Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تطوير مختبر متنقل لفسيولوجيا الميتوكوندريا لقياس طاقة الميتوكوندريا في الميدان

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62956
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 3, 1
1School of Kinesiology, Auburn University, 2Department of Biological Sciences, Auburn University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Auburn University

Summary

قمنا بتصميم وبناء مختبر متنقل لقياس معدلات التنفس في الميتوكوندريا المعزولة للحيوانات البرية التي تم التقاطها في المواقع الميدانية. هنا ، نصف تصميم وتجهيز مختبر الميتوكوندريا المتنقل وبروتوكولات المختبر المرتبطة به.

Abstract

تعد طاقة الميتوكوندريا موضوعا مركزيا في الكيمياء الحيوية الحيوانية وعلم وظائف الأعضاء ، حيث يستخدم الباحثون تنفس الميتوكوندريا كمقياس للتحقيق في القدرة الأيضية. للحصول على مقاييس التنفس الميتوكوندريا ، يجب استخدام عينات بيولوجية جديدة ، ويجب إكمال الإجراء المختبري بأكمله في غضون 2 ساعة تقريبا. علاوة على ذلك ، هناك حاجة إلى قطع متعددة من المعدات المتخصصة لإجراء هذه المقايسات المختبرية. وهذا يخلق تحديا لقياس تنفس الميتوكوندريا في أنسجة الحيوانات البرية التي تعيش بعيدا عن مختبرات علم وظائف الأعضاء حيث لا يمكن الحفاظ على الأنسجة الحية لفترة طويلة جدا بعد جمعها في الحقل. علاوة على ذلك ، فإن نقل الحيوانات الحية لمسافات طويلة يؤدي إلى الإجهاد ، والذي يمكن أن يغير طاقة الميتوكوندريا.

تقدم هذه المخطوطة MitoMobile بجامعة أوبورن (AU) ، وهو مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل الذي يمكن نقله إلى الميدان واستخدامه في الموقع لقياس استقلاب الميتوكوندريا في الأنسجة التي تم جمعها من الحيوانات البرية. يتم تقديم السمات الأساسية للمختبر المتنقل والطرق خطوة بخطوة لقياس معدلات التنفس الميتوكوندريا المعزولة. بالإضافة إلى ذلك ، تؤكد البيانات المقدمة نجاح تجهيز مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل وإجراء قياسات تنفس الميتوكوندريا. تكمن حداثة المختبر المتنقل في القدرة على القيادة إلى الميدان وإجراء قياسات الميتوكوندريا على أنسجة الحيوانات التي تم التقاطها في الموقع.

Introduction

حتى الآن ، اقتصرت الدراسات المصممة لقياس طاقة الميتوكوندريا على المختبر أو الحيوانات التي تم التقاطها بالقرب من مختبرات علم وظائف الأعضاء الراسخة ، مما منع العلماء من إجراء دراسات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في الأنسجة التي تم جمعها من الحيوانات خلال أنشطة مثل الهجرة والغوص والسبات1،2،3،4،5،6. في حين نجح العديد من الباحثين في قياس معدلات الأيض القاعدية والذروة ونفقات الطاقة اليومية للحيوانات البرية 7,8 ، ظلت قدرة الباحثين على قياس أداء الميتوكوندريا محدودة (ولكن انظر1،4،9). ويرجع ذلك جزئيا إلى الحاجة إلى أنسجة جديدة لعزل الميتوكوندريا ومنشأة مختبرية لإجراء عمليات العزل في غضون حوالي 2 ساعة من الحصول على الأنسجة الطازجة. بمجرد عزل الميتوكوندريا ، يجب أيضا إكمال قياسات تنفس الميتوكوندريا في غضون ~ 1 ساعة.

عادة ما يتم إجراء معدلات تنفس الميتوكوندريا المعزولة عن طريق قياس تركيز الأكسجين في حاوية محكمة الغلق متصلة بقطب كلارك. تستند النظرية الكامنة وراء هذه الطريقة إلى الملاحظة الأساسية القائلة بأن الأكسجين هو آخر مستقبل إلكتروني لتنفس الميتوكوندريا أثناء الفسفرة التأكسدية. لذلك ، مع انخفاض تركيز الأكسجين أثناء التجربة ، يفترض أن إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) يحدث10. الأكسجين المستهلك هو وكيل ل ATP المنتج. يمكن للباحثين إنشاء ظروف تجريبية محددة باستخدام ركائز مختلفة وبدء التنفس المستحث بالأدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) (الحالة 3) عن طريق إضافة كميات محددة مسبقا من ADP إلى الغرفة. بعد فسفرة جزيء ADP الخارجي إلى جزيء ATP ، ينخفض معدل استهلاك الأكسجين ، ويتم الوصول إلى الحالة 4 ويمكن قياسها. علاوة على ذلك ، تسمح إضافة مثبطات محددة بالحصول على معلومات تتعلق بالتنفس المتسرب والتنفس غير المنفصل10. تحدد نسبة الحالة 3 إلى الحالة 4 نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR) ، وهي مؤشر اقتران الميتوكوندريا الكلي10,11. تشير القيم المنخفضة ل RCR إلى خلل وظيفي عام في الميتوكوندريا ، بينما تشير قيم RCR الأعلى إلى مدى أكبر من اقتران الميتوكوندريا10.

كما ذكرنا سابقا ، يجب إكمال جمع المواد البيولوجية وعزل الميتوكوندريا وقياس معدلات التنفس في غضون 2 ساعة من الحصول على الأنسجة. لإنجاز هذه المهمة دون نقل الحيوانات لمسافات كبيرة إلى المختبرات القائمة ، تم بناء مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل ليتم نقله إلى المواقع الميدانية حيث يمكن جمع هذه البيانات. تم تحويل مركبة ترفيهية Jayco Redhawk 2018 إلى مختبر فسيولوجيا جزيئية متنقل وسميت جامعة أوبورن (AU) MitoMobile (الشكل 1A). تم اختيار مركبة ترفيهية بسبب الثلاجة المدمجة والفريزر وخزان تخزين المياه والسباكة والكهرباء التي تعمل ببطاريات 12 فولت ومولد الغاز وخزان البروبان ونظام التسوية الذاتية. علاوة على ذلك ، توفر السيارة الترفيهية القدرة على البقاء في المواقع النائية طوال الليل لجمع البيانات. لم يتم تغيير مقدمة السيارة وتوفر أماكن القيادة والنوم (الشكل 1 ب). تمت إزالة وسائل الراحة المثبتة مسبقا في غرفة النوم (السرير والتلفزيون والخزانة) في الجزء الخلفي من السيارة والموقد.

تم تركيب أرفف مصنوعة حسب الطلب من الفولاذ المقاوم للصدأ وسطح عمل كوارتز مخصص مدعوم بإطار من الألومنيوم 80/20 بدلا من وسائل الراحة في غرفة النوم والموقد (الشكل 1C). توفر مقاعد المختبر مساحة كافية لجمع البيانات (الشكل 1 د). وأخذ في الاعتبار استهلاك الطاقة لكل قطعة من المعدات (أي أجهزة الطرد المركزي المبردة، وغرف التنفس الميتوكوندريا، وأجهزة قراءة الألواح، والحواسيب، والمجانسات، والموازين، والمجمدات الفائقة المحمولة، وغيرها من لوازم المختبرات العامة). لدعم الجهد الكبير ومتطلبات التيار لأجهزة الطرد المركزي ، تمت ترقية النظام الكهربائي إلى معدات الطائرات. تم تحويل حجرة خارجية في الجزء الخلفي من السيارة إلى حجرة لتخزين النيتروجين السائل ، والتي تلبي إرشادات وزارة النقل الأمريكية لتخزين النيتروجين السائل ونقله. تم بناء وحدة التخزين هذه من الفولاذ المقاوم للصدأ ولها تهوية مناسبة لمنع أي غاز نيتروجين متمدد من التسرب إلى مقصورة الركاب في السيارة.

للتأكد من إمكانية استخدام المختبر المتنقل في دراسات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ، تم عزل الميتوكوندريا ، وتم قياس معدلات تنفس الميتوكوندريا من الفئران المنزلية المشتقة من البرية (Mus musculus) العضلات الهيكلية الخلفية. نظرا لأن Mus musculus هو كائن نموذجي ، فإن معدلات تنفس الميتوكوندريا لهذا النوع راسخة12،13،14. على الرغم من أن الدراسات السابقة قد وثقت عزل الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي التفاضلي15،16،17 ، إلا أنه تم وصف لمحة موجزة عن الطرق المستخدمة في طرق مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقلة أدناه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تصف الأقسام التالية طرق مختبر الميتوكوندريا. تمت الموافقة على جميع إجراءات التعامل مع الحيوانات وجمع الأنسجة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة أوبورن (# 2019-3582).

1. وصف المخازن المؤقتة المستخدمة لجمع البيانات

ملاحظة: يمكن تحضير هذه المخازن المؤقتة في مختبر ثابت ونقلها إلى المختبر المتنقل قبل الرحلة الميدانية (ما لم يذكر خلاف ذلك أدناه).

  1. قم بإعداد عازلة عزل الميتوكوندريا للعضلات الهيكلية باستخدام ألبومين مصل الأبقار (BSA) ، كما هو موضح في الجدول 1.
    1. قم بإذابة المواد الكيميائية في الماء منزوع الأيونات (~ 90٪ حجم) باستثناء BSA الخالي من الأحماض الدهنية. ضع المخزن المؤقت في الثلاجة حتى تصل درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية.
    2. اضبط المحلول على درجة حموضة 7.5 مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية.
    3. أضف BSA الخالي من الأحماض الدهنية وارفع الحجم إلى 100٪. قسمة الحل إلى أنابيب مخروطية 50 مل. قم بتخزين هذا المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. قم بإعداد عازلة عزل الميتوكوندريا للعضلات الهيكلية بدون BSA كما هو موضح في الجدول 1.
    1. حل المواد الكيميائية في الماء منزوع الأيونات (~ 90٪ حجم). ضع المخزن المؤقت في الثلاجة حتى تصل درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية.
    2. اضبط المحلول على درجة حموضة 7.5 مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية.
    3. ارفع مستوى الصوت إلى 100٪. قسمة الحل إلى أنابيب مخروطية 50 مل. قم بتخزين هذا المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. تحضير المخزن المؤقت لإعادة تعليق العضلات الهيكلية كما هو موضح في الجدول 1.
    1. حل المواد الكيميائية في الماء منزوع الأيونات (~ 90٪ حجم). ضع المخزن المؤقت في الثلاجة حتى تصل درجة الحرارة إلى 4 درجات مئوية.
    2. اضبط المحلول على درجة حموضة 7.4 مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية.
    3. ارفع مستوى الصوت إلى 100٪. قسمة الحل إلى أنابيب مخروطية 50 مل. قم بتخزين هذا المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. تحضير مخزن تنفس العضلات الهيكلية كما هو موضح في الجدول 2.
    1. قم بإذابة المواد الكيميائية في الماء منزوع الأيونات (~ 90٪ حجم) باستثناء BSA الخالي من الأحماض الدهنية. سخني المخزن المؤقت حتى تصل درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
    2. اضبط المحلول على درجة حموضة 7.0 مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.
    3. أضف BSA الخالي من الأحماض الدهنية وارفع الحجم إلى 100٪. قسمة الحل إلى أنابيب مخروطية 50 مل. قم بتخزين هذا المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  5. تحضير ركائز التنفس كما هو موضح في الجدول 2.
    1. تأكد من أن هذه الركائز مصنوعة طازجة في يوم جمع البيانات في 100 mM Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.4. تخزينها على الجليد حتى الاستخدام.
      ملاحظة: القيم المقدمة هي صنع محلول مركز بدرجة كافية لامتصاص الميتوكوندريا كمية كافية من الركيزة. التركيزات النهائية للركائز هي 2 mM pyruvate ، و 2 mM malate ، و 10 mM glutamate ، و 5 mM succinate.

2. إجراء عزل الميتوكوندريا (الشكل 2)

ملاحظة: يتم إجراء قياسات عزل الميتوكوندريا وتنفس الميتوكوندريا في منطقة مقاعد المختبر في المختبر المتنقل ، ويجب الاحتفاظ بجميع المحاليل عند 4 درجات مئوية ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. أوقف المختبر المتنقل على أرض مستوية. قم بتشغيل المولد وتسوية السيارة. قم بتمديد الشريحة وإعداد الجهاز.
  2. قم بإذابة الكميات المطلوبة من المخازن المؤقتة.
    ملاحظة: بشكل عام ، هناك حاجة إلى 30 مل من عازلة عزل العضلات الهيكلية و 10 مل من عازلة عزل العضلات الهيكلية بدون BSA لكل عضلة.
  3. قم بإعداد ومعايرة غرف التنفس الميتوكوندريا إلى درجة الحرارة المطلوبة للتجارب والضغط الجوي الحالي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. انظر جدول المواد لغرف محددة مستخدمة في التجارب.
  4. القتل الرحيم للحيوان عن طريق قطع الرأس.
    ملاحظة: استخدمت الدراسة الحالية قطع الرأس للقتل الرحيم. بعض الغازات ، مثل ثاني أكسيد الكربون والأيزوفلوران ، تؤثر على وظيفة الميتوكوندريا18،19،20 ؛ يجب مراعاة هذه التأثيرات عند اختيار أفضل طريقة للقتل الرحيم لكل دراسة. سيتم تحديد الطريقة التي يجب إجراؤها لكل دراسة من خلال السؤال العلمي المطروح.
  5. استئصال العضلات الهيكلية ، وتقليم الدهون والأنسجة الضامة بسرعة ، ووزن ، ووضع العضلات في عازلة عزل العضلات الهيكلية مع BSA (على الأقل 1/10 w / v) (على سبيل المثال ، 1 غرام من العضلات الهيكلية إلى 10 مل من العازلة).
  6. اللحم المفروم العضلات والهيكل العظمي مع مقص على الجليد.
  7. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام طرف ماصة مقطوع سعة 5 مل. قم بتجانسها بشفرة (انظر جدول المواد) بقوة 50٪ لمدة 5 ثوان. يضاف البروتياز (5 ملغ / غرام من العضلات الرطبة) ويهضم لمدة 7 دقائق ، ويخلط المحلول كل 30 ثانية. قم بإنهاء التفاعل عن طريق إضافة حجم متساو من المخزن المؤقت للعزل باستخدام BSA.
  8. جهاز الطرد المركزي المجانس في 500 × غرام لمدة 10 دقائق. انقل المادة الطافية من خلال القماش القطني مزدوج الطبقات باستخدام طرف ماصة مقطوع سعة 5 مل في أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 3500 × جم لمدة 10 دقائق لترسيب حبيبات الميتوكوندريا البنية.
  9. اسكب الطافية المتبقية. أضف نفس الحجم من المخزن المؤقت للعزل باستخدام BSA إلى أنبوب الطرد المركزي. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا بمكشطة مرنة (شرطي) عن طريق عمل حبيبات الميتوكوندريا برفق على جدران أنبوب الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي عند 3500 × جم لمدة 10 دقائق.
  10. اسكب الطافية المتبقية. أضف نفس الحجم من المخزن المؤقت للعزل بدون BSA إلى أنبوب الطرد المركزي. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا عن طريق عمل حبيبات الميتوكوندريا برفق على جدران أنبوب الطرد المركزي باستخدام شرطي نظيف. جهاز طرد مركزي عند 3500 × جم لمدة 10 دقائق.
  11. صب المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الميتوكوندريا في مخزن إعادة التعليق عن طريق عمل حبيبات الميتوكوندريا برفق على جدران أنبوب الطرد المركزي مع شرطي نظيف.
    ملاحظة: يعتمد حجم المخزن المؤقت لإعادة التعليق على حجم حبيبات الميتوكوندريا.
  12. انقل الميتوكوندريا المعاد تعليقها إلى خالط Dounce بطرف ماصة مقطوع سعة 1 مل. باستخدام الخالط Dounce ، قم بتجانس التعليق بعناية مع 4-5 تمريرات.
  13. ضع معلق الميتوكوندريا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل باستخدام طرف ماصة آخر مقطوع سعة 1 مل.

3. قياسات التنفس الميتوكوندريا (الشكل 3)

  1. ركائز المجمع الأول
    1. أضف 945 ميكرولتر من محلول التنفس إلى الغرفة. تأكد من أن المحرك يدور ، ويتم الحفاظ على درجة حرارة المخزن المؤقت عند 37 درجة مئوية. ابدأ تسجيل جمع البيانات.
    2. بعد استقرار تركيز الأكسجين ، أضف 20 ميكرولتر من الميتوكوندريا وضع الغطاء على الغرفة. في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة الميتوكوندريا إلى الغرفة.
    3. أضف 10 ميكرولتر من 1 M الغلوتامات ، 10 μL من 200 mM malate ، و 10 μL من 200 mM البيروفات إلى الغرفة مع المحاقن الفردية وانتظر حتى تستقر الإشارة. في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة ركائز.
      ملاحظة: تستخدم هذه الركائز عادة لقياس التنفس الناجم عن الكربوهيدرات. للاطلاع على تركيبات أخرى من الركائز التي يجب استخدامها لقياس التنفس الناجم عن الدهون، انظر21.
    4. أضف 5 ميكرولتر من ADP مع حقنة منفصلة ولاحظ الاستهلاك السريع للأكسجين (الحالة 3). في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة ADP.
      ملاحظة: بعد فسفرة ADP المضافة ، سوف يستقر معدل استهلاك الأكسجين إلى الحالة 4.
    5. بعد 4 دقائق من جمع بيانات الحالة 4 ، قم بإنهاء التسجيل. احفظ ملف البيانات.
  2. ركائز المجمع الثاني
    1. أضف 963 ميكرولتر من مخزن التنفس إلى الحجرة. تأكد من أن المحرك يدور ، ويتم الحفاظ على درجة حرارة المخزن المؤقت عند 37 درجة مئوية. ابدأ تسجيل جمع البيانات.
    2. بعد استقرار تركيز الأكسجين ، أضف 20 ميكرولتر من الميتوكوندريا وضع الغطاء على الغرفة. في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة الميتوكوندريا إلى الحل.
    3. أضف 2 ميكرولتر من 4 ميكروغرام / ميكرولتر روتينون متبوعا ب 10 ميكرولتر من سكسينات 500 مللي مول إلى الحجرة باستخدام محاقن منفصلة وانتظر حتى تستقر الإشارة. في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة ركائز.
    4. أضف 5 ميكرولتر من ADP باستخدام حقنة منفصلة ولاحظ الاستهلاك السريع للأكسجين (الحالة 3). في البرنامج ، تشير إلى أنه تمت إضافة ADP.
      ملاحظة: بعد فسفرة ADP المضافة ، سوف يستقر معدل استهلاك الأكسجين إلى الحالة 4.
    5. بعد 4 دقائق من جمع بيانات الحالة 4 ، قم بإنهاء التسجيل. احفظ ملف البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بحثت المخطوطة الحالية في تنفس الميتوكوندريا لعضلات Mus المشتقة من البرية (ن = 7 ، ذكر = 5 ، أنثى = 2 ؛ العمر = 1.30 ± 0.2 سنة) في مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل (الشكل 1). لقياس تنفس الميتوكوندريا في العضلات الهيكلية ، تم استخدام الطرف الخلفي بأكمله ، وبالتالي العضلات الهوائية واللاهوائية ، لعزل الميتوكوندريا (الشكل 2). يوضح الشكل 3 أمثلة على بيانات التنفس الخام للميتوكوندريا. يمثل الشكلان 3 أ و3 ب عملية تنفس الميتوكوندريا المعقدة التي تحركها حرف I. يمثل الانحدار الحاد الملاحظ في الشكل 3 أ معدل التنفس الأقصى المرتفع. هذه هي القيمة المستخدمة لمزيد من تحليل البيانات. لوحظ العزلة الناجحة للميتوكوندريا من العضلات الهيكلية الخلفية من خلال الانعطاف الحاد واستقرار منحدر جديد ، والذي يحدد الحالة 4 (الشكل 3 ب).

يمكن أيضا تفسير هذه البيانات على أنها الميتوكوندريا عالية الأداء بسبب التحول الحاد لإنشاء الحالة 4. يمكن ملاحظة نمط مماثل لتنفس الميتوكوندريا المعقد الذي يحركه II (الشكل 3C والشكل 3D). يوضح الشكل 3E ، F ضعف عمل الميتوكوندريا ، إما بسبب فسيولوجيا الميتوكوندريا أو التنفس غير الناجح للميتوكوندريا. يوضح الشكل 3E اقتران الميتوكوندريا بالتنفس المعقد للميتوكوندريا الذي يحركه I ، كما يتضح من التحول إلى الحالة 4. ومع ذلك ، يوضح الشكل 3F تنفس الميتوكوندريا المعقد II غير المنفصل ، كما هو موضح بخط مسطح بعد إضافة ADP ، ولا يوجد "دوران" لإنتاج بيانات الحالة 4. تشير هذه البيانات إلى مشاكل محتملة أثناء عزل الميتوكوندريا ، والتي تتم مناقشتها أدناه.

يمكن العثور على القيم العددية للحالة 3 والحالة 4 و RCR لكل من المركب I والمركب II من هذه الحيوانات في الشكل 4. تم تحديد هذه البيانات عن طريق قياس 30 ثانية من المنحدر الأكثر انحدارا بعد إضافة ADP لتحديد الحالة 3 (الشكل 3A ، C) وقياس المنحدر بعد "الدوران" لمدة 1 دقيقة لقياس الحالة 4 (الشكل 3B ، D). بمجرد الحصول على هذه القيم ، تم تطبيع البيانات إلى محتوى البروتين (عبر اختبار برادفورد22). باستخدام القيم التي تمت تسويتها ، تم حساب RCR بقسمة قيمة الحالة الطبيعية 3 على قيمة الحالة الطبيعية 4.

Figure 1
الشكل 1: AU MitoMobile ، مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل. (أ) خارج الاتحاد الأفريقي ميتو موبايل. (ب) داخل السيارة التي تنظر إلى المقدمة حيث لم يتم إجراء أي تغييرات. (ج) الجزء الخلفي من السيارة يظهر تركيب المقاعد ومقصورات التخزين وأجهزة الطرد المركزي. (د) إعداد المعدات أثناء جمع البيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: عزل الميتوكوندريا وقياس التنفس في العضلات الهيكلية. (1) يتم تشريح الأنسجة من الحيوان ووضعها في مخزن مؤقت حيث يتم (2) فرمها وتجانسها ومعالجتها بالبروتياز وتعريضها للطرد المركزي حتى يتم الحصول على حبيبات الميتوكوندريا. (3) يتم إنعاش حبيبات الميتوكوندريا ، ويتم الحصول على بيانات التنفس. (4) يمكن استخدام بيانات استهلاك الأكسجين لحساب الحالة 3 والحالة 4 و RCR. اختصار: RCR = نسبة التحكم في التنفس. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: قياسات تنفس الميتوكوندريا مع ركائز معقدة I وركائز II معقدة. استهلاك الأكسجين مع ركائز I المعقدة ، مع تسليط الضوء على تحليل المنحدر للحالة 3 (أ) والحالة 4 (ب). استهلاك الأكسجين مع ركائز II المعقدة ، مع تسليط الضوء على تحليل المنحدر للحالة 3 (C) والحالة 4 (D). يمكن ملاحظة تنفس الميتوكوندريا دون المستوى الأمثل في التنفس المركب الذي يحركه I (E) والتنفس المعقد المدفوع بII (F). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: البيانات التي تم جمعها على الفئران المنزلية (Mus musculus) في AU MitoMobile. تم إجراء عزل الميتوكوندريا والتنفس باستخدام الإجراء الموضح هنا. استخدم البيروفات والمالات والغلوتامات لتحديد معدلات التنفس المركب I. تم استخدام السكسينات والروتينون لقياس معدلات التنفس II المعقدة. (أ) المركب I حالة 3 قياسات، (ب) المركب الأول حالة 4 قياسات، (ج) المركب I RCR، (د) المركب II الحالة 3 القياسات، (ه) المركب II الحالة 4 القياسات، (و) المركب الثاني RCR. اختصار: RCR = نسبة التحكم في التنفس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عازلة عزل الميتوكوندريا للعضلات الهيكلية
الكاشف مع BSA ، التركيز (mM) بدون BSA ، التركيز (mM)
ككل 100 100
تريس حمض الهيدروكلوريك 40 40
قاعدة تريس 10 10
مغ سي سي ال2 1 1
إي جي تي ايه 1 1
ATP 0.2 0.2
خالية من الأحماض الدهنية BSA 0.15% -
عازلة معزولة لإعادة تعليق الميتوكوندريا للعضلات الهيكلية
الكاشف التركيز (مللي مول)
مانيتول 220
سكروز 70
تريس حمض الهيدروكلوريك 10
إي جي تي ايه 1

الجدول 1: مخازن عزل الميتوكوندريا (مع وبدون BSA) وعازلة إعادة تعليق الميتوكوندريا المعزولة للعضلات الهيكلية.

مخزن التنفس المؤقت
الكاشف التركيز (مللي مول)
ككل 100
المماسح 50
كيهاتش 2PO4 10
الجلوكوز 20
مغ سي سي ال2 10
إي جي تي ايه 1
خالية من الأحماض الدهنية BSA 0.20%
ركائز التنفس
الكاشف التركيز (مللي مول)
بيروفات 200
مالات 200
سكسينات 500
البوابة العربية للتنمية 100
الغلوتامات 1000

الجدول 2: مخزن التنفس والركائز.

الدولة 3 الدولة 4 آر سي آر درس ركائز
368.3±80.4 68.9±25.0 5.8±1.6 12 2 مللي مول بيروفات ، 2 مللي متر مالات
241.8±22.5 28.9±3.2 8.3±1.9 23 5 ملليمتر بيروفات ، 2 مللي متر مالات
285.7±36.5 81.9±2.9 3.5±1.0 23 سكسينات 10 مللي متر ، 4 ميكرومتر روتينون
493.4±105.4 61.3±9.6 8.2±2.2 الدراسة الحالية 2 مللي متر بيروفات ، 2 مللي متر مالات ، 10 مللي متر غلوتامات
559.5±74.9 165.2±18.5 3.4±0.2 الدراسة الحالية سكسينات 5 مللي مول، 4 ميكروغرام/ميكرولتر روتينون

الجدول 3: القيم المقارنة للحالة 3 والحالة 4 و RCR. اختصار: RCR = نسبة التحكم في التنفس. قيم الحالة 3 والحالة 4 موضحة بالنانومات O2 / مجم بروتين / دقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل الباحثين من عزل الميتوكوندريا وقياس معدلات تنفس الميتوكوندريا في غضون 2 ساعة من جمع الأنسجة في المواقع الميدانية النائية. تشير النتائج المقدمة هنا إلى أن قياسات تنفس الميتوكوندريا التي أجريت في AU MitoMobile قابلة للمقارنة مع القياسات التي أجريت في مختبر أبحاث جامعي. على وجه التحديد ، فإن قيم الحالة 3 والحالة 4 و RCR للعضلات المشتقة من البرية المعروضة هنا قابلة للمقارنة مع النتائج المنشورة سابقا من نفس المختبر وغيره (الجدول 3)12,23. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه بسبب سلالات الفئران المختلفة والأساليب المستخدمة ، لا يمكن إجراء مقارنة مباشرة لهذه الدراسات. توضح هذه النتائج دليلا على مفهوم قياس تنفس الميتوكوندريا في مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل هذا.

يمكن نقل جميع المواد الكيميائية والمواد اللازمة لعزل الميتوكوندريا وتنفسها وتخزينها داخل المختبر المتنقل ، مما يتيح سهولة الوصول عند إعداد التجارب وإجرائها. بالإضافة إلى ذلك ، توفر الميتوكوندريا المعزولة التي تم جمعها في مختبر الميتوكوندريا المتنقل عينة فريدة لإجراء قياسات كيميائية حيوية أخرى مثل انبعاث أنواع الأكسجين التفاعلية. الأهم من ذلك ، يمكن نقل الميتوكوندريا المجمدة إلى مختبر ثابت لإجراء قياسات كيميائية حيوية إضافية (على سبيل المثال ، أنشطة إنزيم سلسلة نقل الإلكترون الفردية). والجدير بالذكر أن عزل الميتوكوندريا عن طريق تمايز الطرد المركزي ليس الطريقة الوحيدة لقياس تنفس الميتوكوندريا. أجرت مختبرات أخرى قياسات ناجحة لتنفس الميتوكوندريا باستخدام ألياف نفاذية. على الرغم من أن المخطوطة الحالية لا تصف هذه الطريقة (لمزيد من التفاصيل حول الألياف النفاذية ، انظر24،25،26،27،28) ، فمن المهم للقراء أن يلاحظوا أن مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل يمكن أن يضم أيضا المواد اللازمة لهذا الإجراء. يرجى الاطلاع على المراجعات الأخرى حول نقاط القوة والضعف في كل من هذه الطرق25،29،30.

نشرت العديد من المختبرات التي تجري أبحاث الطاقة الحيوية للميتوكوندريا توصيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها التي قد يجدها القراء مفيدة15,17. لأي مشروع تجريبي واحد ، يجب عمل دفعة واحدة من المخازن المؤقتة لجمع جميع البيانات. إن استخدام المخازن المؤقتة المصنوعة في أيام مختلفة يخلق فرصة للاختلاف في المحاليل للتأثير على قياسات تنفس الميتوكوندريا. سيحدث تلف في غشاء الميتوكوندريا الخارجي أثناء عملية العزل ؛ ومع ذلك ، فإن التنفيذ السليم لطريقة العزل من خلال التدريب المختبري يمكن أن يقلل من الضرر الذي سيحدث بشكل طبيعي مع هذا الإجراء29,31. أثناء عملية العزل ، يشار إلى الميتوكوندريا غير الوظيفية أو التالفة بشكل مفرط بواسطة حبيبات الميتوكوندريا البيضاء الرقيقة بدلا من الحبيبات البنية المدمجة. يمكن أن تحدث الميتوكوندريا غير الوظيفية أو التالفة بسبب عدد دورات مفرط في الدقيقة أثناء تجانس الشفرة ، أو التجانس لفترة طويلة جدا ، أو إضافة الكثير من البروتياز أو الهضم لفترة طويلة جدا ، أو استخدام الكثير من السكتات الدماغية أثناء إعادة التعليق النهائي للميتوكوندريا.

علاوة على ذلك ، فإن اختيار العضلات التي يجب عزلها ومقدار العضلات المستخدمة سيؤثر على إنتاج الميتوكوندريا. على سبيل المثال ، في ذي كثافة ميتوكوندريا أعلى ، مثل طائر21 ، سيتم ترسيب المزيد من الميتوكوندريا مقارنة بمزيج من أنواع الألياف العضلية الهيكلية من الطرف الخلفي للفئران. سيؤدي ذلك أيضا إلى تغيير كمية الأنسجة اللازمة للعزل الناجح. كلما زادت كثافة الميتوكوندريا في الأنسجة ، انخفضت كمية الأنسجة اللازمة للعزل الناجح. يجب على الباحثين أيضا النظر في حجم محلول مانيتول السكروز المضاف إلى الميتوكوندريا المعزولة النهائية. ستحتاج حبيبات الميتوكوندريا الأكثر كثافة إلى تخفيف أعلى ، بينما ستحتاج حبيبات الميتوكوندريا الأقل كثافة إلى تخفيف أقل. يعتمد مدى التخفيف على الحيوان ، والطبيعة المؤكسدة للعضلات الهيكلية المعزولة ، ومدى كثافة حبيبات الميتوكوندريا.

قد يكون الحصول على طاقة كهربائية كافية لدعم جميع المعدات اللازمة لجمع البيانات في مختبر متنقل أمرا صعبا. والجدير بالذكر أن أجهزة الطرد المركزي المبردة تسحب تيارا عاليا أثناء التشغيل (خاصة خلال المراحل الأولية من التهدئة). لذلك ، يجب مراعاة اعتبارات خاصة لضمان أن الناتج الكهربائي للمركبة يطابق الطلب الكهربائي للمعدات اللازمة للتشغيل في وقت واحد. التوصية التي يمكن أن تحل هذا القيد هي إضافة المزيد من مصادر الطاقة (على سبيل المثال ، بطاريات إضافية ، مولدات إضافية). والجدير بالذكر أن طريقة قياس تنفس الميتوكوندريا بالألياف النفاذية لا تحتاج إلى استخدام جهاز طرد مركزي مبرد ويمكن أن توفر أيضا حلا لمصدر الطاقة المحدود. وينبغي أيضا مراعاة الظروف البيئية وجودة الطرق عند استخدام المختبر المتنقل. تم قيادة مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل الذي تمت مناقشته هنا بنجاح على الطرق بين الولايات ذات الطقس الصافي. ستشكل الطرق الترابية ذات الطقس القاسي صعوبة أكبر في قيادة السيارة إلى موقع الاهتمام. على الرغم من أن عزل الميتوكوندريا ليس طريقة جديدة ، إلا أن استخدامه في مختبر متنقل يوفر طريقة فريدة لقياس طاقة الميتوكوندريا في الحيوانات التي تعيش بحرية. يمكن أن يكون هذا حاسما في توضيح الاختلافات بين الحيوانات المختبرية والبرية32،33،34. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل للباحثين بدراسة قيود الطاقة والتطرف النشط الموجود بين الحيوانات في العالم الطبيعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgments

يعترف المؤلفون بمارك نيلمز وجون تينانت من قسم الهندسة الكهربائية وهندسة الحاسبات في كلية صموئيل جين للهندسة بجامعة أوبورن للمساعدة في التجهيز الهيكلي والكهربائي ل AU MitoMobile. بالإضافة إلى ذلك ، يقر المؤلفون بالتمويل لتجهيز AU MitoMobile والبحث من منحة الجوائز الرئاسية بجامعة أوبورن للبحوث متعددة التخصصات (PAIR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL centrifuge tubes VWR 87003-294
2.0 mL centrifuge tubes VWR 87003-298
50 mL centrifuge tubes VWR 21009-681 Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube
ADP VWR 97061-104
ATP VWR 700009-070
Bradford VWR 7065-020
Clear 96 well plate VWR 82050-760 Greiner Bio-One
Dounce homogenizer VWR 22877-284 Corning
EGTA VWR EM-4100
Filter paper Included with Hansatech OxyGraph
Free-fatty acid BSA VWR 89423-672
Glucose VWR BDH8005-500G
Glutamate VWR A12919
Hamilton Syringes VWR 60373-985 Gaslight 1700 Series Syringes
Hansatech OxyGraph Hansatech Instruments Ltd No Catalog Number, but can be found under Products --> Electrode Control Units
KH2PO4 VWR 97062-350
Malate VWR 97062-140
Mannitol VWR 97061-052
Membrane Included with Hansatech OxyGraph
MgCl2 VWR 97063-152
MOPS VWR 80503-004
Policeman VWR 470104-462
Polytron Thomas Scientific 11090044
Potassium chloride (KCl) VWR 97061-566
Protease VWR 97062-366 Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used.
Pyruvic acid VWR 97061-448
Sodium Dithionite VWR AA33381-22
Succinate VWR 89230-086
Sucrose VWR BDH0308-500G
Tris-Base VWR 97061-794
Tris-HCl VWR 97061-258

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
  2. Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
  3. Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
  4. Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
  5. Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
  6. Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
  7. Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
  8. Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
  9. Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
  10. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. Third edition. , Academic Press. (2002).
  11. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  12. Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
  13. Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
  14. Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
  15. Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
  16. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
  17. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
  18. Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
  19. Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
  20. Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
  21. Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  23. Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
  24. Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
  26. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
  27. Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , Springer US. 67-85 (2021).
  28. Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
  29. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  30. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
  31. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
  32. Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
  33. Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
  34. Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).

Tags

مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل ، قياس طاقة الميتوكوندريا ، تنفس الميتوكوندريا ، القدرة الأيضية ، العينات البيولوجية ، الإجراءات المعملية ، المعدات المتخصصة ، الحيوانات البرية ، حفظ الأنسجة الحية ، التغيير الناجم عن الإجهاد ، جامعة أوبورن ميتو موبايل ، مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل ، القياس في الموقع ، معدلات تنفس الميتوكوندريا المعزولة ، التحقق من صحة البيانات ، حداثة المختبر المتنقل ، البحث الميداني
تطوير مختبر متنقل لفسيولوجيا الميتوكوندريا لقياس طاقة الميتوكوندريا في الميدان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parry, H. A., Yap, K. N., Hill, G.… More

Parry, H. A., Yap, K. N., Hill, G. E., Hood, W. R., Gladden, L. B., Eddy, M., Kavazis, A. N. Development of a Mobile Mitochondrial Physiology Laboratory for Measuring Mitochondrial Energetics in the Field. J. Vis. Exp. (174), e62956, doi:10.3791/62956 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter