трипсина в 60-миллиметровую чашку (4 мл на чашку) эпителиальной поверхностью, обращенной вверх.
- Используя щипцы, чтобы удержать край неба, аккуратно соскоблите эпителиальный слой с нижележащей lamina propria с помощью лезвия скальпеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соединительная ткань не переваривается трипсином, поэтому она не отслаивается во время соскабливания. - Чтобы собрать максимальное количество эпителиальных клеток из тканей, переложите ткань в другую 60-миллиметровую чашку с 4 мл полной среды и повторите стадию соскоба.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы не соскабливаете ткань кончиком лезвия; вместо этого используйте край лезвия. Соскоб выполняется в течение 5-10 мин на ткань. - Поместите стерильный клеточный сетчатый фильтр 100 мкм поверх конической трубки объемом 50 мл.
- Используя стерильную пипетку, переведите 2 мл раствора трипсина (из стадии 4.1) в ситечко, чтобы смочить его поверхность.
- Используя пипетку, смешайте клеточную суспензию в 60-миллиметровой чашке (из стадий 4,2-4,3) несколько раз и фильтруйте ячейки через 100-мкм клеточный сетчатый фильтр, приготовленный на этапах 4,4-4,5.
- Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Готовят 15 мкл раствора трипан синего цвета и добавляют 15 мкл клеточной суспензии (стадия 4.6). Переложите 10 мкл клеточно-трипановой синей смеси на гемоцитометр и подсчитайте количество клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Один кусок мышиного неба может дать до 1 миллиона клеток. - При подсчете центрифугируют трубку (со стадии 4.6) при 100 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте супернатанта пипеткой. Добавьте в пробирку 2 мл полной среды + хелексед-FBS. Повторно суспендируйте гранулу клетки, тритурируя несколько раз с помощью пипетки 5 мл.
- Пластина 2-5 x 105 клеток от одной мыши в один колодец из 24-луночной пластины, предварительно покрытой коллагеном типа I (см. Таблицу материалов).
- Инкубируют клетки при 37 °C в течение 2 дней без изменения среды.
- Через два дня после посева заменить половину питательной среды на полную среду + хелексед-FBS. Проверьте морфологию клеток под микроскопом. Подкармливают клетки с полной средой + хелексед-ФБС каждые 2 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: После посева будут наблюдаться клетки разных размеров. Примерно через 3-5 дней после посева могут наблюдаться кератиноциты с морфологией булыжника (рисунок 2). Потребуется 1-2 недели посева, прежде чем можно будет провести первый проход, и последующие 1-2 недели необходимы, прежде чем клетки будут готовы ко второму и третьему проходам. После этого клетки будут расти быстрее и могут быть подготовлены к криоконсервации. Ячейки могут быть повторно покрыты в одну скважину (из 24-луночной плиты) и 6-луночную плиту в первом и втором проходе соответственно. Последующее прохождение будет зависеть от роста и плотности клеток. После третьего прохода можно использовать соотношение расщепления клеток 1:2 или 1:3.
5. Кератиноцитарный пассаж
- Соберите 2 мл супернатанта из чашки для культивирования и раздайте в коническую трубку объемом 15 мл (на льду). Промыть клетки стерильным 1x PBS дважды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда клетки достигают примерно 70%-80% слияния, они готовы к прохождению. - Добавьте 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в блюдо в одну лунку 6-луночной тарелки.
- Инкубировать в течение 5-15 мин при 37 °C; проверьте через 5 мин, чтобы увидеть, отсоединяются ли клетки от тарелки.
- Нейтрализуют реакцию с помощью 1 мл раствора для ингибирования трипсина и 2 мл полной питательной среды + хелексед-FBS путем щадящей пипетки. Далее перекладывают клеточную суспензию в ту же коническую трубку объемом 15 мл, что и на этапе 5.1.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 100 х г в течение 5 мин при 4 °С. Аспирировать супернатант пипеткой и повторно суспендировать клеточную гранулу в 1 мл полной питательной среды.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Далее пластина 1 мл клеточной суспензии превращается в новую 24- или 6-луночную культуральную пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые клетки из ранних проходов могут быть заморожены в смеси 70% полной питательной среды + 20% хелексед-FBS + 10% DMSO. 1-2 криовиала клеток могут быть собраны с одной сливающейся культуральной пластины.
6. Криоконсервация и восстановление кератиноцитов
- Замораживание клеток
- Растут кератиноциты до 80%-90% конфлюзии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте клеткам разрастаться, так как это может снизить их статус пролиферации и жизнеспособность. - Обработайте кератиноциты в чашке 0,05% трипсина-ЭДТА, как описано в шагах 5,1-5,5.
- Подсчитайте кератиноциты с помощью гемоцитометра. Подготовьте криовиалы на основе рассчитанного количества клеток, чтобы обеспечить перенос 1 x 106 клеток / мл в каждый флакон.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 100 х г в течение 5 мин при 4 °С. Выбросить надосадочный материал и повторно суспендировать клеточную гранулу в 10 мл растворе 10% ДМСО + 20% хелексед-ФБС + 70% полная культуральная среда (9 мл полной среды + хелексед-ФБС и 1 мл ДМСО).
- Распределите клетки в криовиалы по 1 мл суспензии на флакон. Поместите флаконы в криогенный контейнер для хранения на ночь при температуре -80 °C. Переложите флаконы в резервуар для жидкого азота на следующий день.
- Растут кератиноциты до 80%-90% конфлюзии.
- Восстановление клеток
- Извлеките криовиал из резервуара с жидким азотом и частично разморозьте при комнатной температуре. В пробирке объемом 15 мл смешайте 1 мл клеточной суспензии с 3 мл полной питательной среды + хелексед-FBS.
- Центрифугировать смесь в течение 5 мин при 100 х г и 4 °C. Выбросьте надосадочный материал и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл полной питательной среды + хелексед-FBS.
- Выложите клеточные суспензии в новые 60 мм коллагеновые I-покрытые культурой посуды. Заменяйте культуральную среду каждые 2-3 дня и пропускайте клетки после слияния.
7. Иммунофлуоресцентное окрашивание
- Культивируйте оральные кератиноциты на квадратных покровах (22 мм х 22 мм) в 6-луночных пластинах (5 х 105 клеток/лунка) в течение 2 дней.
- Фиксируют кератиноциты в растворе 4% параформальдегида (PFA) и PBS в течение 20 мин при комнатной температуре перед трехкратной промывкой 1x PBS.
- Пермеабилизируют клетки в растворе 0,1% тритона в PBS. Инкубировать клетки в блокирующем реагенте (2,5% козьей сыворотки, 2,5% ослиной сыворотки) в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей ночной инкубацией с первичными антителами (см. Таблицу материалов) при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные антитела использовались в следующих разведениях: кролик анти-K14 (1:1000), крысиный α6-интегрин (1:100), кролик анти-p63 (1:500), кролик анти-K13 (1:100) и козий анти-PDGFRα (1:100). - Промыть образцы в растворе 0,1% тритона в PBS с последующим инкубацией с вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичные антитела (Alexa 488 или 555) использовались в разведении 1:300. - Обмазывайте все образцы раствором Hoechst в течение 10 минут и устанавливайте ячейки на стеклянные слайды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор Hoechst используется для окрашивания ядер клеток. - Выполните выборочную визуализацию с помощью конфокального микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Яркость и контрастность настраиваются на одинаковую интенсивность с помощью программного обеспечения для редактирования изображений.
Representative Results
Обзор процесса рассечения и выделения оральных кератиноцитов из неба взрослой мыши
Диссоциированные оральные кератиноциты были собраны из неба взрослой мыши и культивированы в индивидуальном 20% хелексед-FBS. Мышиное небо состоит из твердого неба и мягкого неба (рисунок 1С). Процедура выделения мышиных оральных кератиноцитов обобщена на рисунке 1D. Ткань неба рассекают и переносят в среду, содержащую антибиотико-антимикотический раствор, перед инкубацией в 0,025% растворе трипсина при 4 °C в течение ночи. На следующий день ткани неба обрабатывают раствором ингибитора трипсина и полной культуральной средой в равных объемах. Впоследствии ткани соскребаются с помощью хирургического лезвия скальпеля для сбора оральных кератиноцитов. Клеточная суспензия фильтруется через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм и центрифугируется. Затем клетки высевают в покрытые коллагеном I 24-луночные пластины, содержащие 2 мл полной питательной среды + хелексед-FBS.
Репрезентативные результаты успешной изоляции мышиных оральных кератиноцитов
Первичные оральные кератиноциты росли как монослой и демонстрировали морфологию булыжника (рисунок 2). Небольшие колонии кератиноцитов были видны через 3-5 дней (рисунок 2А,В); они становились больше и образовывали плотные колонии на 1 неделе инкубации (рисунок 2C). Колонии кератиноцитов отображали типичные морфологические особенности базальных кератиноцитов, свидетельствующие об их здоровом состоянии. Пероральные кератиноциты человека оставались недифференцированными в течение нескольких проходов в полной культуральной среде, содержащей 0,06 мМ Ca2+16,28. Первое прохождение было выполнено примерно через 2 недели после первоначального нанесения покрытия (рисунок 2D). На более поздних проходах кератиноциты демонстрировали стабильный рост с более коротким периодом культивирования (рисунок 2E-G). Кератиноциты переставали расти, если во время процесса выделения происходило значительное загрязнение фибробластами (рисунок 2Н).
Изолированные мышиные оральные кератиноциты экспрессируют базальноклеточные маркеры
Для подтверждения статуса первичных пероральных кератиноцитов проводили иммуноокрашивание с использованием базальноклеточных маркеров Кератин 14 (К14) и α6-интегрин34. K14 и α6-интегрин экспрессировались в кератиноцитах после культивирования (рисунок 3A,B). Клетки также были окрашены маркером стволовых клеток p63, чтобы подтвердить их стволовость. Клетки раннего пассажа (пассаж 4) и позднего прохождения (пассаж 7) показали равномерную экспрессию р63 (рисунок 3C,D). Напротив, кератиноциты, обработанные высоким содержанием кальция (индукция 1,2 мМ в течение 2 дней), демонстрировали снижение экспрессии р63 (рисунок 3E), что указывает на то, что лечение высоким содержанием кальция подавляет гены, связанные со стволовыми клетками, в первичных кератиноцитах, как сообщалось ранее16. Маркер дифференцировки кератин 13 (K13) показал редкую экспрессию или отсутствие экспрессии как в раннем, так и в позднем течении и значительную экспрессию при лечении высоким содержанием кальция (рисунок 3F-H). Чтобы проверить возможность загрязнения фибробластов в культуре кератиноцитов, окрашивание с использованием маркера фибробластов PDGFRα проводили тем же набором кератиноцитов по сравнению с эмбриональным фибробластом мыши (MEF). Не наблюдалось экспрессии PDGFRα в культуре кератиноцитов по сравнению с высокой экспрессией, наблюдаемой в клетках MEF (рисунок 3I-3L). Эти результаты показали, что этот протокол может успешно изолировать базальные кератиноциты и поддерживать эти клетки в недифференцированном состоянии.
Рисунок 1: Обзор процедуры рассечения и выделения мышиных оральных кератиноцитов. (A) Схематическое изображение полости рта мыши. (B) Инструменты, используемые для рассечения неба и выделения оральных кератиноцитов мыши. (C) Яркое изображение мышиного неба. Шкала: 100 мкм. (D) Краткое изложение протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные результаты успешной изоляции мышиных оральных кератиноцитов. (А-Г) Временные изображения культивируемых первичных пероральных кератиноцитов через 3 дня (А), 5 дней (В), 1 неделю (С) и 2 недели (D) культуры после выделения. Показаны морфологии пероральных кератиноцитов мыши после первого (E), второго (F) и третьего (G) пассажей. (H) Пример загрязнения фибробластами в культуре пероральных кератиноцитов мыши. Шкала: 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Изолированные мышиные оральные кератиноциты экспрессируют базальноклеточные маркеры. (А-Б) Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания K14 (A; красный) и α6-интегрина (B; зеленый) в отрывке 4. (С-Е) Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания p63 (зеленый) в пассаже 4 (C), пассаже 7 (D) и лечении высоким содержанием кальция (E). (Ф-Н) Иммуноокрашивающие изображения K13 (зеленый) в пассаже 4 (F), пассаже 7 (G) и лечении высоким содержанием кальция (H). (И-Л) Иммуноокрашивающие изображения PDGFRα (красный) в пассаже 4 (I), пассаже 7 (J), лечении высоким содержанием кальция (K) и MEF (L). Ядра окрашены Hoechst (синий). Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Первичные кератиноциты, выделенные из эпидермиса кожи человека или мыши, использовались в течение многих лет в исследованиях и клинических применениях12,13,15,18,27,28,29. Напротив, было установлено несколько протоколов для выделения и культивирования первичных пероральных кератиноцитов у взрослых мышей30,31,32. В настоящем исследовании использовалась коммерческая полная культуральная среда и хелексед-FBS для поддержания кератиноцитов в пролиферативном или похожем на стволовые клетки состоянии. Эта культуральная система может быть использована в молекулярных и биохимических анализах для дальнейшего понимания особенностей оральных эпителиальных стволовых клеток и связанных с ними заболеваний.
В этот протокол включено несколько критических шагов. Во-первых, концентрация трипсина и время инкубации необходимы для производства жизнеспособных клеток для последующих культур. Мы последовательно использовали 0,025% растворы трипсина и 16-часовые инкубационные периоды в вытяжке камеры при комнатной температуре. Если не инкубировать в течение достаточного периода времени, кератиноциты не будут должным образом диссоциировать из ткани, что приведет к снижению конечного выхода клеток. Во-вторых, мягкое пипетирование клеточной суспензии на второй день заметно влияет на жизнеспособность клеток. Соскоб следует осторожно начинать с эпителиальной стороны и не превышать 10 мин на образец ткани. Наконец, первая изолированная клеточная суспензия содержит фибробласты и другие типы клеток; эти нежелательные клетки обычно начинают исчезать в последующих культурах.
Потенциальные ограничения были выявлены во время изоляции клеток и культивирования. В редких случаях фибробласты могут быть загрязнены во время процесса выделения, и фибробласты могут ингибировать рост кератиноцитов в последующих проходах (рисунок 2H). Для устранения такого загрязнения в культуре необходимо выбрать коммерческую среду, содержащую ингибитор роста фибробластов. Поскольку неб мыши и другие слизистые оболочки полости рта имеют относительно небольшие размеры, начальный выход клеток от одной мыши может быть низким. Поэтому весь посевной период этого протокола – до стадии криоконсервации – дольше, чем у первичных кератиноцитов кожи. Изолированные оральные кератиноциты лучше всего использовать в течение 10 проходов, так как более длительные периоды культивирования могут изменить свойства клеток и снизить количество стволовых клеток.
Текущий метод показал, что мышиные оральные кератиноциты демонстрировали плотно упакованную морфологию булыжника и образовывали монослойные колонии в пролиферативных условиях. Они также показали высокую экспрессию базальных маркеров α6-интегрина, K14 и маркера стволовых клеток p63. В будущих исследованиях, в дополнение к иммунофлуоресцентному окрашиванию, секвенированию РНК, ОТ-ПЦР и анализу вестерн-блоттинга будут использоваться для проверки клеточной гетерогенности и чистоты оральных кератиноцитов, что еще больше улучшит наше понимание природы этих клеток.
После 2-3 проходов оральные кератиноциты были достаточно стабильны для использования в дальнейших функциональных экспериментах. Важно отметить, что этот протокол культивирования может быть объединен с трансгенными линиями мыши, включая нокаут генов, Cre-loxP и тет-индуцируемые системы, а также может использоваться в клеточных и молекулярных анализах. Таким образом, настоящий протокол предоставляет исследователям фундаментальный и эффективный метод, который может быть использован для дальнейшего понимания биологии оральных кератиноцитарных стволовых клеток.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Грантом в помощь научным исследованиям (B) (20H03266) (для A.S.), Грантом в помощи для начинающих ученых (18K14709) (для A.S.), AMED под номером гранта JP21gm6110016 и 21bm0704067 (для A.S.) и исследовательскими грантами от Научного фонда Takeda (для A.S.). Мы благодарим Центр ресурсов и развития животных в Университете Кумамото и Центр ресурсов животных в Университете Цукуба за отличный уход за мышами. Мы благодарим ядро IRCMS в Университете Кумамото за поддержку в конфокальной визуализации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA, phenol red | Gibco | 25300062 | |
| 0.4w/v% Trypan Blue solution | Wako | 207-17081 | |
| 10 mL Serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 100 µm Nylon cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 mL sterile conical tube | Falcon | 352096 | |
| 2 mL Aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
| 35 mm Cell culture dish | Corning | 353801 | |
| 50 mL sterile conical tube | Falcon | 352070 | |
| 60 mm Cell culture dish | Corning | 353802 | |
| 6-well Tissue Culture plate | Falcon | 353046 | |
| 96 Well Culture plate (U bottom) | Falcon | 353077 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| Biocoat Collagen I cellware 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Blunt Forceps | AS ONE | 1-8187-03 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | Vetorphale | |
| CoolCell LX | Corning | 432002 | Cryogenic storage |
| Cotton | AS ONE | 63-1452-97 | |
| Cover slips 22 x 22 μm square | Matsunami Glass Ind. | C022221 | |
| Cryogenic Vial 1.2 mL | Thermo Scientific | 5000-0012 | |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Gibco | R007100 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31572 | |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21208 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663-10ML | |
| EpiLife Defined Growth Supplement (EDGS) | Gibco | S0120 | |
| EpiLife, with 60 µM calcium | Gibco | MEPI500CA | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | |
| Fine forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3374 | |
| Goat anti-PDGF Receptor α | R&D Systems | AF1062 | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Half-curved forceps | BRC Bio Research Center | PRI13-3376 | |
| Hemocytometer | Hirschmann Laborgeräte | 8100204 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Iris Scissors | Muromachi Kikai | 14090-09 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo | Domitor | |
| Midazolam | Astellas Pharma | Dormicum | |
| No.15 Disposable scalpel | Feather | 219AABZX00136000 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Povidone-iodine | Y's Square | 872612 | |
| Rabbit anti-Cytokeratin 13 antibody | Abcam | ab92551 | |
| Rabbit anti-K14 | BioLegend | 905301 | |
| Rabbit anti-p63 antibody | Abcam | ab124762 | |
| Raspatorium #14 | AS ONE | 8-4599-01 | |
| Rat α6-integrin | BD Biosciences | 553745 | |
| Triton X-100 | Wako | 581-81705 | |
| Type I Collagen coated 24-well plate | Corning | 354408 | |
| Type I Collagen coated 60mm dish | Corning | 356401 | |
| Type I Collagen coated 6-well plate | Corning | 355400 |
References
- Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. Journal of Dental Education. 66 (4), 564-574 (2002).
- Squier, C. A., Kremer, M. J. Biology of oral mucosa and esophagus. Journal of the National Cancer Institute Monographs. (29), 7-15 (2001).
- Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
- Winning, T. A., Townsend, G. C. Oral mucosal embryology and histology. Clinics in Dermatology. 18 (5), 499-511 (2000).
- Asaka, T., Akiyama, M., Kitagawa, Y., Shimizu, H. Higher density of label-retaining cells in gingival epithelium. Journal of Dermatological Science. 55 (2), 132-134 (2009).
- Bickenbach, J. R. Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin. Journal of Dental Research. 60, Spec No C 1611-1620 (1981).
- Bickenbach, J. R., Mackenzie, I. C. Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia. Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 618-622 (1984).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
- Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
- Willberg, J., Syrjanen, S., Hormia, M. Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation. Journal of Periodontology. 77 (5), 840-846 (2006).
- Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
- Compton, C. C., et al. Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study. Laboratory Investigation. 60 (5), 600-612 (1989).
- Gallico, G. G., O'Connor, N. E., Compton, C. C., Kehinde, O., Green, H. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. New England Journal of Medicine. 311 (7), 448-451 (1984).
- Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 2 (2013).
- O'connor, N. E., Mulliken, J. B., Banksschlegel, S., Kehinde, O., Green, H. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal-cells. Lancet. 1 (8211), 75-78 (1981).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Caldelari, R., Suter, M. M., Baumann, D., De Bruin, A., Muller, E. Long-term culture of murine epidermal keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 114 (5), 1064-1065 (2000).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Yano, S., Okochi, H. Long-term culture of adult murine epidermal keratinocytes. British Journal of Dermatology. 153 (6), 1101-1104 (2005).
- Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
- Papagerakis, S., et al. Oral epithelial stem cells - implications in normal development and cancer metastasis. Experimental Cell Research. 325 (2), 111-129 (2014).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of Dental Research. 82 (8), 621-626 (2003).
- Chen, L., et al. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471 (2010).
- Chen, L., Gajendrareddy, P. K., DiPietro, L. A. Differential expression of HIF-1alpha in skin and mucosal wounds. Journal of Dental Research. 91 (9), 871-876 (2012).
- Simoes, A., et al. Differential microRNA profile underlies the divergent healing responses in skin and oral mucosal wounds. Scientific Reports. 9 (1), 7160 (2019).
- Turabelidze, A., et al. Intrinsic differences between oral and skin keratinocytes. PLoS One. 9 (9), 101480 (2014).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Izumi, K., Tobita, T., Feinberg, S. E. Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells. Journal of Dental Research. 86 (4), 341-346 (2007).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Hatakeyama, S., et al. Establishment of gingival epithelial cell lines from transgenic mice harboring temperature sensitive simian virus 40 large T-antigen gene. Journal of Oral Pathology & Medicine. 30 (5), 296-304 (2001).
- Ookura, T., et al. Fibroblast and epidermal growth factors modulate proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (6), 365-372 (2002).
- Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
- Brennan, J. K., Mansky, J., Roberts, G., Lichtman, M. A. Improved methods for reducing calcium and magnesium concentrations in tissue culture medium: application to studies of lymphoblast proliferation in vitro. In Vitro. 11 (6), 354-360 (1975).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
